专利名称：复制缺陷型抗ev71和ca16病毒双价疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗制备技术领域，特别是一种复制缺陷型抗EV71和CA16病毒双价疫苗的制备方法。本发明是基于肠道病毒EV71-HB0803株的研究成果，该毒株由中国典型培养物保藏中心保藏(地址中国，武汉大学生命科学学院，武汉市武昌区八一路四9号， 430072)，保藏日期是2010年9月30日，保藏号是CCTCC NO :V201020。
背景技术：
肠道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒 A16 (Coxsakievirus A16, CA16)为手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)最主要的病原体，属于小 RNA 病毒科，肠道病毒属成员。EV71病毒CA16病毒在婴幼儿中引起手足口病的大范围暴发流行，并可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，病情发展快即可导致死亡，而EV71 更是被称之为脊髓灰质炎病毒之后最重要的神经病毒。卫生部2010年11月统计结果显示，全国丙类传染病发病中，手足口病高达79591例，死亡20例，在丙类传染病中高居第二位。我国自2007年以来日手足口病的多次大面积爆发，使得手足口病毒疫苗研发显得尤为迫切。EV71和CA16在手足口病例中多以混合感染的形式出现，也使双价疫苗的需求呼之欲出。EV71属于肠病毒属，其遗传物质为单一正股RNA。EV71基因组分为结构基因Pl和非结构基因P2P3。其结构蛋白Pl翻译形成的多聚蛋白在非结构基因表达的2A、3CD蛋白酶作用下切割成VP1、VP3、VP0。病毒在形态发生过程中必须专一性的选择正确的基因组RNA 并将之包裹入外壳蛋白质(Capsid)中，才能顺利形成成熟的病毒颗粒并离开宿主细胞。， 提有证据证明病毒的形成需要2CATPase与VP3蛋白质间专一性的结合。本发明将Pl结构基因整合到vero细胞中，形成可稳定表达Pl多聚蛋白的细胞系。再将以CA16病毒VPl替换掉Pl的重组型EV71复制子，通过转染的方式导入该细胞系。重组型复制子表达的2々、30)蛋白酶切割细胞表达的？1，形成￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4，再通过2C与VP3的相互作用，包装重组型复制子形成复制缺陷型病毒。该复制缺陷型病毒在此细胞系中可迅速复制，因而可大量快熟在此细胞中生产。由于缺失结构基因，在正常细胞中无法复制，但EV71病毒颗粒和所表达CA16病毒VPl可作为抗原，引起机体产生抗体，从而同时抗EV71和CA16。我国目前尚无有效的EV71病毒疫苗，已经申请的EV71病毒疫苗研发的专利技术仅1项。现有的EV71病毒疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、VLP疫苗、重组蛋白疫苗和DNA 疫苗多处于实验阶段，无法满足临床需求，且具有以下缺陷(1)上述所有疫苗均为单价疫苗；(2)减毒活疫苗仍然可以存活，有可能发生回复突变，再次变异为强毒株并引起疾病， 经动物实验证实，减毒活疫苗可在神经细胞中检测到其存在，具有潜在的危险；(3)灭活疫苗需大量扩增病毒、纯化并完全灭活，操作复杂，且灭活过程可能降低其免疫原性；(4) VLP 疫苗需大量表达结构蛋白，VLP的形成依赖于蛋白的自组装，效率较低且可能弓I入表达系统的其他蛋白；(5)重组蛋白疫苗需大量表达纯化病毒结构蛋白，DNA疫苗需大量获取病毒cDNA，操作复杂，代价较大。本发明所述基于Pl蛋白稳定表达细胞系和EV71-CA16病毒VPl 重组型复制子的疫苗制备方法，具有明显的优势，比如安全性高、制备速度快、同时抗EV71 和CA16、制备简便稳定，适用于大规模生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术的缺陷，提供一种基于稳定表达细胞系与重组型复制子的、安全性高、方便快速制备的复制缺陷型抗EV71和CA16双价疫苗的制备方法。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案
本发明提供的复制缺陷型抗EV71和CA16病毒双价疫苗的制备方法，包括构建EV71P1 多聚蛋白稳定表达细胞系、构建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的EV71病毒全长cDNA 克隆、转染Pl稳定表达细胞系获取复制缺陷型病毒和复制缺陷型病毒的检测的步骤，具体是
1.构建EV71P1多聚蛋白稳定表达细胞系
(1)重组慢病毒载体质粒构建
以引物 Pl-SalI-Kozak-F 和 Pl-NotI-R 对 EV71-HB0803 株(保藏号CCTCC NO V201020)全长cDNA克隆为模板进行PCR，酶切后连接到MLV逆转录病毒载体pFB-neo上， 得到插入Pl的载体pFB-neo-Pl，
Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA, Pl-NotI-R :CTCCCGCGGCCGC TTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC,
(2)假病毒包装
以pFB-neo-Pl和编码VSVG蛋白的pLP/VSVG质粒共转染用于包装MLV假病毒的 GP2-293细胞，获得假病毒，
(3)vero细胞G418最适筛选浓度的确定
以梯度稀释法确定vero细胞对G418最低敏感浓度，最低敏感浓度+100ug/ml即为抑制浓度，
(4)假病毒感染vero细胞及G418筛选阳性细胞单克隆
假病毒感染24h后加入含有筛选浓度G418的培养基，获得抗性细胞后继续以G418筛选单克隆；筛选3轮后在G418培养基中生长较快、长势良好的克隆，鉴定其Pl多聚蛋白表达情况，
(5)EV71Pl多聚蛋白稳定表达细胞系的PCR及Wfestern blot检测鉴定
提取细胞核酸和蛋白，分别用RT-PCR和Western Blot方法检测核酸水平和蛋白水平 Pl多聚蛋白的表达。2.获取重组CA16VP1基因的复制缺陷型病毒
(1)EV71全长cDNA克隆的构建逆转录PCR获取全长cDNA后克隆到pGEM-T easy载体上的T7启动子下游，得到EV71全长cDNA克隆pEV71，
(2)重组柯萨奇病毒CA16VP1基因质粒构建
提取大肠杆菌DH5 α /pT-CA16VPl (保藏号CCTCC NO :M2010376)中的质粒 pT-CA16VPl，PCR获得CA16VP1基因，并用CA16的VPl基因替换EV71全长cDNA克隆pEV71上的Pl区，
(3)获得复制缺陷型病毒
带有CA16 VPl的EV71重组子质粒体外转录后转染Pl稳定表达细胞系，收取上清中的缺陷型病毒，
(4)复制缺陷型病毒扩大培养
以获得的缺陷型病毒感染Pl稳定表达细胞系，获得大量的子代复制缺陷型病毒， 经过上述步骤，得到可用于制备抗EV71和CA16病毒双价疫苗的复制缺陷型病毒。在假病毒包装过程中，将GP2-293细胞于37°C、体积浓度为5%0)2细胞培养箱中， 以DMEM+10%FBS培养基进行培养。本发明采用以下方法对GP2-293细胞进行培养转染前一天，将每皿5X106个细胞的密度接种于IOcm细胞培养皿中；待细胞培养至70%-80%时，将培养基更换为新鲜的 DMEM+10%FBS培养基；Ih后，将5ugpFB-neo_Pl和2. 5ugpLP/VSVG共转染用于包装MLV假病毒的GP2-293细胞，转染6-8 h后将培养基更换为DMEM+2%FBS ；24h后观察收取上清，加入新鲜培养基，48h后再次收取细胞上清；两次上清合并后离心，除去细胞碎片，以0. 45 μ m孔径滤器过滤，获得整合有Pl基因的MLV假病毒。在共转染GP2-293细胞过程中，所采用的转染试剂为磷酸钙转染试剂。本发明通过RT-PCR获得EV71病毒全长cDNA，并克隆到pGEM_T easy载体上的T7 启动子下游，得到EV71-HB0803株全长cDNA克隆pEV71。所述CA16VP1基因是通过提取大肠杆菌DH5 α /pT_CA16VPl (保藏号CCTCC NO M2010376)中的质粒PT-CA16VP1，然后进行PCR获得。本发明以overlap-PCR的方法用CA16的VPl基因替换EV71-HB0803株全长cDNA 克隆PEV71上的Pl区，引物为
primer-1 ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC，
primer-2 TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT, primer-3 :ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA， primer-4 :TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTC ΤΑ, primer-5 TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA， primer-6 :GTTCCGATACCACGGTGTC。所述Primer-1 和 primer-2、primer-5 和 primer-6 分别以 EV71 全长 cDNA 克隆pEV71为模板进行PCR，Primer-3和primer-4以pT_CA16VPl质粒为模板PCR ；片段以胶回收试剂盒纯化后按1:1:1比例混合，以I^rimer-I和primer-6为上下游引物进行 overlap-PCR,得至Ij overlap-PCR 产物。所述overlap-PCR产物两端带有的SnaBI和Mil单酶切位点，将产物片段和EV71 全长cDNA克隆pEV71分别酶切后加入T4DNA连接酶连接；连接产物转换DH5 α感受态细胞，挑单克隆接菌培养，并以质粒提取试剂盒提取质粒，经irwitrogen公司测序检测无误。本发明制备的复制缺陷型病毒，可以采用以下方法进行检测
(1)复制缺陷型病毒滴度测定
以复制缺陷型感染Pi稳定表达细胞系，取时间点收病毒，有限连续稀释测定滴度；
(2)复制缺陷型病毒的检测将浓缩的的复制缺陷型病毒制备样品，电镜观察。本发明与现有技术相比具有以下的主要优点
(1)操作简便，所需时间短，以少量复制缺陷型病毒感染稳定表达Pi细胞系到产生下一代复制缺陷型病毒只需Mh。(2)复制缺陷性疫苗不能复制，安全性高；
(3)产量大，产生的复制缺陷病毒滴度高达IO6到IO8；
(4)直接从细胞上清收取复制缺陷病毒作为疫苗，杂质少，便于纯化。
图1为EV71P1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图2为Pl稳定表达细胞系PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。图3为Pl稳定表达细胞系western blot鉴定Pl蛋白表达。图4为EV71HB0803株全长cDNA逆转录PCR产物电泳图。图5为复制缺陷型病毒滴度测定。图6为复制缺陷型病毒电镜图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明做进一步描述。1. EV71P1多聚蛋白稳定表达细胞系的构建 (1)重组质粒构建
根据EV71病毒EV71-HB0803株(CCTCC保藏号V201020)基因组Pl基因序列设计一对引物
Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA, Pl-NotI-R CTCCCGCGGCCGCTTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC， 扩增片段为W89bp。为便于PCR产物的克隆，上、下游引物分别添加一个Mil和NotI酶切位点。为提高表达效率，上游引物上引入了真核生物Kozak序列。该引物由hvitrogen 公司合成。以EV71-HB0803株cDNA为模板进行PCR，得到大小为2589 bp的片段(图1)。将获得的用DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司生产)回收PCR产物。以载体 pGEM-T easy(购自promega公司)连接后，转化大肠杆菌DH5 α，获得重组质粒。经序列测定， 说明PCR扩增获得DNA片段为本发明需要的目的片段。用NotI和MlI分别酶切重组质粒和慢病毒载体pFB-neo (Agilent Technology)，回收Pl片段和线性化的pFB-neo，经iMDNA 连接酶(promega公司生产)连接后，转化大肠杆菌DH5 α。用plasmid mini kit (omega) 试剂盒提取质粒，测序鉴定无误，此质粒命名为pFB-neo-Pl。(2)假病毒包装
GP2-293细胞(clontech公司生产)于37°C、5%0)2细胞培养箱中以DMEM+10%FBS培养基进行培养。转染前一天，将每皿5 X IO6个细胞的密度接种于IOcm细胞培养皿中。待细胞培养至70%-80%时，将培养基更换为新鲜的DMEM+10%FBS培养基。Ih后，将5ugpFB-neo_Pl 和2. 5ug编码VSVG囊膜蛋白的pLP/VSVG(invitrogen公司生产)共转染GP2-293细胞，转染试剂为磷酸钙(invitrogen公司)，转染后6_8 h将培养基更换为DMEM+2%FBS。24h后观察收取上清，加入新鲜培养基，4 后再次收取细胞上清。两次上清合并后离心，除去细胞碎片，以0. 45 μ m孔径滤器过滤，即获得整合有Pl基因的MLV假病毒。(3) vero细胞G418最适筛选浓度的确定
以梯度稀释法确定vero细胞对G418最低敏感浓度。将vero细胞接种至12孔板中，加入不含G418的DMEM+10%FBS细胞培养基。24h后，吸去培养基，换为浓度依次为含有IOOug/ ml-700ug/mKM18的新鲜培养基。每2_3天以同等浓度的G418选择培养基换液一次。7_14 天后观察细胞死亡情况，发现300ug/ml以上浓度的G418可使细胞全部死亡。使细胞全部死亡的最低浓度+100ug/ml=G418最适筛选浓度，可得vero细胞的G418最适筛选浓度为 400ug/ml。(4)假病毒感染vero细胞及G418筛选阳性细胞单克隆
感染前一天，将vero细胞以3X IO6个细胞的密度接种于IOOmrn细胞培养皿中，收取未变黄的上清以0. 45nm孔径的滤膜过滤备用。融合度达到70%假病时，假病毒以M0I=5感染 vero细胞。感染M小时后，吸去培养基，以PBS洗一次，加入含有400ug/ml G418 (GE公司)的DMEM+10%FBS培养基进行抗生素筛选。可看到有耐药性克隆出现，以胰酶消化制备细胞悬液，计数并稀释至1个/IOul。向96孔板的每个孔中加入50ul含有400ug/ml G418的 DMEM+10%FBS，然后加入IOul细胞悬液。在显微镜下寻找只有一个细胞的孔，向其中加入前述收取的培养液上清50ul。待单克隆成片后转入48孔板中培养，以同样方法继续筛选两轮。将得到的细胞系western检测Pl蛋白表达量，取表达量较高的细胞扩大培养后冻存。 已冻存的细胞复苏适用时，前两代需以含有400ug/ml G418的培养基培养。(5) EV71多聚蛋白Pl稳定表达细胞系鉴定 1)PCR鉴定
取500ul细胞悬液，5000rpm离心IOmin沉淀细胞，加入ImlTRIZOL (invitrogen公司)， 混勻后室温静置5min。加入200ul氯仿，震荡15s，静置anin。4°C 8000g离心15min。吸取上层水相，转移至一个新的EP管中，加入500ul异丙醇，混勻静置10min，4°C 8000g离心 15min。沉淀以75%乙醇洗一次，4°C 7500g离心5min。吸去乙醇，室温静置至无可见液体， 加入60ulDEPC水。取15ul，加入lulEV71特异性引物EV71-R 5’- AGAGGGAGRTCTATCTCYCC -3’ ，
70 V水浴5min后立即置于冰上，加入IulMLV逆转录酶(promega公司生产)， 2ul 10Xbuffer, IulRNasin (promega 公司生产)，IuldNTPs (Roche 公司生产)，37°C 水浴 30min。得到的 cDNA 以针对EV71VP1 的特异性引物(EV71-F 5' -GARAGYTCTATAGGRGAYAG-3'； EV71-R 5' -AGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3，)进行 PCR 检测，得到大小为的片段(图 2)。2) Western blot 检测鉴定
收集细胞溶于50ul PBS，按比例加入6X蛋白胶上样缓冲液混勻后，95°C加热10 min, 10% SDS-PAGE分离样品。电泳结束后，用半干转移法将蛋白胶上的蛋白转移至NC膜。 将NC膜置于含5% BSA的TBS中4°C封闭过夜。TBS-T洗涤3次(每次10 min)后，加入 1 1000稀释的兔抗VPl血清(抗体稀释液为TBS+0. 5% BSA) 37°C孵育2 h，洗膜3次后，加入AP标记羊抗兔IgG (1:2 500稀释)于37°C孵育1 h后，洗涤4次，用BCIP/NBT显色液室温避光显色10 min，可看到大小约97KD的条带(图3)。
2转染Pl稳定表达细胞系获取复制缺陷型病毒 (1) EV71全长cDNA克隆的构建
以QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒^jIAGEN公司生产)提取EV71基因组RNA，具体操作步骤参见产品说明书。提取的病毒RNA溶于60ulDEPC水中，取14ul，加入lulEV71 特异性引物EV71-RT
GCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC
70 V水浴5min后立即置于冰上，加入IulMLV逆转录酶(promega公司生产)， 2ul 10Xbuffer, IulRNasin (promega 公司生产)，IuldNTPs (Roche 公司生产)，37°C 水浴 30min。得到EV71病毒的cDNA。以EV71cDNA为模板，用LA taq聚合酶进行全长PCR。具体操作如下取 3ulEV71cDNA,加入 IuldNTPs (Roche 公司生产)，IulLA taq 聚合酶(Takara 公司生产)， 5ullOXLA taq buffer,以及上下游引物各Iul
RT-PCR FCTGTCGACGTCTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCAC ； RT-PCR RACCGCTATGCATGCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC ； 补加超纯水至50ul。为方便克隆，引物两端分别引入了 Aat II和Nsi酶切位点。PCR获得大小为7408bp 的片段(图4)。PCR产物以PCR产物纯化试剂盒(omega公司生产)纯化。将纯化后的PCR产物和 pGEM-T easy载体分别以Aat II (NEB公司生产)和Nsi I (NEB公司生产)酶切过夜，以PCR 产物纯化试剂盒(omega公司生产)纯化后加入T4连接酶(promega公司生产)连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，即得到EV71病毒的全长克隆，命名为pEV71。
(2)重组柯萨奇病毒CA16VP1基因质粒构建
根据CA16病毒VPl区基因多序列比对设计overlap-PCR引物，以overlap-PCR的方法用末端加有EV712A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16VP1基因替换pEV71上的Pl基因， 引物序列如下
primer-1 ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC ；
primer-2: TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT ； primer-3: ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA ； primer-4: TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTCTA ； primer-5: TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA ； primer-6 GTTCCGATACCACGGTGTC。Primer-I 和 primer-2、primer-5 和 primer-6 分别以 EV71-HB0803 株 cDNA 为模板进行PCR。用plasmid mini kit 试剂盒(omega 公司生产)从大肠杆菌 DH5 α /pT_CA16VPl 中提取质粒PT-CA16VP1，质粒上含有CA16病毒的VPl基因，以primer-3和primer-4进行 PCR。PCR产物以胶回收试剂盒纯化后按1:1:1比例混合，以primerl和primer-6为上下游引物进行overlap-PCR。overlap-PCR产物两端带有的SnaBI和Mil单酶切位点， 将产物片段和EV71-HB0803株全长cDNA克隆分别酶切后加入T4DNA连接酶(promega)连
9接。连接产物转换DH5ci感受态细胞，挑单克隆接菌培养，并以质粒提取试剂盒提取质粒， 经invitrogen公司测序检测无误，即获得重组CA16病毒VPl的重组质粒pEV_CA16VPl。所述大肠杆菌DH5a/pT-CA16VPl已由中国典型培养物保藏中心保藏(地址中国，武汉大学生命科学学院，武汉市武昌区八一路四9号，430072)，保藏日期是2010年12 月 31 日，保藏号是 CCTCC NO :M2010376o(3)重组质粒转染Pl稳定表达细胞系
15ugpEV-CA16VPl以Nsi I (NEB公司生产)酶切过夜后，以氯仿异戊醇04:1)抽提两次，用无水乙醇沉淀，并以70%乙醇洗一次，获得的线性化DNA溶于无核酶水中。并以 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems — T7 体外转录试剂盒(promega 公司生产)进行体外转录，具体操作步骤见产品说明书。体外转录后，加入DNA酶(promega公司生产)消化15min，除去其中的DNA模板，并以氯仿异戊醇04:1)抽提两次后以无水乙醇沉淀，方法同上，即得到RNA。转染前一天，将Pl稳定表达细胞以每皿5 X IO6个细胞的密度接种于IOcm细胞培养皿中。待细胞培养至70%-80%时，将培养基更换为新鲜的DMEM+10%FBS培养基。池后，以 6ug上述体外转录出的RNA转染Pl稳定表达细胞，转染试剂为TransMessengeKQIAGEN公司生产)，转染后6-8 h将培养基更换为DMEM+2%FBS。96h将细胞培养物冻融三次，离心除去细胞碎片即得到EV71复制缺陷型病毒。(4)复制缺陷型病毒扩大培养将Pl稳定表达细胞以每皿5X IO6个细胞的密度接种于IOcm细胞培养皿中，加入收取的复制缺陷型病毒，吸附一个半小时后将培养基更换为新鲜的DMEM+2%FBS。72 h后收取上清中的病毒，方法同上。离心除去细胞碎片后将沈mL 含有缺陷型病毒的上清装入SW^离心管(Beckman公司生产)中，30 000 Xg超速离心1 h (4°C)，每管沉淀用大约100 uL PBS重悬，测定浓度，分装，用于检测或者冻存于-80°C。(5)复制缺陷型病毒滴度测定
以复制缺陷性病毒感染Pl稳定表达细胞系。通过测定TCID50来测定病毒滴度。病毒感染Pl稳定表达细胞系后，隔2、4、6、9、12、20、28、36、48、72小时收病毒，病毒液从KT1到 10_1(1作连续10倍的稀释。在每孔加入细胞悬液100μ1，使细胞量达到2 3X105个/ml。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排，将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μ1。对每一稀释度中的每一空逐日观察细胞病变效应，并记录结果，得到每一时间点的病毒滴度，以此绘制病毒的生长曲线(图5)。图中复制缺陷病毒在Pl稳定表达细胞系中的可达到IO6到108，比ΗΒ0803株稍低。3.复制缺陷型病毒的电镜观察
于干净的一次性手套上滴加10 μ L浓缩的缺陷型病毒，用专用镊子(北京新兴百瑞公司生产)将铜网(北京新兴百瑞公司生产)插入假型病毒的液滴中，吸附aiiin。滴加10 UL 1% PTA负染液于干净的一次性手套另一处，将铜网从假型病毒的液滴中取下，滤纸条轻轻吸去多余的液体后，将铜网插入负染液的液滴中，染色anin。将铜网从负染液中取出，吸去多余液体，于干燥处放置过夜，在透射电镜(中科院武汉病毒所分析测试中心)下进行观察， 拍照，在电镜下可以看到大量的病毒颗粒结构(图6)。尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种复制缺陷型抗EV71和CA16病毒双价疫苗的制备方法，其特征在于该方法的步骤包括构建EV71P1多聚蛋白稳定表达细胞系、构建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的 EV71病毒全长cDNA克隆、转染Pl稳定表达细胞系获取复制缺陷型病毒作为疫苗，具体是(1)构建EV71P1多聚蛋白稳定表达细胞系1)重组慢病毒载体质粒构建以引物Pl-SalI-Kozak-F和 Pl-NotI-R对保藏号为 CCTCC NO :V201020 的 EV71-HB0803 株全长cDNA克隆为模板进行PCR，酶切后连接到MLV逆转录病毒载体pFB-neo上，得到插入 Pl 的载体 pFB-neo-Pl，Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA,Pl-NotI-R :CTCCCGCGGCCGC TTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC,2)假病毒包装以pFB-neo-Pl和编码VSVG蛋白的pLP/VSVG质粒共转染用于包装MLV假病毒的 GP2-293细胞，获得假病毒，3)vero细胞G418最适筛选浓度的确定以梯度稀释法确定vero细胞对G418最低敏感浓度，最低敏感浓度+100ug/ml即为抑制浓度，4)假病毒感染vero细胞及G418筛选阳性细胞单克隆假病毒感染24h后加入含有筛选浓度G418的培养基，获得抗性细胞后继续以G418筛选单克隆；筛选3轮后在G418培养基中生长较快、长势良好的克隆，鉴定其Pl多聚蛋白表达情况，5)EV71Pl多聚蛋白稳定表达细胞系的PCR及Wfestern blot检测鉴定提取细胞核酸和蛋白，分别用RT-PCR和Western Blot方法检测核酸水平和蛋白水平 Pl多聚蛋白的表达，(2)获取重组CA16VP1基因的复制缺陷型病毒1)EV71全长cDNA克隆的构建逆转录PCR获取全长cDNA后克隆到pGEM_T easy载体上的T7启动子下游，得到EV71全长cDNA克隆pEV71，2)重组柯萨奇病毒CA16VP1基因质粒构建提取保藏号为CCTCC NO :M2010376的大肠杆菌DH5 α /pT_CA16VPl中的质粒 pT-CA16VPl，PCR获得CA16VP1基因，并用CA16的VPl基因替换EV71全长cDNA克隆pEV71 上的Pl区，3)获得复制缺陷型病毒带有CA16 VPl的EV71重组子质粒体外转录后转染Pl稳定表达细胞系，收取上清中的缺陷型病毒，4)复制缺陷型病毒扩大培养以获得的缺陷型病毒感染Pl稳定表达细胞系，获得大量的子代复制缺陷型病毒，经过上述步骤，得到的复制缺陷型病毒即为抗EV71和CA16病毒双价疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是在假病毒包装过程中，将GP2-293细胞于37°C、体积浓度为5%ω2细胞培养箱中，以DMEM+10%FBS培养基进行培养。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是采用以下方法对GP2-293细胞进行培养转染前一天，将每皿5X IO6个细胞的密度接种于IOcm细胞培养皿中；待细胞培养至70%-80%时，将培养基更换为新鲜的DMEM+10%FBS培养基；Ih后，将5ugpFB-neo_Pl和 2. 5ugpLP/VSVG共转染用于包装MLV假病毒的GP2-293细胞，转染6-8 h后将培养基更换为 DMEM+2%FBS ；24h后观察收取上清，加入新鲜培养基，4 后再次收取细胞上清；两次上清合并后离心，除去细胞碎片，以0. 45 μ m孔径滤器过滤，获得整合有Pl基因的MLV假病毒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是在共转染GP2-293细胞过程中，所采用的转染试剂为磷酸钙转染试剂。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是通过RT-PCR获得EV71病毒全长cDNA， 并克隆到pGEM-T easy载体上的T7启动子下游，得到EV71-ΗΒ0803株全长cDNA克隆 pEV710
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于CA16VP1基因是通过提取大肠杆菌 DH5 α /pT-CA16VPl中的质粒pT_CA16VPl，然后进行PCR获得。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于以overlap-PCR的方法用CA16的VPl 基因替换EV71-HB0803株全长cDNA克隆pEV71上的Pl区，引物为primer-Ι ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC，primer-2 TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT, primer-3 :ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA， primer-4 :TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTC ΤΑ, primer-5 TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA, primer-6 :GTTCCGATACCACGGTGTC。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于I^rimer-I和primer-2、primer-5和 primer-6分别以EV71全长cDNA克隆pEV71为模板进行PCR，Primer-3和primer-4以 PT-CA16VP1质粒为模板PCR ；片段以胶回收试剂盒纯化后按1:1:1比例混合，以I^rimer-I 和primer-6为上下游引物进行overlap-PCR，得到overIap-PCR产物。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于overlap-PCR产物两端带有的SnaBI 和Mil单酶切位点，将产物片段和EV71全长cDNA克隆pEV71分别酶切后加入T4DNA连接酶连接；连接产物转换DH5 α感受态细胞，挑单克隆接菌培养，并以质粒提取试剂盒提取质粒，经invitrogen公司测序检测无误。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所制备的复制缺陷型病毒，采用以下方法进行检测(1)复制缺陷型病毒滴度测定以复制缺陷型感染Pi稳定表达细胞系，取时间点收病毒，有限连续稀释测定滴度；(2)复制缺陷型病毒的检测将浓缩的的复制缺陷型病毒制备样品，电镜观察。
全文摘要
本发明是复制缺陷型抗EV71和CA16病毒双价疫苗的制备方法，该方法包括构建EV71P1多聚蛋白稳定表达细胞系、构建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的EV71病毒全长cDNA克隆、转染P1稳定表达细胞系获取复制缺陷型病毒的步骤。本发明的优点是(1)操作简便，所需时间短，以少量复制缺陷型病毒感染稳定表达P1细胞系到产生下一代复制缺陷型病毒只需24h；(2)复制缺陷性疫苗不能复制，安全性高；(3)产量大，产生的复制缺陷病毒滴度高达106到108；(4)直接从细胞上清收取复制缺陷病毒作为疫苗，杂质少，便于纯化。
文档编号C12N15/85GK102284058SQ20111000847
公开日2011年12月21日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者张万坡, 张振峰, 李红霞, 柯贤良, 王汉中, 郑振华 申请人:中国科学院武汉病毒研究所