专利名称：噬氨副球菌lh-n40与异养硝化好氧反硝化微生物菌剂及制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于环境微生物领域，具体涉及微生物菌种，以及由该微生物菌种组成的异养硝化好氧反硝化脱氮的微生物菌剂，以及该菌剂的制备方法与用途。
背景技术：
传统的废水生物脱氮技术主要是靠自养硝化菌和异养反硝化菌通过硝化和反硝化偶联使氨氮转变为氮气脱除。而自养细菌自身的增殖速度慢、在混合培养的活性污泥系统中无法与异养细菌竞争、难以获得较高的生物量、硝化效率低，导致自养微生物脱氮系统抗冲击能力弱、硝化作用不完全；反硝化菌为异养菌，运行中往往需要补加碳源，增加了运行成本。鉴于传统的硝化细菌和反硝化细菌的不足，异养硝化细菌、好氧反硝化细菌的发现解决了传统生物脱氮处理启动时间长，硝化环节条件要求苛刻，硝化和反硝化不能同步进行等缺点，具有较好的发展前景。已报道的异养硝化细菌很多又同时具有好氧反硝化的功能，这为污水脱氮引入新的概念，使得同步硝化反硝化得以实现。目前，高氨氮行业的废水一般含有很多含有毒有害物质，如焦化废水等。针对这一情况，获得耐受环境毒害、去除难降解物质的高效异养硝化好氧反硝化功能菌株，构建组合成微生物菌剂，投加到废水处理系统中或者用于特定污染水体的生物修复，使其成为反应体系中的优势种群而发挥脱氮和去除COD作用，能够增强对难降解污染物的降解能力，提高脱氮速率，并改善原有生物处理体系对目标污染物的去除效能。公开专利文献CN101875909.B提供了一种高效的异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途，该细菌是红球菌属Rhodococcus sp.DN2.3，保藏登记号为CCTCCM209300，能够有效脱除水体中的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮及其混合物，还可同时去除有机废水中的CODCr，但菌剂生产方法过于简单，菌种单一，环境耐受力差，不适用于大规模利用。公开专利文献CN102277314.B提供一种种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株及其菌剂的制备方法，该菌株为腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus),保藏编号为:CGMCCN0.4918，可以利用亚硝酸盐作为唯一的氮源进行生长繁殖。并以该菌株制备水质净化微生物制剂菌剂，可用于污水处理、水产养殖、水族箱或流动水系等水治理工程，未见其用于工业污水处理。公开专利文献CN101899401.A提供了一种含氨废水微生物菌剂及其制备方法，该菌剂包含硝酸菌、亚硝酸菌和反硝化菌，通过定向驯化来调节或者配比，能有效处理低C0D、高氨氮废水，但菌剂中包含的菌株过于笼统，且对有毒有害物质耐受性较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的噬氨副球菌LH-N40。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了含有上述噬氨副球菌LH-N40的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述菌剂的制备方法与用途。本发明公开了一种卩遼氨副球菌(Paracoccusaminovorans) LH-N40 CGMCC N0.6971。本发明所涉及的菌株为噬氨副球菌LH-N40已于2012年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.6971 ;保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，电话:010-64807355。以下对本发明的菌株的分离纯化进行说明。一、噬氨副球菌LH-N40的分离纯化
1.土样驯化富集:取土壤样品，接种至硝化液体培养基中，逐步驯化富集。(硝化富集培养基组成:NH4SO4 lg/L, NaNO31 g/L, NaCl 0.3g/L, FeSO4 0.03g/L, K2HPO4 0.25g/L, MgSO40.03g/L, NaCO30.3g/L, CH3COONa 0.5g/L 蒸馏水 1L, pH 8.0)
2.稀释液准备:取驯化污泥培养液lml，加入盛有9ml无菌水的灭菌试管中，混匀即得10—1浓度的污泥悬液。静置30s,用Iml无菌吸管吸取KT1的污泥悬液Iml放入9ml无菌水管中，吹吸混匀，即为10_2稀释液，依次从10_2连续稀释至10_5，即得一系列的10倍稀释液。3.培养皿准备:取灭菌培养皿,在皿盖上加注样品号、培养基代号、接种稀释度、分离日期等。将灭菌后的硝化培养基倒入皿中约12 15ml，使凝成平板。(硝化固体培养基组成同硝化液体培养基，另加入2%的琼脂)。4.初筛与培养:初筛接种采用涂布法，即用无菌吸管吸取不同倍数稀释液
0.1ml，滴于已制好的平板 上，然后用无菌刮铲涂匀。接种完毕，将皿分类重叠，倒置于30°C培养箱中培养2 4d。5.复筛:取出培养好的平板，选出生长好、有代表性的单菌落，用接种环挑取，接种到同样成分的硝化液体培养基中30°C震荡培养，生长后，用接种环挑取一环培养液在硝化固体培养基上划线纯化，30°C培养箱中培养。待有菌落长出后，挑取单菌落划线，纯化，重复2 3次，筛选得到纯菌株。6.将该纯菌株送到生物工程(上海)有限公司进行16s rDNA测序，经鉴定为噬氨苜Ij 球菌{Paracoccus amino vor an s )。本发明还公开了一种异养硝化好氧反硝化微生物菌剂，其特点是:该微生物菌剂含有卩遼氛副球菌(/Iaracoccw1S aminovorans^) LH-N40 CGMCC N0.6971。本发明菌剂中，菌株是在菌剂中起脱氮和去除COD作用的菌株，菌剂中还可以含有常规的微生物助剂，比如稳定剂和/或保护剂等助剂。本发明微生物菌剂中，菌株的含量根据其所处理的废水需要进行选定，一般地，以质量分数计量，每种菌株的含量均不低于0.1%，优选不低于1%，最优选不低于5%。本发明还公开了一种如以上方案所述的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂的制备方法，其特点是，其步骤如下:
(1)将微生物菌剂中所述的菌株接种到固体培养基进行活化；
(2)活化后转接到相应液体培养基进行摇瓶培养，离心收集菌体，制备高浓度种子液；摇瓶培养条件为，pH:6.0 10.0，温度:10°C 35°C，转速:100 170rpm，培养时间:1 2 d ;高浓度种子液中有效活菌数量彡5 X IO9 cfu/mL ；(3)将上述高浓度种子液到接种到相应的一级种子罐进行放大培养I 7d，培养条件为:温度 10°C 35°C ；ρΗ 6.0 10.0 ；DO 0.5 4.0mg/L，通气量(λ 4 (λ 6m3/h，搅拌速度110 150rpm,浓缩收集菌体,制备一级种子液；再将一级种子液转接到相应二级种子罐进行放大培养I 14d，浓缩收集菌体，制备二级种子液；再将二级种子液转接到相应三级种子罐进行放大培养I 21d，浓缩收集菌体，得到三级种子液；二级种子液和三级种子液的培养条件为:pH 6.0 10.0，温度10 35°C，DO 0.5 4.0mg/L，通气量0.4 0.6m3/h，搅拌速度110 150rpm ;向三级种子液中添加微生物助剂，按照各菌株所需的比例混合即获得微生物菌剂；所述的微生物助剂是稳定剂和/或保护剂；
步骤(I)和(2)中所述的固体培养基和液体培养基组成为:牛肉膏3 5g/L，蛋白胨6 12g/L，氯化钠3 6g/L，蒸馏水1L，固体培养基中再加入1.5 2.5%琼脂；步骤(3)所述的一级种子液所用的培养基组成为:(NH4)2SO4 0.5 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L，MgSO40.01 0.02g/L, K2HPO4 0.1 0.3g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸馏水 IL ;二级种子液和三级种子液所用的培养基组成为:尿素0.5 5g/L，葡萄糖I 3g/L，K2HPO4 0.1
0.3g/L, MgSO4 0.01 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸馏水 1L。以上所述的制备方法的步骤(3)中:所述的稳定剂和保护剂可以为现有技术中常制菌剂常规使用的稳定剂和保护剂，稳定剂优选自甘油、乙醇的一种或其混合物；保护剂优选自活性炭粉末、硅藻土的一种或其混合物。步骤(3)中所述的浓缩方法优选为自然沉降、离心或者过滤。本发明所述的微生物菌剂或者本发明制备方法制得的微生物菌剂可以在处理含氮化工废水中应用。本发明的微生物菌剂可以制备成液态菌剂，或者制备成干粉状的菌剂。与现有技术相比，本发 明的有益效果如下:
1.本发明的微生物菌剂不仅能解决传统反应器中总氮难脱除的问题，而且能够在同一反应器中有效脱除水体中的氨氮和总氮；该微生物菌剂对废水中的酚类、胺类、杂环类、氰类、多环芳烃类等有毒物质具有耐受性或降解能力；该微生物菌剂有利于异养硝化好氧反硝化脱氮的微生物菌剂的规模化生产应用；可以直接应用于含氮有机化工废水的生物处理系统中；可以作为生物强化剂投加到废水处理系统或者在各种填料上挂膜后处理废水；能够有效脱除废水中的C0D，效果稳定，耐环境毒物冲击；在各种含氮有机化工废水处理中有着非常广阔的应用前景。2.本发明的微生物菌剂制备方法制得的微生物菌剂活菌数高，生产周期短、工艺简便。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明进行说明，以下实施方式仅用于说明本发明，而不用于限制本发明所要求保护的范围。实施例1，一种卩遼氨副球菌aminovorans )LH-N40 CGMCC N0.6971。实施例2, —种异养硝化好氧反硝化微生物菌剂,该微生物菌剂包括曬氨副球菌(.Paracoccus amino vorans )LH-N40 CGMCC N0.6971。菌株的含量可以为适宜。菌剂中，各菌株是在菌剂中起脱氮和去除COD作用的菌株，菌剂中可以为单独的菌株，还可以含有常规的微生物助剂，比如稳定剂和/或保护剂等助剂。所述的菌株及其微生物菌剂均可以应用于处理含氮化工废水。实施例3，实施例2所述所述的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂中，以质量分数计量，菌株的含量均不低于0.1%。实施例4，实施例2所述所述的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂中，以质量分数计量，菌株的含量均不低于5%。实施例5，一种如实施例2-4中任何一项所述的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂的制备方法，其步骤如下:
(1)将微生物菌剂中所述的菌株接种到固体培养基进行活化；
(2)活化后转接到相应液体培养基进行摇瓶培养，离心收集菌体，制备高浓度种子液；摇瓶培养条件为，pH:6.0 10.0，温度:10°C 35°C，转速:100 170rpm，培养时间:1 2 d ;高浓度种子液中有效活菌数量彡5 X IO9 cfu/mL ；
(3)将上述高浓度种子液到接种到相应的一级种子罐进行放大培养I 7d，培养条件为:温度 10°C 35°C ；ρΗ 6.0 10.0 ；D0 0.5 4.0mg/L，通气量 0.4 0.6m3/h，搅拌速度110 150rpm,浓缩收集菌体,制备一级种子液；再将一级种子液转接到相应二级种子罐进行放大培养I 14d，浓缩收集菌体，制备二级种子液；再将二级种子液转接到相应三级种子罐进行放大培养I 21d，浓缩收集菌体 ，得到三级种子液；二级种子液和三级种子液的培养条件为:pH 6.0 10.0，温度10 35°C，DO 0.5 4.0mg/L，通气量0.4 0.6m3/h，搅拌速度110 150rpm ;向三级种子液中添加微生物助剂，按照各菌株所需的比例混合即获得微生物菌剂；所述的微生物助剂是稳定剂和/或保护剂；
步骤(I)和(2)中所述的固体培养基和液体培养基组成为:牛肉膏3 5g/L，蛋白胨6 12g/L，氯化钠3 6g/L，蒸馏水1L，固体培养基中再加入1.5 2.5%琼脂；步骤(3)所述的一级种子液所用的培养基组成为:(NH4)2SO4 0.5 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L，MgSO4
0.01 0.02g/L, K2HPO4 0.1 0.3g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸馏水 IL ;二级种子液和三级种子液所用的培养基组成为:尿素0.5 5g/L，葡萄糖I 3g/L，K2HPO4 0.1
0.3g/L, MgSO4 0.01 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸馏水 1L。实施例6，实施例5所述的制备方的步骤(3)中:所述的稳定剂选自甘油、乙醇的一种或其混合物；所述的保护剂选自活性炭粉末、硅藻土的一种或其混合物。实施例7，实施例5所述的制备方的步骤(3)中所述的浓缩方法为自然沉降、离心或者过滤。实施例8，本发明微生物菌剂的异养硝化好氧反硝化性能实验。一、配制氨氮质量浓度为240mg/L左右的模拟废水，添加甲醇为碳源，COD质量浓度为1050mg/L左右。二、按以下方法制得的纯菌株发酵液:
1.菌株活化:将纯菌株接到固体培养基中，25°C恒温培养箱中活化。2.高浓度种子液制备:用接种环取活化后菌株转接到液体培养基中，10 350C UOO 170rpm摇瓶震荡培养I 2d生长至对数期，在灭菌离心管中离心去上清液收集菌体，制备高浓度种子液，有效活菌数量> 5X IO9 cfu/mL。培养基组成为:牛肉膏4g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.5，固体培养基添加2%琼脂。3.一级种子液制备:将上述高浓度种子液到接种到20L—级种子罐，在温度10°C 35°C ；pH 6.0 10.0 ；DO 0.5 4.0mg/L，通气量 0.4 0.6m3/h，搅拌速度 110 150rpm条件下放大培养3d,过滤浓缩收集菌体,制备一级种子液。培养基组成为=(NH4)2SO42g/L，葡萄糖 lg/L, MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.2 g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L。4.二级种子液制备:将菌株的一级种子液以10%的接种量接种到300L 二级种子罐放大培养10d，自然沉降浓缩收集菌体，制备二级种子液。培养条件为pH 6.0 10.0，温度10 35°C，D0 0.5 4.0mg/L，通气量0.4 0.6m3/h，搅拌速度110 150rpm。培养基组成为:尿素 4g/L，葡萄糖 3g/L，K2HPO4 0.2g/L，MgSO4 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.1 g/L。5.三级种子液制备:将菌株的二级种子液以10%的接种量转接到相应5m3三级种子罐放大培养12d，自然沉降浓缩收集菌体，得三级种子液。培养条件和培养基组成同二级种子液制备条件。三.菌剂制备:通过添加微生物助剂甘油，获得微生物菌剂。将菌剂接种6L曝气反应器中，接种量10%，对照接种同体积的灭菌纯水，30°C，150rpm振荡培养12个小时,定时取样测定氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮浓度的变化。结果见表1，从表I可以看出，在培养的前6个小时，菌剂培养液中有微量的硝酸盐和亚硝酸盐出现，8小时以后再未检测到硝酸盐和亚硝酸盐积累，菌剂体系中总氮去除率均达到90.0%以上。该菌剂实现了异养硝化好氧反硝化同步脱氮。表I脱氮微生物菌剂对氨氮的去除效果
权利要求
1.一种卩遼氨副球菌(Zkracoccw1S aminovorans) LH-N40 CGMCC N0.6971。
2.—种异养硝化好氧反硝化微生物菌剂，其特征在于:该微生物菌剂含有权利要求1所述的卩遼氨副球菌aminovorans) LH-N40 CGMCC N0.6971。
3.根据权利要求2所述的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂，其特征在于:该微生物菌剂中，以质量分数计量，菌株的含量均不低于5%。
4.一种如权利要求2或3所述的异养硝化好氧反硝化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，其步骤如下: (1)将微生物菌剂中所述的菌株接种到固体培养基进行活化； (2)活化后转接到相应液体培养基进行摇瓶培养，离心收集菌体，制备高浓度种子液；摇瓶培养条件为，pH:6.0 10.0，温度:10°C 35°C，转速:100 170rpm，培养时间:1 2 d ;高浓度种子液中有效活菌数量彡5 X IO9 cfu/mL ； (3)将上述高浓度种子液到接种到相应的一级种子罐进行放大培养I 7d，培养条件为:温度 10°C 35°C ；ρΗ 6.0 10.0 ；D0 0.5 4.0mg/L，通气量(λ 4 (λ 6m3/h，搅拌速度110 150rpm,浓缩收集菌体,制备一级种子液；再将一级种子液转接到相应二级种子罐进行放大培养I 14d，浓缩收集菌体， 制备二级种子液；再将二级种子液转接到相应三级种子罐进行放大培养I 21d，浓缩收集菌体，得到三级种子液；二级种子液和三级种子液的培养条件为:pH 6.0 10.0，温度10 35°C，DO 0.5 4.0mg/L，通气量0.4 0.6m3/h，搅拌速度110 150rpm ;向三级种子液中添加微生物助剂，按照各菌株所需的比例混合即获得微生物菌剂；所述的微生物助剂是稳定剂和/或保护剂； 步骤(I)和(2 )中所述的固体培养基和液体培养基组成为:牛肉膏3 5g/L，蛋白胨6 12g/L，氯化钠3 6g/L，蒸馏水1L，固体培养基中再加入1.5 2.5%琼脂；步骤(3)所述的一级种子液所用的培养基组成为:(NH4)2SO4 0.5 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L，MgSO40.01 0.02g/L, K2HPO4 0.1 0.3g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸馏水 IL ;二级种子液和三级种子液所用的培养基组成为:尿素0.5 5g/L，葡萄糖I 3g/L，K2HPO4 0.1 0.3g/L, MgSO4 0.01 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸馏水 1L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中:所述的稳定剂选自甘油、乙醇的一种或其混合物；所述的保护剂选自活性炭粉末、硅藻土的一种或其混合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的浓缩方法为自然沉降、离心或者过滤。
7.权利要求1所述的曬氨副球菌(/Iaracoccw1S在处理含氮化工废水中用途。
8.权利要求2或3所述的微生物菌剂或者权利要求4或5或6所述的制备方法制得的微生物菌剂在处理含氮化工废水中用途。
全文摘要
本发明是一种噬氨副球菌(Paracoccusaminovorans)LH-N40CGMCCNo.6971。本发明还公开了一种异养硝化好氧反硝化微生物菌剂，该微生物菌剂含有噬氨副球菌LH-N40组成。本发明还公开了该微生物菌剂制备方法。本发明的微生物菌剂不仅能解决传统反应器中总氮难脱除的问题，而且能够在同一反应器中有效脱除水体中的氨氮和总氮，同时对废水中的酚类、胺类、杂环类、氰类、多环芳烃类等有毒物质具有耐受性或降解能力，特别适用于含氮化工废水，处理工艺简单，效果稳定，耐环境毒物冲击，在各种含氮化工废水处理中有着非常广阔的应用前景。
文档编号C12R1/01GK103146605SQ20131006152
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者杨志林, 董自斌, 田凤蓉, 张彬彬, 徐军, 云干, 王开春, 刘德敏 申请人:中蓝连海设计研究院