抗tim-3抗体的制作方法

专利名称：抗tim-3抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体或其抗体片段与含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子-3 (在后文中称为“TIM-3”)的胞外区结合，并表现出抗体依赖性细胞性细胞毒性(在后文中称为“ADCC”)；生产所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA ;包含所述DNA的载体；通过转化所述载体而获得的转化体；使用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法；以及使用所述抗体或其抗体片段的诊断剂或治疗剂。
背景技术：
Μ-3基因家族由小鼠中的8个基因和人类中的3个基因组成，并且每个这些基因分别位于11号染色体和染色体5q33处(非专利文献I)。已知这些基因区域与自体免疫性疾病和过敏性疾病相关。TIM蛋白是具有结构保守的免疫球蛋白可变(IgV)结构域和粘蛋白结构域的I型跨膜蛋白。TIM蛋白被认为特异性表达在T细胞上并直接调控T细胞活性，但是最近有关于 Μ-3蛋白在抗原呈递细胞中的表达及其功能的报道(非专利文献2)。根据晶体结构分析，TIM蛋白具有保守的蛋白结构，并在IgV结构域中具有配体结合位点。TIM-3被鉴定为特异性表达在小鼠Thl细胞上但不表达在Th2细胞上的分子(非专利文献3)。可以在公共数据库例如GenBank登记号NM_032782和NM-134250中获得 Μ-3的DNA序列、氨基酸序列和三维结构。
Μ-3也被称为HAVCR2。
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在人类中，与小鼠类似， Μ-3被表达在T细胞以及吞噬细胞例如巨噬细胞和树突状细胞上。
Μ-3与蛋白配体(例如半乳糖凝集素9)的结合能够通过诱导凋亡的机制来抑制Thl应答，从而导致例如诱导了外周耐受。用siRNA降低人TIM-3的表达或通过阻断性抗体抑制人TIM-3，增加了 Y干扰素(IFN- Y )从⑶4阳性T细胞的分泌，这支持了 TIM-3在人T细胞中的抑制作用。在吞噬细胞中，TIM-3还作为用于识别凋亡细胞的受体而起作用。来自于自体免疫性疾病患者的临床样品的分析显示，在⑶4阳性细胞中没有TIM-3的表达。具体来说，在源自于患有多发性硬化症的患者的脑脊液的T细胞克隆中，与源自于正常健康人的克隆相比，1'頂-3的表达水平更低并且0^-^的分泌水平更高(非专利文献4)。关于 Μ-3与过敏性疾病或哮喘的关联性，已有报道(专利文献I和2)。根据来自于急性髓性白血病(在后文中称为“AML”)患者的造血干细胞和正常造血干细胞的微阵列分析，TIM-3被表达在AML干细胞上，因此，所述分析表明 Μ-3参与恶性血液病(非专利文献5和专利文献3)。到目前为止，建立的抗 Μ-3单克隆抗体的实例包括抗人 Μ-3大鼠单克隆抗体(Clone 344823，由 R&D Systems 制造)和抗人 Μ-3 小鼠单克隆抗体(Clone F38-2E2，由R&D Systems 制造)。相关技术专利文献
专利文献1:W096/27603专利文献2:TO2003/063792专利文献3:W02009/091547非专利文献非专利文献I:Hafler D A 等，J Exp Med.205:2699-701 (2008)非专利文献2:Anderson A C 等，Science 318:1141-3 (2007 )非专利文献3:Monney L 等，Nature 415:536-41 (2002)非专利文献4:Kogu chi K 等，J Exp Med.203:1413-8 (2006)非专利文献5:Majeti R 等，Proc Natl Acad Sci USA 2009 Mar.3; 106
(9):3396-401.

发明内容
本发明要解决的问题然而，还没有关于具有ADCC活性的针对人 Μ-3的单克隆抗体的报道。因此，本发明的目的是提供与 Μ-3的胞外区的氨基酸序列或三维结构结合并表现出ADCC活性的单克隆抗体或抗体片段。此外，本发明的目的是通过筛选与所述单克隆抗体或其抗体片段竞争的抗人TIM-3抗体来提供具有高ADCC活性的抗人TIM-3抗体。此外，本发明将提供生产所述抗体的杂交瘤，编码所述抗体的DNA，包含所述DNA的载体，通过转化所述载体而获得的转化体，使用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法，以及使用所述抗体或其抗体片段作为活性成分的诊断剂或治疗剂。问题的解决方案本发明的要点涉及下列项。( I)单克隆抗体或其抗体片段，其与人TIM-3的胞外区结合，同时与选自下面(i )至(iii)的一种抗体竞争:(i)抗体，其包括含有互补决定区(在后文中称为“⑶R”)l至3的抗体重链(在后文中称为“H链”)，所述互补决定区I至3包含分别由SEQ ID NO:1至3表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体轻链(在后文中称为“L链”)，所述⑶Rl至3包含分别由SEQID NO:4至6表示的氨基酸序列，(ii)抗体，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ IDNO: 11至13表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 14至16表示的氨基酸序列，(iii)抗体，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ IDNO:21至23表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:24至26表示的氨基酸序列。( 2)上面(I)中所描述的单克隆抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体与选自上面(i)至(iii)的一种抗体所结合的相同表位结合。(3)单克隆抗体或其抗体片段，其与人TIM-3的胞外区结合，同时与选自下面(a)和(b)的一种抗体竞争:(a)抗体，其包括含有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的抗体VL，(b)抗体，其包括含有由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列的抗体VL。(4)上面(3)中所描述的单克隆抗体或其抗体片段，其与选自上面(a)或(b)的一种抗体所结合的相同表位结合。(5)上面(I)至(4)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段，其是重组抗体。(6)上面(5)中所描述的单克隆抗体或其抗体片段，其是选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的重组抗体。( 7 )单克隆抗体或其抗体片段，其是选自下面(i )至(i i i )的一种:(i)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:1至3表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:4至6表示的氨基酸序列，(ii)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 11至13表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 14至16表示的氨基酸序列，(iii)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:21至23表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 24至26表示的氨基酸序列。(8)单克隆抗体及其抗体片段，其是选自下面(a)和(b)的一种:
(a)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的抗体VL，(b)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列的抗体VL。(9)单克隆抗体及其抗体片段，其与由SEQ ID NO:53表示的人 Μ-3的IgV结构域的氨基酸序列中第67至第105位的氨基酸序列、第67至第96位的氨基酸序列或第67至第87位的氨基酸序列结合。(10)上面(I)至(9)任一项中所描述的抗体片段，其中所述抗体片段是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗体片段。(11) DNA,其编码上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段。(12)重组载体，其包含上面(11)中所描述的DNA。(13)转化体，其可以通过将上面(12)中所描述的重组载体导入到宿主细胞中来获得。(14)用于生产上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段的方法，所述方法包括将上面(13)中所描述的转化体在培养物中进行培养以形成并积累上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段，以及从培养物回收单克隆抗体或其抗体片段。(15)用于免疫检测或测定人 Μ-3的方法，所述方法包括使用上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段。
(16)用于检测或测定人 Μ-3的试剂，所述试剂包含上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段。(17)与人 Μ-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，所述诊断剂包含上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段。(18)用于诊断与人 Μ-3阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段检测或测定人ΤΙΜ-3阳性细胞。(19)用于诊断与人 Μ-3阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段检测或测定人ΤΙΜ-3。(20)上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段用于制造与人ΤΙΜ-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂的应用。(21)与人 Μ-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段。(22)与人 Μ-3阳性细胞相关的疾病的治疗方法，所述方法包括使用上面(I)至
(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段诱导人ΤΙΜ-3阳性细胞的细胞死亡。(23)上面(I)至(10)任一项中所描述的单克隆抗体或其抗体片段用于制造与人ΤΙΜ-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂的应用。发明效果本发明的单克隆抗体或抗体片段特异性识别人ΤΙΜ-3的胞外区的氨基酸序列或三维结构，并与所述胞外区 结合。被本发明的单克隆抗体或抗体片段识别的人ΤΙΜ-3的胞外区的氨基酸序列或三维结构不同于被已知的抗 Μ-3单克隆抗体识别的那些。因此，本发明的单克隆抗体或抗体片段具有更高的ADCC活性。本发明的与人ΤΙΜ-3的胞外区特异性结合并具有较高的ADCC活性的单克隆抗体或抗体片段可用作与人ΤΙΜ-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂和诊断剂。本发明可以提供生产所述抗体的杂交瘤，编码所述抗体的DNA，包含所述DNA的载体，通过转化所述载体而获得的转化体，使用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法，以及使用所述抗体或其抗体片段的诊断剂或治疗剂。


图1是分别表示抗体8213的所设计的H链可变区的HVO、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HVlO和HV12的氨基酸序列。图2是分别表示抗体8213的所设计的L链可变区的LVO、LV2、LV4、LV5、LV6、LV7和LV9的氨基酸序列。
具体实施例方式本发明的人 Μ-3包括:包含由SEQ ID NO:53或NCBI登记号ΝΜ_032782表示的氨基酸序列并具有 Μ-3的功能的多肽；包含与由SEQ ID NO:53或NCBI登记号ΝΜ_032782表示的氨基酸序列具有至少60%同源性、优选至少80%同源性、更优选至少90%同源性、最优选至少95%同源性的氨基酸序列并具有ΤΙΜ-3的功能的多肽；等等。包含由SEQ ID NO:53或NCBI登记号ΝΜ_032782表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸残基后的氨基酸序列的多肽，可以通过例如使用定点突变法将定点突变引入到包含由SEQ ID NO:53表示的氨基酸序列的多肽的编码DNA中来获得，所述定点突变法被描述在《分子克隆实验指南》第二版(Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Second Edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、《现代分子生物学实验方法》(Current Protocols in Molecular Biology) (Johnffiley&Sons, 1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79，6409 (1982) ,Gene, 34，315 (1985)、或 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82，488 (1985)由
寸T O对缺失、取代、或添加的氨基酸残基的数量没有具体限制，并且所述数量优选为I至几十个，例如I至20个,更优选为I至几个,例如I至5个。作为编码人 Μ-3的基因，其实例包括由SEQ ID NO:52或NCBI登记号NM_032782表示的核苷酸序列。实例还包括:包含由SEQ ID NO:52或NCBI登记号NM_032782表示的核苷酸序列中缺失、取代或添加至少一个核苷酸后的核苷酸序列并包含具有TIM-3功能的多肽的编码DNA的基因；包含与由SEQ ID NO:52或NCBI登记号NM_032782表示的核苷酸序列具有至少60%同源性、优选至少80%同源性、更优选至少95%同源性的核苷酸序列并包含具有 Μ-3功能的多肽的编码DNA的基因；在严格条件下与由SEQ ID NO:52或NCBI登记号NM_032782表示的核苷酸序列构成的DNA杂交并编码具有 Μ-3功能的多肽的基因；
坐坐寸寸ο在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是指使用由SEQ ID NO:52或NCBI登记号NM_032782表示的核苷酸序列构成的DNA作为探针通过集落杂交、噬菌斑杂交、DNA印迹杂交、或DNA微阵列分析等获得的DNA。这种DNA的具体实例是可以`通过以下步骤而鉴定到的DNA:在0.7到1.0mol/L氯化钠存在下使用具有固定在其上的集落或噬菌斑来源的DNA、编码所述DNA序列的PCR产物或寡DNA的滤膜或载玻片在65°C下进行杂交，然后在65°C下用0.1到2倍浓度的SSC溶液(I倍浓度的SSC溶液:150mmol/L氯化钠和15mmol/L柠檬酸钠)洗涤滤膜或载玻片。可以按照《分子克隆实验指南》第二版(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, SecondEdition) , Cold Spring Harbor Lab.Press (1989)、《现代分子生物学实验方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology) , John Wiley&Sons (1987-1997)、《DNA 克隆1:核心技术实用方法》第二版(DNA Cloning1: Core Techniques, A Practical Approach, SecondEdition) , Oxford University (1995)等中描述的方法进行杂交。具体来说，能够杂交的DNA包括与由SEQ ID NO:52或NCBI登记号NM_032782表示的核苷酸序列具有至少60%或更高同源性、优选80%或更高同源性、更优选95%或更高同源性的DNA。在真核生物蛋白的编码基因的核苷酸序列中经常识别到遗传多态性。本发明中所使用的TIM-3基因也包括通过这种多态性而在核苷酸序列中产生少量修饰的基因。除非另有指明，否则本发明中所描述的同源性数值可以是通过使用技术人员已知的同源性检索程序而计算出的数值。对于核苷酸序列来说,可以通过在BLAST [J.Mol.Biol.，215，403 (1990)]等中使用默认参数来计算该数值，对于氨基酸序列来说，可以通过在 BLAST2[Nucleic Acids Res.，25，3389(1997)、Genome Res., 7, 649(1997)>http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/informations, html]等中使用默认参数来计算
该数值。作为默认参数,G (开放空位罚分(cost to open gap))对于核苷酸序列来说是5,对于氨基酸序列来说是11 ;-E(空位延伸罚分(cost to extend gap)对于核苷酸序列来说是2,对于氨基酸序列来说是I ;_q(核苷酸错配罚分(penalty for nucleotide mismatch))是-3 ；-r (核苷酸匹配奖分(reward for nucleotide match))是 I ;-e (期望值(expectvalue))是10 ；-ff (字长(wordsize))对于核苷酸序列来说是11个残基，对于氨基酸序列来说是3个残基；-y (以位数表示的非空位延伸下降(X) (dropoff (X) for blast extensionsin bits))对于blastn来说是20,对于blastn之外的程序来说是7 ；-X (以位数表示的空位比对下降值 X(Xdropoff value for gapped alignment in bits))是 15 ;Z (以位数表不的最终空位比对下降值 X(final X dropoff value for gapped alignment in bits))对于 blastn 来说是 50,对于 blastn 之外的程序来说是 25 (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。可以根据技术人员已知的方法制备包含由SEQ ID NO:53或NCBI登记号NM_032782表示的氨基酸序列的 部分序列的多肽。例如，可以通过将编码由SEQ ID NO:52表示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对其中导入了含有所述DNA的表达载体的转化体进行培养来制备所述多肽。此外，基于由此制备的多肽或DNA，可以以与上述相同的方式制备包含由SEQ IDNO:53或NCBI登记号NM_032782表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸后的氨基酸序列的多肽。也可以通过化学合成方法例如荷甲氧基羰基(Fmoc)方法或叔丁氧基羰基(tBoc)方法来生产包含由SEQ ID NO:53或NCBI登记号NM_032782表示的氨基酸序列的部分序列的多肽或包含由SEQ ID NO:53或NCBI登记号NM_032782表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加至少一个氨基酸后的氨基酸序列的多肽。本发明的人 Μ-3的胞外区例如包括通过用常规已知的跨膜区预测程序SOSUI(http://bp.nuap.nagoya_u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)、TMHMM ver.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)> ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.0rg/)或 SMART (http://smart, embl-heidelberg.de/)利用由 SEQ ID NO:53表示的多肽的氨基酸序列所预测的区域。在本发明中，人 Μ-3的胞外区的氨基酸序列包括由SEQ ID NO:53表示的氨基酸序列中第I至第201位的氨基酸序列，这是通过SMART预测的胞外区的区域。在本发明中，对人 Μ-3的胞外区的三维结构没有限制，只要包含由SEQ ID NO:53或GenBank登记号NM_032782表示的氨基酸序列的人 Μ-3的胞外区具有与天然状态下相同的结构即可。人 Μ-3的胞外区在天然状态下的三维结构是被表达在细胞膜表面上的人 Μ-3的三维结构的天然类型。就人TIM-3的功能而言，TIM-3与蛋白配体(例如半乳糖凝集素9)的结合能够通过诸如在Thl细胞中诱导凋亡的机制来抑制Thl应答，从而导致诱导了外周耐受。在吞噬细胞中，人 Μ-3作为用于识别凋亡细胞的受体而起作用。本发明中的抗体或其抗体片段与人TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构的结合可以通过常规已知的免疫检测方法利用表达人 Μ-3的细胞来证实，所述免疫检测方法例如放射免疫测定法与固相夹心法或酶联免疫吸附测定法(ELISA)、以及优选的荧光细胞染色方法，其中证实了表达特定抗原的细胞与该特定抗原的抗体的结合能力。具体实例包括利用FMAT8100HTS系统(由Applied Biosystems制造)等的荧光抗体染色方法[Cancer Immunol.1mmunother.，36，373 (1993)]、利用流式细胞术的突光细胞染色方法、利用Biacore System (由GE Healthcare制造)等的表面等离子体共振、等等。此外，可以将已知的免疫检测方法[《单克隆抗体:原理与实践》第三版(Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition), AcademicPress (1996);《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual) , Cold SpringHarbor Laboratory (1988);《单克隆抗体实验手册》(Monoclonal Antibody ExperimentManual)，Kodan-sha Scientific (1987)]等进行组合来证实所述结合。在本发明中，表达人TIM-3的细胞可以是任何细胞，只要它表达人TIM-3即可，实例包括人体中天然存在的细胞、从人体中天然存在的细胞建立的细胞系、通过重组技术获得的细胞等。人体中天然存在的细胞的实例包括在患有癌症、自体免疫性疾病或过敏性疾病的患者体内表达TIM-3的细胞，具体来说，所述细胞是Thl细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。从人体中天然存在的细胞建立的细胞系的实例包括在通过建立从上述癌症患者获得的表达人TIM-3的细胞而制备的细胞系中，表达人TIM-3的细胞系，其实例包括从人的细胞建立的人急性髓性白血病细胞系KG-1 (ATCC登记号:CCL-246)、人Burkitt淋巴瘤细胞系 Daudi (ATCC 登记号:CCL-213)等。通过重组技术获得的细胞的具体实例可以包括通过将包含人 Μ-3的编码cDNA的表达载体导入到昆虫细胞、或动物细胞等中而获得的表达人TIM-3的细胞等。

此外，本发明涉及识别人 Μ-3的胞外区的氨基酸序列或三维结构并表现出ADCC活性的单克隆抗体。本发明的ADCC活性是指这样的反应，其中，与细胞表面上的人 Μ-3结合的抗体通过Fe区与主要为自然杀伤细胞(在后文中称为NK细胞)的表面上的Fe Y RIIIa结合，因此，从NK细胞释放的细胞毒性分子例如穿孔素分子和颗粒酶引起细胞裂解[ClarkM, Chemical Immunology, 65, 88 (1997) ;Gorter A 等，Immunol.Today, 20，576 (1999)]。本发明的抗体可以是任何抗体，只要它是识别人TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构并与所述胞外区结合的抗体或其抗体片段或者是与人 Μ-3的胞外区或其三维结构结合并具有ADCC活性的抗体或其抗体片段即可。本发明的抗体的具体实例可以包括与选自以下序列的氨基酸序列或其三维结构结合的抗体:在人TIM-3的胞外区的氨基酸序列中优选第67至第105位、更优选第67至第96位、最优选第67至第87位的序列，所述人 Μ-3的胞外区由SEQ ID NO:53所表示的序列中第I至第201位的序列构成。抗体的实例包括下面(i)至(iii)中所描述的单克隆抗体及其抗体片段:(i)单克隆抗体或其抗体片段，其包括含有互补决定区(在后文中称为“⑶R”)I至3的抗体重链(在后文中称为“H链”)，所述互补决定区I至3包含分别由SEQ ID N0:1至3表示的氨基酸序列；并包括含有CDRl至3的抗体轻链(在后文中称为“L链”)，所述CDRl至3包含分别由SEQ ID NO:4至6表示的氨基酸序列，(ii)单克隆抗体或其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 11至13表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 14至16表示的氨基酸序列，(iii)单克隆抗体或其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:21至23表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 24至26表示的氨基酸序列。单克隆抗体的实例包括下面(a)和(b)中所描述的单克隆抗体及其抗体片段:(a)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的抗体VL，(b)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列的抗体VL。此外，本发明的抗体包括在与人 Μ-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合中与上述单克隆抗体竞争的单克隆抗体或其抗体片段；以及与上述单克隆抗体所结合的存在于人 Μ-3的胞外区上的相同表位结合的单克隆抗体或其抗体片段。在本发明中，与单克隆抗体竞争的抗体是指与本发明的单克隆抗体识别人TIM-3的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述表位结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的人TIM-3的氨基酸序列的抗体。本发明的单克隆抗体包括由杂交瘤生产的抗体和由用含有抗体的编码基因的表达载体转化后的转化体生产的重组抗体。单克隆抗体是由单个克隆的生产抗体的细胞所分泌的抗体，并且只识别一个表位(也称为抗原决定簇)并具有相同的氨基酸序列(一级结构)。表位的实例包括被单克隆抗体识别并结合的单个氨基酸序列、包含所述氨基酸序列的三维结构、结合有糖链的氨基酸序列、包含结合有糖链的氨基酸序列的三维结构等。本发明的单克隆抗体优选结合于在由SEQ ID NO:53表示的人 Μ-3的胞外区中人TIM-3的IgV结构域的第22至131位的氨基酸序列。具体来说，本发明的单克隆抗体所结合的氨基酸序列优选为由SEQID NO:53表示的氨基酸序列中第67至第105位的氨基酸序列，更优选为第67至第96位的氨基酸序列，最优选为第67至第87位的氨基酸序列。本发明的单克隆抗体所结合的表位优选可以被包含在人TIM-3的IgV结构域中，所述结构域是由SEQ ID NO:53所表示的人 Μ-3的胞外区中第22至第131位的氨基酸序列表示的。具体来说，本发明的单克隆抗体所结合的表位优选被包含在由SEQ ID N0:53表示的氨基酸序列中第67至第105位的氨基酸序列中，更优选被包含在第67至第96位的氨基酸序列中，最优选被包含在第67至第87位的氨基酸序列中。本发明的单克隆抗体所结合的表位的氨基酸序列可以优选包括至少一个选自在人 Μ-3的IgV结构域中的由SEQ ID NO:53表示的氨基酸序列中第67至第87位的氨基酸序列的氨基酸，更优选包括至少一个选自第67位、第74位、第76位、第78位、第79位、第81位、第83位和第85位氨基酸的氨基酸 。本发明的单克隆抗体所结合的表位的氨基酸序列可以优选包括至少两个或更多个选自人TIM-3IgV结构域的第67至第87位的连续的氨基酸；更优选可以包括至少一个选自第67位、第74位、第76位、第78位、第79位、第81位、第83位和第85位氨基酸的氨基酸并包括至少两个或更多个选自由SEQ ID NO:53表示的氨基酸序列中第67至第87位的氨基酸序列的连续的氨基酸。具体来说，本发明的单克隆抗体所结合的表位的氨基酸序列的实例包括由SEQ IDNO: 53表示的氨基酸序列中的包含第67至第74位氨基酸的氨基酸序列，包含第67至第76位氨基酸的氨基酸序列，包含第67至第78位氨基酸的氨基酸序列，包含第67至第79位氨基酸的氨基酸序列，包含第67至第81位氨基酸的氨基酸序列，包含第67至第83位氨基酸的氨基酸序列，包含第67至第85位氨基酸的氨基酸序列，包含第74至第76位氨基酸的氨基酸序列，包含第74至第78位氨基酸的氨基酸序列，包含第74至第79位氨基酸的氨基酸序列，包含第74至第81位氨基酸的氨基酸序列，包含第74至第83位氨基酸的氨基酸序列，包含第74至第85位氨基酸的氨基酸序列，包含第76至第78位氨基酸的氨基酸序列，包含第76至第79位氨基酸的氨基酸序列，包含第76至第81位氨基酸的氨基酸序列，包含第76至第83位氨基酸的氨基酸序列，包含第76至第85位氨基酸的氨基酸序列，包含第78至第79位氨基酸的氨基酸序列，包含第78至第81位氨基酸的氨基酸序列，包含第78至第83位氨基酸的氨基酸序列，包含第78至第85位氨基酸的氨基酸序列，包含第79至第81位氨基酸的氨基酸序列，包含第79至第83位氨基酸的氨基酸序列，包含第79至第85位氨基酸的氨基酸序列，包含第81至第83位氨基酸的氨基酸序列，包含第81至第85位氨基酸的氨基酸序列，`包含第83至第85位氨基酸的氨基酸序列，等等。例如可以通过以下步骤来制备杂交瘤:制备上述表达 Μ-3的细胞作为抗原，从用所述抗原免疫接种后的动物诱导具有抗原特异性的生产抗体的细胞，并将生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合。通过培养杂交瘤或将杂交瘤细胞施用于动物以在动物中弓I起腹水肿瘤，并对培养物或腹水进行分离和纯化，可以获得抗 Μ-3抗体。用抗原免疫接种的动物可以是任何动物，只要可以制备杂交瘤即可，适合使用的是小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、或兔等。此外，可以从这样的动物获得具有生产抗体的能力的细胞，并且本发明的抗体包括通过将体外免疫后的细胞与骨髓瘤细胞融合而获得的杂交瘤所生产的抗体。在本发明中，重组抗体包括通过基因重组产生的抗体，例如人嵌合抗体、人CDR移植抗体、人抗体及其抗体片段。在重组抗体中，作为治疗剂，优选的是具有普通单克隆抗体的特性、低免疫原性和延长的血液半衰期的重组抗体。重组抗体的实例包括通过使用重组技术修饰本发明的上述单克隆抗体而制备的抗体。人嵌合抗体是包含非人类动物的抗体的VH和VL以及人抗体的重链恒定区(在后文中称为CH)和轻链恒定区(在后文中称为CL)的抗体。具体来说，本发明的人嵌合抗体可以通过以下步骤来生产:从生产特异性识别人 Μ-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，将它们每一个都插入到包含人抗体的CH和CL的编码DNA的动物细胞用表达载体中从而构建用于表达人嵌合抗体的载体，然后将所述载体导入到动物细胞中以表达所述抗体。作为人嵌合抗体的CH，可以使用任何CH，只要它属于人免疫球蛋白(在后文中称为“hlg”)即可，优选的是属于hlgG类的那些，并且可以使用属于hlgG类的亚类例如hlgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4中的任一个。作为人嵌合抗体的CL，可以使用任何CL，只要它属于hlg类即可，并且可以使用属于K类或λ类的那些。本发明的人嵌合抗体的具体实例包括包括含有由SEQ ID NO:28表示的氨基酸序列的抗体VH并包括含有由SEQ ID NO:30表示的氨基酸序列的抗体VL的嵌合抗体。此外，本发明的嵌合抗体包括在与人 Μ-3的胞外区或其三维结构结合中与上述单克隆抗体竞争的嵌合抗体；以及与上述嵌合抗 体所结合的存在于人 Μ-3的胞外区上的相同表位结合的嵌合抗体。 人CDR移植抗体也被称为人源化抗体，是其中非人类动物抗体的VH和VL的CDR被移植到人抗体的VH和VL的适当位置中的抗体。本发明的人CDR移植抗体可以通过以下步骤来生产:构建编码抗体V区的cDNA，其中源自于非人类动物的、由生产特异性识别TIM-3的三维结构并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的杂交瘤生产的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到适合的人抗体的VH和VL的骨架(在后文中称为“FR”)中；将它们每一个都插入到包含人抗体的CH和CL的编码基因的动物细胞用表达载体中，从而构建用于表达人源化抗体的载体；并将所述载体导入到动物细胞中以表达和生产人源化抗体。作为人CDR移植抗体的CH，可以使用任何CH，只要它属于人免疫球蛋白(在后文中称为“hlg”)即可，优选的是属于hlgG类的那些，并且可以使用属于hlgG类的亚类例如hlgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4中的任一个。作为人⑶R移植抗体的CL，可以使用任何CL，只要它属于hlg类即可，并且可以使用属于K类或λ类的那些。本发明的⑶R移植抗体的实例包括其中抗体VH的⑶Rl至3包含分别由SEQ IDNO:21、22和23表示的氨基酸序列并且抗体VL的CDRl至3包含分别由SEQ ID NO:24、25和26表示的氨基酸序列的人源化抗体。人源化抗体的具体实例包括含有下面(a) VH和(b) VL中的至少一个的人源化抗体:(a)抗体的VH，其包含由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列或其中至少一个选自在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第12位的Lys、第20位的Val、第38位的Arg、第40位的Ala、第48位的Met、67位的Arg、第68位的Val、第70位的He、第72位的Ala、第74位的Thr、第98位的Arg和第113位的Val的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列，(b)抗体的VL，其包含由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列或其中至少一个选自在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第11位的Leu、第13位的Ala、第15位的Val、第36位的Tyr、第43位的Ala、第44位的Pro、第46位的Leu、第71位的Phe和第85位的Thr的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。作为被包含在人源化抗体中的VH，下面的(I)至(8)是优选的:(1)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第12位的Lys、第20位的Val、第38位的Arg、第40位的Ala、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第70位的lie、第72位的Ala、第74位的Thr、第98位的Arg和第113位的Val被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；(2)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第12位的Lys、第38位的Arg、第40位的Ala、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第70位的lie、第72位的Ala、第74位的Thr和第98位的Arg被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；(3)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第20位的Val、第38位的Arg、第48位的Met、第68位的Val、第70位的lie、第72位的Ala、第98位的Arg和第113位的Val被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；(4)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第38位的Arg、第40位的Ala、第48位的Met、第67位的Arg、第72位的Ala、第74位的Thr和第98位的Arg被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；(5)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第12位的Lys、第67位的Arg、第68位的Val、第72位的Ala、第74位的Thr和第98位的Arg被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；

(6)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第38位的Arg、第40位的Ala、第48位的Met、第67位的Arg和第98位的Arg被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；(7)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第38位的Arg、第48位的Met、第67位的Arg和第74位的Thr被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列；以及(8)VH，其包含其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中第38位的Arg、第48位的Met和第98位的Arg被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。通过氨基酸修饰获得的上述VH的氨基酸序列包括其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列氨基酸修饰中的至少一个修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys,用Leu取代第20位的Val,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg或用Leu取代第113位的Val。其中引入了 12个修饰的后VH的氨基酸序列的具体实例包括其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val。其中引入了 11个修饰后的VH的氨基酸序列的实例包括下面的氨基酸序列(I)至
(12):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Ly s，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(10)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(11)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Leu取代第113位的Val ；以及(12)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg。其中引入了 10个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(8):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第
70位的He，用V al取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第
70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的 Val ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的 Val ；
(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第
70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的 Val ；

(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第
70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ;以及(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第
70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg0其中引入了 8个修饰后的VH的氨基酸序列的实例包括下面的氨基酸序列(I)至(13):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(10)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Gly取代第98位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；

(11)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(12)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；以及(13)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Argo其中引入了 7个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(11):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Ala取代第68位的Val，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Ala取代第68位的Val，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(10)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Leu取代第70位的He，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ;以及(11)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg。其中引入了 6个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(16):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Gly取代第98位的Arg ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys,用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Gly取代第98位的Arg ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val和用Gly取代第98位的Arg ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys， 用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Gly取代第98位的Arg ；(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val和用Gly取代第98位的Arg ；(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(10)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(11)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Ala取代第68位的Val和用Gly取代第98位的Arg ；(12)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(13)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；(14)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；(15)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg ；以及(16)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala，用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg。其中引入了 5个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(7):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Gly取代第98位的Arg ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg和用Gly取 代第98位的Arg ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg和用Gly取代第98位的Arg ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Ala取代第68位的Val和用Gly取代第98位的Arg ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Leu取代第70位的Ile和用Gly取代第98位的Arg ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met，用Lys取代第67位的Arg，用Val取代第72位的Ala和用Gly取代第98位的Arg ；以及(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg,用Lys取代第74位的Thr和用Gly取代第98位的Arg。其中引入了 4个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(8):
(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Lys取代第74位的Thr ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第67位的Arg ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第67位的Arg ；

(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Arg取代第40位的Ala，用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第67位的Arg ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Ala取代第68位的Val ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Leu取代第70位的Ile ;(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Val取代第72位的Ala;以及(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met,用Lys取代第67位的Arg和用Gly取代第98位的Arg。其中引入了 3个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(9):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Gly取代第98位的Arg ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys，用Lys取代第38位的Arg和用Ile取代第48位的Met ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val，用Lys取代第38位的Arg和用Ile取代第48位的Met ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Arg取代第40位的Ala和用Ile取代第48位的Met ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg,用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第67位的Arg ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Ala取代第68位的Val ；(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Leu取代第70位的Ile ；(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Val取代第72位的Ala ；以及(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg，用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第74位的Thr。其中引入了 2个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(21):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys和用Lys取代第38位的Arg ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val和用Lys取代第38位的Arg ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Arg取代第40位的Ala ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Ile取代第48位的Met ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Lys取代第67位的Arg ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Ala取代第68位的Val ；
`
(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Leu取代第70位的Ile ;(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Val取代第72位的Ala ；(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Lys取代第74位的Thr ；(10)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Gly取代第98位的Arg ；(11)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg和用Leu取代第113位的Val ；(12)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys和用Ile取代第48位的Met ；(13)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val和用Ile取代第48位的Met ；(14)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Arg取代第40位的Ala和用Ile取代第48位的Met ；(15)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第67位的Arg ；(16)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Ala取代第68位的Val ；(17)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Leu取代第70位的Ile ;(18)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Val取代第72位的Ala ；(19)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Lys取代第74位的Thr ；(20)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Gly取代第98位的Arg ；以及(21)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met和用Leu取代第113位的Val。其中引入了 I个修饰后的VH的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(12):(I)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第12位的Lys ；(2)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第20位的Val ；(3)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第38位的Arg ；(4)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Arg取代第40位的Ala ；(5)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ile取代第48位的Met ；(6)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第67位的Arg ；(7)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ala取代第68位的Val ；(8)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第70位的Ile ；(9)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第72位的Ala;(10)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Lys取代第74位的Thr ；(11)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Gly取代第98位的Arg ；以及(12)其中在由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第113位的Val。

作为被包含在人源化抗体中的VL，下面的(I)至(6)是优选的:(1)VL，其包含其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第11位的Leu、第13位的Ala、第15位的Val、第36位的Tyr、第43位的Ala、第44位的Pro、第46位的Leu、第71位的Phe和第85位的Thr被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。(2)VL，其包含其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第11位的Leu、第15位的Val、第36位的Tyr、第44位的Pro、第46位的Leu、第71位的Phe和第85位的Thr被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。(3)VL，其包含其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第15位的Val、第36位的Tyr、第44位的Pro、第46位的Leu、第71位的Phe和第85位的Thr被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。(4)VL，其包含其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第36位的Tyr、第43位的Ala、第44位的Pro、第46位的Leu和第85位的Thr被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。(5)VL，其包含其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第15位的Val，第36位的Tyr，第46位的Leu和第71位的Phe被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。(6) VL，其包含其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中第36位的Tyr和第44位的Pro被其他氨基酸残基取代后的氨基酸序列。通过氨基酸修饰获得的上述VL的氨基酸序列包括其中在由SEQID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列氨基酸修饰中的至少一个修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr。其中引入了 9个修饰后的VL的氨基酸序列的实例包括其中在由SEQ ID N0:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后`的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr。其中引入了 8个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(9):(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；
(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第
71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第
71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第
71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Tyr取代第
71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(8)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第8 5位的Thr ；以及(9)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Tyr取代第71位的Phe。其中引入了 7个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(9):(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；

(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(8)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ;以及(9)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Tyr取代第
71位的Phe。其中引入了 6个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(6):(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu,用Leu取代第36位的Tyr,用Phe取代第44位的Pro,用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；以及(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr。其中引入了 5个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(7):(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro和用Gly取代第46位的Leu ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Tyr取代第71位的Phe ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Tyr取代第71位的Phe ；

(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；以及(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr,用Phe取代第44位的Pro,用Gly取代第46位的Leu,用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr。其中引入了 4个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(10):(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Gly取代第46位的Leu和用Tyr取代第71位的Phe ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro和用Gly取代第46位的Leu;(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro和用Tyr取代第71位的Phe ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro和用Asp取代第85位的Thr ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ；(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Tyr取代第71位的Phe ；(8)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Gly取代第46位的Leu和用Asp取代第85位的Thr ；(9)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr ;以及(10)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Gly取代第46位的Leu，用Tyr取代第71位的Phe和用Asp取代第85位的Thr。其中引入了 3个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(7):`
(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu，用Leu取代第36位的Tyr和用Phe取代第44位的Pro ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第13位的Ala，用Leu取代第36位的Tyr和用Phe取代第44位的Pro ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val，用Leu取代第36位的Tyr和用Phe取代第44位的Pro ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Ser取代第43位的Ala和用Phe取代第44位的Pro ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro和用Gly取代第46位的Leu ；(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro和用Tyr取代第71位的Phe ；以及(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr，用Phe取代第44位的Pro和用Asp取代第85位的Thr。其中引入了 2个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至(15):
(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr和用Phe取代第44位的Pro ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu和用Leu取代第36位的Tyr ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第13位的Ala和用Leu取代第36位的Tyr ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val和用Leu取代第36位的Tyr ；

(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr和用Ser取代第43位的Ala ；(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr和用Gly取代第46位的Leu ；(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr和用Tyr取代第71位的Phe ；(8)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr和用Asp取代第85位的Thr ；(9)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu和用Phe取代第44位的Pro ；(10)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第13位的Ala和用Phe取代第44位的Pro ；(11)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val和用Phe取代第44位的Pro ；(12)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ser取代第43位的Ala和用Phe取代第44位的Pro ；(13)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Phe取代第44位的Pro和用Gly取代第46位的Leu ；(14)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Phe取代第44位的Pro和用Tyr取代第71位的Phe ；以及(15)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Phe取代第44位的Pro和用Asp取代第85位的Thr。其中了 I个修饰后的VL的氨基酸序列的具体实例包括下面的氨基酸序列(I)至
(9):(I)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Met取代第11位的Leu ；(2)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Val取代第13位的Ala ；(3)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第15位的Val ；(4)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Leu取代第36位的Tyr ；(5)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Ser取代第43位的Ala ；(6)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Phe取代第44位的Pro ；(7)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Gly取代第46位的Leu ；(8)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Tyr取代第71位的Phe ;以及(9)其中在由SEQ ID NO:69表示的氨基酸序列中引入了下列修饰后的氨基酸序列:用Asp取代第85位的Thr。此外，本发明的人源化抗体的实例包括其中抗体VH包含由SEQID NO:67表示的氨基酸序列和/或抗体VL包含由SEQ ID: 69表示的氨基酸序列的人源化抗体，其中抗体VH包含由SEQ ID NO:67表示的氨基酸序列和/或抗体VL包含图2中所示的任一个氨基酸序列的人源化抗体，或其中抗体VH包含图1中所示的任一个氨基酸序列和/或抗体VL包含由SEQ ID:69表示的氨基酸序列的人源化抗体。此外，本发明的人源化抗体的实例包括在与人TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合中与本发明的单克隆抗体竞争的人源化抗体；以及与上述人源化抗体所结合的存在于人 Μ-3的胞外区上的相同表位结合的人源化抗体。人抗体最初是人体中天然存在的抗体，但是它也包括从基于遗传工程、细胞工程和发育工程技术的最新进展制备的人抗体噬菌体文库或生产人抗体的转基因动物获得的抗体。人体中存在的抗体例如可以通过以下步骤来制备:分离人外周血淋巴细胞，通过用EB病毒等感染使其永生化，然后使其克隆化从而获得能够生产所述抗体的淋巴细胞，对由此获得的淋巴细胞进行培养，并从培养上清液中纯化所述抗体。人抗体噬菌体文库是其中通过将从人B细胞制备的编码抗体的基因插入到噬菌体基因中而在噬菌体表面上表达抗体片段例如Fab和scFv的文库。表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体可以通过利用它与固定有抗原的基质的结合活性作为指标而从文库中得到回收。抗体片段可以通过遗传工程技术进一步转变为包含两条完整的H链和两条完整的L链的人抗体分子。生产人抗体的转基因动物是其中人抗体基因被整合到细胞中的动物。具体来说，生产人抗体的转基因动物可以通过以下步骤来制备:将编码人抗体的基因导入到小鼠ES细胞中，将ES细胞移植到小鼠的早期胚胎中，然后使其发育。通过以下步骤从生产人抗体的转基因非人类动物制备人抗体:通过通常在非人类哺乳动物中进行的杂交瘤制备方法获得生产人抗体的杂交瘤,对获得的杂交瘤进行培养,并在培养上清液中形成和积累人抗体。在构成上述抗体或其抗体片段的氨基酸序列中，其中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加但仍与上述抗体或其抗体片段具有相似活性的抗体或其抗体片段也被包括在本发明的抗体或抗体片段中 。缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸数量是一个或多个，并且没有具体的限制，但是它在通过已知方法例如定点突变法所能缺失、取代、或添加的范围之内，所述定点突变法被描述在《分子克隆》第二版(Molecular Cloning, Second Edition), Cold Spring HarborLaboratory Press( 1989)、《现代分子生物学实验方法》(Current Protocols in MolecularBiology) , John ffiley&Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) >Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79，6409 (1982)、Gene,34，315 (1985)、Nucleic AcidsResearch, 13，4431 (1985)、或 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 488(1985)等中。例如，数量优选为I至几十个，更优选为I至20个，进一步优选为I至10个，最优选为I至5个。在上述抗体的氨基酸序列中“一个或多个氨基酸残基被缺失、取代、插入和/或添力口”的表述意义如下。即，它意味着在该序列和一个或多个氨基酸序列中的任选位置处，存在着一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同时发生，并且被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然类型或非天然类型的。天然类型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。可互相取代的氨基酸的优选实例显示在下面。相同组中的氨基酸可以互相取代。A组:亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸B组:天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C组:天冬酰胺、谷氨酰胺 D组:赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸E组:脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸F组:丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸G组:苯丙氨酸、酪氨酸本发明的抗体片段包括Fab、F (ab’)2、Fab’、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含⑶R的肽等。Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50，000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。本发明的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本发明的特异性识别人 Μ-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。F(ab’)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。本发明的F (ab’) 2可以通过用胃蛋白酶处理本发明的特异性识别人 Μ-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab’来生产所述F(ab’ )2Fab’是通过切割上述F(ab’)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50，000并具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的Fab’可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本发明的特异性识别 Μ-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab’)2来生产。此外，可以通过将编码抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab’来生产所述Fab’。scFv是其中使用适当的肽接头(在后文中称为“P”)将一条链VH和一条链VL连接在一起后的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的scFv可以通过以下步骤来生产:获得本发明的特异性识别人 Μ-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。本发明的双抗体可以通过以下步骤来生产:获得本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering, 7，697 (1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基
酸残基。本发明的dsFv可以通过以下步骤来生产:获得获得本发明的特异性识别人 Μ-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。包含⑶R的肽是通过包含VH或VL的⑶R中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。本发明的包含⑶R的肽可以通过以下步骤来生产:构建本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含⑶R的肽。本发明的单克隆抗体包括抗体结合物，其中本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段通过化学或遗传方法与放射性同位素、具有低分子量的药剂、具有高分子量的药剂、蛋白质、或治疗性抗体等连接。可以通过将放射性同位素、具有低分子量的药剂、具有高分子量的药剂、佐剂、蛋白质、或治疗性抗体等化学结合到本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段的H链或L链的N端侧或C端侧、足够的取代基或侧链、糖链等上来生产本发明的抗体结合物 [Kotai Kogaku Nyumon,由Chi jin Shokan出版(1994)]。此外，抗体结合物可以如下通过遗传方法来生产:将本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段的编码DNA与编码待结合的蛋白质或治疗性抗体的其他DNA连接在一起，将DNA插入到表达载体中，并将表达载体导入到适合的宿主细胞中。放射性同位素包括1311、1251、9°Y、64CU、199Tc、77LU、211At等。放射性同位素可以通过氯胺-T方法等直接与抗体结合。此外，可以将螯合放射性同位素的物质与抗体结合。螯合剂包括1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等。具有低分子量的药剂包括抗肿瘤剂例如烷化剂、亚硝基脲药剂、代谢拮抗剂、抗生素物质、来源于植物的生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法药剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、钼络合衍生物、M期抑制剂和激酶抑制剂[Rinsho Syuyo-gaku(Clinical Oncology), Gan to Kagakuryoho-Sha (1996)],留类药剂例如氢化可的松和泼尼松，非留类药剂例如阿司匹林和吲哚美辛，免疫调节剂例如硫代苹果酸金、青霉胺，免疫抑制剂例如环磷酰胺和硫唑嘌呤，抗炎剂例如抗组胺剂，例如马来酸氯苯那敏和氯马斯汀[Ensho to Kouensho-Ryoho (Inflammation and Ant1-1nflammation Therapy), IshiyakuShuppann (1982)]等。抗肿瘤剂的实例包括阿米福汀(氨磷汀)、顺钼、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(氮芥子气)、链脲菌素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(Gemsal)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇(泰素)、多烯紫衫醇(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡钼、奥沙利钼、奈达钼、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、5-氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司纳、伊立替康(CPT-11)、拓扑替康、米托蒽醌、拓泊替康、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、羟基脲、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烧、链脲 霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林(IeuproreI in )、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氦芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利钼、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI 571)、厄洛替尼、FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂例如易瑞沙和特罗凯、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安丫啶、全反式视黄酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢菌素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(Targretin)、他莫昔芬、地塞米松、孕激素物质、雌激素物质、阿那曲唑(瑞宁得)、来普林(Leuplin)、阿司匹林、吲哚美辛、塞来考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、蓓萨罗丁、砷、voltezomib、别嘌呤醇、卡奇霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星(ozogamine)、克拉霉素、甲酰四氢叶酸、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、甲氨蝶呤、美登醇(maytansinoid)及其衍生物。用于将具有低分子量的药剂与抗体结合的方法包括:将药剂与抗体的氨基通过戊二醛结合的方法、将药剂的氨基与抗体的羧基通过水溶性碳二亚胺结合的方法等。
具有高分子量的药剂包括聚乙二醇(在后文中称为“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过将这些具有高分子量的化合物与抗体或抗体片段结合，下列效应所期望的:(1)提高对抗各种不同的化学、物理或生物因素的稳定性，(2)显著延长在血液中的半衰期，(3)使免疫原性或对抗体生产的抑制消失，等等[Bioconjugate Drug, Hirokawa Shoten (1993)]。例如，用于将PEG与抗体结合的方法包括使抗体与PEG修饰剂进行反应的方法[BioconjugateDrug, Hirokawa Shoten (1993) ]。PEG修饰剂包括赖氨酸的ε -氨基的修饰剂(日本公布的未经审查的专利申请N0.178926/86)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本公布的未经审查的专利申请N0.23587/81)、精氨酸的胍基的修饰剂(日本公布的未经审查的专利申请N0.117920/90)等。免疫刺激剂可以是任何被称为免疫佐剂的天然产物。增强免疫原的药剂的实例包括β (I —3)葡聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、α-半乳糖苷基神经酰胺等。蛋白质包括激活免疫活性细胞例如NK细胞、巨噬细胞或中性粒细胞的细胞因子或生长因子，毒蛋白等。细胞因子或生长因子的实例包括干扰素(在后文中称为“IFN”)-a、IFN-β、IFN- y、白介素(在后文中称为“IL”)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)
坐寸ο`毒蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，还包括其中在蛋白质中引入了突变以便控制毒性的毒蛋白。治疗性抗体包括针对其中通过与抗体结合而诱导凋亡的抗原的抗体、针对参与形成肿瘤的病理状态的抗原的抗体、针对调节免疫功能的抗原的抗体以及针对与病理部位中血管形成相关的抗原的抗体。其中通过与抗体结合而诱导凋亡的抗原包括分化簇(在后文中称为“⑶”)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80 (B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86 (B7.2)、人白细胞抗原(HLA) II类、表皮生长因子受体(EGFR)等。参与形成肿瘤病理状态的抗原或调节免疫功能的抗原包括⑶4、⑶40、⑶40配体、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7 家族分子的配体(CD28、CTLA-4、I COS, PD-U BTLA)、0X-40、0X-40 配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(DR4、DR5、TNFRU TNFR2)、TNF相关的诱导凋亡的配体受体(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κ B的受体激活剂(RANK)、RANK 配体、CD25、叶酸受体 4、细胞因子[IL-1 a、IL-1 β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF) β , TNF α等]、这些细胞因子的受体、趋化因子(SLC、ELC、1-309、TARC、MDC、CTACK等)以及这些趋化因子的受体。抑制病理部位中血管形成的抗体的抗原包括血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF),促红细胞生成素(EPO )、TGF β、IL-8、Ephi I in、SDF-1、它们的受体等。带有蛋白质或治疗性抗体的融合抗体可以通过以下步骤来生产:将编码单克隆抗体或抗体片段的cDNA与编码所述蛋白质的cDNA相连，构建编码所述融合抗体的DNA，将所述DNA插入到原核生物或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述融合抗体。当在本发明中将上述抗体结合物用于检测方法、定量测定方法、检测试剂、定量测定试剂或诊断剂的情形中，本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段所结合的药剂的实例包括在常规免疫检测或测定方法中所使用的标记物。标记物包括酶例如碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶，发光物质例如吖啶酯和洛酚碱，荧光物质例如荧光素异硫氰酸酯(FITC)和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)，等
等此外，本发明包括用于治疗与TIM-3阳性细胞相关的疾病的药剂，所述药剂包含本发明的单克隆抗体或其抗体片段作为活性成分。对与TIM-3阳性细胞相关的疾病没有限制，只要它是与表达TIM-3的细胞相关的疾病即可，例如癌症、自体免疫性疾病和过敏性疾病。癌症包括血液癌、乳腺癌、子宫癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、小肠癌、前列腺癌和胰腺癌。癌症的优选实例包括血液癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和前列腺癌。血液癌的实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS )、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL )、急性淋巴细胞性白血病(ALL )、慢性淋巴细胞性白血病(CLL )、其他淋巴性白血病、NK细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤例如Burkitt淋巴瘤、
等等自体免疫性疾病的具体实例包括类风湿关节炎、牛皮癣、克罗恩病、强硬性脊柱炎、多发性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren综合征、移植排斥后的自体免疫性溶血性贫血、水疱性类天疱疮、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血等。过敏性疾病的实例包括急性或慢性反应性气道疾病、支气管哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、荨麻疹、PIE综合征、食物过敏、花粉热、过敏性鼻、支气管哮喘、特应性皮炎、过敏性休克等。本发明的治疗剂包含本发明的上述单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。包含本发明的单克隆抗体或其抗体片段或其结合物的治疗剂可以只包含抗体或其抗体片段或其结合物作为活性成分。一般来说，优选情况下，将所述治疗剂制备成通过制药学技术领域中公知的适合方法、通过将其与一种或多种可药用载体混合而生产的药物制剂。优选的是，通过对治疗最有效的途径来施用治疗剂。实例包括口服施用和肠胃外施用，例如口腔、气管、直肠、皮下、肌内或静脉内施用，并且静脉内施用是优选的。药物制剂包括包括喷雾剂、胶囊、片剂、粉剂、颗粒、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软
膏、胶带等。尽管施用的剂量或频率随着目的治疗效果、施用方法、治疗时间、年龄、体重等而变，但它通常为每天每位成人10 μ g/kg至10mg/kg。此外，本发明涉及用于免疫检测或测定TIM-3的方法、用于免疫检测或测定TIM-3的试剂、用于免疫检测或测定表达TIM-3的细胞的方法和用于诊断与TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。在本发明中，用于检测或测定 Μ-3的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA )、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。上述与 Μ-3阳性细胞相关的疾病可以通过用本发明的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达TIM-3的细胞来诊断。为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT 8100HTS系统(AppliedBiosystem)的突光抗体染色法等。在本发明中，对用于检测或测定TIM-3的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达 Μ-3的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。根据所需的诊断方法，含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段或其结合物的诊断剂还可以含有用于执行抗原 -抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试齐U，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。下面具体描述用于生产本发明的抗体的方法、用于治疗疾病的方法和用于诊断疾病的方法。1.单克隆抗体的制备方法(I)抗原的制备作为抗原的TIM-3或表达TIM-3的细胞可以通过将包含编码全长TIM-3或其部分长度的cDNA的表达载体导入到大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母、昆虫细胞、或动物细胞等中来获得。此外，可以从表达大量TIM-3的各种人肿瘤细胞系、人组织等中纯化并获得TIM-3。可以将所述肿瘤细胞系和组织直接用作抗原。此外，可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来制备具有TIM-3的部分序列的合成肽，并将其用作抗原。例如,可以使用《分子克隆实验指南》第二版(Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Second Edition) , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 或《现代分子生物学实验方法》(Current Protocols in Molecular Biology) , Johnffiley&Sons (1987-1997)等中描述的方法通过在宿主细胞中表达编码 Μ-3的DNA按照下述方法来生产本发明中所使用的TIM-3。首先，通过将包含 Μ-3编码区的全长cDNA插入到适合的表达载体的启动子下游中来制备重组载体。这时，如果需要，可以使用具有适当长度并含有基于全长cDNA制备的多肽的编码区的DNA片段来代替上述全长cDNA。接下来，通过将所述重组载体导入到适合于所述表达载体的宿主细胞中，可以获得生产多肽的转化体。表达载体可以是任何表达载体，只要它能够在供使用的宿主细胞中自主复制或者可以被整合到染色体中并在能够转录所述多肽的编码DNA的位置处包含适当的启动子即可。宿主细胞可以是任何细胞，只要它能够表达目的基因即可。实例包括属于埃希氏杆菌(Escherichia)属的微生物例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。当使用原核生物例如大肠杆菌作为宿主细胞时，优选情况下，本发明中使用的重组载体可以在原核生物中自主复制并包含启动子、核糖体结合序列、编码 Μ-3的DNA以及转录终止序列。重组载体不是必需具有转录终止序列，但转录终止序列优选被刚好设在结构基因的下游。重组载体还可以包含调控启动子的基因。此外,上述重组载体优选为质粒,其中作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间的间隔被调整到适合的距离(例如6至18个核苷酸)。此外，编码 Μ-3的DNA的核苷酸序列可以被另一个碱基取代，以便成为适合在宿主细胞中表达的密码子，从而提高目的TIM-3的生产率。可以使用任何表达载体，只要它能够在供使用的宿主细胞中起作用即可。表达载体的实例包括 pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (都由 Roche Diagnostics 制造)、pKK233_2(由 Pharmacia 制造)、pSE280 (由 Invitrogen 制造)、pGEMEX-Ι (由 Promega 制造)、pQE-8 (由QIAGEN制造)、pKYPIO (日本公布的未经审查的专利申请N0.110600/83)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48,669 (1984)]、pLSAl [Agric.Biol.Chem.，53，277 (1989) ]、pGELl [Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82，4306 (1985) ]、pBluescriptII SK(-)(由 Stratagene 制造)、pTrs30[从大肠杆菌 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)中制备]、pTrs32 [从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)中制备]、pGHA2 [从大肠杆菌IGHA2 (FERM BP-400)中制备，日本公布的未经审查的专利申请N0.221091/85]、pGKA2 [从大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)中制备，日本公布的未经审查的专利申请N0.221091/85]、pTerm2 (US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400 [J.Bacteriol., 172, 2392 (1990) ]、pGEX (由 Pharmacia 制造)、pET 系统(由 Novagen 制造)、PME18SFL3，等等。可以使用任何启动子，只要它能够在供使用的宿主细胞中起作用即可。实例包括源自于大肠杆菌、噬菌体等的启动子，例如trp启动子(Ptrp )、Iac启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子等。此外，可以使用人工设计和修饰的启动子，例如其中串联连接了两个Ptrp的启动子、tac启动子、lacT7启动子和IetI启动子。宿主细胞的实例包括大肠杆菌XLl-Blue、大肠杆菌XL2_Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌N0.49、大肠杆菌胃3110、大肠杆菌阶49、大肠杆菌0册0，等等。可以使用任何导入重 组载体的方法，只要它是用于将DNA导入到所述宿主细胞中的方法即可，实例包括 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 69，2110(1972)、Gene, 17，107(1982)和Molecular&General Genetics, 168, 111 (1979)中描述的使用I丐离子的方法等。
当使用动物细胞作为宿主细胞时，可以使用任何表达载体，只要它能够在动物细胞中起作用即可。实例包括pcDNA1、pcDM8 (由Funakoshi制造)、pAGE107[日本公布的未经审查的专利申请 N0.22979/91 ；Cytotechnology, 3, 133(1990)]、pAS3_3 (日本公布的未经审查的专利申请 N0.227075/90)、pCDM8[Nature, 329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp (由Invitrogen 制造)、pcDNA3.1(由 Invitrogen 制造)、pREP4(由 Invitrogen 制造)、pAGE103 [J.Biochemistry, 101，1307 (1987) ]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93 (WO 97/10354)等。可以使用任何启动子，只要它能够在动物细胞中起作用即可。实例包括巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)基因的启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRa启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒启动子或增强子等。此外，可以将人CMV的IE基因的增强子与所述启动子一起使用。宿主细胞包括人Namalwa白血病细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 60, 1275(1968) ；Genetics, 55, 513 ( 1968) ；Chromosoma, 41, 129 ( 1973) ；Methods in CellScience,18, 115 (1996) ；Radiation Research, 148, 260 (1997) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 77, 4216 (1980)；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 60, 1275 (1968)；Cell, 6, 121 (1975);《分子细胞遗传学》附录 I 和 II (Molecular Cell genetics, Appendix I, II) (pp.883-900)]、CH0/DG44、CH0-K1 (ATCC 登记号:CCL_61)、DUkXBll (ATCC 登记号:CCL_9096)、Pro-5(ATCC 登记号:CCL-1781)、CHO-S (Life Technologies,目录号 11619)、Pro_3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Agl4、叙利亚仓 鼠细胞BHK或HBT5637(日本公布的未经审查的专利申请N0.299/88)
等可以使用任何导入重组载体的方法，只要它是用于将DNA导入到动物细胞中的方法即可，实例包括电穿孔[Cytotechnology, 3，133 (1990)]、磷酸I丐方法(日本公布的未经审查的专利申请N0.227075/90)、脂质体转染方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 84，7413(1987)]等。
Μ-3可以通过以下步骤来生产:将源自于微生物、或动物细胞等的具有包含TIM-3的编码DNA的重组载体的转化体在培养基中进行培养以在培养物中形成并积累TIM-3，并从培养物中回收TIM-3。根据宿主培养中通常使用的方法来执行用于在培养基中培养转化体的方法。当在源自于真核生物的细胞中表达TIM-3时，可以获得结合有糖或糖链的TIM-3。当对用含有诱导型启动子的重组载体转化后的微生物进行培养时，如果需要，可以向培养基中加入诱导剂。例如，当对转化有使用Iac启动子的重组载体的微生物进行培养时，可以向培养基中加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷等，或者当对转化有使用trp启动子的重组载体的微生物进行培养时，可以向其中加入吲哚丙烯酸等。当对使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体进行培养时，培养基包括通常使用的 RPMI 1640 培养基[The Journal of the American MedicalAssociation, 199，519 (1967) ]、Eagle 氏 MEM 培养基[Science, 122，501 (1952) ]、Dulbecco氏改良MEM培养基[Virology, 8，396(1959)]以及 199 培养基[Proceeding of the Societyfor the Biological Medicine, 73，I (1950) ]、Iscove 氏改良的Dulbecco 氏培养基(IMDM)、其中添加了胎牛血清等的培养基，等等。培养通常在存在5%C02的条件下在pH 6到8和30至40°C下进行I到7天。如果有必要，在培养期间可以向培养基中添加抗生素例如卡那霉
素或青霉素。对于 Μ-3编码基因的表达方法来说，除了直接表达之外，还可以按照《分子克隆实验指南》第二版(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition) , ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)中描述的方法进行分泌生产、融合蛋白表达等。用于生产TIM-3的方法包括在宿主细胞中细胞内表达的方法、从宿主细胞进行细胞外分泌的方法、在宿主细胞外膜上生产的方法等。可以通过改变所使用的宿主细胞和所生产的TIM-3的结构来选择适合的方法。当在宿主细胞中或在宿主细胞膜外包膜上生产 Μ-3时，可以按照Paulson等的方法[J.Biol.Chem., 264, 17619 (1989) ]、Lowe 等的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86，8227 (1989)，Genes Develop.，4，1288 (1990)]、日本公布的未经审查的专利申请N0.336963/93和W094/23021中描述的方法等将 Μ-3主动分泌到细胞外。此外，按照日本公布的未经审查的专利申请N0.227075/90中描述的方法利用使用二氢叶酸还原酶基因的基因扩增系统能够提高TIM-3的生产量。可以对得到的TIM-3例如按如下所述进行分离和纯化。当TIM-3以溶解状态被表达在细胞内时，将培养后的细胞通过离心回收，悬浮在水性缓冲液中，然后使用超声发生器、French压碎器、Manton Gaulin勻衆器、或珠磨机(dynomill)等进行破碎，以获得无细胞的提取物。将无细胞的提取物进行`离心以获得上清液，并可以通过使上清液经受通用的蛋白质分离和纯化技术来获得纯化的制备物，所述技术例如溶剂提取，使用硫酸铵等的盐析，脱盐，用有机溶剂沉淀，使用树脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75 (由Mitsubishi Chemical制造)的阴离子交换层析,使用树脂例如S-琼脂糖FF (由Pharmacia制造)的阳离子交换层析，使用树脂例如丁基-琼脂糖或苯基-琼脂糖的疏水层析，使用分子筛的凝胶过滤，亲和层析，层析聚焦，电泳例如等点聚焦，等等，它们可以被单独或组合使用。当TIM-3通过形成包涵体被表达在细胞内时，以同样的方式对细胞进行回收、破碎和离心，并回收作为沉淀级分(fraction)的 Μ-3包涵体。用蛋白变性剂使回收的 Μ-3蛋白的包涵体溶解。通过对溶解的溶液进行稀释或透析，使蛋白成为正常的三维结构，然后通过与上述相同的分离纯化方法获得多肽的纯化的制备物。当 Μ-3或衍生物例如糖基化产物被分泌到细胞外时，可以从培养上清液回收 Μ-3或衍生物例如糖基化产物。也就是说，以与上述相同的方式通过诸如离心的方法对培养物进行处理以获得可溶性级分，通过与上述相同的分离纯化方法可以从可溶性级分获得TIM-3的纯化的制备物。此外，可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产本发明中使用的 TIM-3。此外，可以使用由 Advanced ChemTech、Perkin-Elmer> Pharmacia、ProteinTechnology Instrument、Synthece11-Vega、PerSeptive、或Shimadzu Corporation等制造的肽合成仪来化学合成所述TIM-3。(2)动物的免疫接种和用于融合的生产抗体的细胞的制备
用上面(I)中制备的抗原免疫接种3至20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等，并收集动物的脾脏、淋巴结或外周血中的生产抗体的细胞。此外，当由于免疫原性低而在上述动物中没有观察到足够的滴度增加时，可以使用TIM-3敲除的小鼠作为供免疫接种的动物。通过皮下、静脉内或腹膜内注射向动物施用抗原以及适合的佐剂(例如完全弗氏佐剂，或氢氧化铝凝胶与百日咳菌苗的组合等)来进行免疫接种。当抗原是部分肽时，用载体蛋白例如BSA (牛血清白蛋白)、或KLH (匙孔血蓝蛋白)等产生结合物，并将其用作抗原。在第一次施用后，抗原的施用每一周或每两周被执行5到10次。在每次施用后的第三至第七天，从眼底收集血液样品，通过例如酶免疫测定法[《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等测试血清与抗原的反应性。其血清中显示出针对用于免疫接种的抗原的足够的抗体滴度的动物，被用作用于融合的生产抗体的细胞的来源。在末次施用抗原后的三至七天，从免疫接种后的动物切下含有生产抗体的细胞的组织例如脾脏，以收集生产抗体的细胞。当使用脾细胞时，将脾脏切下并打散，随后进行离心。然后，通过去除红细胞来获得用于融合的生产抗体的细胞。(3)骨髓瘤细胞的制备从小鼠获得的已建立的细胞系被用作骨髓瘤细胞。实例包括8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c)的骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Current Topicsin Microbiology and Immunology,18，I (1978)]、P3_NSl/l_Ag41 (NS-1) [EuropeanJ.1mmunology, 6，511 (1976) ]、SP2/0_Agl4 (SP-2) [Nature, 276，269 (1978)]、P3-X63-Ag8653 (653) [J.1mmunology, 123，1548 (1979)]、P3_X63_Ag8 (X63)[Nature, 256, 495(1975)]等。将骨髓瘤细胞在正常培养基[向RPM1-1640培养基添加谷氨酰胺、2_巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤后的培养基]中进行传代培养，并且在细胞融合之前将它们在正常培养基中传代培养3或4天，以确保在融合当天的细胞数量为2 X IO7个或更多。(4)细胞融合和用于生产单克隆抗体的杂交瘤的制备用最小必需培养基(MEM)或PBS (1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，I升蒸馏水，PH 7.2)将通过上面(2)获得的用于融合的生产抗体的细胞和通过上面
(3)获得的骨髓瘤细胞充分洗涤并混合，使生产抗体的细胞:骨髓瘤细胞的比率=5至10:1，然后进行离心。然后弃去上清液。将沉淀的细胞团充分打散。在将沉淀的细胞打散后，在37°C下在搅拌下向细胞添加聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、MEM和二甲亚砜的混合物。此外，每I或2分钟加入I至2mL MEM培养基数次，并加入MEM培养基使得总量为50mL。离心后，弃去上清液。在将细胞轻柔打散后，将细胞轻柔地悬浮在HAT培养基[含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基蝶呤的正常培养基]中。将悬浮液在5%C02培养箱中在37°C下培养7至14天。培养后，将一部分培养上清液作为样品，通过如下所述的结合测定法来选择对含有TIM-3的抗原具有反应性而对不含TIM-3的抗原没有反应性的杂交瘤。然后，通过有限稀释法执行两次克隆化[第一次使用HT培养基(从HAT培养基中去除了氨基蝶呤后的培养基)，第二次使用正常培养基 ]，稳定地显示出高抗体滴度的杂交瘤被选择作为生产单克隆抗体的杂交瘤。
(5)纯化的单克隆抗体的制备通过腹膜内注射将上面(4)所获得的生产单克隆抗体的杂交瘤细胞施用于用0.5mL鲨肝油烷处理(腹膜内施用2，6，10，14-四甲基十五烷(鲨肝油烷)，然后饲养2周)过的8至10周龄的小鼠或裸鼠中。杂交瘤在10至21天内发展成腹水肿瘤。从小鼠收集腹水液，离心以去除固体，用40到50%硫酸铵进行盐析，然后用辛酸沉淀，穿过DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱以收集IgG或IgM级分作为纯化的单克隆抗体。此外，可以将上面(4)所获得的生产单克隆抗体的杂交瘤培养在含有10%FBS等的RPMI1640培养基中，并通过离心去除上清液。将沉淀的细胞悬浮在杂交瘤-SFM培养基中并培养3至7天。通过将获得的细胞悬液离心，然后用蛋白A柱或蛋白G柱从得到的上清液中进行纯化以收集IgG级分，可以获得纯化的单克隆抗体。此外，杂交瘤-SFM培养基可以含有 5%DIG0 GF21。可以使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来确定抗体的亚类。可以通过Lowry方法或从280nm处的吸光度来确定蛋白的量。(6)单克隆抗体的选择通过下面使用酶免疫测定方法的结合测定法和氨基酸的细胞内摄取抑制测定法来进行单克隆抗体的选择。(6_a)结合测定法通过将在(I)中获得的含有编码 Μ-3的cDNA的表达载体导入到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、或动物细胞等中而获得的导入了基因的细胞、重组蛋白、或从人组织获得的纯化的多肽或部分肽被用作抗原。当抗原是部分肽时，用载体蛋白例如BSA或KLH来制备结合物并使用所述结合物。
`
通过分配到96孔板中使这些抗原进入固相层后，待测试的物质例如血清、杂交瘤的培养上清液或纯化的单克隆抗体被分配在其中作为第一抗体并进行反应。在用PBS、PBS-吐温等充分洗涤后，用生物素、酶、化学发光物质、或放射性化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体被分配在其中作为第二抗体并进行反应。在用PBS-吐温充分洗涤后，执行适合于第二抗体的标记物的反应，以选择与抗原特异性反应的单克隆抗体。此外，在与人TIM-3的胞外区结合中与本发明的抗TIM-3的单克隆抗体竞争的单克隆抗体可以通过向上面的结合测定体系中加入受试抗体以使其反应来获得。也就是说，可以通在加入抗体后筛选能抑制单克隆抗体结合的受试抗体来获得在与人TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合中与所获得的单克隆抗体竞争的单克隆抗体。此外，与本发明的与TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体结合相同表位的抗体可以通过以下步骤来获得:鉴定通过上面的结合测定系统获得的抗体的表位，制备所述表位的部分合成肽或模拟所述表位的三维结构的合成肽，并用所述肽进行免疫接种。(6-b)使用Biacore的动力学分析使用Biacore TlOO测定抗原与测试物质之间的动力学，然后使用该装置随附的分析软件分析获得的结果。通过胺结合方法将抗小鼠IgG抗体固定在CM 5传感器芯片上之后,允许测试物质例如杂交瘤的培养上清液、纯化的单克隆抗体以适合的量流动并结合,并且还允许抗原以多种已知浓度流动。然后对结合和解离进行测定。
使用获得的数据和装置随附的软件，使用1:1结合模型执行动力学分析以获得必需的参数。或者，通过胺结合方法将人 Μ-3固定在传感器芯片上之后，允许纯化的单克隆抗体以多种已知浓度流动，然后对结合和解离进行测定。使用获得的数据和装置随附的软件，使用二价分析物模型执行动力学分析以获得必需的参数。2.重组抗体的制备作为重组抗体的生产实例，下面显示了用于生产人嵌合抗体和人⑶R移植抗体的方法。( I)用于表达重组抗体的载体的构建用于表达重组抗体的载体是其中已插入了人抗体的CH和CL的编码DNA的动物细胞用表达载体，是通过将人抗体的CH和CL的编码DNA每一个都克隆到动物细胞用表达载体中而构建的。人抗体的C区可以使用任何人抗体的CH和CL。实例包括属于Y I亚类的CH、属于K亚类的CL等。作为人抗体的CH和CL的编码DNA，一般可以使用cDNA，并且也可以使用含有外显子和内含子的染色体DNA。作为动物细胞用表达载体，可以使用任何表达载体，只要能够在其中插入并在其中表达人抗体C区的编码基因即可。实例包括pAGE107[Cytotechnol.，3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987) ]、pHSG274[Gene, 27，223(1984) ]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 78，1527(1981)]、pSGlbd2_4[Cytotechnol.，4，173(1990) ]、pSElUKlSedl-3[Cytotechnol., 13, 79(1993)]等。动物细胞用表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40早期启动子[J.Biochem., 101, 1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒 LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960 (1987)]、免疫球 蛋白 H 链启动子[Cell, 41，479 (1985)]和增强子[Cell, 33，717(1983)]等。用于表达重组抗体的载体可以是其中抗体的H链编码基因和抗体的L链编码基因存在于分开的载体上的类型，也可以是其中两个基因存在于相同载体上的类型(串联类型)。从构建用于表达重组抗体的载体的容易性、导入到动物细胞中的容易性、以及抗体H链和L链在动物细胞中的表达量之间的平衡的角度来说，串联类型的用于表达重组抗体的载体是更优选的[J.1mmunol.Methods, 167，271 (1994)]。串联类型的用于表达重组抗体的载体的实例包括 PKANTEX93 (W097/10354)、pEE18 [Hybridoma, 17, 559(1998)]等。(2)源自于非人类动物的抗体V区的编码cDNA的获得以及氨基酸序列分析非人抗体的VH和VL的编码cDNA的获得和氨基酸序列分析按照下面的方式来执行。从生产非人抗体的杂交瘤细胞提取mRNA以合成cDNA。将合成的cDNA克隆到载体例如噬菌体或质粒中以制备cDNA文库。使用编码小鼠抗体的C区或V区的一部分的DNA作为探针，从文库中分离每个含有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。确定重组噬菌体或重组质粒上目的小鼠抗体的VH和VL的全长核苷酸序列，并从核苷酸序列分别推导出VH和VL的全长氨基酸序列。用于制备生产非人抗体的杂交瘤细胞的非人类动物的实例包括小鼠、大鼠、仓鼠、或兔等。可以使用任何动物，只要可以从中生产杂交瘤细胞即可。用于从杂交瘤细胞制备总RNA的方法的实例包括硫氰酸胍-三氟乙酸铯方法[Methods in Enzymo1.，154，3 (1987)]、使用试剂盒例如 RNAeasy 试剂盒(由 Qiagen 制造)
坐寸O用于从总RNA制备mRNA的方法的实例包括寡聚(dT)固定化的纤维素柱方法[《分子克隆实验指南》第二版(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, SecondEdition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]、使用试剂盒例如01igo-dT30〈Super>mRNA纯化试剂盒(由Takara Bio制造)的方法等。此外,用于制备mRNA的方法的实例包括使用试剂盒Fast Track mRNA分离试剂盒(由Invitrogen制造)或QuickPrep mRNA纯化试剂盒(由Pharmacia制造)等的方法。用于合成cDNA和制备cDNA文库的方法的实例包括已知方法[《分子克隆实验指南〉〉第二版(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition) , Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989);《现代分子生物学实验方法》(Current Protocols inMolecular Biology),附录 I, John ffiley&Sons (1987-1997)],使用试剂盒例如用于 cDNA合成和质粒克隆的Super Script质粒系统(由Invitrogen制造)、ZAP_cDNA合成试剂盒(由Stratagene制造)等的方法,等等。其中插入有合成的cDNA、用于制备cDNA文库的载体可以是任何载体，只要可以插入所述cDNA即可，所述cDNA是利用从杂交瘤细胞提取的mRNA作为模板而合成的。所述载体的实例包括 ZAPExPress [Strategies, 5，58 (1992) ]、pBluescript II SK (+) [NucleicAcids Research, 17, 9494 (1989) ]、λ ZAPII (由 Stratagene 制造)、λ gtlO 和 λ gtll [ ((DNA克隆实用方法》(DNA Cloning:A Practical Approach) , I, 49 (1985) ] > Lambda BlueMid(由 Clontech 制造)、λ ExCell 和 pT7T3_18U (由 Pharmacia 制造)、pcD2 [Mol.Cell.Biol.，3，280 (1983) ]、pUC18 [Gene , 33，103 (1985)]等。可以使用任何大肠杆菌用于导入由噬菌体或质粒载体所构建的cDNA文库，只要cDNA文库可以被导入、表达并保持即可。实例包括XLl-BlueMRF’ [Strategies,5，81 (1992)]、C600 [Genetics, 39，440 (1954) ]、Y1088 和Y1090[Science, 222: 778 (1983) ]、NM522[J.Mol.Biol.，166，I (1983)]、K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)], JM105 [Gene, 38，275(1985)]等。使用同位素或荧光标记的探针的集落杂交或噬菌斑杂交方法可以被用于从cDNA文库中筛选编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆等[《分子克隆实验指南》第二版，(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition) , Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)]。 此外，通过制备引物并使用从mRNA制备的cDNA或cDNA文库作为模板，可以通过聚合酶链反应(在后文中称为“PCR”；《分子克隆实验指南》第二版，(Molecular Cloning，ALaboratory Manual, Second Edition) , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；《现代分子生物学实验方法》，(Current Protocols in Molecular Biology),附录I, Johnffiley&Sons (1987-1997))来制备编码 VH 和 VL 的 cDNA。 cDNA的核苷酸序列可以通过以下步骤来确定:用适合的限制性酶等消化所选择的cDNA,将片段克隆到质粒例如pBluescript SK (-)(由Stratagene制造)中，通过通常使用的核苷酸序列分析方法来进行反应。例如，在诸如双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 74，5463(1977)]的反应后，通过使用自动化核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM3700(由PE Biosystems制造)和A.L.F.DNA测序仪(由Pharmacia制造)来执行核苷酸序列分析方法。通过从确定的核苷酸序列推测VH和VL的全长氨基酸序列并将它们与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA测序仪，美国卫生与公众服务部，(1991)]进行比较，可以验证所获得的cDNA是否编码含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。对于含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列来说，通过将它们与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA测序仪，美国卫生与公众服务部，(1991)]进行比较，可以推测出分泌信号序列和N端氨基酸序列的长度，并且可以进一步确定它们所属的亚类。此外，通过将它们与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA测序仪，美国卫生与公众服务部，(1991)]进行比较，可以确定VH和VL的每个⑶R的氨基酸序列。此外，利用获得的VH和VL的全长氨基酸序列，通过在任何数据库例如SWISS-PR0T、或PIR-Protein等中进行序列同源性检索，例如根据BLAST方法[J.Mol.Biol.，215，403 (1990)]等，可以检查VH和VL的全长氨基酸序列的新颖性。(3)用于表达人嵌合抗体的载体的构建将编码非人类动物的抗体的每个VH和VL的cDNA都克隆到上面(I)中提到的用于表达重组抗体的载体中的人抗体CH或CL编码基因的上游中，从而构建用于表达人嵌合抗体的载体。为了将包含非人类动物抗体的VH或VL的3’端核苷酸序列的cDNA和包含人抗体的CH或CL的5’端核苷酸序列的cDNA进行连接，制备编码非人类动物抗体的VH或VL的每个cDNA，使得编码适合的氨基酸并在连接部分处具有适合的限制性酶识别序列。将制备的编码抗体的VH和VL的cDNA分别进行克隆，以便它们每个都以适当形式表达在上面(I)中提到的用于表达人CDR移植抗体的载体中的人抗体CH或CL编码基因的上游中，从而构建用于表达人嵌合抗体的载体。此外，利用在两端具有适当的限制性酶识别序列的合成的DNA，通过PCR扩增编码非人类动物抗体的VH或VL的cDNA，`并且将它们每个都克隆到上面(I)中获得的用于表达重组抗体的载体中。(4)编码人⑶R移植抗体V区的cDNA的构建可以如下获得编码人⑶R移植抗体的VH或VL的cDNA。分别选择人抗体的VH或VL中的骨架区(在后文中称为“FR”)的氨基酸序列，向其中移植源自于非人类动物抗体的抗体VH或VL中的CDR的氨基酸序列。可以使用人抗体的FR的任何氨基酸序列，只要它们源自于人即可。实例包括在数据库例如蛋白质数据库(Protein Data Bank)等中登记的人抗体的FR的氨基酸序列、以及人抗体的FR亚类共有的氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest,美国卫生与公众服务部，(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性降低，选择与原始抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高同源性(至少60%或更高)的氨基酸序列。然后，将原始抗体的CDR的氨基酸序列分别移植到人抗体的VH或VL中FR的选定氨基酸序列中，以设计人源化抗体的VH或VL的每个氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的核苷酸序列中发现的密码子使用频率[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,美国卫生与公众服务部，(1991)]，将设计的氨基酸序列转化成DNA序列，设计了编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。基于所设计的核苷酸序列，合成几个长度为约100个核苷酸的合成DNA，并使用它们进行PCR。在这种情况下，鉴于PCR的反应效率和可以合成的DNA的长度，优选为每条H链和L链设计6个合成的DNA。此外，通过向存在于两个末端上的合成DNA的5’端引入适当的限制性酶识别序列，可以将编码人⑶R移植抗体的VH或VL的cDNA容易地克隆到(I)中所构建的用于表达人CDR移植抗体的载体中。或者，基于所设计的DNA序列，可以使用合成的DNA作为编码每个全长H链和全长L链的一种DNA来进行。在PCR后,将扩增产物克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(由Stratagene制造)等中，并按照与(2)中所描述的方法类似的方法来确定核苷酸序列，以获得具有编码所需人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。(5)人⑶R移植抗体的V区氨基酸序列的修饰已知，当通过仅仅将源自于非人类动物的抗体的VH和VL中的⑶R简单地移植到人抗体的VH和VL的FR中来生产人CDR移植抗体时，它的抗原结合活性比源自于非人类动物的原始抗体的抗原结合活性低[B10/TECHN0L0GY，9，266 (1991)]。在人CDR移植抗体中，在人抗体的VH和VL中的FR的氨基酸序列中，鉴定与抗原结合直接相关的氨基酸残基、与CDR中的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基以及维持抗体的三维结构并与抗原结合间接相关的氨基酸残基，并将它们修饰成在原始的非人源化抗体中所发现的氨基酸残基，从而提高已降低的抗原结合活性。为了鉴定FR中与抗原结合活性相关的氨基酸残基，可以通过X-射线晶体学[J.Mol.Biol.，112，535 (1977)]、或计算机建模[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等来完成抗体三维结构的构建和分析。此外,通过各种不同的尝试例如为每种抗体产生几种修饰的抗体并检查它们的结合活性，可以获得对抗原具有足够的结合活性的修饰的人CDR移植抗体。利用各种不同的修饰用合成DNA，根据(4)中所描述的PCR可以实现对人抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列的修饰。对于通过PCR获得的扩增产物来说，按照(2)中所描述的方法来确定核苷酸序列，以便验证是否已执行了目的修饰。(6)用于表达人⑶R移植抗体的载体的构建通过将构建的重组抗体的VH或VL的每个编码cDNA都克隆到(I)中所描述的用于表达重组抗体的载体中的人抗体CH或CL的每个编码基因的上游中，可以构建用于表达人CDR移植抗体的载体。 例如，在(4)和(5)中构建人⑶R移植抗体的VH或VL中所使用的合成DNA中，当向其中位于两个末端的合成DNA的5’端引入适合的限制性酶识别序列时，可以进行克隆，以便它们以适当的形式被表达在(I)中所描述的用于表达人CDR移植抗体的载体中的人抗体CH或CL的每个编码基因的上游。(7)重组抗体的瞬时表达为了有效评估所产生的各种不同人CDR移植抗体的抗原结合活性，可以使用(3)和(6)中所描述的用于表达抗体的载体或其修饰的表达载体来瞬时表达重组抗体。可以使用任何细胞作为宿主细胞，只要所述宿主细胞能够表达重组抗体即可。例如，从高表达量的角度来看，使用C0S-7细胞(ATCC CRL1651) [Methods in Nucleic AcidsRes.，CRC Press, 283(1991)]。用于将表达载体导入到C0S-7细胞中的方法的实例包括DEAE-葡聚糖方法[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)]、脂质体转染方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 84，7413 (1987)]等。在导入表达载体后，可以通过酶免疫测定法[《单克隆抗体:原理和实践》第三版，(Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition), AcademicPress (1996);《抗体实验指南》，(Antibodies-A Laboratory Manual) , Cold SpringHarbor Laboratory (1988);《单克隆抗体实验手册》，(Monoclonal Antibody ExperimentManual) , Kodansha Scientific (1987)]等来测定培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性。(8)获得稳定表达重组抗体的转化体以及重组抗体的制备可以通过将(3 )和(6 )中所描述的用于表达重组抗体的载体导入到适合的宿主细胞中来获得稳定表达重组抗体的转化体。用于将表达载体导入到宿主细胞中的方法的实例包括电穿孔[日本公布的未经审查的专利申请 N0. 257891/90，Cytotechnology, 3，133 (1990)]等。作为其中导入了用于表达重组抗体的载体的宿主细胞，可以使用任何细胞，只要它是能够生产重组抗体的宿主细胞即可。实例包括CH0-K1 (ATCC CCL-61)、DUkXBll (ATCCCCL-9096)、Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies，目录号 11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Agl4(ATCC N0.CRL1581)、小鼠 P3X63_Ag8653 细胞(ATCC N0.CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(在后文中称为“dhfr”)缺陷的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，77，4216(1980)]、获得了凝集素抗性的 Lecl3 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55(1986)]、a 1,6-岩藻糖基转移酶基因缺陷的CHO细胞(W0 2005/35586, WO 02/31140)、大鼠 YB2/3HL.P2.Gil.16Ag.20 细胞(ATCC N0.CRL1662)等。此外，也可以使用其中蛋白质例如与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶、蛋白质例如与使岩藻糖的1-位通过a键连接到复合型N-糖苷连接糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位上的糖链修饰相关的酶、或与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质的活性降低或缺失的宿主细胞，优选为WO 2005/35586、或W002/31140等中描述的a 1，6_岩藻糖基转移酶基因缺陷的CHO细胞。在导入表达载体之后，通过在含有药剂例如G418硫酸盐(在后文中称为“G418”)等的动物细胞培养用培养基中进行培养来选择稳定表达重组抗体的转化体(日本公布的未经审查的专利申请N0.257891/90)。
动物细胞培养用培养基的实例包括RPMI1640培养基(由Invitrogen制造)、GIT培养基(由Nihon Pharmaceutical制造)、EX-CELL301培养基(由JRH制造)、MDM培养基(由Invitrogen制造)、杂交瘤-SFM培养基(由Invitrogen制造)、通过向这些培养基加入各种不同添加剂例如FBS而获得的培养基等。通过将获得的转化体在培养基中进行培养，可以在培养上清液中生产并积累重组抗体。可以通过ELISA等测定培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性。此外，在转化体中，按照日本公布的未经审查的专利申请N0.257891/90中公开的方法，通过使用DHFR扩增系统等可以提高重组抗体的表达量。通过使用蛋白A柱，可以从转化体的培养上清液纯化重组抗体[《单克隆抗体:原理和实践》第三版，(MonoclonalAntibodies-Principlesand Practice, Thirdedition) , Academic Press (1996);《抗体实验指南》，(Antibodies-A LaboratoryManual) , Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。此外，可以通过纯化方法例如凝胶过滤、离子交换层析、超滤等的组合来纯化重组抗体。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(在后文中称为“SDS-PAGE”)[Nature, 227，680 (1970)]、蛋白质免疫印迹[《单克隆抗体:原理和实践》第三版，(MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third edition), Academic Press (1996)；《抗体实验指南》，(Antibodies-A Laboratory Manual) , Cold Spring HarborLaboratory (1988)]等来测定纯化的重组抗体的H链或L链或完整抗体分子的分子量。3.单克隆抗体或抗体片段的活性评估可以以下面的方式评估本发明的纯化的单克隆抗体或抗体片段的活性。通过在上面1- (6a)中所描述的结合测定法和使用例如上面(6b)中所描述的Biacore系统的表面等离子体共振方法来评估与表达TIM-3的细胞的结合活性。此外，可以通过突光抗体技术[Canc er Immunol.1mmunother., 36, 373 (1993)]等来测定所述结合活性。通过已知方法[CancerImmunol.1mmunother., 36, 373 (1993)]来评估针对抗原阳性细胞系的补体依赖性细胞毒性(在后文中称为“CDC活性”)或ADCC活性。4.控制抗体的效应子活性的方法作为用于控制本发明的单克隆抗体的效应子活性的方法，已知的有用于控制以α -1, 6连接键结合于与抗体Fe区第297位的天冬酰胺(Asn)结合的复合型N-连接糖链的还原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的岩藻糖(在后文中也称为“核心岩藻糖”)的量的方法(W02005/035586、W02002/31140和W000/61739)，通过修饰抗体Fe区的氨基酸基团控制单克隆抗体的效应子活性的方法等。可以使用任何所述方法来控制本发明的抗TIM-3单克隆抗体的效应子活性。“效应子活性”是指通过抗体的Fe区诱导的抗体依赖性活性。作为效应子活性，已知的有ADCC活性、⑶C活性、经吞噬细胞例如巨噬细胞或树突状细胞的抗体依赖性吞噬作用(ADP活性)等。通过控制抗体Fe的复合型N-连接糖链的核心岩藻糖含量，可以提高或降低所述抗体的效应子活性。根据用于降低与结合于抗体Fe的复合型N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以通过使用α 1，6岩藻糖基转移酶编码基因缺陷的CHO细胞表达抗体来获得未结合有岩藻糖的抗体。未结合有岩藻糖的抗体具有高ADCC活性。另一方面，根据用于提高与结合于抗体Fe的复合型N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以通过使用其中导入了 α 1，6岩藻糖基转移酶编码基因的宿主细胞表达抗体来获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合有岩藻糖的抗体低的ADCC活性。此外，通过修饰抗体Fe区中的氨基酸残基，可以提高或降低ADCC活性或⑶C活性。例如，通过使用US2007/0148165中所描述的Fe区的氨基酸序列，可以提高与抗体的结合活性。此外，通过如美国专利N0.6，737，056或7，297，775或7，317，091中所述对氨基酸进行修饰，可以提高或降低ADCC活性或CDC活性。此外，在一种抗体内通过组合上述方法可以获得效应子活性受控的抗体。5.使用本发明的抗ΤΙΜ-3单克隆抗体或抗体片段治疗疾病的方法本发明的单克隆抗体或其抗体片段可用于治疗与ΤΙΜ-3阳性细胞相关的疾病。包含本发明的抗体或抗体片段或其衍生物的治疗剂可以仅仅是作为活性成分的抗体或抗体片段或其衍生物，并且优选将所述治疗剂提供为通过制药学技术领域公知的适合方法、通过将其与一种或多种可药用载体混合而生产的药物制剂。施用途径的实例包括口服施用和非口服施用，例如口腔、气管、直肠、皮下、肌内或静脉内施用。剂型的实例包括喷雾剂、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、胶带等。适合于口服施用的药物制剂包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。可以使用水，糖类例如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄榄油和大豆油，抗菌剂例如对羟基苯甲酸酯，调味剂例如草莓香料和胡椒薄荷等作为添加剂来生产液体制剂例如乳剂和糖浆。可以使用赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解剂例如淀粉和藻酸钠，润滑剂例如硬脂酸镁和滑石粉，粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶，表面活性剂例如脂肪酸酯，增塑剂例如甘油等作为添加剂来生产胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。 适合于肠胃外施用的药物制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂等。可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物来制备注射剂。可以使用载体例如可可脂、氢化脂肪或羧酸来制备栓剂。可以使用抗体或抗体片段本身、或将它与不刺激患者的口腔或气道粘膜并能通过将化合物分散成细粒子而促进所述化合物吸收的载体一起使用来制备喷雾剂。载体包括乳糖、甘油等。可以生产药物制剂例如气雾剂和干粉剂。此外，也可以将被示例作为口服制剂的添加剂的组分添加到肠胃外制剂中。6.使用本发明的抗ΤΙΜ-3单克隆抗体或其抗体片段诊断疾病的方法通过使用本发明的单克隆抗体或抗体片段检测或测定ΤΙΜ-3或表达ΤΙΜ-3的细胞，可以诊断与ΤΙΜ-3相关的疾病。例如，可以通过下面对ΤΙΜ-3的检测或测定来进行与ΤΙΜ-3相关的疾病之一癌症的诊断。可以通过用免疫 学方法例如流式细胞术检测患者体内细胞上的 Μ-3表达来进行癌症的诊断。
免疫学方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫学方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。放射性物质标记的免疫抗体方法的实例包括下述方法:使本发明的抗体或抗体片段与抗原、或表达抗原的细胞等进行反应，然后使经受过放射性标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段与其进行反应，然后使用闪烁计数器等进行测定。酶免疫测定法的实例包括下述方法:使本发明的抗体或抗体片段与抗原、或表达抗原的细胞等进行反应，然后使经受过抗体标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段与其进行反应，并通过分光光度计测定有色色素，例如，可以使用夹心ELISA。作为在酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用前面描述的任何已知酶标记物(《酶免疫测定法》(Enzyme Immunoassay),由Igaku Shoin出版，1987)。实例包括碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、生物素标记等。夹心ELISA为下述方法:将抗体结合于固相，捕获待检测或测定的抗原，并使另一种抗体与被捕获的抗原进行反应。在ELISA中，制备两种识别待检测或测定的抗原并且抗原识别位点不同的抗体或其抗体片段，并将第一抗体或抗体片段预先吸附在板(例如96孔板)上，用荧光物质例如FITC、酶例如过氧化物酶或生物素标记第二抗体或抗体片段。使吸附有上述抗体的板与从活体分离的细胞或其破碎的细胞悬液、组织或其破碎溶液、细胞培养上清、血清、胸腔积液、腹水、或眼液等进行反应，然后使其与标记的单克隆抗体或抗体片段反应，并执行与标记物质相对应的检测反应。根据通过已知浓度的抗原的逐步稀释而制备的校正曲线，可以计算待测试样品中的抗原浓度。作为用于夹心ELISA的抗体，可以使用任何多克隆抗体和单克隆抗体，或者可以使用抗体片段例如Fab、Fab’和F(ab)2。作为在夹心ELISA中使用的两种抗体的组合，可以使用识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，或者可以使用多克隆抗体与单克隆抗体或多克隆抗体与抗 体片段的组合。突光免疫测定法包括文献[《单克隆抗体:原理和实践》第三版，(MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third Edition) , Academic Press(1996);《单克隆抗体实验手册》，(Manual for Monoclonal Antibody Experiments) , KodanshaScientific (1987)]中描述的方法等。作为用于荧光免疫测定法的标记物，可以使用任何已知的突光标记物[《突光免疫测定法》，(Fluorescent Immunoassay), Akira Kawao, SoftScience, (1983)]。标记物的实例包括FITC、RITC等。可以使用文献[《生物发光和化学发光》，(Bioluminescence and ChemicalLuminescence) , Rinsho Kensa, 42, Hirokawa Shoten (1998)]中描述的方法等来执行发光免疫测定法。作为用于发光免疫测定法的标记物，可以包括任何已知的发光标记物。可以使用的实例包括吖啶酯、或洛酚碱等。蛋白质免疫印迹是下述方法:将抗原或表达抗原的细胞通过SDS (十二烧基硫酸钠)-PAGE[《抗体实验指南》，(Antibodies-A Laboratory Manual) (Cold Spring HarborLaboratory, 1988)]进行分级，将凝胶转印到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，使膜与识别抗原的抗体或抗体片段进行反应，进一步使其与标记有突光物质例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶、或生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或抗体片段进行反应，并使标记物可视化以证实反应。其实例如下所述。将其中表达了具有由SEQ ID NO:53表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解在溶液中，并在还原条件下通过SDS-PAGE方法对每个泳道0.1到30 μ g的蛋白量进行电泳。将电泳后的蛋白转移到PVDF膜上，并使其与含有I至10%BSA的PBS (在后文中称为“BSA-PBS”)在室温下反应30分钟以进行封闭。此时，将本发明的单克隆抗体与其进行反应，用含有0.05至0.1%吐温20的PBS(在后文中称为“吐温-PBS”)洗涤，并使其与过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。将其用吐温-PBS洗涤，使用ECL蛋白质免疫印迹检测试剂(由Amersham制造)等检测结合有单克隆抗体的条带，从而检测具有由SEQ ID NO:1表不的氣基酸序列的多妝。作为在蛋白质免疫印迹中用于检测的抗体，使用能够与不具有天然类型的三维结构的多肽结合的抗体。具体来说，通过使作为抗原的 Μ-3与本发明的抗体或抗体片段反应形成凝集体并检测该凝集体来执行物理化学方法。物理化学方法的其他实例包括毛细管方法、一维免疫扩散方法、免疫比池法、乳胶免疫比池法[《临床测试方法手册》，(Handbook of ClinicalTest Methods) , Kanehara Shuppan (1988)]等。例如，在乳胶免疫扩散法中，可以使用用抗体或抗原致敏的粒径为约0.1到I μ m的载体例如聚苯乙烯乳胶，并且当使用相应的抗原或抗体进行抗原-抗体反应时，反应溶液中的散射光增加而透射光减少。当这样的变化被作为吸光度或积分球浊度检测到时，就可以测定待测试样品中的抗原浓度等。此外，为了检测表达 Μ-3的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法、荧光抗体染色法等。免疫沉淀法是下述方法:使表达 Μ-3的细胞与本发明的单克隆抗体或抗体片段进行反应，然后加入对免 疫球蛋白具有特异性结合能力的载体例如蛋白G-琼脂糖，以使抗原-抗体复合物沉淀。此外，可以执行下述方法。将本发明的上述抗体或抗体片段固相化在用于ELISA的96孔板上，然后用BSA-PBS进行封闭。当抗体是未纯化的状态例如杂交瘤细胞的培养上清液时，使抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或蛋白G等预先吸附在用于ELISA的96孔板上并用BSA-PBS进行封闭，并向其分配杂交瘤细胞的培养上清液以进行结合。在弃去BSA-PBS并将残留物用PBS充分洗涤后，与表达 Μ-3的细胞或组织的溶解溶液进行反应。用SDS-PAGE用样品缓冲液从充分洗涤后的板中提取免疫沉淀物，并通过上述蛋白质免疫印迹进行检测。免疫细胞染色法或免疫组织染色法是下述方法:如果需要，用表面活性剂、或甲醇等处理表达抗原的细胞或组织以使抗体容易地渗透到细胞或组织中，然后使本发明的单克隆抗体与其进行反应，然后使其进一步与经受过荧光标记例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶或生物素标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段进行反应，使标记物可视化并在显微镜下进行观察。此外，可以通过免疫荧光染色法来检测细胞，在所述方法中，使细胞与荧光标记的抗体反应并通过流式细胞仪进行分析[《单克隆抗体:原理和实践》第三版，(MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third Edition) , Academic Press (1996);《单克隆抗体实验手册》(Manual for Experiments of Monoclonal Antibody) , KodanshaScientific (1987)],其中使细胞与突光标记的抗体反应并通过流式细胞仪进行分析。具体来说，通过荧光抗体方法，本发明的与 Μ-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段能够检测表达了维持天然三维结构的多肽的细胞。此外，在荧光抗体染色法中使用FMAT8100HTS系统(由Applied Biosystems制造)等的情形中，无需分离所形成的抗体-抗原复合物和没有参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原，即可测定抗原量或抗体量。本发明可以提供与 Μ-3的胞外区的氨基酸序列或三维结构结合并表现出ADCC活性的单克隆抗体或其抗体片段，生产所述抗体的杂交瘤，编码所述抗体的DNA，包含所述DNA的载体，通过转化所述载体而获得的转化体，使用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法，以及包含所述抗体或其抗体片段作为活性成分的治疗剂或诊断剂。在后文中，将具体描述本发明的示例性实施方式。然而，本发明不限于下面描述的示例性实施方式。实施例实施例1(人HM-3cDNA的分子克隆和稳定表达细胞的建立)使用ExTaq (由 Takara Bio Inc.制造)并使用人 MTC panel (由 Clontech 制造)作为模板，通过PCR扩增人HM-3cDNA。对于引物来说，使用TM_3Fw2 (SEQ ID NO:31)和TIM-3Re2(SEQ ID NO:32)。将获得的 PCR 产物插入到 pGEM-T Easy 载体(由 Promega Corp.制造)中，并将质粒导入到TOPlO One shot感受态细胞(由Invitrogen制造)中以进行扩增。通过小量制备方法提取质粒DNA。
`0597]通过使用引物TIM_3Fw和TIM_3Re2分析纯化的DNA的序列，选择与GenBank登记号NM_032782的编码区具有相同序列的克隆。通过用逆转录病毒构建系统Ampho(Retrovirus Constructive System Ampho,由 Takara Bio Inc.制造)将所选择的克隆插入到pMCs-1RES-GFP载体(由Cell Biolabs Inc.制造)中而进行的重组来构建人 Μ-3逆转录病毒(hHM-3/pMCs-1G)。将人 Μ-3逆转录病毒感染到Jurkat细胞(ATCC登记号:CRL-2063)、EoL_l细胞(RIKEN CELL BANK NO:RCB0641)和 L929 细胞(由 Sigma-Aldrich C0., LLC.制造)中，这些细胞被流式细胞术分析证实不内源性表达 Μ-3。在几次传代后，通过FACSAria (由BDBiosciences制造)收集TIM-3阳性细胞。通过在几次传代后用FACSAria再次收集TIM-3阳性细胞，建立人 Μ-3稳定表达细胞系。实施例2(可溶性细胞外人TIM-3-人Fe融合蛋白的表达载体的制备)使用ExTaq (由Takara Bio Inc.制造)并使用在实施例1中构建的Μ Μ_3/pMCs-1g作为模板，通过PCR扩增编码人 Μ-3的胞外区的cDNA。对于引物来说，使用pMCs-Fw (SEQ ID NO:33)和 HM3ED_FcReXba 2 (SEQ ID NO:34)。将扩增的PCR产物插入到pTracer-CMV-FLAG-人Fe载体[修饰后的载体，其中将FLAG和人IgGl的Fe结构域插入到pTracer-CMV (由Invitrogen制造)载体中XbaI位点和ApaI位点之间]中。在将质粒导入到TOPlOOne shot感受态细胞(由Invitrogen制造)中以进行扩增之后，通过小量制备方法提取质粒DNA (sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV)。
通过使用T7 (SEQ ID NO:35)和 hHM_3Fwl (SEQ ID NO:36)作为引物分析 DNA序列，证实了纯化的sHM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV具有与GenBank登记号NM_032782中的相应区域相同的核苷酸序列。核苷酸序列(从EcoRI识别位点至ApaI识别位点)与由SEQID NO:37表不的核苷酸序列相同。实施例3(可溶性细胞外人 Μ-3的表达载体的制备)使用ExTaq (由Takara Bio Inc.制造)并使用在实施例2中建立的sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV作为模板，通过PCR扩增编码人 Μ-3的胞外区的cDNA。作为引物，使用 TIM-3Fw2 (SEQ ID NO:31)和 HM3ED_FLAG4aa (SEQ ID NO:39)。接下来，使用ExTaq (由 Takara Bio Inc.制造)、使用 TIM-3Fw2 (SEQ ID NO:31)和C-FLAG-NotR2 (SEQ ID NO:40)作为引物并使用获得的PCR产物作为模板，通过PCR方法来连接FLAG表位。将PCR产物插入到pGEM-T Easy载体(由Promega Corp.制造)中。在将质粒导入到TOPlOOne shot感受态细胞(由Invitrogen制造)中以进行扩增之后,通过小量制备方法提取质粒DNA (sHM-3-FLAG/pEF6Myc_HisC)。通过使用T7 (SEQ ID NO:35)和 BGH-R (SEQ ID NO:41)作为引物进行 DNA 序列分析，证实了纯化的 sHM-3-FLAG-Fc/pEF6Myc_HisC 具有与 GenBank 登记号 NM_032782 中的相应区域相同的核苷酸序列。实施例4(可溶性细胞外人TIM-3-人Fe融合蛋白和可溶性细胞外人TIM-3的制备) 将在实施例2和实施例3中分别获得的sIlM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV质粒DNA和sTIM-3-FLAG-Fc/pEF6Myc_HisC 质粒 DNA 各自导入到 HEK293F 细胞(由 Invitrogen 制造)中，并进行瞬时表达。6天后，回收每种细胞上清液并将其用于蛋白纯化。在转染后6天，通过离心回收含有可溶性细胞外人TIM-3-人Fe融合蛋白或可溶性细胞外人 Μ-3的培养上清液。通过用抗FLAG M2琼脂糖亲和凝胶(由Sigma-AldrichC0., LLC.制造)制备的抗FLAG柱以及通过FLAG肽(由Sigma-Aldrich C0., LLC.制造)，按照制造商的操作规程来纯化融合蛋白。将洗脱的样品分级，然后将每个级分在还原条件下通过SDS-PAGE进行分析，然后进行银染和蛋白质免疫印迹。对于蛋白质免疫印迹来说，使用抗FLAG M2抗体(由Sigma-Aldrich C0., LLC.制造)和碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体(由Dako制造)。使用Amicon Ultra 410K (由Millipore制造)来浓缩含有祀蛋白的级分，并使用Superdex 200gp柱(由GE Healthcare制造)进行凝胶过滤层析。在分级后，将每个级分在还原条件下进行SDS-PAGE，银染，然后进行蛋白质免疫印迹。将其中发现有靶蛋白的级分浓缩，并用0.5mlPBS洗涤。在通过孔径为0.22μπι的MILLEX-GV除菌过滤器(由Mi 11 ipore制造)过滤后，收集可溶性细胞外人 Μ-3-人Fe融合蛋白或可溶性细胞外人TIM-3。通过检测内毒素的试剂盒Limulus ES-1I试剂盒Wako (由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)测定蛋白质的纯度,并证实了所述级分是足够纯的。实施例5(表达人抗体的小鼠的制备)`
用于免疫接种的小鼠具有下述遗传背景:其中内源性Ig重链基因座和K轻链基因座两者被纯合地破坏，并且同时保持包含人重链转入染色体(transchromosome)的14号染色体片段(SC20)和人IgK链转入基因(transgene，KC05)。该小鼠品系是通过将具有人Ig重链基因座的小鼠品系A与保持人IgK链转入基因的小鼠品系B杂交育种而建立的。小鼠品系A是纯合子，其中内源性Ig重链基因座和K轻链基因座两者被纯合地破坏并保持可以被传递给子代的14号染色体片段(SC20),例如在Tomizuka等(Tomizuka, K.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97:722-727)中所描述的。小鼠品系B是其中内源性Ig重链基因座和K轻链基因座两者被纯合地破坏并保持人IgK轻链转入基因(KCo5)的小鼠品系(转基因小鼠)，例如被描述在Fishwild等(1996) [Nature Biotechnology 14:845-851]中。通过将品系A的雄性小鼠与品系B的雌性小鼠或者将品系A的雌性小鼠与品系B的雄性小鼠进行杂交育种获得动物个体，所述动物个体是可以在其血清中同时检测到人Ig重链和IgK轻链的小鼠[Ishida&Lonberg，《IBC第11届抗体工程大会》摘要(IBC' s IIthAntibody Engineering, Abstract) 2000],并被进一步用于免疫学实验。仅供参考,通过建立许可可以从Kyowa Hakko Kirin获得表达人抗体的小鼠(在后文中称为“KM小鼠”)。实施例6(抗人 Μ-3单克隆抗体的制备)本实施例中单克隆抗体的制备是按照通用方法来进行的，例如发表在《单克隆抗体实验手册》(Monoclonal Antibody Experiment Manual) (Yasuhigashi Tamie 等，Kodansha, 1991)中的方法。使用在实施例1中制备的表达 Μ-3的L929细胞或在实施例4中制备的可溶性细胞外人TIM-3-人Fe融合蛋白作为TIM-3免疫原。被免疫接种的动物是如上所述的KM小鼠。

将表达 Μ-3的L929细胞以I X IO7个细胞/动物的剂量腹膜内注射到小鼠中。在第一次免疫接种后，将同样的细胞在这之后进一步另外施用三次或更多次。在获取脾脏之前3天，以20 μ g/小鼠从尾静脉施用在实施例4中制备的可溶性细胞外人TIM-3-人Fe融合蛋白。通过手术从免疫接种后的小鼠取出脾脏，将其置于4ml PBS中，并使用注射器活塞在筛网(细胞滤网:由Falcon制造)上捣碎。将通过筛网的细胞悬液进行离心来沉淀细胞，并将细胞重悬在Iml红细胞裂解缓冲液(由Sigma-Aldrich C0., LLC.制造)中。在室温下孵育5min后，加入含有50单位/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的IOml无血清DMEM培养基(由Invitrogen制造)(在后文中称为“无血清DMEM培养基”)，并通过离心来沉淀细胞。将细胞沉淀重悬在无血清DMEM培养基中。另一方面，将骨髓瘤细胞系SP2/0(ATCCNO:CRL-1581)培养在含有10%FBS、50单位/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的DMEM培养基(在后文中称为“含血清的DMEM培养基”)中，并在5%C02下在37°C下孵育，使细胞数量不超过IXlO6个细胞/ml。与脾脏来源的细胞的情形相同，将SP2/0细胞用IOml无血清DMEM培养基洗涤，并悬浮在无血清DMEM培养基中。将这些脾脏来源的细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液以5:1的比率混合，离心，并完全去除上清液。为了使细胞融合，缓慢加入Iml 50% (w/v)的聚乙二醇(由Boehringer Mannheim Corp.制造)，同时用吸管尖端搅拌沉淀,然后加入lml37°C预热的无血清DMEM培养基。缓慢加入5ml和IOml无血清DMEM，然后在5%C02下在37°C下孵育5min。在离心并去除上清液后，将融合的细胞重悬在50ml含有10%FBS (由Invitrogen制造)、青霉素-链霉素-谷氨酰胺(由Invitrogen制造，目录号10378-016的100倍稀释液)、IL-6 (5ng/ml)和2-巯基乙醇(由Invitrogen制造，目录号21985-023的1000倍稀释液)的DMEM培养基(在后文中称为“含有IL-6的DMEM培养基”)中，并在5%C02下在37°C下孵育。第二天，通过吸管吸取来收获细胞，离心，并将沉淀重悬在IOml含有IL_6的DMEM培养基中。第二天，加入次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(在后文中称为“HAT”，由Sigma-Aldrich C0.，LLC.制造)。在孵育约7至10天后，收集培养上清液用于杂交瘤筛选。实施例7(抗人TIM-3小鼠单克隆抗体的制备)本实施例中单克隆抗体的制备是按照发表在《单克隆抗体实验简介》(Introduction to Monoclonal Antibody Experiment) (Yasuhigashi Tamie 等，Kodansha, 1991)中的通用方法来进行的。使用在实施例1中制备的表达 Μ-3的L929细胞或在实施例4中制备的可溶性细胞外人TIM-3作为TIM-3免疫原。被免疫接种的动物是Balb/c 小鼠(从 Nihon Charles River 购买)。首先，通过以IX IO7个细胞/动物的剂量腹膜内注射表达 Μ-3的L929细胞，对Balb/c小鼠进行免疫接种。在第一次免疫接种后，将同样的细胞在这之后进一步另外施用三次或更多次。在取出脾脏之前3天，以20 μ g/小鼠从尾静脉施用在实施例4中制备的可溶性细胞外人 Μ-3蛋白。通过手术从免疫接种后的小鼠取出脾脏，将其置于4mlPBS中，并使用注射器活塞在筛网(细胞滤网:由Falcon制造)上捣碎。

将通过筛网的细胞悬液进行离心来沉淀细胞，并将细胞重悬在Iml红细胞裂解缓冲液(由Sigma-Aldrich C0., LLC.制造)中。在室温下孵育5min后,加入IOml无血清DMEM培养基，然后通过离心来沉淀细胞。将沉淀重悬在无血清DMEM培养基中。另一方面，通过在5%C02下在37°C下孵育，将骨髓瘤细胞系SP2/0 (ATCC NO:CRL_1581)在DMEM培养基中培养至细胞数量为I X IO6个细胞/ml或更少。与脾脏来源的细胞类似，将SP2/0细胞用IOml无血清DMEM培养基洗涤，并悬浮在无血清DMEM培养基中。将脾细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液以5:1的比率混合。离心后，去除上清液。向该沉淀缓慢加入Iml 50% (w/v)的聚乙二醇(由Boehringer Mannheim Corp.制造)，同时用吸管尖端搅拌沉淀，然后加入Iml预热至37°C的无血清DMEM培养基。向该悬液缓慢加入5ml DMEM培养基。在进一步加入IOml无血清DMEM后，将悬液在5%C02下在37°C下孵育5min。在将悬液离心后，将细胞沉淀重悬在50ml含有IL-6的DMEM培养基中并在5%C02下在37°C下进行培养。在孵育I天后，通过吸管吸取来收集细胞。在离心后，将沉淀重悬在IOml含有IL-6的DMEM培养基中。第二天，加入HAT培养基(由Sigma-Aldrich C0.，LLC.制造)。在孵育约7至10天后，回收培养上清液并用于杂交瘤筛选。实施例8(生产与人TIM-3结合的人或小鼠单克隆抗体的杂交瘤的筛选)
使用在实施例6和实施例7中制备的细胞上清液筛选杂交瘤。所使用的方法是利用表达人TIM-3的细胞系的流式细胞术方法。首先，将在实施例1中制备的表达人TIM-3的Jurkat细胞或EoL-1细胞用染色介质(含有2%FBS和0.05%叠氮化钠的PBS)洗涤，然后重悬在Iml染色介质中，得到I X IO6个细胞/ml的细胞密度。将细胞悬液以10 μ I/孔分配到96孔培养板中。然后，加入5(^1杂交瘤上清液并在41:下孵育301^11。在用染色介质将细胞洗涤两次后，向每个孔加入50 μ I被染色介质稀释200倍后的标记的抗体，并在4°C下孵育30min。至于标记的抗体,对于人单克隆抗体来说,使用山羊F(ab’)2抗人IgG ( Y链特异性)-R-PE (由SouthernBiotech制造),而对于小鼠单克隆抗体来说，使用山羊F (ab' )2抗小鼠 IgG (H+L) R-PE (由 SouthernBiotech 制造)。在用染色介质洗漆两次后，使用FACSCalibur (由BD Biosciences制造)对细胞进行分析作为初次筛选。在挑取阳性克隆并扩增后，通过FACSAria(由BD Biosciences制造)对杂交瘤细胞进行克隆分选，并在含有IL-6且还含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷(在后文中称为“HT”，由Sigma-Aldrich C0.，LLC.制造)的DMEM培养基中培养七天。与初次筛选方法中的相同，对收获的上清液进行筛选，从而使表达抗人 Μ-3人单克隆抗体的杂交瘤和表达抗人TIM-3小鼠单克隆抗体的杂交瘤克隆化，所选择的杂交瘤克隆被用于纯化单克隆抗体。实施例9(源自于杂交瘤的单克隆抗体的纯化)从实施例8中所制备的表达抗人 Μ-3的人或小鼠单克隆抗体的杂交瘤纯化抗 Μ-3的人或小鼠单克隆抗体。简单来说，使用CELLine抗体生产系统(由BD Biosciences制造)制备含有高浓度抗 Μ-3抗体的杂交瘤上清液，并从所述上清液纯化抗人 Μ-3单克隆抗体。首先，为了使克隆的杂交瘤适应无血清培养基，将杂交瘤培养在以1:1比率混合含有HT和IL-6的DMEM培养基与BD Cell MAb无血清培养基(由BD Biosciences制造)后的培养基中数天，然后培养在具有1:2混合比率的培养基中数天。接下来，将杂交瘤培养在BD Cell MAb无血清培养基(由BD Biosciences制造)中并使杂交瘤适应无血清培养基。按照制造商的说明书，将适应无血清培养基后的杂交瘤细胞在CL-1000培养瓶中进行培养，并从培养瓶收集含有高浓度抗 Μ-3抗体的杂交瘤上清液。按照标准程序，使用蛋白A纯化来自杂交瘤上清液的抗体。具体来说,将MabSelect (由GE Healthcare制造)装填在开放的柱子中，并荷载被PBS稀释2倍后的上清液，然后用0.lmol/L甘氨酸-HCl (pH 2.7)洗脱，然后用AmiconUltra (由Millipore制造)浓缩。接下来,通过使用NAP-5柱(由GE Healthcare制造),将获得的溶液用PBS缓冲液进行平衡，然后进行过滤除菌，获得抗人TIM-3人单克隆抗体的4个克隆(抗体512、抗体644、抗体4545和抗体4177)以及抗人 Μ-3小鼠单克隆抗体的一个克隆(抗体8213)。实施例10(抗TIM-3人单克隆抗体的同种型的鉴定)通过固相ELISA 和流式细胞术确定实施例9中所制备的每种抗 Μ-3人单克隆抗体的同种型。
具体来说,对于固相ELISA来说,用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(由Sigma-AldrichC0.，LLC.制造)稀释实施例4所获得的可溶性细胞外人TIM-3以得到I μ g/ml的浓度，并将其以50 μ I/孔分配到96孔培养板(Maxisorp,由Nunc制造)中。通过在4°C下孵育过夜使可溶性细胞外人TIM-3吸附于微孔板。在弃去上清液后，向板中加入在TBS中的SuperBlock封闭缓冲液(由PIERCE制造)，然后在室温下孵育lOmin，加入50 μ I杂交瘤培养上清液,然后在室温下孵育30min。在用含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤每个孔后，加入各50 μ I的HRP标记的小鼠抗人IgGl、抗人IgG2、抗人IgG3或抗人IgG4抗体(分别用含有10%SuperBlOCk封闭缓冲液的TBS-T将每种抗体稀释2000、2000、2000和4000倍；由SouthernBiotech制造)，并在室温下孵育30分钟。在用TBS-T洗涤每个孔后，加入50 μ I底物缓冲液(ΤΜΒ，由DAKO制造)，然后在室温下孵育 20min。通过加入 50 μ I 0.5mol/L硫酸(由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)来终止反应。在微孔板读板器(VersaMax,由Molecular Devices, LLC.制造)上测定450nm波长处的吸光度(参考波长:570nm)。此外，在流式细胞术方法中，用染色介质洗涤实施例1中制备的表达人 Μ-3的Jurkat细胞，然后加入50 μ I杂交瘤上清液，并在4°C下孵育30min。在洗涤后，加入各50 μ I的被染色介质稀释100倍后的小鼠抗人IgGl-PE、小鼠抗人IgG2_PE、小鼠抗人IgG3(铰链)_PE和小鼠抗人IgG4(Fc)-PE(由SouthernBiotech制造)，使其在4°C下静置30min，然后使用FACSCalibur流式细胞仪(由BD Biosciences制造)进行分析。根据结果，抗体512、抗体644和抗体4545的同种型分别为IgGl、IgG4和IgG2。实施例11(人TIM-3的小鼠单克隆抗体的同种型的鉴定)

使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Iso Strip MouseMonoclonal Antibody Isotyping Kit)(由 Roche-diagnostics 制造)确定实施例 9 中制备的抗人TIM-3小鼠单克隆抗体的同种型。通过使用实施例8中制备的含有抗TIM-3抗体的杂交瘤上清液，按照制造商的说明书确定同种型。结果，抗体8213的同种型被确定为IgG2b。实施例12(抗TIM-3单克隆抗体基因的分离)从生产实施例9中制备的抗人TIM-3的人或小鼠单克隆抗体的杂交瘤分离实施例9中制备的抗TIM-3的人或小鼠单克隆抗体的基因。使用高纯RNA分离试剂盒(由Roche-Diagnostics制造),按照制造商的说明书从克隆的杂交瘤提取总RNA。使用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(由Clontech制造)，按照其随附的说明书执行编码可变区的cDNA的克隆。使用UPM (SMART RACE cDNA 扩增试剂盒；由 Clontech 制造)和引物 hh_6 (SEQID NO:44)通过PCR扩增人单克隆抗体的重链(VH)。使用一部分反应产物作为模板，使用NUP (SMART RACE cDNA 扩增试剂盒；由 Clontech 制造)和引物 hh_3 (SEQ ID NO:45)进行PCR。使用Zero Blunt T0P0 PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)进行PCR产物的克隆。通过载体的通用引物(例如T7或M13R引物)分析核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出氨基酸序列。结果，抗体512的VH的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:54和SEQ IDNO:55表示，抗体644的VH的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID N0:58和SEQ ID NO:59表示，抗体4545的VH的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8表示，并且抗体4177的VH的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID N0:17和SEQ ID NO:18表示。将每个获得的可变区和人IgGl的恒定区插入并连接到表达载体N5KG1(由BiogenIDEC Inc.制造)中。使用UPM (SMART RACE cDNA 扩增试剂盒；由 Clontech 制造)和引物 hk_2 (SEQ IDNO:46)通过PCR扩增人单克隆抗体的轻链(VL)。使用一部分反应产物作为模板，使用NUP(SMART RACE cDNA 扩增试剂盒；由 Clontech 制造)和引物 hk_6 (SEQ ID NO:47)进行 PCR。使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)克隆PCR产物。通过载体的通用引物(例如T7或M13R)分析核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出氨基酸序列。结果，抗体512的VL的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:57表示，抗体644的VL的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID N0:60和SEQ ID NO:61表示，抗体4545的VL的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10表示，并且抗体4177的VL的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20表示。将每个获得的可变区和K链的恒定区插入并连接到表达载体N5KG1 (由BiogenIDEC Inc.制造)中。使用UPM (SMART RACE cDNA 扩增试剂盒；由 Clontech 制造)和引物 mH_Rvl (SEQID NO:48)通过PCR扩增小鼠单克隆抗体的重链(VH)。使用一部分反应产物作为模板，使用 NUP (SMART RACE cDNA 扩增试剂盒;由 Clontech 制造)和引物 mH_Rv2 (SEQ ID NO:49)进行PCR。使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)执行PCR产物的克隆。通过载体的通用引物(例如T7或M13R)分析核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出氨基酸序列。结果，抗体8213的VH的核苷酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:27和SEQID NO:28表示。将获得的可变区和小鼠IgG2a的恒定区连接并插入到表达载体N5KG1 (由Biogen IDEC Inc.制造)中。使用UPM (SMART RACE cDNA 扩增试剂盒；由 Clontech 制造)和引物 mK_Rvl (SEQID NO:50)通过PCR扩增小鼠单克隆抗体的轻链(VL)。此外，使用一部分反应产物作为模板，使用NUP (SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech制造)和引物mK_Rv2 (SEQ IDNO:51)进行PCR。使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)克隆PCR产物。通过载体的通用引物(例如T7或M13R)分析核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出氨基酸序列。结果，抗体8213的VL的核苷`酸序列和氨基酸序列分别由SEQ ID N0:29和SEQ IDN0:30表示。将获得的可变区和K链的恒定区连接并插入到上面提到的编码抗体8213的VH的表达载体中。此外，为了获得抗二硝基苯基(DNP)人IgGl抗体作为阴性对照，将抗体重链(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:62)、抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:64)以及人IgGl和κ链的恒定区插入到表达载体N5KG1 (由Biogen IDEC Inc.制造)中。实施例13(重组抗TIM-3人单克隆去岩藻糖抗体的纯化)通过将实施例12中制备的重组抗体表达载体导入到宿主细胞中来产生表达重组抗体的细胞。作为用于表达的宿主细胞，按照已发表的报道(Clin Cancer Res 2006:12(9)Iida等)使用FUT8+CH0细胞。简单来说，使用FreeStyle MAX试剂(由Invitrogen制造)，将实施例12中制备的用于各512、644、4545和4177的表达载体导入到FUT8+CH0细胞中。在摇床上将FUT8+CH0细胞在5%C02下在37°C下进行培养。在约5天后回收培养上清液。根据样品量，使用蛋白A (由GE Healthcare制造)并进一步使用0.8X40cm柱(由BioRad制造)等纯化回收的上清液。使用PBS作为结合缓冲液并使用0.02mol/L柠檬酸钠(pH 2.7,50mmol/L NaCl)缓冲液作为洗脱缓冲液，对抗体进行亲和纯化。向洗脱级分加入0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。使用NAP-25柱(由GE Healthcare制造)对所制备的抗体溶液用PBS进行平衡，并用Amicon UltraC 10000截留，由Millipore制造)进行浓缩。在过滤除菌后，获得重组的抗TIM-3人单克隆去岩藻糖抗体(抗体512、抗体644、抗体4545和抗体4177)。通过LimulusES-1I 试剂盒 Wako (由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)测定蛋白质的纯度，并发现这些抗体是充分纯化的。将实施例12中制备的用于表达抗DNP的载体导入到CH0-DG44细胞中。在摇床上将CH0-DG44细胞在5%C02下在37°C下进行培养。在孵育5天后回收培养上清液。根据样品量，使用蛋白A (由GE Healthcare制造)并进一步使用0.8 X 40cm柱(由BioRad制造)等纯化收集的上清液。使用PBS作为结合缓冲液并使用0.02mol/L柠檬酸钠(pH 2.7, 50mmol/L NaCl)缓冲液作为洗脱缓冲液，对抗体进行亲和纯化。向洗脱级分加入0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。分别 使用 NAP-25 柱(由 GE Healthcare 制造)和 Amicon Ultra (10000截留，由Millipore制造)对所制备的抗体溶液用PBS进行平衡以及进行浓缩。在过滤除菌后，获得重组的抗DNP抗体。使用Limulus ES-1I试剂盒Wako (由Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.制造)测定蛋白质的纯度,并发现所述抗体是充分纯化的。实施例14(重组抗TIM-3小鼠单克隆抗体的纯化)使用293fectin (由Invitrogen制造)将实施例12中制备的用于表达抗体8213的载体导入到HEK293F细胞(由Invitrogen制造)中。在摇床上将HEK293F细胞在5%C02下在37°C下进行孵育。在孵育5天后收集培养上清液。根据样品量，使用蛋白A (由GEHealthcare制造)并进一步使用0.8X40cm柱(由BioRad制造)等纯化收集的上清液。使用PBS作为结合缓冲液并使用0.02mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 2.7,50mmol/L NaCl)作为洗脱缓冲液，对抗体进行亲和纯化。向洗脱级分加入0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。使用NAP-25柱(由GEHealthcare制造)对所制备的抗体溶液用PBS进行平衡,并用Amicon Ultra (10000截留，由Millipore制造)进行浓缩。在过滤除菌后，获得重组的抗TIM-3小鼠单克隆抗体(8213抗体)。使用 LimulusES-1I 试剂盒 Wako (由 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)测定蛋白质的纯度，并发现所述抗体是充分纯化的。
实施例15(纯化的单克隆抗体的荧光标记)通过使用Alexa Fluor 647单克隆抗体标记试剂盒(由Invitrogen制造),按照制造商的说明书执行源自于杂交瘤的单克隆抗体和重组单克隆抗体的荧光标记。在标记后，通过FACSCalibur (由BD Biosciences)对表达 Μ-3的细胞进行分析，证实了每种抗体都被Alexa Fluor 647 (在后文中称为“Alexa-647”)阳性标记。实施例16(使用竞争试验对表位进行分类-1)通过竞争试验分析实施例13和实施例14中制备的抗体与可商购的抗TIM-3抗体344823 (Clone 344823，由R&D Systems制造)之间的表位的关系。简单来说，使测试抗体与实施例1中制备的表达TIM-3的细胞相互作用，然后通过流式细胞术方法评估另一种抗TIM-3抗体是否能够进一步与表达TIM-3的细胞结合。在第一步中，检查实施例13和实施例14中制备的每种单克隆抗体(抗体512、抗体644、抗体4177和抗体8213)与抗体34823之间是否竞争。首先，用染色介质洗涤表达人TIM-3的EoL-1细胞和亲代细胞EoL-1细胞，然后使其与每种纯化的目的单克隆抗体(抗体512、抗体644、抗体4177和抗体8213)反应(4°C，30min)。终浓度为10yg/ml。接下来，加入PE标记的抗体344823 (Clone 344823，由R&DSystems制造)并使其进行反应(4°C，30min)。在用染色介质洗漆后，加入7-ADD(由BD Biosciences制造),并使用FACSCalibur(由 BDBiosciences)进行分析。结果，被用作阳性对照的源自于山羊的抗人TIM-3多克隆抗体(由R&D Systems制造)和抗体644几乎完全阻断PE标记的抗体344823与表达 Μ-3的细胞结合。然而，抗体512,4545和8213不抑制PE标记的抗体344823与表达 Μ-3的细胞结合。抗体4177抑制PE标记的抗体344823与表达 Μ-3的细胞结合，但是这种抑制比抗体644的抑制弱。因此，抗体644与抗体344823竞争，但是抗体512、4545和8213不与抗体344823竞争。发现抗体4177与抗体344823彼此竞争，但是它们部分竞争。在第二步中，在所测试的抗 Μ-3单克隆抗体中，检查不与抗体344823相互作用的抗体512、4545和8213是否竞争。以与第一步中相同的方式进行实验，区别在于使用实施例15中制备的Alexa-647标记的抗体512或Alexa-647标记的抗体8213作为标记的抗体。结果，抗体4545和抗体8213不抑制Alexa-647标记的抗体512与表达 Μ-3的细胞
彡口口 然而，抗体4545抑制Alexa-647标记的抗体8213与表达 Μ-3的细胞结合。因此，发现抗体4545与抗体8213彼此竞争，但是这两种抗体不与抗体512竞争。该结果表明，抗体512识别与抗体344823和抗体8213不同的表位。在第三步中，用抗体512和抗体8213对在第一步中显示出与抗体344823部分竞争的抗体4177进行竞争性测定。以与第二步中描述的相同的方式进行实验。结果，抗体4177不抑制Alexa-647标记的抗体512与表达 Μ-3的细胞结合，但抑制Alexa-647标记的抗体8213与表达 Μ-3的细胞结合。因此，发现抗体4177不与抗体512竞争，而是只与抗体8213竞争。 根据这些结果，在实施例13和实施例14中所制备的5种抗体中，抗体644识别与抗体344823所识别的表位接近的表位；抗体512识别与抗体344823和其他4种抗体(抗体644、抗体4545、抗体4177和抗体8213)所识别的表位不同的表位。表明，抗体8213识别与抗体344823或512所识别的表位不同的表位。还表明，抗体4545识别与抗体8213所识别的表位接近的表位。然而，抗体4177识别与抗体8213所识别的表位接近的表位，并且也微弱地识别与抗体344823所识别的表位接近的表位。实施例17(重组抗 Μ-3人单克隆去岩藻糖抗体的抗体依赖性细胞性细胞毒性试验)对于借助于抗体的细胞性细胞毒性活性来说，通过使用人外周血单核细胞(在后文中称为“PBMC”)作为效应子，在抗体存在下测定针对靶细胞的ADCC活性。首先，从健康人供体收集外周血并与抗凝剂混合。将获得的血液荷载到Ficoll-Plaque Plus (由GEHealthcare 制造)上，并用大型离心机(CF9RX,由 Hitachi Koki C0., Ltd.制造)以 2000rpm离心20min,以便不破坏边界。收集含有细胞的中间级分并用PBS洗涤，然后以900rpm离心20min以去除血小板。由此获得的PBMC被用于测定。接下来，使用Daudi细胞作为靶细胞，并以效应子/靶细胞=50的比率混合PBMC。将在实施例13和实施例14中制备的每种重组抗人单克隆去岩藻糖抗体(抗体512、抗体644、抗体4545和抗体4177)以及作为人IgGl对照的抗DNP抗体悬浮在培养基中，以得到I μ g/ml的终浓度和100 μ I的总体积。在混合后，将溶液在5%C02下在37°C下孵育4hr。根据释放到培养基中的LDH的量评估靶细胞的裂解率。使用CytoTox 96无放射性细胞毒性测定(由Promega Corp.制造)，按照其随附的说明书来计算LDH活性和裂解率。作为统计学分析，使用标准的Student’s t检验，其中具有小于0.05的风险率(p)的样品被认为是显著不同的样品。作为在Daudi细胞上测定ADCC活性的结果，据发现，与抗DNP抗体相比，抗体4545和抗体4177表现出靶细胞的裂解率显著增加。该结果表明，抗 Μ-3小鼠抗体8213和与抗TIM-3小鼠抗体8213竞争的抗TIM-3抗体具有高ADCC活性。类似地，通过使用在实施例13中制备的重组抗 Μ-3人单克隆去岩藻糖抗体(抗体4545和抗体4177)、可商购的抗 Μ-3单克隆抗体344823和作为阴性对照的抗DNP抗体，测定ADCC活性。首先，从健康人供体收集外周血并与抗凝剂混合。将获得的血液荷载到Ficoll-Plaque Plus(由GE Healthcare制造)上，并用大型离心机(CF9RX,由Hitachi KokiC0.，Ltd.制造)以2000rpm离心20min,以便不破坏边界。收集含有细胞的中间级分并用PBS洗涤，然后以900rpm离心20min以去除血小板。由此获得的PBMC级分被用于测定ADCC活性。接下来，使用Daudi细胞作为靶细胞，并以效应子/靶细胞=25的比率混合PBMC。将每种抗体4545、抗体4177、抗体344823、抗DNP抗体和PBS悬浮在培养基中，以得到I μ g/ml的终浓度和100 μ I的总体积。在混合后，将溶液在5%C02下在37°C下孵育4hr。基于使用释放到培养基中的LDH的量，评估靶细胞的裂解率。使用CytoTox 96无放射性细胞毒性测定(由Promega Corp.制造),按照其随附的说明书来计算LDH活性和裂解率。作为`统计学分析，使用标准的Student’s t检验，其中具有小于0.05的风险率(P)的样品被认为是显著不同的样品。作为在Daudi细胞上测定ADCC活性的结果，据发现，与抗DNP抗体相比，抗体4545和抗体4177表现出靶细胞的裂解率显著增加。另一方面，与抗DNP抗体和PBS相比，抗体344823没有表现出靶细胞的裂解率显著增加。实施例18(使用抗 Μ-3抗体计算结合/解离常数)使用基于表面等离子体共振的生物传感器(Biacore,由GE Healthcare制造)分析结合/解离常数。简单来说，将抗人抗体或抗小鼠抗体固定在CM5传感器芯片上。接下来，使抗TIM-3的人或小鼠抗体流动以与芯片结合，然后使实施例4中制备的可溶性细胞外人TIM-3流动，以检测 Μ-3与抗 Μ-3抗体的结合/解离常数。在整个实验过程中，基本上使用由GE Healthcare提供的用于计算结合/解离常数的实验方法。具体来说，使用CM5作为传感器芯片(研究级，由GE Healthcare制造)。首先，通过流过400mmol/L EDC (N-乙基-N’- (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)与IOOmmol/L NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)的等份混合溶液来活化CM5芯片。接下来，用人抗体捕获试剂盒(由GE Healthcare制造)随附的溶液稀释该试剂盒随附的抗人抗体，并使获得的溶液流动，使得对于人抗体的抗体，所需量的抗体被固定在CM5芯片上。对于小鼠抗体来说，通过稀释在小鼠抗体捕获试剂盒(由GE Healthcareantibody制造)提供的溶液中,将针对小鼠抗体的抗体固定在CM5表面上。通过流过Imol/L乙醇酰胺盐酸盐来封闭活化的芯片表面并将其失活。接下来,对于每一个流动池,用HBS-EP缓冲液(由GE Healthcare制造)稀释一种抗 Μ-3抗体并使其流过，以便与固定在芯片表面上的人抗体的抗体或小鼠抗体的抗体结合。然后使可溶性细胞外人 Μ-3流过。为了使结合的抗TIM-3抗体与可溶性细胞外人TIM-3解离，将全部体积 的人抗体捕获试剂盒随附的3mol/L MgCl2或小鼠抗体捕获试剂盒随附的甘氨酸-HCl (pH1.7)流过所述池。将上面描述的程序视为一个步骤，并使用不同浓度的可溶性细胞外人TIM-3重复相似的程序，以收集用于计算结合/解离常数的数据(传感图谱(sensorgram))。通过测定280nm处的吸光度、然后将1.40D值转变成lmg/mL来计算被用作分析物的可溶性细胞外人TIM-3的浓度。根据电泳上的迁移率，计算得到可溶性细胞外人 Μ-3的分子量为42.8kDa。使用Biaevaluation软件(由GE Healthcare制造)，按照Biaevaluation软件手册来分析数据。具体来说，通过基本上采用1:1Langmuir结合反应模型进行拟合，同时执行动力学分析并计算结合速率常数(Ka)和解离速率常数(Kd)。然后从Kd/Ka计算解离常数(Kd)的值。大多数抗人 Μ-3人单克隆抗体具有约10_9mol/L的Kd值。就此而言，在靶向TIM-3的ADCC活性与结合亲和性之间不存在关联性。当对抗人TIM-3单克隆抗体进行监测(例如监测解离状态30min)时,使用抗原可溶性细胞外人TIM-3作为抗原没有检测到解离。结果，发现可以生产对人TIM-3具有非常高亲和性的单克隆抗体。实施例19(使用竞争试验对表位进行分类-2)
通过竞争性测定法分析抗 Μ-3抗体即抗体512、抗体644、抗体4545、抗体8213、抗体344823、抗体F38-2E2和作为对照的抗DNP抗体的表位。简单来说，使未标记的靶抗体与在实施例1中制备的表达TIM-3的细胞相互作用，并通过流式细胞术方法评估其他荧光标记的抗TIM-3抗体是否进一步与表达TIM-3的细胞结合。用染色介质洗涤表达人 Μ-3的EoL-1细胞，并使其与纯化的测试单克隆抗体[抗体512、抗体644、抗体4545、抗体8213、抗体344823 (由R&D Systems制造)、抗体F38_2E2(由 Imgenex 制造)]反应(4°C, 30min)。终浓度为 10 μ g/ml。接下来,加入 Alexa-647或APC标记的抗 Μ-3抗体[抗体344823 (由R&D Systems制造)和抗体F38-2E2 (由eBiosciences制造)],并使其进行反应(4°C, 30min)。在用染色介质洗漆后,加入7-ADD(由BD Biosciences 制造),然后用 FACSCalibur (由 BD Biosciences 制造)进行分析。结果显示在表I中。如表I中所示，与结合有未标记的抗TIM-3抗体的表达TIM-3的细胞的结合程度类似于阴性对照的情形，标为“ + ”，发现与结合有未标记的抗TIM-3抗体的表达TIM-3的细胞结合、但结合程度低于阴性对照的情形，标为“+/_”，而没有检测到与结合有未标记的抗TIM-3抗体的表达TIM-3的细胞结合的情形，标为“-”。表权利要求
1.单克隆抗体或其抗体片段，其与人TIM-3的胞外区结合，同时与选自下面(i)至(iii)中的一种抗体竞争:(i )抗体，其包括含有互补决定区⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQID NO:1至3表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:4至6表示的氨基酸序列，(ii)抗体，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQID NO:11至13表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 14至16表示的氨基酸序列，(iii)抗体，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQID NO:21至23表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:24至26表示的氨基酸序列。
2.权利要求1的单克隆抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体与选自上面(i)至(iii)中的一种抗体所结合的相同表位结合。
3.单克隆抗体或其抗体片段，其与人TIM-3的胞外区结合，同时与选自下面(a)和(b)中的一种抗体竞争:(a)抗体，其包括含有由SEQID NO:8表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQID NO:10表示的氨基酸序列的抗体VL，(b)抗体，其包括含有由SEQID NO: 18表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQID NO:20表示的氨基酸序列的抗体VL。
4.权利要求3的单克隆抗体或其抗体片段，其与选自上面(a)或(b)的一种抗体所结合的相同表位结合。
5.权利要求1至4任一项的单克隆抗体或其抗体片段，其是重组抗体。
6.权利要求5的单克隆抗体或其抗体片段，其是选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的重组抗体。
7.单克隆抗体或其抗体片段，其是选自下面(i)至(iii)中的一种:(i )单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:1至3表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ IDNO:4至6表示的氨基酸序列，( )单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO: 11至13表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:14至16表示的氨基酸序列，(iii)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有⑶Rl至3的抗体H链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:21至23表示的氨基酸序列；并包括含有⑶Rl至3的抗体L链，所述⑶Rl至3包含分别由SEQ ID NO:24至26表示的氨基酸序列。
8.单克隆抗体及其抗体片段，其是选自下面(a)和(b)中的一种:(a)单克隆抗体及其抗体片段，其包括含有由SEQID NO:8表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列的抗体VL，(b)单克隆抗体及其抗体片段， 其包括含有由SEQID NO:18表示的氨基酸序列的抗体VH，并包括含有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列的抗体VL。
9.单克隆抗体及其抗体片段，其与由SEQID NO:53表示的人TIM-3的IgV结构域的氨基酸序列中第67至第105位的氨基酸序列、第67至第96位的氨基酸序列或第67至第87位的氨基酸序列结合。
10.权利要求1至9任一项的抗体片段，其中所述抗体片段是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含⑶R的肽的抗体片段。
11.DNA，其编码权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段。
12.重组载体，其包含权利要求11的DNA。
13.转化体，其可通过将权利要求12的重组载体导入到宿主细胞中获得。
14.用于生产权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段的方法，所述方法包括将权利要求13的转化体在培养物中进行培养以形成并积累权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段，以及从培养物回收单克隆抗体或其抗体片段。
15.用于免疫检测或测定人TIM-3的方法，所述方法包括使用权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段。
16.用于检测或测定人TIM-3的试剂，所述试剂包含权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段。
17.与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，所述诊断剂包含权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段。
18.用于诊断与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用权利要求1至10任一项的单克隆抗体 或其抗体片段检测或测定人TIM-3阳性细胞。
19.用于诊断与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段检测或测定人TIM-3。
20.权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段在制造与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂中的应用。
21.与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段。
22.与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗方法，所述方法包括使用权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段诱导人TIM-3阳性细胞的细胞死亡。
23.权利要求1至10任一项的单克隆抗体或其抗体片段在制造与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了针对与表达人TIM-3的细胞相关的疾病的抗人TIM-3抗体，所述抗体与TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合并表现出较高的效应子活性例如抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC活性)。本发明提供了与TIM-3的胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合并表现出ADCC活性的单克隆抗体或其抗体片段；生产所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；包含所述DNA的载体；可通过导入所述载体而获得的转化体；用于生产所述抗体或其抗体片段的方法，其包括使用所述杂交瘤或转化体；包含所述抗体或其抗体片段作为活性成分的治疗剂和诊断剂。另外，本发明通过筛选与所述单克隆抗体或其抗体片段竞争的抗人TIM-3抗体而提供了具有高ADCC活性的抗人TIM-3抗体。
文档编号A61P7/00GK103079644SQ201180028878
公开日2013年5月1日 申请日期2011年6月10日 优先权日2010年6月11日
发明者高柳晋一郎, 户村瞳, 俵知纪, 稻垣好昌, 久保田丽夫, 赤司浩一, 菊繁吉谦 申请人:协和发酵麒麟株式会社, 国立大学法人九州大学