专利名称:一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法。
背景技术：
在转基因中，农杆菌介导的外源基因转化依赖于T-DNA的转移及整合，这一过程的前提是农杆菌必须依附于植物材料，并有足够的时间从外植体的伤口浸入并感染植物。因而，外植体和农杆菌共培养的时间对外源基因的转化至关重要。延长共培养时间有助于更多T-DNA发生转移，但共培养时间延长，转化率虽然增加，而农杆菌会由于过盛生长，造成外植体严重污染而褐化死亡。因而，如何优化共培养时间，使对转化效率有重要影响的共培养时间与外植体受农杆菌污染褐化死亡的矛盾得到一定程度的平衡和解决，成了提高转化效率的关键。
发明内容本发明涉及一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它可以大幅度地提高外源基因在蝴蝶兰上的转化率。
本发明的采用了以下技术方案一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它采用如下步骤步骤一，以叶片为受体材料，建立蝴蝶兰外源基因转化的受体系统；步骤二，进行抗生素敏感性试验，获得本底指标；步骤三，取蝴蝶兰的脱毒无菌苗生理状态良好的叶片，剪去叶片边缘，再将叶片剪成四周都有创口，以利于携有外源目的基因的农杆菌侵染和附着，叶片经处理后，植入诱导培养基，叶片在近轴面朝下进行预培养；步骤四，制作农杆菌感受态细胞，转化农杆菌，从转化的农杆菌中，随机挑选单菌落，进行农杆菌培养；步骤五，将农杆菌液置平衡，然后从培养瓶中取出预培养好的叶片，浸入菌液中浸染，取出放入培养皿中并吸出多余的菌液后，将浸染后的叶片，放在预培养基上，将细菌和外植体置于暗培养室中培养，在诱导培养基上添加抗生素，抑制农杆菌的快速生长，将上述共培养的叶片在此诱导培养基上培养；步骤六，将上述共培养的叶片用含头孢霉素的液体培养基冲洗干净后，转移到含抗生素的筛选培养基中，在暗培养室中继续培养，在筛选过程中一直加入抗生素，当肉眼不可见农杆菌出现时，除去头孢霉素，当叶片边缘肉眼可见淡黄色颗粒型胚性愈伤组织时，可将淡黄色颗粒型胚性愈伤组织小心切下，转移到相同培养基上在光培养下进行增殖；步骤七，当颗粒型胚性愈伤组织增殖后，转到分化培养基上，诱导幼芽分化，当幼芽长到一定程度时，转入生根状苗培养基中培养。待根系长成后，一部分出瓶练苗，并移栽到水苔中，于温室中培养，一部份直接用于分子检测。
步骤二中的抗生素为头孢霉素。步骤三中所述的蝴蝶兰脱毒无菌苗生理状态良好叶片的培养时间为三周。将步骤五农杆菌液置时的温度为20℃，平衡时间为3-5分钟。步骤五中所述的细菌和外植体放到暗培养室中培养的温度为25℃，时间为5天。步骤五中所述的抗生素为头孢霉素，浓度为20mg/l。步骤五中共培养的叶片在诱导培养基上培养的时间为2-3周。步骤六中所述的液体培养基为无蔗糖液体培养基，其内含头孢霉素500mg/L。步骤六中叶片在暗培养室中继续培养需要每三个星期转移一次。
采用如上技术方案，它可以通过在适当共培养时间内的将外源基因的转化效率提高5倍左右，同时又解决了外植体受农杆菌污染褐化死亡的问题。
具体实施方式本发明为一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它采用如下步骤步骤一，以叶片为受体材料，建立蝴蝶兰外源基因转化的受体系统；步骤二，进行抗生素敏感性试验，抗生素为头孢霉素，获得本底指标；步骤三，取蝴蝶兰培养三周的脱毒无菌苗生理状态良好的叶片，剪去叶片边缘，再将叶片剪成四周都有创口，以利于携有外源目的基因的农杆菌侵染和附着，叶片经处理后，植入诱导培养基，叶片近轴面朝下进行预培养；步骤四，制作农杆菌感受态细胞，转化农杆菌，从转化的农杆菌中，随机挑选单菌落，进行农杆菌培养；步骤五，在超净的工作台上，将农杆菌在20℃的条件下液置平衡3-5分钟，然后从培养瓶中取出预培养好的叶片，浸入菌液中浸染，取出放入培养皿中并吸出多余的菌液后，将浸染后的叶片，放在预培养基上，然后细菌和外植体置于培养的温度为25℃暗培养室中培养5天，在诱导培养基上添加浓度为20mg/l为头孢霉素，抑制农杆菌的快速生长，将上述共培养的叶片在此诱导培养基上培养2-3周；步骤六，将上述共培养的叶片用含500mg/L头孢霉素的液体培养基冲洗干净后，转移到含抗生素的筛选培养基中，在暗培养室中继续培养需要每三个星期转移一次，在筛选过程中一直加入抗生素，当肉眼不可见农杆菌出现时，除去头孢霉素。当叶片边缘肉眼可见淡黄色颗粒型胚性愈伤组织时，可将淡黄色颗粒型胚性愈伤组织小心切下，转移到相同培养基上在光培养下进行增殖；步骤七，当颗粒型胚性愈伤组织增殖后，转到分化培养基上，诱导幼芽分化，当幼芽长到一定程度时，转入生根状苗培养基中培养。待根系长成后，一部分出瓶练苗，并移栽到水苔中，于温室中培养，一部份直接用于分子检测。
权利要求
1.一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它采用如下步骤步骤一，以叶片为受体材料，建立蝴蝶兰外源基因转化的受体系统；步骤二，进行抗生素敏感性试验，获得本底指标；步骤三，取蝴蝶兰的脱毒无菌苗生理状态良好的叶片，剪去叶片边缘，再将叶片剪成四周都有创口，以利于携有外源目的基因的农杆菌侵染和附着，叶片经处理后，植入诱导培养基，叶片在近轴面朝下进行预培养；步骤四，制作农杆菌感受态细胞，转化农杆菌，从转化的农杆菌中，随机挑选单菌落，进行农杆菌培养；步骤五，将农杆菌液置平衡，然后从培养瓶中取出预培养好的叶片，浸入菌液中浸染，取出放入培养皿中并吸出多余的菌液后，将浸染后的叶片，放在预培养基上，将细菌和外植体置于暗培养室中培养，在诱导培养基上添加抗生素，抑制农杆菌的快速生长，将上述共培养的叶片在此诱导培养基上培养；步骤六，将上述共培养的叶片用含头孢霉素的液体培养基冲洗干净后，转移到含抗生素的筛选培养基中，在暗培养室中继续培养，在筛选过程中一直加入抗生素，当肉眼不可见农杆菌出现时，除去头孢霉素，当叶片边缘肉眼可见淡黄色颗粒型胚性愈伤组织时，可将淡黄色颗粒型胚性愈伤组织小心切下，转移到相同培养基上在光培养下进行增殖；步骤七，当颗粒型胚性愈伤组织增殖后，转到分化培养基上，诱导幼芽分化，当幼芽长到一定程度时，转入生根状苗培养基中培养。待根系长成后，一部分出瓶练苗，并移栽到水苔中，于温室中培养，一部份直接用于分子检测。
2.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是步骤二中的抗生素为头孢霉素。
3.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是步骤三中所述的蝴蝶兰脱毒无菌苗生理状态良好叶片的培养时间为三周。
4.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是将步骤五农杆菌液置时的温度为20℃，平衡时间为3-5分钟。
5.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是步骤五中所述的细菌和外植体放到暗培养室中培养的温度为25℃，时间为5天。
6.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是步骤五中所述的抗生素为头孢霉素，浓度为20mg/l。
7.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是步骤五中共培养的叶片在诱导培养基上培养的时间为2-3周。
8.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征是步骤六中所述的液体培养基为无蔗糖液体培养基，其内含头孢霉素500mg/L。
9.根据权利要求
1所述的一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，其特征步骤六中叶片在暗培养室中继续培养需要每三个星期转移一次。
专利摘要
本发明公开了一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它采用如下步骤1)以叶片为受体材料，建立蝴蝶兰外源基因转化的受体系统；2)进行抗生素敏感性试验，获得本底指标；3)转化农杆菌，培养农杆菌菌株；4)对蝴蝶兰受体材料进行预培养后，将外植体和农杆菌在无任何抗生素的诱导培养基上共培养5天；5)在诱导培养基上添加较低浓度的抗生素，抑制农杆菌的快速生长，将上述共培养的叶片，在此诱导培养基上共培养2－3星期；6)转化体的筛选和增殖；7)转化株的再生和分子检测。
文档编号C12N15/87GK1995360SQ200610161525
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月27日
发明者李 杰 申请人:李 杰导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan