专利名称：一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株h11株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物疫苗领域，具体涉及一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hll株及其应用。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(Infeetious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infeetious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种高度接触性传染病,是目前危害世界养禽业的主要传染病之一，主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊器官，该病的危害不仅直接造成鸡只死亡、增加淘汰率、影响增重，更重要的是破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致免疫抑制，使病鸡更易感其它疫病，对疫苗接种的免疫应答下降或丧失。由于IBD在外界环境中较为稳定，采取消毒和隔离措施来控制本病不易达到目的。本病至今仍无有效的治疗方法，预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种。目前，市售的法氏囊疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品批间质量相差较大、且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点。2011年初，哈药集团生物疫苗有限公司分离了一株法氏囊病毒，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性，基于此，本研究针对组织苗的不足，驯化出了一株细胞适应毒，命名为Hll株，故此，提出对该病毒株进行专利保护。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株，命名为Hll株，分类命名为传染性法氏囊病毒，保藏编号为CGMCC N0.6910，保藏日期为2012年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院。本发明分离的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hll株通过以下方法制备得到:1、病毒的分离:病料来自黑龙江省阿城市郊某养殖场，采集濒死法氏囊，无菌条件下剪碎，氯仿处理，离心，取上清接种鸡胚，收集48h 120h鸡胚和尿囊膜。用组织捣碎机研磨后，至_20°C保存备用。2、病毒分离株的初步鉴定组织液的红细胞凝集试验呈阴性；与抗鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清进行琼脂双向扩散试验，结果为阳性。3、在鸡胚原代成纤维细胞(CEF)上的传代与收获
(I)将收获的组织毒，用灭菌生理盐水稀释后，接种长成单层的CEF上，37°C培养5天，放入_20°C中冻融3次，收获病毒液。
(2)重复上述试验10次，直至病毒在CEF增殖良好，即得Hll株。本发明还提供了所述的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hll株在制备预防鸡传染性法氏囊病的活疫苗中的应用。将本发明获得的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hl I株利用CEF细胞生产IBDV Hll活疫苗，其具体方法如下:1、生产用毒种制备(I)毒种繁殖将毒种Hll株(保藏编号为CGMCC N0.6910)用灭菌生理盐水作IO3 IO4倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞(CEF)。弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37°C吸附I小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液。37°C，5%C02条件下，培养3 4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。于_20°C冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，-20°C保存。注明收获日期、毒种代次及装量。(2)毒种鉴定应符合生产用种子标准。(3)毒种保存在_20°C以下保存，应不超过9个月。(4)毒种继代应不超过3代。
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2、制苗材料制备(I)细胞的制备取9 10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37°C培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用。(2)传代培养传代次数不超过5代。3、IBDV Hll株细胞病毒液的制备( I)接种弃掉细胞培养液，取生产用种毒Hll株，用灭菌生理盐水作适当稀释(IO3 IO4倍)，按培养液体积的1/10接种单层鸡胚成纤维细胞。37°C吸附I小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37°C培养。(2)培养病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培养3 4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。(3)病毒液收获将装有病毒液的培养瓶，放入_20°C冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15°C以下保存，应不超过I个月。4、半成品检验(I)无菌检验每组病毒液分别取样，应无菌生长。
(2)病毒含量测定每0.2ml病毒含量应为IO5 5EID5tl，方可配苗。5、配苗及分装(1)冻干保护剂的制备A液:明胶5%、蔗糖5%、糊精5%、胰蛋白胨2%，去离子水配制，116°C，高压灭菌30min, 15°C保存,不超过7天。B液:Vc0.1%、山梨醇2%、谷氨酸钠1.5%，去离子水配制，0.22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存，不超过3天。(2)分装将保护剂A液、B液按1:1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1:1加入保护剂中，定量分装。6、冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。进一步的，本发明还提出了一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中，其有效成分包含本发明所述的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株(Hll株)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。材料和试剂:毒株:传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hll株，保藏编号为CGMCCN0.6910，保藏日期为2012年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院。材料:9 10日龄SPF鸡胚、10 12日龄SPF鸡胚为哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场种蛋在本研发中心孵化、鸡胚原代成纤维细胞购自中国兽药监察所、0.22 μ m滤膜购自PALL公司。试剂:抗鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所、还原型谷胱甘肽购自Sigma、胰酶购自Gibco、明胶购自Sigma、鹿糖购自国药化学试剂有限公司、糊精购自上海酶联生化试剂有限公司、胰蛋白胨购自Amresco、维生素C购自SIGMA、山梨醇购自Amresco、谷氛酸纳购自MBCHEM。实施例1传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hll株的分离1、病毒的分离:病料来自黑龙江省阿城市郊某养殖场，采集濒死法氏囊，无菌条件下剪碎，氯仿处理，离心，取上清接种鸡胚，收集48h 120h鸡胚和尿囊膜。用组织捣碎机研磨后，至_20°C保存备用。2、病毒分离株的初步鉴定组织液的红细胞凝集试验呈阴性；与兔抗法氏囊病毒多克隆抗体进行琼脂双向扩散试验，结果为阳性。3、在鸡胚原代成纤维细胞(CEF)上的传代与收获(I)将收获的组织毒，用灭菌生理盐水稀释后，接种长成单层的CEF上，37°C培养5天，放入_20°C中冻融3次，收获病毒液。(2)重复上述试验10次，直至病毒在CEF增殖良好，即得Hll株。本发明获得的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株Hll株，保藏编号为CGMCC N0.6910，保藏日期为2012年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院。实施例2利用传代鸡胚成纤维细胞生产IBDV Hll活疫苗1、生产用毒种制备(I)毒种繁殖将毒种Hll株(保藏编号为CGMCC N0.6910)用灭菌生理盐水作IO3 IO4倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞(CEF)。弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37°C吸附I小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液。37°C，5%C02条件，培养3 4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。于_20°C冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，_20°C保存。注明收获日期、毒种代次及装量。(2)毒种鉴定应符合生产用种 子标准。(3)毒种保存在_20°C以下保存，应不超过9个月。(4)毒种继代应不超过3代。2、制苗材料制备(I)细胞的制备取9 10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37°C培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用。(2)传代培养传代次数不超过5代。3、IBDV Hll株细胞病毒液的制备( I)接种弃掉细胞培养液，取生产用种毒Hll株，用灭菌生理盐水作IO3 IO4倍适当稀释，按培养液体积的1/10接种传代后的单层鸡胚成纤维细胞，37°C吸附I小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37°C培养。(2)培养病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培养3 4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。(3)病毒液收获将装有病毒液的培养瓶，放入_20°C冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15°C以下保存，应不超过I个月。4、半成品检验(I)无菌检验每组病毒液分别取样，应无菌生长。(2)病毒含量测定每0.2ml病毒含量应为105_5EID5tl，方可配苗。5、配苗及分装( I)冻干保护剂的制备A液:明胶5%、蔗糖5%、糊精5%、胰蛋白胨2%，去离子水配制，116°C，高压灭菌30min, 15°C保存,不超过7天。B液:Vc0.1%、山梨醇2%、谷氨酸钠1.5%，去离子水配制，0.22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存，不超过3天。(2)分装将保护剂A液、B液按1:1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1:1加入保护剂中，定量分装。6冻干:分装后迅速进行冷冻真空干燥。试验例I利用鸡胚生产IBDV Hll株活疫苗
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1、生产用毒种制备(I)毒种繁殖将毒种Hll株用灭菌生理盐水作100 1000倍稀释后，经绒毛尿囊膜途径接种10 12日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml。置37°C孵育，选接种48 120小时死亡鸡胚，收取病变胎儿及尿囊膜，装于无菌容器内，同时吸取部分鸡胚液作无菌检验。将培养无菌的鸡胚、尿囊膜剪碎混合，用普通肉汤或同批尿囊液制成5倍稀释的乳剂，离心去渣，上清液加适量的抗生素分装，_20°C保存。注明收获日期、毒种代次及装量。(2)毒种鉴定应符合生产用种子标准。(3)毒种保存在-10°C以下保存，应不超过6个月。(4)毒种继代应不超过3代。2、制苗材料选择选择发育良好，10 12日龄SPF鸡胚作为制苗材料。3、制苗毒液的制备(I)接种取生产用毒种Hll株，用灭菌生理盐水稀释50 100倍，每胚经尿囊腔或绒毛尿囊膜途径接种0.1 0.2ml，封口后，置37°C继续孵育，不必翻蛋。(2)孵育和观察接种后，将36小时前死亡的鸡胚弃去。36小时后，每隔4 8小时照蛋一次，随时取出48 168小时死亡鸡胚，置2 8°C冷却。(3)收获
将冷却4 24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部，以无菌手术除去蛋壳，收获胎儿和尿囊膜，分组置于无菌容器内，置-10°c以下冷冻保存。在收获的同时，应逐个检查胎儿病变，须具有传染性法氏囊病病毒Hll株所引起的特异性病变。4、半成品检验(1)无菌检验每组鸡胚分别取样，应无菌生长。(2)病毒含量测定每0.2ml病毒含量应为105_ 5EID50,方可配苗。5、配苗及分装将检验合格的鸡胚、鸡胚尿囊膜磨碎，按适当比例加入5%蔗糖脱脂奶制成乳剂，同时加入适量的抗生素充分混匀，定量分装。6、冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。
试验例2实施例2通过细胞培养制备的10批次IBDV Hll株活疫苗(细胞苗(毒))与试验例I通过组织培养制备的10批次IBDV Hll株活疫苗(组织苗(毒))相比较，现将其中一些指标的比较结果总结如下:表I两种种毒鸡胚毒力的比较
权利要求
1.一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株，其特征在于所述的适应株命名为Hll株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.6910。
2.权利要求1所述的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株在制备预防鸡传染性法氏囊病的活疫苗中的应用。
3.一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中，其有效成分包含权利要求1所述的传染`性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株。
全文摘要
本发明涉及一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用。本发明的一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株，其保藏编号为CGMCC NO.6910，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。此外，本发明还提供了分离该H11株的方法，及该毒株在制备预防鸡传染性法氏囊病的活疫苗中的应用。本发明的提出克服了鸡胚组织苗成本高、产品批间质量相差较大、且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N7/00GK103146653SQ201310061700
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者丁国杰, 张杨, 郑德富, 刘洪斌, 焦利红, 李东伟, 杨鹏欣, 孙心, 王全杰, 孙德君 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司