静宁鸡胚成纤维细胞系及其培养方法

专利名称:静宁鸡胚成纤维细胞系及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞系及其培养方法，具体地说是利用静宁鸡胚胎进行初代培养、传代培养获得高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系，属于细胞生物学领域。
背景技术：
随着科技的发展和人们物质生活需求的不断提高，畜牧业生产正朝着高产、优质、抗逆、抗病及集约化的方向快速转变和发展。在大多数发达国家里，由于人们过于追求经济利益等缘故，大量繁育的畜禽只是少数经济价值高的品种和杂交种，因而，导致了而很多产量不高、品质不佳、抗逆和抗病力差的地方品种的濒临灭绝，甚至灭绝。虽然相关的国际组织、政府部门和专家学者对畜禽遗传资源的保存和管理工作相当重视，但畜禽种质资源仍在大量丧失，遗传多样性遭到了前所未有的破坏，并且危机程度日益加剧。
1995年，FAO的统计数据表明在撒哈拉沙漠以南的中部非洲地区登记在案的畜禽约有738个品种，将近15％为濒危畜禽资源。非洲地区的形式非常严峻，畜禽遗传资源已惨遭破坏，从1995年至今，处于濒临灭绝的家禽由20％上升到了34％。亚太地区拥有全球1/5的畜禽资源，1251个畜禽品种被登记，据估计在所被记录的品种中，约有10％为濒危资源。在1995年到1999年间，亚洲濒临灭绝的家禽由32％上升到37％。在东欧这种情况更为严重，在1995年到1999年的几年时间里，处于濒临灭绝的家禽由65％上升到了76％。拉丁美洲现存20％的品种被认为处于濒危。处于濒危状态的禽类由1995年的5％急剧上升到了1999年的45％。近东地区生产的集约化和机械化导致了很多畜禽品种的濒临灭绝。在571个被登记的品种中，有44个甚至更多被认为是处于濒危状态。北美持续的生产集约化，使得在生产中仅依赖少数的品种来满足食品生产的需求，因此加重了畜禽遗传资源多样性的危机程度，在被记录的259个品种中，有35％濒临灭绝。据2000年联合国粮农组织(FAO)与联合国环境规划署的报道，目前全球畜禽品种以每周减少2个品种的速度在丧失，在被FAO所记录的2576个畜禽品种中，几乎半数被认为是濒危畜禽资源，约有1350个品种面临灭绝，使世界畜禽种质资源出现越来越狭窄的格局，因此挽救和保护濒危畜禽品种已成为当务之急。
我国畜禽生产力类型丰富，其遗传资源具有物种和品种繁多，起源和分布广泛，生态类型多样等特点，且我国地方品种所占的比例远远高于其他国家。我国畜禽具有对疫病抵抗力强的特性，具有各种抗性和经济性状的优良基因。
但是，近些年来，由于生态环境的不断恶化、国外畜禽品种的大量引进和集约化养殖等诸多因素的影响，导致我国很多优良地方畜禽品种的灭绝或处于濒临灭绝状态。近20年，41.9％的地方品种群体数量有不同程度的下降。80年代中后期鸡的配套系又取代了本地鸡品种和新培养品种，致使我国家养动物种质资源受到严重破坏。我国的畜禽遗传资源多样性状况也并不乐观，而且有不断恶化的趋势。畜禽种质资源的危机，意味着畜禽种质所携带基因的危机，甚至是基因的永远消失，意味着畜禽遗传资源多样性的衰退和丧失。品种的灭绝意味着细胞和分子生物学对其进行科学研究的基本材料的永远丧失，如果这些品种的种质资源在灭绝前未曾以任何方式保存下来，不仅永远丧失了其基因资源，而且使科学家们对于它们诸多未知的细胞和分子生物学机理的探索及通过体细胞克隆技术使之再现的愿望将永远成为谜和梦，同时也将是世界遗传资源遗产和生命科学理论宝库的巨大损失。因此，在全球性抢夺生物资源和保护生物多样性的今天，从我国畜禽种质资源保存的实际出发，通过构建重要、濒危畜禽品种群体细胞库的方式来保存其基因资源，具有重要意义。
近年来，由于体外培养细胞在遗传资源保存和生命科学研究等诸多方面具有巨大的科学价值和应用价值，已引起各国政府高度重视。除美国外，日本大阪发酵所(IFO)、德国培养物保藏所(DSM)等都在逐渐扩大保藏范围，将细胞培养物列入保藏对象。
目前，低温冷冻保存技术的发展和完善，使得任何体外培养物都可以在保持其活力的基础上无限期地得以保存，因此，对于动物细胞的大量培养以解决种质资源问题无疑是现阶段细胞生物学领域研究的重要问题。
静宁鸡是原产于我国甘肃静宁的卵肉兼用型地方良种家禽。它的头部高举，尾羽高耸，胸肌发达，背宽而长。公鸡多为玫瑰冠，毛色红棕及酱红色为主，主翼羽、主尾羽均为黑色，外观美丽；母鸡头小清秀，黄色占大部分，麻色占的比例也不少，其肉质鲜美细嫩，目前采用农户分散饲养，山区以放牧为主。但是，由于近几十年来自然环境的污染和恶化，静宁鸡的种质资源已经严重匮乏，在绝大多数地区已经灭绝，在小部分地区也只还存在有限的数目，而目前人工繁育所面临的多方面技术问题导致其繁育效果不佳，我国静宁鸡面临濒临灭绝的危险。更由于其种质资源的匮乏，使生物学、医学等领域对于静宁鸡的研究也成为空白。因此，为保护国家珍惜禽种，一个最优的方法是对静宁鸡成纤维细胞的大规模培养并加以保藏。
目前随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，以便获得大量有用的细胞表达产物。但是，由于静宁鸡成纤维细胞生长缓慢，对培养环境十分敏感，若直接从组织块原代培养其所获得的细胞数量少，细胞类型多而杂，如成纤维细胞中常混杂有上皮细胞，随着培养时间的延长，培养物所含各种类型细胞间的生长期限出现差异，有的细胞类型经过适应生长阶段而加速繁殖生长，而另一些细胞，或者死亡，或者经过逐步退化而至死亡。而第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。而采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，也已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。目前使用较多的反应器培养虽可以获得高密度细胞，但是扩大规模较难，只适合于少量、价值高的细胞培养。
目前，常采用EB病毒转化技术、贴壁培养法和胶原酶消化技术进行禽类品种体外细胞的大量培养，但对比试验结果表明EB病毒转化技术对于禽类品种的体外细胞培养并不适用，其培养的细胞活率及纯度均不能达到所需标准，EB病毒转化技术对于人类和灵长类动物的细胞培养效果要优于禽类细胞培养；胶原酶消化技术和贴壁培养法获得的原代细胞分别经传代后接种，细胞群体倍增时间(PDT)分别为35.9h和48h。但前者操作步骤繁杂，不适合于体外大规模化细胞的培养，后者简单易行，适合于体外大规模化细胞的培养。因此建立细胞系以采用后者为佳。对于禽类细胞保藏而言，细胞纯度及活性均有较高的要求，目前，贴壁培养方法存在诸多弊端，如方法单一、成本过高、细胞活性及纯度偏低、细胞冻存复苏后死亡率过高等。因此，现在急需对其方法改进使静宁鸡成纤维细胞达到高细胞活率高纯度的标准已得到很好的保藏并延续下去。

发明内容本发明的目的是提供一种高细胞活性、高细胞纯度的静宁鸡胚成纤维细胞系，其保藏号为CGMCC No.1878。
本发明的另一目的在于提供上述细胞系的培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC(地址北京市海淀区中关村北一条13号；邮编100080；电话010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏号CGMCC No.1878，建议的分类命名为静宁鸡胚成纤维细胞系。该静宁鸡胚成纤维细胞系具有以下特征静宁鸡的胚胎组织块接种6h后即有细胞长出，1～2天即可贴满瓶壁。倒置显微镜下可见细胞透明，胞质突起丰满，呈长梭形，胞核椭圆形、居中，核仁清晰。当细胞生长成片后，细胞呈长梭形，火焰状，细胞形态趋于一致，为单核成纤维样。同时，细胞性质稳定，增殖较快。
上述高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，该方法包括下述步骤(1)初代培养将除去脑、眼、四肢、内脏的静宁鸡胚胎用PBS漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的组织块；将组织块移入培养瓶，倒置培养瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培养箱中培养3～4h；组织块完全贴壁后加入培养基6～10ml，培养基成分MEM+10％胎牛血清，继续培养10～12h；(2)传代培养弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入全培养液(10％FBS的MEM)6～10ml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培养箱中继续培养至冻存前24h；(3)细胞冻存A、冻存前24h弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，培养液成分MEM+10％胎牛血清，继续培养24h；B、用胰蛋白酶消化培养细胞，然后加入全培养液6～10ml终止反应；C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；D、收集1000rpm离心6～10min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；冻存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％MEM；E、将培养物分装入灭菌的冻存管中封口；F、预冻将冻存管装入降温盒中，放于4℃20～30min，然后置于-70℃预冻4h以上；G、冻存提出冻存管放入液氮柜中，即完成细胞冻存。
上述高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其中，步骤(1)中所述的静宁鸡胚胎6日龄为最佳。
上述高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其中，步骤(2)及步骤(3)中所述的胰酶消化具体步骤是向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后后翻转消化30～60s。
上述高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其中，根据实际需要可以将步骤(3)冻存的细胞进行细胞复苏，具体步骤为将冻存管从液氮中取出置入42℃水浴中，连续晃动1min后，将细胞移入加有培养液(MEM+10％胎牛血清)的培养瓶中吹打均匀，放置含37.5℃5％CO2的培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。
本发明的优点与效益本发明对于贴壁培养方法及培养基培养液成分的改进调整，可以使培养出的成纤维细胞无上皮细胞等杂质细胞，细胞纯度于现有技术相比有大幅提高；对于冻存条件的改进使复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后细胞的活率可达到并维持在93.2％～96.7％之间，且细胞传代生长稳定，与现有培养技术培养的细胞相比有显著提高，适合大规模培养。
与酶消化法比贴壁培养法的静宁鸡胚成纤维细胞培养效率和质量有很大的提高，利用酶消化法培养静宁鸡胚成纤维细胞的对比实验中发现，原代细胞生长状态与贴壁培养发的区别很小，但是传代2d左右即发现细胞出现空泡，而且随培养时间的增加细胞空泡化日益严重，无法得到健康状态的静宁鸡胚成纤维细胞。因此，利用贴壁培养法培养静宁鸡胚成纤维细胞具有明显的优势。本发明培养的细胞生长速度快、成活率高、外源基因表达率高、细胞融合率和凋亡率低，应用范围广。
对于培养基的调整及培养方法的改进，还可以使成本大幅降低。本发明在方法等各方面弥补了现有禽体细胞保存状况不理想的情况，静宁鸡胚成纤维细胞系的活率及纯度的提升也使重要、濒危静宁鸡品种的基因资源以体外培养细胞的形式得以长期保存。
由于静宁鸡种质资源的匮乏，使得对于静宁鸡在各领域内的研究成为空白。而本发明所述的高细胞活率及高纯度的静宁鸡胚成纤维细胞系可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量的高品质材料；并可以作为禽体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上可以丰富地方禽品种改良以及地方优良禽品种保种的手段；还可以作为是疫苗生产的主要原材料及肝细胞培养的饲养层；同时可用于细胞凋亡及细胞融合研究之用。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对
发明内容
有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
图1为静宁鸡胚原代细胞显微镜下图；图2为静宁鸡传代前细胞显微镜下图；图3为静宁鸡继代I细胞显微镜下图；图4为静宁鸡胚继代II细胞显微镜下 图5为被支原体污染的成纤维细胞对照图；图6为静宁鸡胚成纤维细胞支原体检测阴性结果图示；图7为静宁鸡胚成纤维细胞生长曲线图；图8为静宁鸡胚成纤维细胞核型图示；图9为静宁鸡胚成纤维细胞乳酸脱氢同功酶电泳图示(左侧两个泳道为白耳鸡、右侧两个泳道为静宁鸡的乳酸脱氢同功酶)；图10为静宁鸡胚成纤维细胞苹果酸脱氢酶电泳图示(右侧两个泳道为白耳鸡的、左侧两个泳道为静宁鸡的苹果酸酸同功酶)；图11为外源基因在静宁鸡胚成纤维细胞中表达24h图示(pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染)；图12为外源基因在静宁鸡胚成纤维细胞中表达48h图示(pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染)；图13为外源基因在静宁鸡胚成纤维细胞中表达48h图示(pDsRed1-N1荧光蛋白质粒转染)；图14为外源基因在静宁鸡胚成纤维细胞中表达48h图示(pEYFP-N1荧光蛋白质粒转染)；图15伊红染色的静宁鸡细胞(400×)；图16DAPI染色的天祝白牦牛细胞(400×)；图17天祝白牦牛和静宁鸡细胞融合(1000×)；图18天祝白牦牛和静宁鸡融合细胞某一位点放大图(400×)；图19静宁鸡细胞自身融合(400×)；图20静宁鸡复苏后凋亡检测(200×)。
具体实施方式实施例中所用的主要仪器及试剂来源静宁鸡胚来源静宁鸡蛋胚采自甘肃省静宁县。
(一)主要仪器设备1、CO2培养箱Heraeus BB16UV；2、DL-CJ-2N高性能无菌实验台哈尔滨；3、IX-71倒置相差显微镜，CX31生物显微镜，IX-71倒置相差荧光显微镜Olympus；4、TDL-4OB低速离心机CENTERIGUGE；
5、颇尔超纯水器Pall-pruelab_plus；6、电动移液器德国Accu-jet；7、-70℃低温冰箱美国kelvinator；8、激光扫描共聚焦显微镜尼康TE-2000-E；9、液氮贮存器四川东亚YES-50B-125F；10、电泳仪DYY-6C及电泳槽DYC-24A北京六一厂；(二)主要试剂1、MEM(含Earle’s盐、L-谷胺酰氨、非必需氨基酸，不含重碳酸盐)Gibco公司；2、脂质体LipofectinGibco公司；3、载体pEGEP-N3Clontech；4、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆萨(Giemsa)Amresco；5、胎牛血清(Defined FBS)特级胎牛血清(Defined FBS)，Hyclone；6、台盼蓝(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉双丙烯酰胺)98％，过硫酸铵(AmmoniumPersulfate)，PMS，NAD，噻唑蓝(Thiazolyl Blue)Sigma；7、甘油分析纯华绿渊；8、TrisPromega；9、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)NOVON；10、PEGMylab；成纤维细胞培养所用试剂11、MEM培养液超纯三蒸水溶解9.6g的MEM，2.2g的NaHCO3，加水定容至1L，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，500ml/瓶分装，4℃贮存；12、全培养液MEM培养液中加入终浓度为10％(体积比)的FBS，0.22μm滤膜过滤除菌后，500ml/瓶分装，4℃贮存。
13、双抗贮存液100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400ml灭菌去离子水中。
14、1×PBS缓冲液NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO40.10g，加三蒸水定容至500ml，pH为7.2，高压灭菌密封后4℃贮存。
15、0.25％(质量体积比)胰蛋白酶溶液1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，分装，-20℃贮存。
16、0.9％(质量比)生理盐水0.45g NaCl溶于500ml三蒸水，高压灭菌30min。
17、细胞冻存液将50ml DMSO加入450ml全培养液(含体积比15％FBS的全培养液)中，用0.22μm滤膜过滤除菌，以100ml/瓶分装，贮存于-20℃冰箱。
微生物检测所用试剂18、大豆胰蛋白胨3g大豆胰蛋白胨，加100ml三蒸水，调pH至7.3，高压灭菌15～20min，分装到15mm×150mm的玻璃管中。
19、麦芽汁2g麦芽汁加100ml三蒸水，调pH至3～4，高压灭菌15～20min，分装到15mm×150mm的玻璃管中。
20、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。
21、封片液22.2ml 0.1M的柠檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH调节pH至5.5，贮存于4℃。
22、固定液冰醋酸与甲醇以体积比1∶3的比例(现用现配)。
染色体标本制备所用试剂23、秋水仙素贮存液10mg秋水仙素溶于10ml三蒸水中。
24、稀释液三蒸水将贮存液稀释10倍至终浓度为100μg/ml。
25、低渗KCl溶液0.5g的KCl溶于100ml三蒸水。
26、固定液冰醋酸与甲醇按体积比1∶3的比例配制。
27、Giemsa染色液原液将1g Giemsa染粉倒入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止，然后加甘油至33ml，放在56℃保温箱2h后，加入45ml甲醇搅拌均匀，棕色瓶中贮存备用。
工作液磷酸缓冲液将Giemsa原液稀释10倍至终浓度为10ml。
28、磷酸缓冲液的配制KH2PO40.34g加入100ml去离子水(用NaOH调pH 6.8)脂质体转染细胞所用试剂29、质粒DNA(DsRed、pEYFP-N1和pEGFP-N3)，脂质体Lipofectamine，不含血清的MEM培养液，含血清的MEM培养液，pH7.4的PBS。
同工酶分析所用试剂30、0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液分别称取0.9g NaCl和0.0223gEDTA溶于100ml三蒸水中即可。
31、蛋白提取液将5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(质量比)NaCl-0.06mmolEDTA溶液中即得蛋白提取液，将其贮于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。
32、40％(质量体积比)蔗糖溶液将40g蔗糖溶于100ml水中。
33、胶溶液的配制A液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用浓盐酸调至pH8.9B液Acr 40.0g，Bis 2gC液过硫酸铵0.14g(现配现用)D液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用浓盐酸调至pH6.7E液Acr 10.0g，Bis 2.5gF液核黄素4.0mgG液蔗糖40.0g34、聚丙稀酰胺凝胶溶液浓度，见表1表1
35、电极缓冲液的配置6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸馏水，pH调至8.736、电泳指示剂分别秤称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。
37、LDH染色液配制(染色前1h配制)乳酸钙100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml噻唑蓝5mg+三蒸水1.0mlPMS 2.5mg+三蒸水1.0ml辅酶I(NAD)10mg染色前，将以上保温试剂混合后，倒入20ml 2％(体积比)琼脂溶液中，混匀。
38、MDH染色液配制(染色前1h配制)DL-苹果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中噻唑蓝15mg+三蒸水1.5mlPMS 5mg+三蒸水1.0ml辅酶I(NAD)10mg将以上混合后，倒入25ml 2％(体积比)琼脂溶液中。
39、固定液的配制乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。
40、溴酚蓝溶液得配制分别称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。
细胞融合所用试剂41、GKN溶液NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，NaH2PO40.68g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml蒸馏水中。
42、50％(质量体积比)PEG溶液称取50g的PEG(WM＝4000)放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的GKN溶液100ml，混匀，置37℃备用。
43、0.5mol/L CaCl2溶液5.5495g无水CaCl2溶于100ml三蒸水中，终浓度为0.5mol/L。
44、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。
45、伊红染液(试剂盒)细胞凋亡检测所用试剂46、固定液冰醋酸与无水甲醇以体积比1∶3的比例混合，4℃贮存备用(现用现配)。
47、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。
48、封片液的配制将22.2ml 0.1mol/L柠檬酸与27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH调pH至5.5，4℃贮存备用。
实施例1高细胞活率高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系的培养(1)初代培养无菌条件下，将静宁鸡6日龄胚胎破蛋壳大端，用眼科镊小心取出胚胎，置于小培养皿内，除去胚胎的脑、眼、四肢、内脏，放入装有PBS的培养皿中漂洗3～4次，以去除表面血污；将组织剪切成0.5～1.5mm3的组织块；用移样器将组织块分别移入培养瓶中分散均匀，倒置培养瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培养箱中培养3～4h；组织块完全贴壁后加入培养基8ml，培养基成分MEM+10％特级胎牛血清，继续培养10～12h；(2)传代培养弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，以除去残余的血清和脱落的组织块及死细胞，向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶2ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化50s，在倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞间隙增大时，加入全培养液(10％FBS的MEM)8ml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培养箱中继续培养至冻存前24h；(3)细胞冻存A、至冻存前24h弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液8ml，培养液成分MEM+10％特级胎牛血清，继续培养24h；B、向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶2ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化50s，加入全培养液8ml终止反应；C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；
D、收集1000rpm离心8min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；冻存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％MEM；E、将培养物分装入灭菌的冻存管中严密封口，标明日期、品种、细胞名称、培养代数；F、预冻将冻存管装入降温盒中，放于4℃20～30min，然后在-70℃冰箱中预冻10～12h(4h以上)；G、冻存提出冻存管放入液氮柜中，即完成细胞冻存。
(4)细胞复苏将冻存管从液氮中取出，迅速置入42℃水浴中，连续晃动1分种后，见余有小冰团成黄豆粒大h放入超净工作台内；将细胞移入加有培养液(MEM+10％特级胎牛血清)的培养瓶中轻轻吹打均匀，放置含37.5℃5％CO2的CO2培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。
(5)纯化细胞利用胰酶消化进行纯化成纤维细胞。从建成的细胞系形态学观察结果看，在原代培养及早期传代培养时，上皮细胞和成纤维细胞同时出现，混杂生长，混杂生长细胞分区成片。上皮细胞为多边形，形态上与成纤维细胞有很大不同。由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同，在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而且传代后贴壁快，附着快。而另外大部分上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍振动即浮起，需要生长基质如胶原或其它细胞外基质成分等的支持，因此，利用这个差别，经酶消化法和反复贴壁法处理2～3代后，能够完全纯化成纤维细胞。细胞呈典型的梭形，中央有卵圆形核，细胞在生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走行。细胞纯度达到99％以上。
实施例2静宁鸡胚成纤维细胞系生物学特性的检测对实施例1培养的静宁鸡胚成纤维细胞系进行生物学特性检查，方法及结论如下。
一、细胞形态学观察方法细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养液颜色变化情况以及细胞是否发生污染。
结论如图1(静宁鸡原代细胞)、图2(静宁鸡传代前细胞)、图3(静宁鸡继代I细胞)、图4(静宁鸡继代II细胞)所示，当细胞生长状态良好时，其形态为典型的成纤维状，呈现梭形或不规则三角形。对细胞群体的全貌观察，所培养的细胞均呈放射状、火焰状或漩涡状走势，证明细胞生长健康旺盛。
二、微生物检测
1、细菌、真菌检测方法(1)取总冻存细胞安瓿0.5％的冻存细胞，分别溶解于8ml无抗培养基中，混匀后将细胞悬液以2000g离心20min，并重复两次，以消除抗生素的影响。再重悬于2ml无抗生素的培养液中。
(2)将细胞以0.5ml接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
(3)设对照为A.阳性对照枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中培养，置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
B.阴性对照胰蛋白豆胨培养基和麦芽汁培养基，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
结论检测细胞肉眼观察接种有静宁鸡成纤维细胞的大豆胰蛋白胨培养液和麦芽汁培养液，均呈现清亮透明状，将试管置于显微镜下观察，除动物细胞呈圆形的透明状亮点漂浮在培养液中，无其它异物。证明在细胞培养冻存及细胞复苏的整个过程中，细胞未被细菌、真菌污染。
2、病毒检测方法(1)接种待检测细胞培养物，用无抗生素的培养液培养至致密单层。
(2)采集新鲜的肝素抗凝全血(鸡血、豚鼠血)，1000rpm离心10min，弃上清。沉积的红细胞用PBS洗涤3次，用0.9％NaCl溶液悬浮，制成0.5％(V/V)的红细胞悬液。
(3)待检细胞弃除培养液，用0.9％NaCl溶液冲洗单层细胞2～3次。
(4)分别加0.5ml新鲜配制的鸡、豚鼠红细胞悬液于待检细胞瓶中，于4℃放置20min。
(5)观察红细胞凝集和吸附现象，不呈现红细胞吸附的细胞，需重复进行(2)～(4)的操作。
结论
由于有些病毒表面有血凝素，能结合某些物种的红细胞，出现红细胞凝集现象。被这些病毒感染的细胞能够将鸡、豚鼠的红细胞吸附在其表面上。检测结果在无抗生素的条件下常规培养静宁鸡胚成纤维细胞，相差显微镜观察，鸡的红细胞呈椭圆状悬浮在成纤维细胞上方，未出现凝集现象；豚鼠的红细胞呈圆形悬浮在上方，也未出现凝集现象。检测结果为阴性，证明该培养方法培养的细胞在培养过程中没有因为病毒而造成细胞损伤。
3、支原体检测方法(1)标本将成纤维细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml。
(2)培养被检细胞在不含抗生素的培养液中传代培养3次以上(不低于3次)，在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液，继续培养2～3d。
(3)接种阴性对照皿加细胞培养液MEM 2ml；待检皿内加入待检样品2ml，待盖片培养细胞汇合前从瓶中取出(如细胞完全汇合，影响对支原体的观察)。
(4)漂洗将细胞盖片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷风吹干。
(5)固定用固定液浸泡盖玻片，固定细胞10min后，重复步骤(4)。
(6)染色将配制好Hoechst 33258染液滴加到固定好的细胞上，室温下染色30min。
(7)漂洗用PBS浸洗染色后的盖玻片3次，每次3～5min，冷风吹干。
(8)制片将一滴含1％甘油的PBS加到染色后的细胞表面，将有细胞的盖玻片面朝下覆盖在载玻片上。
(9)观察以100×至400×荧光显微镜观察，打开光源10min后，以330～380nm紫色荧光激发，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或丝状点的荧光物产生。
结论Hoechst 33258荧光染料能透过细胞胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA中，使之发出明亮的蓝色荧光。支原体内也含有DNA，亦能着色，在荧光显微电镜下观察可看到蓝色荧光。因此，在阳性对照中，除细胞核部位有蓝色荧光外，在细胞表面及周围也能看到蓝色点状或丝状荧光。而且在细胞表面同时有支原体DNA荧光染色颗粒和丝状小点，如图5所示。检测结果显示如图6所示，体外培养静宁鸡胚成纤维细胞制片后，在倒置荧光显微镜下，用380nm的紫色荧光激发，可以发现整个视野内可见的细胞核表面均为光滑样，细胞核呈圆状或椭圆状，细胞核中的DNA发出蓝色荧光，且细胞周围无丝状或颗粒状小点。
三、细胞生长曲线绘制方法(1)悬液制备取待测生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液，并计数。
(2)接种向培养板的24个孔内分别接种相同数量的细胞，一般为(1～2)×104个细胞/ml，于37℃ CO2培养箱中继续培养。
(3)计数检测从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8组结束。
(4)绘图以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。
结论通过对所培养的静宁鸡体外培养细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1ml细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7天定时记数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线如图7所示，接种后从第2天细胞数开始增加，第3天进入对数生长期，第6天细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，细胞接种后均有24h的潜伏期，此期为细胞的适应阶段，是细胞由于接种时胰酶消化而致的损伤后的修复时期，此后细胞呈指数增殖，即指数生长期，最后进入停滞期，细胞生长缓慢，几乎停止，可见有细胞漂浮。而细胞分裂指数(MI)最高值(培养第2天)在进入对数生长期前出现，并在培养第2～4天时维持于一个较高的水平，随后下降到初始水平。本发明方法培养的静宁鸡胚成纤维细胞系的纯度为99％以上，与现有技术培养细胞平均纯度85％～90％比具有显著提高；且群体倍增时间为24h，与现有技术胶原酶消化技术和现有贴壁培养法获得的细胞群体倍增时间(PDT)35.9h和48h相比具有显著的提高，证明细胞纯度高、生命力旺盛。
四、细胞活率测定方法检测冻存细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μl细胞悬液加人10μl 1％台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者均为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。数二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。
结论细胞冻存前后对静宁鸡胚细胞进行细胞活率测定。结果表明冻存前细胞活率在95.8％～98.7％之间，冻存后细胞活率降到93.2％～96.7％之间，与现有技术培养细胞活率80％～85％左右相比有显著的提高。且复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定。
五、核型的制备方法1、加秋水仙素取对数生长期的细胞培养物，加秋水仙素到培养液内，终浓度为0.1～0.4μg/ml。
2、在37℃培养箱中继续培养1～4h，使大部分细胞处于分裂中期。
3、采集分裂相细胞加0.25％胰蛋白酶溶液用常规方法消化，然后加全培养液，终止胰蛋白酶溶液对细胞的作用。转入15ml离心管，以1000rpm离心8min，收集细胞。
4、低渗吸除上清液，加入预热至37℃、0.075M(或0.4％)KCl溶液2ml，打匀，继续加至10ml，37℃温箱中温育15min。
5、预固定悬液中加入新鲜固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，打匀(打匀时要轻轻吹打防止细胞破裂)。
6、固定将悬液以1000rpm离心8min，去掉上清夜，加入新鲜固定液5ml，打匀，室温静置20min。
7、重固定重复2次，离心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混匀。
8、滴片将载玻片成45°倾斜，甩掉冰水后用吸管迅速滴上2～3滴细胞悬液，立即用嘴在片子上吹气使细胞分散均匀，将载玻片掠过酒精灯几次，以助染色体分散和展开，室温下干燥。
9、染色用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，空气干燥。
10、镜检先用低倍物镜找出分散好的分裂相视野，再换高倍物镜和油镜观察，应看到很多中期分裂相细胞和铺展的染色体，细胞质被染成蓝色，细胞核被染成淡紫色。
11、染色体照片及数据处理选择染色体形态及分散良好的分裂相进行显微照相，每个品种统计100个分裂相以确定染色体数目，按Denver(1960)会议和Leven标准(1964)测量并计算染色体的三个参数即相对长度、臂比值和着丝点指数，并确定染色体着丝点类型。三个参数的计算公式如下
12、如标本需要保存或作长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶盖玻片封片，(或先迅速过丙酮两次，每次30s，再过二甲苯，然后封片亦可)。
结论细胞系质量的国际标准是二倍体细胞的出现率达到85％以上，在本试验中，对100个静宁鸡胚成纤维细胞的染色体数目计数，只对其是否为整二倍体进行计算，分别以第1～3代的细胞为研究对象。统计结果为细胞染色体中二倍体占主体，为95％以上，说明所建静宁鸡胚成纤维细胞系达到优质细胞的标准，细胞遗传性能稳定，该细胞系为稳定二倍体细胞系。
具体数据见表2，M代表中部着丝点染色体，SM代表亚中部着丝点染色体，ST代表亚端部着丝点染色体，T代表端部着丝点染色体。
静宁鸡二倍体染色体数目为2n＝78±，包括9对大染色体和30对微小染色体，性染色体为Z、W，雄性为同配ZZ，雌性为异配ZW。如图8所示，根据染色体大小顺序每对特征如下
1号亚中央着丝粒染色体，为最大的一对；2号亚中央着丝粒染色体，在大小上仅次于第一号；3号亚中央着丝粒染色体；4号端着丝粒染色体，大小同第三号染色体差不多；5号中央着丝粒Z染色体，另一条为亚中央着丝粒W染色体；6号亚中着丝粒染色体；7号亚中着丝粒染色体；8号端着丝粒染色体；9号端着丝粒染色体；10～39号近端或端着丝粒染色体；表2 静宁鸡染色体参数(♀)
六、同工酶分离方法采用不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
1、收集细胞用PBS重新悬浮，记数；2、清洗用PBS洗细胞3次，离心弃去上清夜；3、用蛋白提取液重新悬浮细胞，密度达5×107个/ml，轻轻吹打均匀；4、将细胞悬液移到1.5ml离心管中，4℃下以8.733g离心2min收取上悬液，分装后将上悬液置-70℃贮存备用；5、上悬液加入等量40％蔗糖溶液，混匀即为样品液；
6、用微量加液器向每个样品槽加样20～50μl，再用稀释10倍的电极缓冲液把每个样品槽补充满，然后向上下槽缓缓加入电极缓冲液。在上槽中加入1～2滴溴酚蓝，放入4℃冰箱；7、接通电源，上槽为负极，下槽为正极，调节电压为120V维持1h，再调至220V，待溴酚蓝迁移至下端0.5～1cm处停止电泳，约5h；8、电泳完毕，分别收集上下槽缓冲液用10ml注射器吸满水，装上10cm长的细穿刺针头，沿玻璃内侧插入，边注水边前进，借助水的润滑作用和针头的刮切作用，使胶与玻璃板分离，然后轻轻拿起上层玻璃板，切去浓缩胶，再用蒸馏水漂洗两次后，浸入染色液中置37℃温箱中保温染色30～60min，胶条染色后用凝胶固定液固定后照相；9、用相对迁移率(Rf)表示，即区带泳动距离(d)与指示染料泳动距离(D)之比，计算公式为Rf＝d/D×100％。区带泳动距离一律按区带后缘的距离测量。
结论如图9所示，静宁鸡胚成纤维细胞的乳酸脱氢同工酶酶谱从“阳极”到“阴极”分别为LDH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5，酶活性强弱依次为LDH5＞LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH1，而且LDH1活性很弱。与白耳鸡的乳酸脱氢同工酶进行对比，结果显示两个鸡种的各自具有特征谱系，且相对迁移率完全不同，见表3。
表3 LDH同工酶的相对迁移率
如图10所示，静宁鸡的苹果酸脱氢酶谱各呈现2条区带，即sMDH(细胞质型)区带组和mMDH(线粒体型)区带组，且后者比前者泳动速度慢。两个带组的相对迁移率见表4。
表4 苹果酸脱氢酶的相对迁移率
同一种酶在不同的物种中、同一物种不同组织中表现不同的谱带。上述两种同工酶电泳结果表明所培养的体细胞遗传性能稳定，纯度高，细胞之间未发生交叉污染。
七、外源基因在培养细胞中的表达方法1、荧光蛋白报告质粒(pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1)的制备及鉴定按照Plasmid Midi Kit质粒提取盒说明书，提取、纯化pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1荧光蛋白基因质粒。将所得质粒溶于TE(PH8.0)低盐溶解液中，用紫外分光光度计测定其质粒浓度(质粒浓度[μg/ml]＝0D260×50μg/ml×稀释倍数)，得到的pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1荧光蛋白质粒浓度为0.31μg/ml质粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之间，实验结果表明所提取质粒较纯，无RNA、无水乙醇和蛋白质等杂质。再用Nhe I和Xba I双酶切后，用1％琼脂糖电泳鉴定酶切结果，可以得到约750bp和4kb两条谱带。根据荧光蛋白质粒酶切图谱分析所获质粒确为所需pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1荧光蛋白质粒。
2、脂质体介导法转染成纤维细胞(1)、于转染前一天，用胰蛋白酶溶液消化细胞培养物，将细胞接种到6孔(或35mm)的培养板内，每孔(1～2)×105细胞，加2ml含血清培养液；(2)、置37℃的CO2培养箱中培养细胞达到70％～80％的汇合程度；(3)、转染前，在倒置显微镜下观察，挑取生长旺盛、形态好的细胞用于转染；(4)、将待转染的细胞不含血清的培养液漂洗细胞两次；(5)、合并溶液A和B，轻轻混合后于室温下静置45min，然后加入0.8ml不含血清的培养液；(6)、将DNA、脂质体和不含血清的培养液的混合物滴加在培养版中待转染的细胞表面，于CO2培养箱中继续培养5～24h；(7)、倒掉转染夜，加入含血清的培养液，于培养箱中继续培养细胞；(8)、在相应颜色荧光激发下观察三种荧光蛋白的表达结果，计算转染效率。
结论如图11、12所示，静宁鸡胚成纤维细胞的转染峰出现在转染24h后，绿色荧光蛋白的荧光强度达在转然后48h最强，转染率为55.5％；红色荧光蛋白pDsRed1-N1在转染后48h转染率达到60.2％，如图13所示；黄色荧光蛋白pEYFP-N1在转染后48h转染率也分别达到了60.2％，如图14所示；转染48h后阳性细胞和荧光强度均逐渐减少、减弱。
将外源基因转入细胞的方法很多，主要有脂质体包裹、多聚赖氨酸介导、受体介高压电击、基因枪及显微注射等。脂质介导转染是目前最为有效的转染方法，脂质介导转染所用的DNA量与磷酸钙法相比大为减少，而转染效率却比磷酸钙法高出5～100倍。通过脂质体介导质粒DNA对静宁鸡的成纤维细胞进行抽样转染，通过观测荧光蛋白基因的表达效果来反向证实所培养细胞的遗传性能，结果显示绿色荧光蛋白pEGFP-N3的转染率为55.5％；黄色荧光蛋白pEYFP-N1的转染率也分别达到了60.2％，如图14所示；红色荧光蛋白pDsRed1-N1的转染率达到60.2％，远远高于普通培养细胞的15％～30％的转染率。这些结果说明了所培养的静宁鸡成纤维细胞能够很好地表达外源基因，进一步证明了所培养细胞系的高表达率的特性。
八、细胞凋亡方法1、将细胞以4.0×105个/ml密度接种于12孔培养板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁。
2、DAPI染色倒掉细胞的培养基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液冲洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆盖细胞，37℃温育15min，再倒掉染色液，用甲醇冲洗一次。
3.激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。
结论细胞凋亡是完成新旧细胞的生死交替的自然过程，若其规律失常则个体即不能正常发育，或发生畸形，或不能存活。
细胞凋亡时，核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周围，胞膜内陷将细胞自行分割为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体。其原因是由于真核细胞染色质是由许多核小体以一定的方式包装而成，核小体是由核心颗粒和连接区两部分组成，前者是由组蛋白八聚体与140bp的DNA片段组成，后者是合成RNA引物的起始点，由组蛋白H1与60bp左右的DNA片段组成，H1磷酸化与细胞分裂关系密切，易受核酸内切酶攻击。每个核小体DNA全长为150～241bp。细胞凋亡时，激活了核酸内切酶，切割连接区DNA，从而产生长度为180～200bp左右的寡核苷酸碎片，形成凋亡小体。
因此常用DNA的特异性荧光染料DAPI，以非嵌入式与DNA的A-T碱基区结合，从而对细胞核染色。染色后，激光扫描共聚焦显微镜下活细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色颗粒块状荧光，图20为静宁鸡复苏时凋亡细胞。
共聚焦显微镜下，观察统计100～200个细胞，计算凋亡率凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数×100％计算得出所培养的静宁鸡胚成纤维细胞系凋亡率低于5％。
实施例3利用静宁鸡配成纤维细胞进行细胞融合实验1、细胞染色(1)静宁鸡伊红染色95％(体积比)乙醇5s，伊红染色液染色30s～120s(可以根据染色结果和要求调整时间)。70％(体积比)乙醇洗涤2次后即可直接观察。
(2)天祝白牦牛DAPI染色倒掉细胞的培养基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液冲洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆盖细胞，37℃温育15min，再倒掉染色液，用甲醇冲洗一次。
2、混合细胞取4ml复苏后培养的106～107个/ml细胞悬液注入10ml具塞尖底离心管中，取出0.4ml的悬液，用生理盐水稀释5倍，作为对照组。
3、细胞融合(1)将上述剩余的细胞悬液以1500r/min的转速离心5min，去掉大部分上清液，留下0.2ml液体将沉降的细胞分散于其中，制成细胞悬液；(2)轻轻摇动试管，并逐滴加入37℃下预热的50％(质量体积比)PEG溶液0.4ml；(3)将此悬液置于37℃水浴中，温育90s；(4)缓慢地加入无血清培养液5ml，以中止PEG的作用；(5)盖塞，并慢慢的倾转离心管4～5次；(6)以1500r/min离心5min。去除大部分上清液，留下约0.1ml液体悬浮细胞；(7)在悬浮液中加入5ml的全培养液，混匀后，取出0.4ml悬液滴片作观察用。
4、细胞培养将细胞作4倍稀释，混匀，以每孔0.5ml分装于24孔培养板或每孔0.1ml分装于96孔培养板，置于37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养。
5、用激光扫描共聚焦显微镜观察从形态上识别两种亲本细胞并观察其中有无融合细胞，同时通过激光扫描共聚焦显微镜观察同一细胞核质颜色不同的即为融合细胞，如图15。
6、细胞融合率观察统计100～200个细胞(包括已融合的与未融合的)，计算融合率融合率＝融合细胞数/总细胞数×100％
结论PEG融合法虽没有品种种属科间的特异性或专一性，动植物间的限制也被打破，但其融合率低。最佳条件下，不同科属原生质体间的融合率仅为30％，此外PEG法对细胞毒性大。因此，PEG诱导细胞融合通常选相对分子质量在1000～6000，浓度在体积比30％～50％(质量体积比)的PEG，并且严格控制促融作用时间，减少对细胞的毒性。
天祝白牦牛细胞核和静宁鸡细胞质分别用DAPI和伊红染色后，再用相对分子质量为4000、浓度为50％(质量体积比)的PEG促融90s，从而使核与质分别染成蓝、红色的细胞融合。异源细胞或原生质体在促融剂作用下，呈致密状态细胞的细胞膜性质发生变化，细胞间发生凝集现象，一部分凝集细胞间的膜发生粘连，融合成多核细胞，随后多核细胞又进行核的融合而成为单核杂种细胞。
图15为543nm波长激发光下被伊红染色的呈现红色的静宁鸡细胞质，图16为408nm波长激发光激发下被荧光染料DAPI染色的呈蓝色的天祝白牦牛细胞核。由于一种细胞核染为蓝色，另一种细胞质染为红色，所以同一细胞中含有蓝色核和红色质的即为融合的细胞，如图17所示的同一视野下细胞在两种激发光作用下的合成图，图18为天祝白牦牛和静宁鸡融合细胞某一位点放大图，图19为静宁鸡细胞自身融合(400×)。
通过计算得出天祝白牦牛和静宁鸡的细胞融合率为97.2％，静宁鸡自身细胞融合率为92.4％。融合率较高，这是因为与融合前对细胞进行的染色处理、醇类脱脂脱水的固定，从而改变了细胞膜结构，提高了融合率；同时也能看出，同种间和不同种间的细胞融合率基本相同。
以上结果说明了所培养的静宁鸡胚成纤维细胞系可以用于细胞融合等更广范围的细胞学实验，为其他生物学、医学领域提供高质量的细胞系。
权利要求
1.一种静宁鸡胚成纤维细胞系，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.1878。
2.一种静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，该方法包括下述步骤(1)初代培养将除去脑、眼、四肢、内脏的静宁鸡胚胎用PBS漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的组织块；将组织块移入培养瓶，倒置培养瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培养箱中培养3～4h；组织块完全贴壁后加入培养基6～10ml，培养基成分MEM+10％胎牛血清，继续培养10～12h；(2)传代培养弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入全培养液(10％FBS的MEM)6～10ml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培养箱中继续培养至冻存前24h；(3)细胞冻存A、冻存前24h弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，培养液成分MEM+10％胎牛血清，继续培养24h；B、用胰蛋白酶消化培养细胞，然后加入全培养液6～10ml终止反应；C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；D、收集1000rpm离心6～10min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管吹打使细胞重悬；冻存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％MEM；E、将培养物分装入灭菌的冻存管中封口；F、预冻将冻存管装入降温盒中，放于4℃ 20～30min，然后置于-70℃预冻4h以上；G、冻存提出冻存管放入液氮柜中，即完成细胞冻存。
3.根据权利要求
2所述的一种静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的静宁鸡胚胎为6日龄。
4.根据权利要求
2所述的一种静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，步骤(2)及步骤(3)中所述的胰酶消化具体步骤是向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30s～60s。
5.根据权利要求
2所述的一种静宁鸡胚成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，将步骤(3)冻存的细胞进行细胞复苏，具体步骤为将冻存管从液氮中取出置入42℃水浴中，连续晃动1分种后，将细胞移入加有培养液(MEM+10％胎牛血清)的培养瓶中吹打均匀，放置含37.5℃5％CO2的CO2培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。
专利摘要
本发明公开了一种高活率、高纯度静宁鸡胚成纤维细胞系，其保藏编号为CGMCC No.1878属于细胞生物学领域。本发明培养出的成纤维细胞无上皮细胞等，细胞纯度高；冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到并维持在93.2％～96.7％之间，传代生长稳定，适合大规模培养。本发明涉及的静宁鸡胚成纤维细胞系可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量高品质材料；并可以作为禽体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上可以改良地方禽品种及可以作为地方优良禽品种保种的手段；还可以作为是疫苗生产的主要原材料及肝细胞培养的饲养层；同时可用于细胞凋亡及细胞融合研究之用。
文档编号C12N5/06GK1995333SQ200610164983
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月11日
发明者关伟军, 马月辉, 刘长青, 包阿东, 王有柱, 刘学东 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan