专利名称：一种猪疫苗使用的pIFN－γ基因佐剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及猪疫苗使用的佐剂和其制备方法，以及用本发明的佐剂构成的猪用疫苗。
背景技术：
自从上世纪20年代以来，许多物质被尝试作为免疫佐剂，但只有铝胶佐剂获得了人类疫苗的许可，并大量用于猪疫苗。它作为抗原的储存库和载体，缓慢释放抗原从而延长诱导机体的体液免疫反应，但缺点是仅诱导Th2体液免疫反应，抗体以IgG1型为主，无TCL反应。油佐剂和弗氏完全佐剂虽能明显提高免疫应答能力，但在实际应用中常出现不良反应，如注射部位肿胀、疼痛、发烧，或发生过敏等，仅限用于实验室动物试验。206佐剂是目前商品化的高效动物疫苗油佐剂，已广泛使用于动物疫苗中，实践证实是可靠的、有效的和安全的，但需要进口，价格较高。
我国是世界养猪大国，2002年以来生猪饲养量在11亿头以上，在畜牧业生产中占有较大的比重，同时养猪业也是我国部分省区的主要生产支柱和新的经济增长点。但面对当前养猪业重大疫病发生和流行愈加复杂的形势——旧病未除，新病又起，疫情不断，这就要求我们必须运用新的科学理论和生产技术来发展猪用安全、高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行，而佐剂研制是疫苗研究的主要组成部分。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的供猪疫苗使用的基因佐剂，这种佐剂可使低应答或无应答以及应答不全的疫苗产生有效的免疫反应。
本发明的第二个目的是提供一种以本发明前述的基因佐剂与现有的某种佐剂配伍的新佐剂。
本发明的第三个目的是提供本发明的基因佐剂的制备方法。
本发明的第四个目的是提供两类采用本发明佐剂的猪用疫苗。
本发明的猪疫苗使用的基因佐剂是指包含有猪γ-干扰素基因(pIFN-γ)的佐剂。
本发明的一个具体实例的佐剂为动物细胞表达质粒pcDNA3.1和猪γ-干扰素基因(pIFN-γ)的重组质粒pcDNA-pIFN-γ。
本发明所述的基因佐剂与现有的某种佐剂配伍的新佐剂是pcDNA-pIFN-γ基因佐剂和206佐剂的配伍。
本发明所述的佐剂中的猪干扰素-γ基因的重组质粒pcDNA-pIFN-γ的制备方法是将猪的pIFN-γ分泌细胞经刺激诱导培养后，采用RT-PCR技术扩增克隆获得全基因序列，再根据pcDNA3.1载体的特性在猪IFN-γ基因阅读框两侧设计表达型引物克隆其全基因序列，并引入相应的酶切位点，扩增后用相应的酶分别同时酶切目的基因和载体，用T4连接酶连接重组，构建环形重组表达质粒pcDNA-pIFN-γ，将所得的重组质粒表达载体转化大肠杆菌，进行扩增培养，然后再用碱性裂解法大量提取和纯化所述这些目的基因的重组表达质粒DNA。
本发明的两类猪疫苗是猪抗囊尾蚴病的疫苗组合物和猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗组合物，这两类疫苗组合物分别是猪抗囊尾蚴病的疫苗组合物是由含有选自猪囊尾蚴虫体抗原和TSO18重组抗原疫苗，与本发明的基因佐剂或基因佐剂与206佐剂的混合或乳化而成；猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗组合物是由猪口蹄疫病毒灭活疫苗与与本发明的基因佐剂或基因佐剂与206佐剂的混合或乳化而成。
细胞因子是机体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一类具有广泛生物学活性的调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用(孙卫民等编著.细胞因子研究方法学，1999年第一版)。早在DNA疫苗产生之前就有人把细胞因子作为佐剂与疫苗联用，但由于细胞因子在体内细胞或体液中含量极低，且半衰期太短，故人工提取造价昂贵，未能在传统疫苗中广泛应用。受DNA疫苗以质粒作为抗原载体的启发，构建细胞因子重组表达质粒的形式在动物体内表达而发挥免疫调节作用即基因佐剂。用细胞因子基因佐剂与疫苗同时注射，可使低应答或无应答以及应答不全的疫苗产生有效的免疫反应。这是建立本发明的佐剂的理论依据。
干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)是一种具有强烈抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由激活的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ是一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白，具有强烈的免疫调节作用，对寄生在细胞内的各种病原体均具有有效的抑制作用。无论作为疫苗佐剂或其它类型的生物制剂，IFN-γ均可明显提高机体抗感染能力，主要是一种Th1类细胞因子基因佐剂。
本发明的基因佐剂的优越性有1)在宿主体内表达所所需的细胞因子，在构象上接近天然分子结构，活性不受影响；2)一次少量给予即可长时间低量表达，无须多次给药；3)制备简单，质量易于控制，易规模化生产，成本低廉，易于保存和运输；4)安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；5)易于构建和改造。利用分子生物学技术在基因水平可自由地选择细胞因子种类，实现人们所期望的免疫应答强度和类型。一般情况下，接种某种类型的细胞因子(Th1或Th2类)质粒可促进相应类型的免疫反应。
经相关的实验表明，本发明的基因佐剂具有可使低应答或无应答以及应答不全的疫苗产生有效的免疫反应的作用，采用本发明的佐剂的疫苗较不使用佐剂的疫苗有更强烈的免疫作用。而采用本发明的基因与206佐剂配伍而成的新佐剂时，可兼有两类不同佐剂的优点，同时可以大大降低佐剂的制备成本。而本发明的方法提供了制备本发明的基因佐剂或配伍佐剂的有效措施。
图1pcDNA-pIFN-γ表达质粒对猪囊尾蚴虫体抗原的免疫抗体的增强效果。图1中CAg代表猪囊尾蚴抗原；IFN代表pcDNA-pIFN-γ重组表达质粒；V代表pcDNA空质粒；206代表206佐剂；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液；纵轴代表ELISA法检测的OD值，横轴代表免疫后的天数。
图2pcDNA-pIFN-γ表达质粒对猪囊尾蚴病TS018重组抗原的免疫抗体的增强效果。图2中TSO18代表猪囊尾蚴病重组抗原；IFN代表pcDNA-pIFN-γ重组表达质粒；206代表206佐剂；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液；纵轴代表ELISA法检测的OD值，横轴代表免疫后的天数。
图3pcDNA-pIFN-γ表达质粒对猪口蹄疫灭活疫苗的免疫抗体滴度的增强效果。图3中FAg代表猪口蹄疫灭活疫苗；IFN代表pcDNA-pIFN-γ重组表达质粒；V代表pcDNA空质粒；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液。纵轴代表阻断ELISA法检测的抗体滴度值，横轴代表免疫后的天数。
具体实施例方式
本发明的佐剂的制备方法详述如下(1)从猪外周血或淋巴结中分离单个核细胞，经诱导剂刺激培养后，RT-PCR克隆出目的细胞因子基因，经序列同源性、遗传演化关系以及其分子结构与功能预测分析后，作为基因佐剂的候选基因；(2)采用基因工程重组技术，选择合适的含酶切位点的表达型引物将目的细胞因子基因克隆入动物细胞表达质粒载体；(3)用步骤(2)所得的重组质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养；和(4)大量提取和纯化目的基因的重组质粒DNA。
其中步骤(2)中的质粒载体是基因工程核酸疫苗中常用的载体即pcDNA3.1质粒载体，用于目的基因的扩增，并使细胞因子在动物体内稳定、持久表达，以保持其佐剂效应。这类载体是本领域普通技术人员熟知的，添加的酶切位点和克隆的方法是现有技术中的常规手段，酶切位点通常是其多克隆位点的特定位点。
步骤(3)中的原核宿主菌也是基因工程领域中常用的，能够大量扩增重组质粒，例如大肠杆菌。宿主细胞的转化、阳性克隆的筛选、序列测定、宿主菌株的培养以及重组表达质粒的提取纯化都是本领域技术人员熟知的，例如描述于Sambrook等人的《Molecular CloningA Laboratory Manual》(纽约，冷泉港实验室，2001年)。
以下是本发明的一个具体的实施例从长白猪外周血或淋巴结中用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经诱导剂(PHA、LPS或二者联合)37℃刺激培养后，在不同时间段提取已刺激培养细胞的总RNA或mRNA，设计特异性引物(pIFN-γ的上游引物5′-CGGAATTCCTCTCCGAAACAATGAGTT-3′，下游引物5′ATTGCGGCCGCTGCAGGCAGGATGACAAT-3，酶切位点为EcoR I和NotI)，以其为模板RT-PCR克隆出目的细胞因子基因pIFN-γ的全序列，分别经序列同源性、遗传演化关系以及其分子结构与功能预测分析后，作为基因佐剂的候选基因，即通过基因工程重组技术，定向将其克隆入动物细胞表达质粒载体pcDNA3.1中，构建重组表达载体pcDNA-pIFN-γ；将重组质粒表达载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养。培养所得产物的基因序列见后。
选择细胞因子重组质粒的高拷贝阳性菌株，接种到1000ml含氨苄的LB培养基中，在摇床中220rpm 37℃培养12～14小时后，用SDS碱裂解法大量提取重组质粒。粗提取的质粒经5M冰冷的LiCl分离后，其上清用等体积异丙醇沉淀，再用70％乙醇洗涤沉淀，离心除去上清；将沉淀用含RNase的TE缓冲液溶解，室温处理30分钟后，再用酚氯仿抽提2次，2倍无水乙醇沉淀离心；用1ml灭菌水溶解沉淀后，加入0.5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入40％PEG 8000)，充分混匀后放置15分钟，13000rpm离心20分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤2次，再用TE缓冲液或无菌水溶解沉淀，即得到所谓的佐剂，经用核酸蛋白检测仪分别测定其含量和纯度，在4℃保存备用。
以下为本发明基因佐剂的中pIFN-γ基因及其推导氨基酸序列atg agt tat aca act tat ttc tta gct ttt cag ctt tgc gtg act 45Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Thr-23 -20-15 -10ttg tgt ttt tct ggc tct tac tgc cag gcg ccc ttt ttt aaa gaa 90Leu Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu-5 -1 1 5ata acg atc cta aag gac tat ttt aat gca agt acc tca gat gta 135Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Asp Val10 15 20cct aat ggt gga cct ctt ttc tta gaa att ttg aag aat tgg aaa 180Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys25 30 35gag gag agt gac aaa aaa ata att cag agc caa att gtc tcc ttc 225Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe40 45 50tac ttc aaa ttc ttt gaa atc ttc aaa gat aac cag gcc att caa 270Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln55 60 65agg agc atg gat gtg atc aag caa gac atg ttt cag agg ttc cta 315Arg Ser MET Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu70 75 80aat ggt agc tct ggg aaa ctg aat gac ttc gaa aag ctg att aaa 360Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile Lys85 90 95att ccg gta gat aat ctg cag atc cag cgc aaa gcc atc agt gaa 405
Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu100 105 110ctc atc aaa gtg atg aat gat ctg tca cca aga tct aac cta aga 450Leu Ile Lys Val MET Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg115 120 125aag cgg aag aga agt cag act atg ttc caa ggc cag aga gca tca 495Lys Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser130 135 140aaa taa 501Lys***本发明的佐剂对疫苗免疫作用的影响见下述的相关实验1、pcDNA-pIFN-γ重组表达质粒基因佐剂对猪囊尾蚴病抗原的免疫增强作用(1)将重组表达质粒pcDNA-pIFN-γ与猪囊尾蚴虫体抗原(200μg/只)配伍，制备疫苗免疫小鼠，以206佐剂(200μl/只)和pcDNA3.1空载体(100μg/只)为佐剂对照，接种剂量400μl，后肢股内侧各注射200μl；在第一次免疫后，25d和63d各加强免疫一次。在免疫后不同时间剪尾采血分离血清，测定血清中的抗体和免疫脾细胞分泌IFN-γ的含量。试验证明pcDNA-pIFN-γ重组表达质粒能明显增强小鼠抗猪囊尾蚴虫体抗原的体液免疫水平，稍高于或相当于206佐剂的免疫增强水平，且明显高于空质粒免疫对照组，(见图1)。
(2)将重组表达质粒pcDNA-pIFN-γ和206佐剂(250μl/头)配伍与猪囊尾蚴病TS018重组抗原(200μg/只)组合，制备分子疫苗免疫家猪(500μl/头)，在首免后7天，进行二免，二免后7天攻击感染(25000个猪带绦虫虫卵)，随后采血检查抗体，以及在感染后90天屠杀动物检查囊尾蚴寄生情况，确定免疫保护效果。结果表明在诱导的抗体水平方面，pcDNA-pIFN-γ佐剂组显著低于免疫对照组；但在减虫率方面也显著高于免疫对照组，参见附图2。
2、pcDNA-pIFN-γ重组表达质粒基因佐剂对猪口蹄疫灭活疫苗的作用将重组表达质粒pcDNA-pIFN-γ100μg单独分别与猪口蹄疫灭活抗原(200μg/只)配伍，制备疫苗免疫小鼠(400μl/只)，以206佐剂(200μl/只)和pcDNA3.1空载体(100μg/只)为佐剂对照，后肢股内侧各注射200μl；在第一次免疫后，25d和63d各加强免疫一次。在免疫后不同时间剪尾采血分离血清，用液相阻断ELISA法检测口蹄疫抗体滴度。发现该种猪细胞因子重组质粒基因佐剂对猪口蹄疫抗原有较强的佐剂效应或免疫调节作用，其抗体滴度在初次免疫后90天可达300左右(见图3)。
上述实验表明，本发明的佐剂性能具体表现在(1)能显著增强猪囊尾蚴病虫体抗原和重组抗原的免疫效果。
a.在实验动物小鼠该细胞因子重组质粒同时与猪囊尾蚴虫体抗原组合配制疫苗肌肉接种免疫小鼠，其能够在小鼠体内表达，调节机体产生较强的免疫应答，其增强囊尾蚴虫体抗原诱导体液反应的能力高于或相当于206标准佐剂，但其增强免疫应答的强度和类型与细胞因子的种类有关。
b.在靶动物猪IFN-γ重组表达质粒同时与猪囊尾蚴病TS018重组抗原组合配制分子疫苗肌肉接种免疫家猪，在体内表达的这些细胞因子能调节机体产生较强的免疫应答，其中IFN-γ转化淋巴细胞的能力明显高于其他对照组，即细胞免疫水平较高；在攻击感染保护方面，本发明的佐剂显著增强宿主对猪带绦虫虫卵的攻击感染，其中减虫率高达92％，而免疫对照组的减虫率仅为70％。
(2)能显著增强猪口蹄疫灭活抗原疫苗的免疫效果。用本发明的基因佐剂同时与猪口蹄疫灭活抗原疫苗肌肉接种免疫小鼠，重组质粒在小鼠体内表达的这种细胞因子能够调节机体产生较强的免疫应答，其增强猪口蹄疫灭活抗原疫苗诱导体液反应的能力显著高于标准疫苗对照，其诱导的抗体滴度在免疫后90天时可达300以上，而空质粒标准疫苗对照组仅为60左右。
(3)该细胞因子重组表达质粒具有使用剂量小，毒性低的特性。分别用100μg、300μg剂量的重组质粒免疫刺激小鼠和家猪，可达到比206佐剂标准剂量更好的免疫效果，也未发现对小鼠和家猪的毒副作用。
(4)该猪细胞因子重组表达质粒对小鼠的免疫刺激也具有交叉活性，因此该类基因佐剂适应的动物谱和抗原谱较广，实验动物小鼠可作为该基因佐剂效果评价的动物模型。
有关的实验还表明，当本发明的基因佐剂与206佐剂配伍可形成一种新的佐剂，既可以减小206佐剂的使用量，又可以兼有两类不同佐剂的优点。至于其具体的配伍比例可通过试验确定。
权利要求
1.一种猪疫苗使用的基因佐剂，其特征在于该基因佐剂包含有猪γ-干扰素基因(pIFN-γ)。
2.根据权利要求1所述的猪疫苗使用的基因佐剂，其特征在于这种佐剂为动物细胞表达质粒pcDNA3.1和猪γ-干扰素基因(pIFN-γ)的重组质粒pcDNA-pIFN-γ。
3.一种猪疫苗使用的佐剂，其特征在于佐剂为动物细胞表达质粒pcDNA3.1和猪γ-干扰素基因(pIFN-γ)的重组质粒pcDNA-pIFN-γ的基因佐剂与206佐剂的配伍。
4.根据权利要求2或3所述的猪疫苗使用的佐剂中的猪γ-干扰素基因的重组质粒pcDNA-pIFN-γ的制备方法，其特征在于将猪pIFN-γ分泌细胞经刺激诱导培养后，采用RT-PCR技术扩增克隆获得全基因序列，再根据pcDNA3.1载体的特性在猪IFN-γ基因阅读框两侧设计表达型引物克隆其全基因序列，并引入相应的酶切位点，扩增后用相应的酶分别同时酶切目的基因和载体，用T4连接酶连接重组，构建环形重组表达质粒pcDNA-pIFN-γ，将所得的重组质粒表达载体转化大肠杆菌，进行扩增培养，然后再用碱性裂解法大量提取和纯化所述这些目的基因的重组表达质粒DNA。
5.一种猪抗囊尾蚴病的疫苗组合物，其特征在于组合物由含有选自猪囊尾蚴虫体抗原和TSO18重组抗原疫苗，与权利要求1或2或3所述的佐剂混合或乳化而成。
6.一种猪口蹄疫病毒灭活疫苗组合物，其特征在于猪口蹄疫病毒灭活抗原疫苗与权利要求1或2或3所述的佐剂混合或乳化而成。
全文摘要
本发明公开一种猪疫苗使用的佐剂和其制备方法，以及用本发明的佐剂构成的猪用疫苗。本发明的猪疫苗使用的基因佐剂是指包含有猪γ－干扰素基因(pIFN－γ)的佐剂，或者本发明的佐剂为动物细胞表达质粒pcDNA3.1和猪γ－干扰素基因(pIFN－γ)的重组质粒pcDNA－pIFN－γ，或者是由pcDNA－pIFN－γ与206佐剂配伍的佐剂。本发明的猪疫苗是猪用抗囊尾蚴虫的疫苗组合物和猪口蹄疫病毒灭活疫苗与基因佐剂的组合物。本发明的佐剂制备采用基因克隆，重组和重组质粒的扩增、提取和纯化等方法。
文档编号A61P31/00GK1772297SQ200510119720
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者景志忠, 才学鹏, 窦永喜, 蒙学莲, 王佩雅, 陈国华, 罗启慧, 袁改玲, 侯俊玲, 骆学农 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所