专利名称：猪圆环病毒Ⅱ型基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术领域，具体而言，涉及一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用。
背景技术：
1991年加拿大John Harding报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS),后经研究证实猪圆环病毒 II 型(Porcinecircovirus 2, PCV2)是该综合征的主要病原。现有研究表明 ，猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease, PCVD)是由PCV2感染而引起的一种临床综合征，其主要症状表现为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎等。猪圆环病毒II型主要侵害5-12周龄断奶仔猪，而且与近年来发生的PMWS、猪皮炎与肾炎综合症(porcine dermatitis and nephropathysyndrome, F1DNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、A2 型先天性振颤(congenital tremor, CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferativeand necrotizing Pneumonia,PNP)、繁殖障碍(Reproductive failure)等疾病都有密切关系。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病呈世界流行，从2000年我国首次发现存在此病以来，已给我国养猪业造成了相当大的经济损失。猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)在分类学上属圆环病毒科、圆环病毒属，是已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称结构，无囊膜。PCV具有两个基因型，即:PCV1、PCV2，基因组大小约为1.76kb，含有2个主要阅读框架，其中ORFl基因产物与病毒复制酶(Itep)相关，0RF2基因产物是构成病毒衣壳蛋白(Capsid protein,简称:cap)的成分。PCVl是由Tischer等1974年首次在PK15细胞培养物中发现，对猪无致病性。PCV2是于1991年首次在加拿大猪群中发现。1998年证实该病毒具有感染性和致病性，是养猪业需要防治的病毒类型。但由于PCV2在体外培养时不产生细胞病变,病毒增殖能力差，采用传统的方法制备该病毒疫苗非常困难。用基因工程的方法制备猪圆环病毒II型(PCV2)疫苗是控制该病的重要途径。尽管目前市场上已有杆状病毒表达的PCV2基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的PCV2疫苗的制备方法。
发明内容
本发明旨在提供一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗、及其制备方法和应用，以提供一种新的猪圆环病毒II型亚单位疫苗及其制备方法和应用。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。进一步地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位。进一步地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下氨基酸残基位点:6)第 97，99，116 位;或 7)第 97，99，180，186 位。进一步地，定位信号区域剪切包括猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA链；优选地，69 123bp ;优选地，105bp。根据本发明的另一个方面，提供上述可溶性融合蛋白在制备猪圆环病毒II型疫苗中的应用。根据本发明的再一个方面，提供编码上述可溶性融合蛋白的DNA序列。根据本发明的又一个方面，提供一种载体。该载体包含上述编码可溶性融合蛋白DNA序列。根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体。进一步地，该宿主细胞保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为武汉市武汉大学)，保藏编号为CCTCC M2012474 ;保藏日期2012年11月23日，分类命名Escherichiacoli BL21/pET28a PCV2 MNdX Cap (埃希氏菌属，大肠杆菌种)。根据本发明的又一个方面，提供一种猪圆环病毒II型疫苗。该疫苗包括上述可溶性融合蛋白。进一步地，该疫苗包括佐剂，佐剂包括氢氧化铝胶和CpG-DNA。根据本发明的又一个方面，提供上述疫苗的制备方法。该制备方法包括通过上述宿主细胞培养、提取抗原蛋白，然后添加佐剂制备而来。根据本发明的又一个方面，提供上述猪圆环病毒II型疫苗在预防猪圆环病毒II型引起的猪相关疾病中的应用。进一步地，对21日龄的猪进行免疫注射。应用本发明的技术方案制备的猪圆环病毒II型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，且对猪等动物没有致病性。使用该疫苗免疫后的猪只增重明显提高，呼吸道疾病明显减少。并且，本发明的疫苗通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:图1示出了根据本发明实施例的变异体筛选的工程菌E.col1.BL21/pET28a-PCV2MNd Xcap诱导表达产物的SDS-PAGE结果图，其中，I泳道为E.col1.BL21/pET28a (空白对照)上清，2泳道为E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd X cap全菌，3泳道为E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd Xcap 全菌，4 泳道为 E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd X cap上清，5 泳道为 E.col1.BL21/pET28aPCV2MNd X cap 上清，M 为蛋白 marker ；以及图2示出了根据本发明实施例的蛋白纯化产物电泳结果，其中，M泳道为蛋白质低分子量标记物；1泳道为DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱液；2泳道为20 % -40 %饱和度硫酸铵沉淀蛋白。
具体实施例方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。在重组疫苗研究中PCV2的Cap蛋白基因是最为重要的备选基因，因为Cap蛋白是该病毒主要的结构蛋白，含有型特异性抗原决定簇。有研究资料报道，PCV2的中和性单克隆抗体和多克隆猪抗血清都能与Cap蛋白相识别和发生中和反应。在基因工程疫苗中，重组基因工程亚单位疫苗是最为安全的疫苗，而且其免疫的效果也最为确定，只要抗原蛋白的量足够大就能产生相应的特异性抗体。根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型(PCV2)衣壳蛋白(cap)基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，使基因中编码序列变短，删除部分或全部信号区域甚至部分N端序列。使精氨酸残基的稀有密码子变成能在大肠杆菌中很好表达的密码子，使该基因片段更适合于在大肠杆菌中表达。基因改造综合作用的结果是，表达产物具有天然cap蛋白的免疫原性，且在中性pH的缓冲溶液中有很好的溶解性。与传统的疫苗制备方法相比，在大肠杆菌中表达制备疫苗其制备工艺相对简单，成本低，且抗原纯度高、安全性好，免疫原性强。对信号区域剪切可以是对猪圆环病毒II型衣壳蛋白全基因删除不同长度核苷酸序列，优选地，定位信号区域剪切包括猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA链；更优选地，69 123bp ;进一步优选地，105bp。
根据本发明一典型的实施方式，表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白的核苷酸序列的获得系用PCV2-FJ株，进行0RF2全基因克隆，然后对该基因进行5’端剪裁不同长度核苷酸序列后的剩余基因片段，它们分别为:Ndl3cap gene,Nd23cap gene,Nd35cap gene,Nd41capgene, Nd53cap gene (剪切核苷酸数目见表I)用这些基因片段作为进一步改造用基因。表I
剪接后基因名称15'删除核I SDS_PAGE检测表达 苷酸数目蛋白相对含量(%)
NdO cap geneO bpO
ISid13 cap gene39 bp5.3
Nd23 cap gene69 bp11.2
Nd35 cap gene105 bp20.8
Nd41 cap gene123 bp10.5
Nd53 cap gene159 bp12.2注:诱导表达产物SDS-PAGE电泳后，经Biorad GelDoc XR凝胶成像分析系统中的Quantity One 1_D软件分析,表达蛋白占可溶性蛋白总量的百分比；SDS-PAGE检测表达蛋白相对含量(％)，指表达蛋白占可溶蛋白总量的百分比。
优选地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位；其中较优选的部位是:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；最优选的部位是:第97和第99位。当然，这些位点的突变也可以联合使用，可以将最优选的定点变异部位(第97和第99位)与116位定点变异位点进行组合(即6，第97，99，116位联合突变)，或与180位和186位定点变异位点进行组合(即7，第97，99，180，186位联合突变)变异操作；最优的组合是:第97和第99位变异与第116位的组合(即6)第97，99，116位)。将以上7种突变后的表达菌，按菌体湿重的10倍加生理盐水，超声波破碎后，12000转/分离心15分钟后取上清，用琼脂双向免疫扩散实验(AGP)进行抗原滴度检测。结果如下表2:表 权利要求
1.一种可溶性融合蛋白，其特征在于，包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，所述定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。
2.根据权利要求1所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点:1)第97和第99位；2)第116 位；3)第 180 位；4)第 186 位；5)第 222 位。
3.根据权利要求2所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下氨基酸残基位点:6)第97，99，116位；或7)第97，99，180，186 位。
4.根据权利要求1所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定位信号区域剪切包括所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA链；优选地，69 123bp ；优选地，105bp。
5.如权利要求1至4中任一项所述的可溶性融合蛋白在制备猪圆环病毒II型疫苗中的应用。
6.编码如权利要求1至4中任一项所述的可溶性融合蛋白的DNA序列。
7.—种载体,其特征在于,包含如权利要求6所述的DNA序列。
8.—种宿主细胞，其特征在于,包含如权利要求7所述的载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCCM2012474。
10.一种猪圆环病毒II型疫苗，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述可溶性融合蛋白。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于，进一步包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶和CpG-DNA。
12.根据权利要求10或11所述的疫苗、，其特征在于，通过如权利要求8或9所述的宿主细胞培养、提取抗原蛋白，然后添加佐剂制备而来。
13.如权利要求10或11所述的猪圆环病毒II型疫苗在预防猪圆环病毒II型引起的猪相关疾病中的应用。
14.根据如权利要求13所述的应用，其特征在于，对21日龄的猪进行免疫注射。
全文摘要
本发明公开了一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。其中，猪圆环病毒II型疫苗包括可溶性融合蛋白，该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。应用本发明的技术方案制备的猪圆环病毒II型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，对猪等动物没有致病性。并且，本发明的疫苗抗原通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。
文档编号C12N1/21GK103204942SQ20131005000
公开日2013年7月17日 申请日期2013年2月8日 优先权日2013年2月8日
发明者荣俊, 杜元钊, 范根成, 韩建文, 蔡联燊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司