专利名称：一种采用pcr特异检测片形吸虫的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种试剂盒，特别涉及肝片吸虫、大片吸虫、 中间型吸虫成虫、尾蚴、虫卵的特异PCR检测，具体来说是一种采用PCR特异检测片形吸虫 的试剂盒。
背景技术：
片形吸虫病是由片形科(Fasciolidae)片形属(Fasciola)吸虫(肝片吸虫、大片 吸虫、中间型吸虫)寄生于家畜肝脏、胆管而引起的一种蠕虫病。主要发生于反刍动物(黄 牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼等)，协诊症状主要是营养障碍和中毒所引起的慢性消瘦和衰竭； 病理特征是慢性胆管炎及肝炎。人也可以感染片形吸虫。本病病原主要为肝片形吸虫和大 片形吸虫两种，目前在越南还发现中间型吸虫感染动物和人的报道。三种吸虫成虫形态基 本相似，虫体扁平，呈柳叶状。肝片吸虫长20-35毫米，宽5-13毫米，色红褐，呈扁平的叶片 状，虫体肩部宽而明显；大片吸虫长33-76毫米，宽5-12毫米，肩部不明显，后端钝圆。中间 吸虫的形态很难有确定的描述，某些中间型吸虫的形态近似肝片吸虫，某些中间型吸虫的 形态又近似大片吸虫，所以，在中间型吸虫的分类定位方面，传统的形态学较难区分中间型 吸虫。近年来，以聚合酶链反应(PCR)为基础的分子生物学方法已在寄生虫学领域广泛 应用。PCR以其简便、快速、特异、敏感等优势已在人及动物寄生虫病的诊断中应用，片形吸 虫病的诊断方法主要是通过形态学检测成虫和感染动物排出的虫卵。建立片形吸虫特异 PCR诊断方法的关键是寻找敏感、特异的遗传标记。综上所述，现有检测方法存在检出率不高、假阳性较多、费时费力，容易出现误诊 和漏诊，敏感性有限等问题，迫切需要探讨一种使用方便、灵敏度高，且适合用于尾蚴和虫 卵的快速检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用PCR特异检测片形吸虫的试剂盒，所述的这种采 用PCR特异检测片形吸虫的试剂盒要解决现有技术中检测片形吸虫的方法检出率不高、假 阳性较多、费时费力，容易出现误诊和漏诊，敏感性有限的技术问题。本发明提供了一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，含有DNA裂解液、PCR反 应液和肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫DNA阳性对照液，所述的DNA裂解液中由细胞裂解 液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液 的终浓度为7-10 μ Μ,所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的终浓度为0. 5Μ，所述的蛋白酶 K在所述的DNA裂解液中的终浓度为18-20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的终 浓度为3-5uM，所述的PCR反应液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、 扩增大片吸虫的下游引物、扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl2配制而成，所 述的扩增肝片吸虫的下游弓丨物的序列为5 ‘-CCAATGACAAAGTGACAGCG-3，，所述的扩增大片吸
3虫的下游引物为5 ‘-CCAATGACAAAGTAACAGCA-3，，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物 的序列为5 ‘-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3，，在所述的PCR反应液中，所述的dATP、dTTP、dGTP 和dCTP的终浓度均为200μΜ，所述的扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物 和扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的终浓度均为50ρπιΟ1/μ L，所述的MgCl2的终 浓度为2mM。进一步的，所述的试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶。进一步的，所述的肝片吸虫、大片吸虫和中间型吸虫DNA阳性对照液的浓度均为 33.0-42ng/μ 1。进一步的，所述的Taq DNA聚合酶的浓度为6U/ μ L。进一步的，所述的Taq DNA聚合酶的体积为25 μ L。本发明还提供了一种采用特异PCR方法检测片型吸虫的方法，包括如下步骤(1)对未知吸虫的成虫、尾蚴、虫卵进行DNA的提取；(2)以上述提取的DNA作为模板，利用PCR反应液进行扩增，所述的PCR反应 液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物、 扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl2配制而成，所述的扩增肝片吸虫的 下游引物的序列为5 ‘ -CCAATGACAAAGTGACAGCG-3 ’，所述的扩增大片吸虫的下游引物 为5 ‘ -CCAATGACAAAGTAACAGCA-3 ’，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的序列为 5 '-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3'；(3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察。进一步的，PCR扩增条件为:92-95°C 预变性 4-6min ;92-95°C 变性 25-35sec、 50-60°C退火 25-35sec、70-74°C延伸 25_35sec，30-40 个循环；70_74°C后延伸 4_6min。进一步的，在所述的PCR反应液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的终浓度均 为200 μ M，所述的扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物和扩增肝片吸虫和 大片吸虫的共用上游引物的终浓度均为50pmol/yL，所述的MgCl2的终浓度为2mM。本发明同时提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(I)DNA的提取虫体材料置于1. 5mL的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次，移 去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA，56°C过夜消化15_18h ；消化好 的虫体悬液按 Promega 试剂盒Wizard SV Genomic DNA purification system 使用说明 提取虫体DNA，直接使用或于-20°C冰箱保存备用。尾蚴DNA的提取方法为将宿主螺用灭菌双蒸水反复洗5次，用两个载玻片将其压 碎，去掉外面的螺壳，螺肉内尾蚴的提取方法参照虫体的提取方法。虫卵DNA的提取方法参照MUller (2007)提纯虫卵的方法并加以改良，取0. 1克阳 性粪便于1. 5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0. IM的氢氧化钾的溶 液Iml室温下作用lOmin，其间不断摇勻。然后IOOOOrpm离心2min，去上清，重复前面的步 骤清洗两次。离心去上清后加入1. 2ml饱和硫代硫化钠溶液，混勻，HOOOrpm离心5min。 此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中。分别吸取200 μ 1上清到另一个1. 5ml Eppendorf管中，加入1. 2ml双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，保留100 μ 1左右液体， 用移液器吹打使沉淀与液体混勻。然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸 水，12000rpm离心2min。去上清，再加入1. 2ml双蒸水，如此重复3 5次。最后离心去上清，保留30 μ 1液体。在显微镜下操作，用移液器从纯化的虫卵中分别吸取1个、3个、5个虫卵到含有 30 μ 1双蒸水的1. 5ml Eppendorf管中，做好标记，以检测虫卵特异PCR检测方法的敏感性。加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡Imin后瞬时离心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm离心lmin，取3μ 1上清PCR扩增。(2) PCR扩增按照扩增样品数η (η =样品数+2)取PCR反应液、TaqDNA酶混合于 一离心管中，混勻，分装；将阳、阴性对照液分别加入一个分装管中，取各样品的DNA加入对 应反应管中；各反应管标记后离心混勻，置于PCR仪上反应；(3)PCR产物观察取扩增后的产物加样于1. 0%琼脂糖凝胶上，电泳后置于紫外 透射仪下观察结果并拍照分析。步骤⑵所述TaqDNA酶按每个PCR反应含1. 25U加入。步骤(2)所述PCR扩增条件为94°C预变性5min ;94°C变性30seC、55°C退火 30sec、72°C延伸 30sec，35 个循环；72°C后延伸 5min。本发明试剂盒PCR反应条件的优化过程为Mg2+浓度梯度在1. 5mM至3. OmM之间、退火温度在50°C至60°C之间进行调整，以取 得用ITS-2PCR扩增的最佳Mg2+浓度和最佳退火温度。经试验确定，最佳退火温度为60°C ； MgCl2的浓度为2. 5mM ；循环数选择为35个循环。本发明尤其适用于中间宿主螺中尾蚴和感染动物排出的虫卵的检测。本发明通过对来自于全球不同流行区(中国、尼日尔、法国、美国、西班牙)片形吸 虫成虫分离株、尾蚴、虫卵进行快速检测。本发明采用PCR技术，利用三种片形吸虫扩增了核糖体内转录间隔区-2基因(The second internal transcribed spacers (ITS-2) ofnuclear ribosomal DNA)白勺差异设计了 两对特异引物，发现了该段基因能特异的区分肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫和其他常见 感染人的寄生虫。本申请人根据片形吸虫ITS-2基因的特性并结合PCR技术的检测特点， 设计一种片形吸虫特异PCR检测的方法。本发明的有益效果是(1)本发明通过对来自于不同流行区的片形吸虫分离株进行遗传变异分析，通过 测序发现大片吸虫的ITS-2序列全长为361bp，肝片吸虫的ITS-2序列全长为362bp，两个 虫种的变异位点共有6个，但都很分散。设计引物时选择了 ITS-2序列第270bp-290bp之 间的序列作为下游引物，涵盖两个变异位点，并将271bp处的碱基A错配成G。本申请人根 据上述两个变异位点设计一种特异反应体系，建立了用于鉴别肝片吸虫、大片吸虫、中间型 吸虫的快速、特异、敏感的检测方法。(2)本发明通过优化反应体系和反应条件，研制出一种鉴别云肝片吸虫、大片吸虫、中 间型吸虫的特异性检测试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客 观，不仅可用于人和动物片形吸虫病的诊断与流行病学调查，还可用于研究片形吸虫分子鉴定 标记的开发与分析等科研用途，为片形吸虫病诊断和防治技术等进一步研究奠定基础。
图1为肝片吸虫特异性电泳图谱；其中，M，DL2000marker ； 1-8代表肝片吸虫，大片吸虫，中间型吸虫，日本血吸虫，同盘吸虫，胰阔盘吸虫，牛弓首蛔虫，水牛DNA ;9为阴性 对照。图2为为大片吸虫特异性电泳图；M，DL2000marker ； 1-8代表肝片吸虫，大片吸 虫，中间型吸虫，日本血吸虫，同盘吸虫，胰阔盘吸虫，牛弓首蛔虫，水牛DNA ；9为阴性对照。图3为肝片吸虫特异PCR敏感性电泳图谱；1代表DNA浓度为44. 16ng(肝片吸 虫)；2-7代表DNA稀释倍数如下:25，50，100，200，400，800倍；8为阴性对照。图4为大片吸虫特异PCR敏感性图谱；1代表DNA浓度为140. 96ng (大片吸虫)；
2-7代表DNA稀释倍数如下:25，50，100，200，400，800倍；8为阴性对照。图5为采用特异引物对肝片吸虫进行特异PCR检测的电泳图谱；1为大片吸虫成 虫阳性对照，2为贵州水牛的大片吸虫，3为广西水牛的大片吸虫，4为来自贵州山羊的肝片 吸虫，5为来自黑龙江奶牛的中间型吸虫，6-7为来自四川山羊的肝片吸虫，8为来自甘肃山 羊的肝片吸虫，9为来自南京山羊的肝片吸虫，10为来自法国山羊的肝片吸虫，11为来自尼 日尔黄牛的肝片吸虫，12为来自尼日尔绵羊的大片吸虫，13为阴性对照。图6为采用特异引物对大片吸虫特异PCR检测的电泳图谱；1为大片吸虫成虫阳 性对照，2为贵州水牛的大片吸虫，3为广西水牛的大片吸虫，4为来自贵州山羊的肝片吸 虫，5为来自黑龙江奶牛的中间型吸虫，6-7为来自四川山羊的肝片吸虫，8为来自甘肃山羊 的肝片吸虫，9为来自南京山羊的肝片吸虫，10为来自法国山羊的肝片吸虫，11为来自尼日 尔黄牛的肝片吸虫，12为来自尼日尔绵羊的大片吸虫，13为阴性对照。图7为采用特异引物对来自自然感染大片吸虫的水牛粪便中的虫卵进行特异PCR 检测的电泳图谱；1代表大片吸虫成虫样本(FgGXBl) ；2代表肝片吸虫成虫样本(FhCMA)；
3-11代表感染了大片吸虫的水牛粪便中的虫卵样本；12-17代表单个大片吸虫虫卵；18代 表未感染大片吸虫的水牛的粪便。图8为采用特异引物对自然感染大片吸虫尾蚴的中间宿主螺进行特异PCR检测的 电泳图谱；1代表大片吸虫成虫样本(FgGXBl) ；2代表肝片吸虫成虫样本(FhCMA) ；3_18代 表单个螺样本(感染大片吸虫尾蚴)；19代表未感染大片吸虫尾蚴的中间宿主螺样本。
具体实施例方式实施例1本发明一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，含有DNA裂解液、PCR反应液 和肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫DNA阳性对照液，所述的DNA裂解液中由细胞裂解液、 EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终 浓度为7-lOuM，所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的终浓度为0. 5M，所述的蛋白酶K在所 述的DNA裂解液中的终浓度为18-20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的终浓度 为3-5uM，所述的PCR反应液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、扩增 大片吸虫的下游引物、扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl2配制而成，所述的 扩增肝片吸虫的下游引物的序列为5 ‘-CCAATGACAAAGTGACAGCG-3，，所述的扩增大片吸虫的 下游引物为5 ‘-CCAATGACAAAGTAACAGCA-3，，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的序 列为 5 ‘-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3，，在所述的 PCR 反应液中，所述的 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP的终浓度均为200 μ M，所述的扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物和扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的终浓度均为50pmol/yL，所述的MgCl2的终浓 度为2mM。进一步的，所述的试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶。进一步的，所述的肝片吸虫、大片吸虫和中间型吸虫DNA阳性对照液的浓度均为 33. 0-42. Ong/μ 1。进一步的，所述的Taq DNA聚合酶的浓度为6U/ μ L。进一步的，所述的Taq DNA聚合酶的体积为25 μ L。实施例2 —个优选的试剂盒试剂盒内含DNA裂解液，其中含细胞裂解液(7 μ Μ)、ρΗ 8. 0的(终浓度0. 5Μ) EDTA、蛋白酶Κ(终浓度20mM)和RNase A溶液(终浓度5 μ M)的混合溶液共IOOml ；PCR反 应液100个反应(25 μ L/反应)是终浓度为200 μ M的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度为 50pmol/yL的扩增肝片吸虫的引物、终浓度为50pmol/y L的扩增大片吸虫的下游引物、终 浓度为50ρπιΟ1/μ L的扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物、终浓度为2mM的MgCl2的 混合溶液，25yL Taq DNA聚合酶(6U/μ L)；肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫DNA阳性对照 液。 实施例2试剂盒特异性试验用经过DNA有效性验证的肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫对照样品DNA各1 μ L 为模板，按照试剂盒的反应条件进行PCR扩增，同时设空白对照和试剂盒阴、阳性对照。表IPCR扩增体系
组份
PCR反应液 模板DNA
Taq DNA 聚合酶(8U/pL)
总体积
PCR扩增条件 94°C 变性 5min
94°C变性
30sec
体积
23.75μ
Ιμ 0. 25μ
25μ
60°C复性
72°C 延伸 30sec 72°C 延伸 5min
PCR产物在1. 0% TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系
3Osec 35个循环
统摄像。 结果试剂盒分别能够从肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫(两种引物均可扩出)样
7本DNA中扩出300bp的条带(图1和图2)。实施例3试剂盒的敏感性试验首先将片形吸虫成虫提取DNA后进行稀释，旋涡振荡混勻，按Eppendorf Biophotometer核酸蛋白测定仪的操作规程，检测其总DNA含量。肝片吸虫为44. 16ng，大 片吸虫为140. 96ng。按25，50，100，200，400，800倍稀释DNA, PCR扩增条件同上，同时设空 白对照。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以确定其敏感性。试验结果表明该PCR检 测方法敏感性高，最低能检测到0. Ilng的肝片吸虫，0. 35ng的大片吸虫(图3和图4)。实施例4试剂盒对来自不同地区片形吸虫样本的检测用经过DNA有效性验证的肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫(来自中国、尼日尔、法 国、美国、西班牙)样品DNA各1 μ L为模板，按照试剂盒的反应条件进行PCR扩增，同时设 空白对照和试剂盒阴、阳性对照。PCR产物在1. 0% TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系 统摄像。结果试剂盒分别能够从肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫(两种引物均可扩出)样 本DNA中扩出300bp的条带(图5和图6)。单独图5出来条带，即表示该片形吸虫为肝片 吸虫；单独图6出来条带，则表示它是大片吸虫；而两图一起出来，则表示它为中间型吸虫。实施例5试剂盒的保存期试验将在4°C和-20°C保存1个月、3个月、6个月、9个月的试剂盒对已知样品进行检 测，扩增条件同前述。结果表明试剂盒可在4°C (Bst酶除外，须-20°C保存)和-20°C保存 长期保存，在试验周期的9个月内，在合适保存条件下阳性样品均能扩增出目的亮带，而阴 性对照无目的亮带出现。实施例6试剂盒对自然感染大片吸虫水牛粪便中虫卵以及自然感染大片吸虫尾 蚴的中间宿主螺样品在诊断中的应用1.DNA 样品大片吸虫的虫卵15个样品、尾蚴样品16个样品，70%酒精保存备用。2. DNA 的提取尾蚴DNA的提取方法为将宿主螺用灭菌双蒸水反复洗5次，用两个载玻片将其压 碎，去掉外面的螺壳，螺肉内尾蚴的提取方法参照成虫的提取方法。虫卵DNA的提取方法参照MUller (2007)提纯虫卵的方法并加以改良，取0. 1克阳 性粪便于1. 5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0. IM的氢氧化钾的溶 液Iml室温下作用lOmin，其间不断摇勻。然后IOOOOrpm离心2min，去上清，重复前面的步 骤清洗两次。离心去上清后加入1. 2ml饱和硫代硫化钠溶液，混勻，HOOOrpm离心5min。 此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中。分别吸取200 μ 1上清到另一个1. 5ml Eppendorf管中，加入1. 2ml双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，保留100 μ 1左右液体， 用移液器吹打使沉淀与液体混勻。然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸 水，12000rpm离心2min。去上清，再加入1. 2ml双蒸水，如此重复3 5次。最后离心去上 清，保留30 μ 1液体。在显微镜下操作，用移液器从纯化的虫卵中分别吸取1个、3个、5个虫卵到含有 30 μ 1双蒸水的1. 5ml Eppendorf管中，做好标记，以检测虫卵特异PCR检测方法的敏感性。
加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡Imin后瞬时离心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm离心lmin，取3μ 1上清PCR扩增。3. PCR 扩增首先应用试剂盒对上述抽提的基因组DNA进行PCR扩增，同时做空白对照、阴性对 照和阳性对照。4.琼脂糖电泳分析PCR产物在1. 0% TBE琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。5.结果与分析对事先经过形态学鉴定的肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫成虫分离株、尾蚴、虫 卵样品进行PCR反应，以上样本均能快速被检测出(图7和图8)，证明了所建立的特异PCR 方法能有效快速的检测肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫感染，还可用于片形吸虫病的流行 病学调查研究。
权利要求
一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，其特征在于含有DNA裂解液、PCR反应液和肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫DNA阳性对照液，所述的DNA裂解液中由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终浓度为7 10uM，所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的终浓度为0.5M，所述的蛋白酶K在所述的DNA裂解液中的终浓度为18 20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的终浓度为3 5uM，所述的PCR反应液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物、扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl2配制而成，所述的扩增肝片吸虫的下游引物的序列为5‘ CCAATGACAAAGTGACAGCG 3’，所述的扩增大片吸虫的下游引物为5‘ CCAATGACAAAGTAACAGCA 3’，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的序列为5‘ ATATTGCGGCCATGGGTTAG 3’，在所述的PCR反应液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的终浓度均为200μM，所述的扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物和扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的终浓度均为50pmol/μL，所述的MgCl2的终浓度为2mM。
2.根据权利要求1所述的一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，其特征在于所 述的试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，其特征在于 所述的肝片吸虫、大片吸虫和中间型吸虫DNA阳性对照液的浓度均为33. 0-42. Ong/μ L·
4.根据权利要求2所述的一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，其特征在于所 述的Taq DNA聚合酶的浓度为6U/ μ L。
5.根据权利要求2所述的一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，其特征在于所 述的Taq DNA聚合酶的体积为25 μ L。
6.一种采用特异PCR方法检测片型吸虫的方法，其特征在于包括如下步骤(1)对未知吸虫的成虫、尾蚴、虫卵进行DNA的提取；(2)以上述提取的DNA作为模板，利用PCR反应液进行扩增，所述的PCR反应液 中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物、 扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl2配制而成，所述的扩增肝片吸虫的 下游引物的序列为5 ‘ -CCAATGACAAAGTGACAGCG-3 ’，所述的扩增大片吸虫的下游引物 为5 ‘ -CCAATGACAAAGTAACAGCA-3 ’，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的序列为 5 '-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3'；(3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察。
7.根据权利要求6所述的一种采用特异PCR方法检测片型吸虫、的方法，其特征在于 PCR 扩增条件为92-95°C预变性 4-6min ；92-95°C变性 25-35sec、50-60°C退火 25_35sec、 70-74°C延伸 25-35sec，30-40 个循环；70_74°C后延伸 4_6min。
8.根据权利要求6所述的一种采用特异PCR方法检测片型吸虫、的方法，其特征在于 在所述的PCR反应液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的终浓度均为200 μ Μ，所述的扩 增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物和扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游 引物的终浓度均为50pmol/ μ L，所述的MgCl2的终浓度为2mM。
全文摘要
本发明公开了一种片形吸虫特异PCR检测试剂盒，它含有DNA裂解液、PCR反应液和肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫DNA阳性对照液。本发明还提供了一种采用特异PCR方法检测片型吸虫的方法。本发明可快速、特异、灵敏地检测螺内片形吸虫尾蚴、感染动物粪便内片形吸虫虫卵的诊断和检测。本发明建立了用于检测肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫成虫、尾蚴、虫卵的快速、特异、敏感的PCR方法，可准确地鉴定肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫成虫、尾蚴、虫卵。本发明的试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，可用于片形吸虫的快速鉴别。
文档编号C12Q1/68GK101962679SQ20101029713
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者朱兴全, 李鑫, 艾琳, 陈家旭, 陈木新, 陈韶红 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所