一种猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及以一种猪流行性腹泻病毒M蛋白单域抗体。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV) 感染引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。感染PEDV的病猪主要通过粪便传播病毒，发 病猪主要表现腹泻、呕吐和脱水等临床特征，是导致哺乳仔猪死亡的主要传染病之一。1971 年，PED首次在英国发生，随后扩散到世界各地。我国于1980年首次分离到PEDV，2010年国内 大部分养猪地区发生PH)疫情，从哺乳仔猪到繁殖母猪均有发病，给养猪户造成了严重地经 济损失。PEDV属于尼多病毒目（Nidovirales)冠状病毒科(Coronavi ridae)冠状病毒属 (Coronav irus)，基因组是单股正链具有感染性的RNA，与其他冠状病毒相似，基因组Y 端有一个帽子结构（cap)，3'端有1个Poly (A)尾，基因组全长为2,8033 nt，分别编码S、 E、M和N等4个病毒结构蛋白。S担保存在的中和表位能够诱导机体产生中和抗体，对仔猪具 有良好的保护效果。PHW感染早期，机体能够产生抗N和N蛋白的高水平抗体，是研发病毒血 清抗体诊断方法的候选抗原。E蛋白在抗病毒研究方面具有应用前景。
[0003] 胳5它属外周血中存在的天然缺失轻链的重链抗体（variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH)具有其他陆生生物所不具备的生物学特征，它的抗原结合位 点仅由重链可变区单一结构域组成，却同普通IgG抗体一样保持着良好和特异的抗原结合 能力。VHH是目前可以得到的、具有完整功能的、最小IgG抗体分子片段，分子量为15kDa，是 常规IgG的1/10,单克隆抗体的1/3,分子高度4.8nm，直径2.2纳米，也称为纳米抗体 (nanobody) C3VHH抗体抗原结合位点具有伸展的抗原互补结合区和组织穿透性，可结合普通 IgG抗体无法接触的抗原表位。另外，体外重组VHH具有易表达和水溶性好等独特性质，在作 为小型化基因工程抗体、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前 景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体； 本发明的另一个目的是提供一种编码所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的 核苷酸序列； 本发明的再一个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码 序列在E.coli中的表达。
[0005] 本发明采用以下技术方案，一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所 述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.4，SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6，SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8。
[0006] -种重组表达载体，含有上述的核苷酸序列。
[0007] -种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。
[0008] 优选的，所述宿主细胞为含有上述表达载体的原核细胞。
[0009] 所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E. COli中的表达。
[0010] 本发明的效果在于:利用噬菌体展示技术构建PEDV M蛋白双峰驼源免疫文库，筛 选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性 表达和ELI SA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度0D405值的不同表明其同M蛋白结合 能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。
【附图说明】
[0011]图1是是抗PEDV M蛋白VHH克隆氨基酸序列比对结果图； 图2是E. Co I i中抗PEDV M蛋白VHH抗体SDS-PAGE分析图。
【具体实施方式】
[0012]下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0013]实施例1、猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的制备 1.材料和方法 1.1实验动物和试剂 2峰10月龄雌性双峰驼作为实验动物，牛淋巴细胞分离液，96孔酶标板;限制性内切酶， DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA产品，镍亲和层析树脂(Qiagen);E. coli重组 表达PEDV M抗原(His标签和GST标签）；菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌TGl和BL21 Star (DE3)、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2购于NEB公司，其它试剂均为国产分析纯。
[0014] 1.2方法 1.2.1骆驼免疫和抗体监测 首次免疫，用206佐剂(购于法国seepic公司），乳化500yg重组M蛋白皮下多点（背部，后 腿和颈部两侧肌肉）接种骆驼。首免21天后加强免疫，剂量为206乳化1000 yg M蛋白，与首免 间隔35天、42天和63天加强免疫，抗原接种剂量均为1000 yg M蛋白。在首次免疫前和每次 加强免疫前均采集静脉血并分离到血清，用M蛋白（GST标签)作为抗原的间接ELISA检测 PEDV抗体。本次免疫实验过程中，骆驼饲养管理，免疫，血液样品的采集均在专业兽医工作 人员监督指导下完成。
[0015] 1.2.2外周血的分离 最后一次免疫后7天（即第63天)颈静脉采抗凝血10 mL(抗凝剂为肝素钠，10IU/mL)，加 入等量的Han' s液做1倍稀释，而后加入等体积淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心分离外 周血总淋巴细胞。分离的淋巴细胞用MEM重悬中加入到六孔板中（37°C，5%C0 2)静止30 min， 吸附除去细胞碎片和巨噬细胞，离心收集淋巴细胞加入MEM，保存在液氮中用于细胞RNA提 取。
[0016] 1.2.3 VHH抗体免疫文库构建 设计3对引物（参见表1-VHH基因扩增用引物)通过三轮扩增得到编码VHH蛋白目的基 因。通过Trizol试剂抽提淋巴细胞总RNA，用Gl作为反转录引物，合成第一链cDNA，以cDNA为 模板，H1、G1为引物扩增得到600bp和900bp大小2条DNA带，回收600bp条带作为模板，进行第 2轮PCR扩增。
[0017] 以第2轮PCR产物为模板，H2、H3为引物得到450bp DNA带。以2轮PCR产物为模板， Pl，TN为上下游引物进行第3轮扩增得到450bp带。将第3轮PCR产物经过Sfi I/Notl双酶切克 隆到PHEN2载体，电转化方法将连接产物转化到TGl中，37°C，180r/min培养Ih，离心浓缩后 涂在氨苄抗性的2 X YTG平板(2%葡萄糖，100yg/mL Ampi )。同时取IOyL稀释至I X IO4倍涂 板，37°C过夜培养，计算库容。转化后平板37°C温箱中培养16小时，用IOmL的2 X YT培养基将 培养板上长出的菌苔刮