使用偶合的抗体或抗体片段治疗人免疫缺陷病毒感染的方法和组合物的制作方法

专利名称：使用偶合的抗体或抗体片段治疗人免疫缺陷病毒感染的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在受感染的受治疗者中治疗和在优选的实施方案中消除 人免疫缺陷病毒(HIV)的方法和组合物。在特别的实施方案中，所述组合物 和方法涉及靶向分子，如针对H1V抗原，例如针对H1V包膜抗原的抗体 或抗体片段。在更特别的实施方案中，所迷抗体或抗体片段可偶合至一个 或多个试剂，如治疗剂、诊断剂、抑制病毒生长剂和/或细胞毒剂，包括但 不限于化疗剂如阿霉素。在可选实施方案中，可使用具有针对HIV抗原的 一个或多个结合位点和对载体分子亲和的一个或多个结合位点的双特异 性或多特异性抗体或其片段，所述载体分子可连接细胞毒剂、抑制病毒生 长剂或其它治疗和/或诊断剂。
相关领域描述
虽然使用抗逆转录病毒治疗(ART)在治疗人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)中 取得振奋人心的进展，但是对外周血和淋巴结的分析已证明存在容纳潜伏 原病毒的静止T细胞的持久库，所述潜伏的原病毒可在甚至终止治疗后的 岁月里自发性活化(Berger等，Prac Ato/ y4cad"&4 1998 ,95:11511-11513; Blankson等，y4朋wWevA/W2002， 53:557-593)。
结合和中和抗体可防止游离病毒与细胞的受体连接，所述抗体可与病 毒表面结合，并可诱导补体介导的对游离病毒粒子的病毒溶解(Parren等， 1999, 13[增刊A]:S137-162)。抗体还可通过抗体依赖性细胞毒作用 (ADCC)、通过将NK-细胞偶联至受感染的靶细胞介导受感染细胞的杀伤 (Broliden等，./Wra/ 1990, 64:936-940)。但是，单独使用抗病毒抗体作为 感染HIV的患者的免疫治疗部分未实现其最初的诺言(Hinkula等J」c^/r /"2/m/we外"c/r 1994， 7:940-951; Trkola等，Ato Afed2005, 11:615-622)。
已尝试使用各种病毒或细胞组分作为通过抗体向感染HIV的细胞递 送治疗剂的把(Davey等，J Dw 1994, 170:1180-1188; Pincus等，/
/m"w"o/ 2003, 170:2236-2241; Ramachandran等，，/ /",e" Dw 1994, 170:1009-1013; Saavedra-Lozano等，Prac WW/爿c^ 〖7&4 2004， 101:2494-2499)。相似的免疫毒素已证明在癌症患者中有前途(Wu和Senter ， AW5wfec/ 朋/2005, 23:1137-1146)。但是，仍需要更有效的方法和组合物 来治疗感染H1V的细月包。
发明概述
本发明通过提供抑制、阻抑、；险测、识別、定位和/或消除感染HIV 的细胞的方法和组合物解决了本领域未解决的问题。在某些实施方案中， 所述组合物和/或方法可涉及针对H1V抗原的靶向分子。所述靶向分子可 包括但不限于肽、抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或任何此类抗体 的片段和/或抗体类似物。在某些实施方案中，所述靶向分子可是未偶合的， 例如"棵露"抗体或抗体片段。在其它实施方案中，所述靶向分子可偶合 至一个或多个治疗和/或诊断剂。所述剂可包括但不限于药物、前体药物、 抑制病毒生长剂、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、放射性核素、免 疫调节剂、细胞因子、标记物、荧光标记物、发光标记物、顺磁标记物、 MRI标记物、胶团、脂质体、纳米粒子或其组合。在特别的实施方案中， 偶合的抗-HIV抗体或片段可在体内施用至具有已知或疑似的HIV感染的 患者。所述施用可阻止或防止患者细胞感染HIV、可减少或消除患者中感染HIV的细胞，和/或可减少或消除先前和/或同时使用其它已知的抗逆转 录病毒治疗的患者中的感染HIV的细胞的残留病灶。
其它实施方案涉及治疗受治疗者，如感染HIV、 SIV、其它逆转录病
毒的受治疗者的方法和/或组合物。受治疗者可包括但不限于人、动物、猫、 狗、牛、羊、山羊、马和哺乳动物。所述方法和组合物可包含将为受治疗 者施用的一个或多个棵露或偶合的靶向分子。在优选的实施方案中，所述 耙向分子是抗体或抗体片段，包括嵌合、人源化或人抗体或片段的任何变 化。施用可以是通过本领域已知的任何路径，如口服、鼻、口腔、吸入、 直肠、阴道或局部。可选地，施用可以是通过原位、皮内、皮下、肌内、 腹腔内、动脉内、鞘内或静脉内注射。
熟练的技术人员应理解， 一个或多个HIV靶向分子，无论是偶合还是 未偶合的，均可单独施用或可选地与HIV感染的其它已知的治疗性治疗， 如叠氮胸苷、其它核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、 HIV蛋白酶抑制剂和/或融合抑制剂联合施用。在某些实施方案中，偶合的 H1V靶向分子可与HAART(高效抗逆转录病毒治疗)组合使用。许多抗-HIV 治疗剂在本领域为已知，可单独或以任何组合使用任何此类已知的试剂， 包括但不限于施多宁、齐多夫定、替诺福韦、拉米夫定、恩曲他滨、去羟 肌苷、阿巴卡韦、司他夫定、奈韦拉平、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、 福沙那韦、茚地那韦、奈非那韦、沙查那韦。
在一些实施方案中，抗-HIV抗体或片段可作为双特异性或多特异性抗 体复合体的一部分施用，所述双特异性或多特异性抗体具有至少一个HIV 抗原结合位点和针对第二个靶如半抗原或载体分子的第二个结合位点。在 其它实施方案中，抗-HIV抗体或片段可共价连接至抗体、抗体片段、单克 隆抗体、Fc片段、Fc-结合蛋白或抗体结合蛋白，或作为与抗体、抗体片 段、单克隆抗体、Fc片段、Fc-结合蛋白或抗体结合蛋白的融合蛋白提供。
在不同的实施方案中，抗-HIV抗体或片段可通过本领域公知的方法如 使用共价交联试剂，共价或非共价连接至不同的部分。许多此类试剂，如 碳二亚胺、双亚氨酸酯(bisimidate)、辛二酸的N-羟基丁二酰亚胺酯、二曱 基画3,3'-二硫-双丙亚氨酸酯、叠氮乙二醛(azidoglyoxal)、 1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)和用于蛋白质和/或肽的其它交联剂为已知，并可使用。
在其它实施方案中，所述抗-HIV抗体或片段可用作诊断和/或成像用 途的组剂(adjunct)。例如，抗-HIV抗体或片段可用任何已知的造影或检 测剂标记，或可使用任何已知的方法如ELISA等检测。所述抗-HIV抗体 或片段可间接体内使用，例如通过组织切片的免疫组织化学，以检测残留 的HIV感染。可选地，抗-HIV抗体或片段可施用至受治疗者以在体内检 测感染HIV的组织。所述组合物和方法可用于纟全测和/或"^断HIV感染的 存在，以监控治疗后残留的HIV感染，和/或监控抗-HIV治疗的有效性。
附图简述
附图构成本说明书的一部分，并被包括以进一步示范本发明特定实施 方案的某些方面。通过参考这些附图的一个或多个并结合下文显示的详细 描述，可更好地理解所述实施方案。


图1A. HIV-lmB在体外中和HIV感染。通过将不同浓度的免疫球蛋白 与HIV-lniB孵育，然后分析HIV易感的Jurkat T-细胞的病毒感染，测试免 疫球蛋白的中和能力。10貼/ml阿霉素-P4/D10和未标记的P4/D10 二者对 HIV-lmB的中和均显著好于HIV阴性血清(p-O.OOl)。
图lB.HIV-lme在体外抑制HIV感染在细胞间的扩散。为了测试所述 免疫球蛋白是否可以限制HIV-1感染的细胞间扩散，将Jurkat T-细胞按 0.2%、 1%、 3%和5°/。感染细胞和99.8%、 99%、 97%和95%未感染细胞的 比例进行混合。显示了使用不同浓度的免疫球蛋白处理3%感染HIV-IIIB 的Jurkat T-细胞和97%未感染细胞后的HIV-1 p24产生。结果显示为培养7 天后p24产生的抑制百分比。在0.5或0.05昭/ml的浓度下，阿霉素-P4/D10 对HIV-1 p24的产生的抑制效应显著好于未标记的P4/D10、对照抗体阿霉 素-LLl 、游离阿霉素和HIV-阴性血清(p二0.002)。
图2.针对HIV-l/MuLV感染的体内保护。使用HIV-l/MuLV感染的
脾细胞i.p.攻击小鼠(6-12只/组)，然后立即用单克隆抗体(Mab)或游离阿霉 素治疗。按每只小鼠100-800叫未偶合的P4/D10 Mab、 100-400貼游离阿霉素和100-200吗无关的阿霉素-hRS7进行滴定。所有其它治疗均按每只 小鼠100昭进行。攻击后10天，收集腹膜细胞并将其与HTV易感的.Turkat T-细胞混合。每3-4天测量这些细胞培养物中的HIVp24产生，持续18天。 显示了使用100貼Mab或游离阿霉素治疗后具有p24阳性细胞培养物的小 鼠的百分比。仅有来自使用100吗阿霉素-P4/D10治疗的小鼠的细胞不含 感染性HIV，这显著不同(p二0.0001)于所有其它组。
示例性实施方案描述
本申请引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、 论文、书籍和论著，均明确地通过引用整体结合入本文。
定义
如本文所用，"一个(a)"或"一种(an)"可指一个(种)或多于一个(种) 的项目。
如本文所用，术语"和"和"或"可用于表示合取或析取。即，除非 另外指明，二者均应理解为等同于"和/或"。
如本文所用，"大约"指在一个数字的加或减10%范围内。例如，"大 约100"指90和110之间的任何数字。
如本文所述，"抗体"指全长(即天然存在的或者通过正常的免疫球 蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)，或者免 疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分或类似物，像抗体片段。
"抗体片段"是抗体的一部分，如F(ab)2、 F(ab')2、 Fab、 Fv、 sFv和 类似物。无论结构如何，抗体片段与完整抗体识别的相同抗原结合。术语 "抗体片段"还包括通过结合特异抗原形成复合体，执行抗体类似作用的 任何合成或基因工程蛋白质。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离片 段，如由重链和轻链的可变区组成的"Fv"片段，其中轻链和重链可变区通 过肽连接体连接的重组单链多肽分子("scFv蛋白")和由氨基酸残基组成的 模仿高变区的最小识别单位(CDR)。
14"治疗剂"是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例 包括抗体、抗体片段、药物、抑制病毒生长剂、毒素、酶、核酸酶、激素、
免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、 光敏剂、染料和放射性同位素。其它示例性治疗剂和使用方法请参见美国 专利申请公布第20050002945、 20040018557、 20030148409和20050014207 号，其均通过引用结合入本文。
"中和抗体，，或"中和抗体片段"在本文中用于指与感染性病原体(如 病毒)反应并破坏或抑制其感染性和/或毒性的抗体或片段。
"诊断剂"是用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包 括但不限于放射性同位素、染料(如生物素-链霉亲和素复合体)、造影剂、 荧光化合物或分子，和磁共振成像(MRI)的增强剂(如顺磁离子)。
"免疫偶合物"是结合分子(如抗体组分)与原子、分子或高阶结构 (如载体、治疗剂或诊断剂)的偶合物。
"棵露抗体"是未与任何其它试剂偶合的抗体。
子、分子或高阶结构。载体可包括脂类(如能够形成高阶结构的两亲性脂)、 多糖(如葡聚糖)、蛋白质、肽、肽类似物、肽衍生物或其它高阶结构(如 胶团、脂质体或纳米粒子)。在某些实施方案中，可将载体设计为抗蛋白 酶解或其它酶降解，例如通过用D-氨基酸取代蛋白质或肽中天然存在的 L-氨基酸。
如本文所用，术语"抗体融合蛋白"指重组制备的抗原结合分子，其中 段。融合蛋白的价位指示融合蛋白对单个抗原或表位具有多少结合臂或位
点；即单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价位意味着它在与抗 原结合时可以利用多个相互作用，因而可以增强与抗原结合的亲和力。特
异性指示抗体融合蛋白能与多少种抗原或表位结合；即单特异性、双特异 性、三特异性、多特异性。4艮据这些定义，天然抗体如IgG为双价，因为 它有两个结合臂，但是它是单特异性，因为它结合一个表位。单特异性、
15多价融合蛋白具有多于一个的表位结合位点，但是只与 一 个此类表位结 合，例如具有两个与同一抗原反应性的结合位点的二链抗体。融合蛋白可 包含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合、或者同一抗体 组分的多个拷贝。融合蛋白可额外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适合此 类融合蛋白的治疗剂实例包括免疫调节剂("抗体-免疫调节剂融合蛋白")
和毒素("抗体-毒素融合蛋白")。 一个优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA 酶)，优选为重组RNA酶。
"双特异性抗体"是可同时与具有不同结构的两个耙结合的抗体。特 别关注的双特异性抗体和双特异性抗体片段具有至少一个与例如HIV包 膜蛋白特异性结合的臂和至少一个与可靶向的携带治疗或诊断剂的偶合 物特异性结合的其它臂。
如果抗体或者免疫偶合物制剂，或者本文所述的组合物的施用量在生 理学上是显著的，即被称为施以"有效治疗量"。如果试剂的存在引起受体 哺乳动物发生可检测的生理学变化，即被视为生理学上显著的。特别地， 如果抗-HlV抗体制剂的存在减少、抑制或消除感染H1V的细胞或减少、 抑制或消除未感染细胞的HIV感染，即被视为生理学上显著的。
如果组合物的施用可被受体患者耐受，其即被称为"药学可接受载 体"。无菌磷酸盐緩沖液是药学可接受载体的一个实例。其它合适的载体 对本领域技术人员为公知。例如，参见REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SC正NCES (雷明顿氏药物科学)，第19版(Mack Publishing Co. 1995)和古 德曼和吉尔曼的THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (治疗 学的药理学基础)(Goodman等编，Macmillan Publishing Co. ， New York， 1980和2001年版)。
使用的缩写词如下
ABS ，含有150 mM氯化钠的醋酸钠緩沖液； ADCC ，抗体依赖性细胞毒作用； DTT, 二石危苏糖醇； ELISA，酶联免疫吸附分析；
16ART, 4元逆寿争录病毒治疗； HIV，人免疫缺陷病毒； Mab,单克隆抗体； MuLV，小鼠白血病病毒； PBMC，外周血单核细胞； TCIDso， 50%组织培养物感染剂量。 抗体
不同的实施方案可涉及针对一个或多个HIV抗原或表位的抗体配体。 在优选的实施方案中，所述抗原或表位t艮示于感染HIV的细胞表面的抗 原或表位，如HIV包膜蛋白。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的 技术在本领域为公知。制备和鉴定抗体的方法也是本领域公知的(例如，参 见Harlowe和Lane， 1988, ylw"Z)0(i/e&'爿La6ora/or_y Maww"/ (抗体实3全手 册)，Cold Spring Harbor Laboratory)。使用的抗体也可从许多已知的来源通 过商业获得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤系可从美国典型培养物保藏中 心(ATCC， Manassas ， VA)获得。
卓乂歷戎脊
虽然优选的实施方案可涉及P4/D10抗体的使用，但是同样可获得、 制备和/或使用其它抗-HTV抗体。已报告了多种针对HTV的抗体，并且在 某些实施方案中，可以利用任何此类已知的抗-HIV抗体。例如，4E10 (Rosa 等，Immunity 2:163-73， 2005); 2F5(Bryson等，Protein and Peptide Letters, 8:413-18, 2001); 3D6(Ruker等，Ann. NY Acad. Sci. 646:212-19, 1991); C37 (Cao等，DNAand Cell Biology, 12:836-41,2004); IACY、 1F58、 IGGGC (Berry等，Proteins, 45:281-82， 2001); 2G12 (Armbruster等，J. Antimicrob. Chemother. 54:915-20， 2004),其均通过引用结合入本文。在可选实施方案 中，单克隆抗体可通过使用公知技术如美国专利4,196,265中举例的技术 很容易地获得。典型地，此技术包括用选择的免疫原组合物免疫合适的动 物。优选的是啮齿动物如小鼠和大鼠的细胞。更优选地是小鼠，最优选地 是BALB/c小鼠，因为BALB/c小鼠是最常规使用的，并且一般产生较高百分比的稳定融合。
免疫之后，选择具有生产抗体潜能的体细胞，特别是B-淋巴细胞(B-细胞)用于Mab生产方案。这些细胞可从活组织检查的脾、扁桃体或淋巴 结，或从外周血样品中获得。通常应免疫一组动物，然后摘取具有最高抗 体滴度的动物的脾，通过用注射器匀浆所述脾获得脾淋巴细胞。典型地， 免疫小鼠的脾含有大约5 x 107至2 x 108个淋巴细胞。
然后将所述免疫动物的产生抗体的B-淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的 细胞融合，所述永生骨髓瘤细胞一般是与被免疫动物属于同 一物种的动 物。适合在生产杂交瘤融合程序中使用的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗 体、融合效率高和具有酶缺陷的细胞系，所述酶缺陷使该细胞系不能在某 些仅支持融合细胞(杂交瘤)生长的选择培养基上生长。
如本领域技术人员已知的，可使用许多骨髓瘤细胞中的任何一种。例 如，当被免疫的动物是小鼠时，技术人员可使用P3-X63/Ag8、 P3-X63-Ag8.653 、 NSl/l.Ag41 、 Sp210-Ag14、 FO、 NSO/U、 MPC-ll 、 MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul;对于大鼠，技术人员可使用 R210.RCY3、 Y3-Agl.2.3、 IR983F和4B210;以及U-266、 GM1500-GRG2、 LICR-LON-HMy2和UC729-6均可用于细胞融合。
制备生产抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂种的方法通常包 括在存在促进细胞膜融合的一种试剂或多种试剂(化学或电的)下将体细 胞与骨髓瘤细胞按2:1的比率混合，但是此比率可分别为从大约20:1至大 约1:1不等。已描述了使用仙台病毒的融合方法和使用聚乙二醇(PEG)如 37% (v/v) PEG的融合方法。使用电诱导的融合方法也是适合的。
融合程序通常以低频率(约1 x 10—6至1 x 10-8)产生可存活杂种。不 过这并不会产生问题，因为通过在选择培养基上培养，将从亲本未融合细 胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，其正常情况下将继续无限分裂)中分化出 存活的融合杂种。所述选择培养基一般是含有阻止在组织培养基上从头合 成核苷酸的试剂的培养基。示例性试剂有氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨 酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻止嘌呤和嘧啶两者的从头合成，而重氮丝氨酸 仅阻止噪呤的合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基中添加次黄。票呤和胸腺嘧啶作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时， 则向培养基中添加次黄嘌呤。
优选的选择培养基是HAT。只有能够操纵核苷酸补救途径的细胞能够 在HAT培养基上存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤 磷酸核糖基转移酶(HPRT)，因而无法存活。B-细胞可以操纵此途径，但是 其在培养中的寿命有限， 一般在大约两周内死亡。因此，唯一可以在所述 选择培养基上存活的细胞是骨髓瘤细胞和B-细胞形成的那些杂种。
此培养提供了一群杂交瘤，从中可以选择特定的杂交瘤。典型地，杂 交瘤的选择通过下述方法执行在微滴定板上进行单克隆稀释来培养细 胞，然后对各个克隆上清液(大约两至三周以后)进行需要的反应性测试。 所述分析应灵敏、简单和快速，如放射免疫分析、酶免疫分析、细胞毒性 分析、噬菌斑分析、斑点免疫结合分析和类似分析。
然后将所选杂交瘤进行连续稀释并克隆至产生各个生产抗体的细胞 系，然后可无限繁殖其克隆以提供Mab。所述细胞系可通过两个基本方法 用于Mab生产。杂交瘤样品可注射至(通常是至腹膜腔)组织相容性动物， 所述动物是用于为原始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的类型。注射后的动 物形成分泌特异性单克隆抗体的肿瘤，所述特异性单克隆抗体由融合的细 胞杂种产生。然后可选择所述动物的体液如血清或腹水以提供高浓度的 Mab。所述各个细胞系也可在体外培养，其中Mab被天然分泌至培养基， 从中可以容易地获得高浓度的Mab。如果需要，任一方法产生的Mab可进 一步使用过滤、离心和各种层析方法如HPLC或亲和层析进行纯化。
本发明要求保护的方法和/或组合物的一些实施方案可涉及抗体片段。 此类抗体片段可通过传统方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体获 得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶解抗体产生，以提供表示为F(ab')2 的5S片段。此片段可进一步使用硫醇还原剂进行裂解和任选地使用针对 裂解二硫键产生的巯基的封闭基团，以生产3.5SFab'单价片段。可选地， 使用胃蛋白酶的酶解产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。生产抗体片 段的示例性方法参见美国专利第4,036,945号；美国专利第4,331,647号；Nisonoff等，1960, Arch. Biochem. Biophys., 89:230; Porter, 1959, Biochem. .T., 73:119; Edelman等，1967， METHODS IN ENZYMOLOGY (酶学方 法)，第422页(Academic Press)和Coligan等(编)，1991， CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (免疫学最新实验方案)，(John Wiley & Sons)。
也可使用其它裂解抗体的方法，如分离重链以形成单价的轻-重链片 段、进一步裂解片段或其它酶学、化学或遗传技术，只要所述片段与完整 抗体识别的抗原结合。例如，Fv片段包含Vh和Vt链的締合。此締合可以 是非共价的，参见lnbar等，1972， Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69:2659。 可选地，所述可变链可通过分子内二石克键连接或通过化学剂如戊二醛交 联。参见Sandhu, 1992， Crit. Rev. Biotech., 12:437。
优选地，所述Fv片段包含通过肽连接体连接的Vh和Vt链。这些单 链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建包含编码Vh和Vl結枸域的DNA序列的 结构基因制备的，所述序列用寡核苷酸连接体连接。将所述结构基因插入 表达载体，然后将所述表达载体导入宿主细胞如大肠杆菌(A'. co/,)。重组的 宿主细胞即合成由连接体肽连接所述两个V结构域的单个多肽链。生产 sFv的方法在本领域为公知。参见Whitlow等，1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Bird等，1988, Science, 242:423;美国专 利第4,946,778号；Pack等,1993， Bio/Technology, 11:1271和Sandhu, 1992， Crit. Rev. Biotech., 12:437。
抗体片段的另一形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽("最 小识别单位")可通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因获得。例如， 通过使用聚合酶链式反应从生产抗体的细胞的RNA合成可变区制备此类 基因。参见Larrick等，1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Ritter等(编)，1995， MONOCLONAL ANTIBOD正S: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION (单克隆 抗体生产、加工和临床应用)，第166-179页(Cambridge University Press); Birch等，(编)，1995， MONOCLONAL ANTIBOD正S: PRINCIPLES AND APPLICATIONS (单克隆抗体:原理和应用),第137-185页(Wiley-Liss，
20Inc.)。嵌合#乂漆化戎#嵌合抗体是其中例如人抗体的可变区被例如小鼠抗体的可变区取代， 而包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)的重组蛋白。嵌合抗体在被施用至受 治疗者时表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。构建嵌合抗体的方法在 本领域为公知(例如，Leung等，1994， Hybndoma 13:469)。嵌合单克隆抗体可通过将小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的小鼠 CDR转移至人抗体的相应结构域进行人源化。所述嵌合单克隆抗体的小鼠 骨架区(FR)也被替换为人FR序列。为了保留人源化单克隆的稳定性和抗 原特异性，可将一个或多个人FR残基替换为小鼠的对等残基。人源化单 克隆抗体可用于受治疗者的治疗性治疗。还可通过所述CDR序列的选4奪 修饰增加人源化抗体的耙亲和性(WO0029584Al)。生产人源化单克隆抗体 的技术在本领域为公知。(例如，参见Jones等，1986， Nature, 321:522; Riechmann等,Nature，1988,332:323; Verhoeyen等，1988, Science，239:1534; Carter等，1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285; Sandhu， Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest等，1991, Biotechnology 9:266; Singer 等，J. Immun.， 1993， 150:2844。)其它实施方案可涉及非人灵长类动物抗体。在狒狒中培养治疗有用抗 体的一般技术可参见，例如Goldenberg等，WO 91/11465 (1991)和Losman 等，Int. J. Cancer 46: 310 (1990)。乂我傳在另一实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。此类抗体可从已加工 为响应抗原攻击生产特异性人抗体的转基因小鼠中获得。在此技术中，人 重链和轻链基因座的元件被引入小鼠系中，所述小鼠系是从含有内源重链 和轻链基因座的靶向阻断的胚胎干细胞系产生的。所述转基因小鼠可合成 对人抗原特异的人抗体，因此所述小鼠可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。 从转基因小鼠获得人抗体的方法参见Green等，Nature Genet. 7:13 (1994)， Lonberg等，Nature 368:856 (1994)和Taylor等，Int. Immun. 6:579 (1994)。使用组合方法或使用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物生产完全人抗体的方法在本领域为已知(例如，Mancini等，2004， Wew M/cra/nV /. 27:315-28; Gonrad禾口 Scheller， 2005， CVw76. CT/e/w. ///g// 77/rowg/2/w/1 Scree". 8:117-26; Brekke和Loset， 2003， (9戸w. P/wmaco/. 3:544-50;其均通的副作用，并在体内充当基本内源人抗体。在某些实施方案中，本发明要 求保护的方法和程序可利用通过所述技术生产的人抗体。在一个可选实施方案中，可使用噬菌体展示技术生产人抗体(例如， Dantas-Barbosa等，2005, Afo/. 4:126-40,通过引用结合入本文)。人抗体可从正常人或表现出特定疾病状态(如HIV感染或AIDS )的人中 生产。从患病个体构建人抗体的优点是循环抗体库可能偏好针对疾病相关 抗原的抗体。在此方法的 一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)从骨肉瘤患 者构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。 一般而言，从循环血淋巴细 胞(似)获得总RNA。从p、 y和K链抗体库克隆重组的Fab并将其插入噬 菌体展示文库(W.)。 RNA可通过使用对重链和轻链免疫球蛋白序列特异的 引物转化为cDNA，并用于制备Fab cDNA文库(Marks等，1991 ，</. Mo/.说o/. 222:581-97，通过引用结合入本文)。文库构建根据下列文献执行 Andris-Widhopf等(2000,选自P/ ageZXy/7/(3少Z^6orator少Afawwa/(口苤菌体 展示实验手册)，Barbas等(编)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY第9.1至9.22页，通过引用结合入本文)。 用限制性内切酶消化最终的Fab片段，将其插入噬菌体基因组以制备噬菌 体展示文库。所述文库可通过标准噬菌体展示方法如生物淘选进行筛选。 熟练的技术人员应理解此技术仅是示例性的，可使用任何已知的通过噬菌 体展示制备和篩选人抗体或抗体片段的方法。在另一可选实施方案中，可使用上述标准免疫方案，可以使用经过基 因工程改造以生产人抗体的转基因动物来生产针对基本上任何免疫原性 把的抗体。所述系统的非限制性实例如Abgenix (Fremont, CA)的Xeno 'J 、 鼠⑧(例如，Green等,1999， </ /麗画/.231: 11-23)。在Xeno小鼠⑧和类似动物中，小鼠抗体基因已被灭活，并替换为功能性人抗体基因， 而小鼠免疫系统的剩余部分则保持完整。Xeno小鼠⑧已转化了种系配置的YAC (酵母人工染色体)，所述YAC 包含部分人IgH和IgK基因座，包括可变区序列的大部分以及辅助基因和 调控序列。可使用人可变区库生产产生抗体的B细胞，所述B细胞可通过 已知的技术加工成杂交瘤。使用靶抗原免疫的Xeno小鼠⑧将通过正常的免有多个种系的Xeno小鼠⑧可用，每个种系均能产生不同类别的抗体。所述 人抗体可通过化学交联或其它已知的方法偶联至其它分子。已显示转基因 生产的人抗体具有治疗潜力，并保留普通人抗体的药代动力学特性(Green 等，1999)。熟练的技术人员应理解，本发明要求保护的组合物和方法不限 于使用Xeno小鼠⑧系统，而可利用经过基因工程改造以生产人抗体的任何 转基因动物。在某些实施方案中，优选使用能够破坏或抑制HIV的感染性和/或毒 性的中和抗体或其片段。多种HIV中和抗体在本领域为已知，可使用任何 此类已知的抗体或其片段，包括但不限于P4/D10、 2G12(例如，Joos等， v4""附,cra6ylgewteC/2ewc^2er2006， 50:1773-79)、 4E10(Joos等，2006)、 2F5 (Joos等，2006)、 bl2(例如，Wu等，用ra/2006， 80:2585)、 X5 (Moulard 等，PracAto/y4cad5^2002， 99:6913-18)或其任何组合。当使用多特异性 抗体或片段时，熟练的技术人员应理解，可组合与相同或不同HIV表位结 合的多个抗体或片段。虽然优选针对HIV包膜蛋白(gpl20)和/或即41的抗 体，但是熟练的技术人员应理解，可利用其它HIV靶抗原以形成靶向感染 HIV的细胞的抗体或其片段。在一些情况下，可利用与一个或多个HIV抗 原以及T-细胞抗原(例如，CD4、 CCR5和/或CXCR4)结合的抗体或片段。不同的实施方案可涉及融合蛋白。 一般地，在这些分子中， 一个肽的 全部或大部分在N-或C-末端连接至第二个多肽或蛋白质的全部或大部分。 例如，融合可利用其它物种的先导序列以允许蛋白在异源宿主中的重组表23达。另一种有用的融合包括将具有免疫活性的结构域(如抗体或片段)连 接至治疗剂(如肽或蛋白质毒素或酶)。融合的另一有用形式可包括连接可用于纯化的部分，如FLAG表位(Prickett等，1989， 5,Wec/mz，e-s' 7:580-589; Castrucci等，1992， J Mra/66:4647-4653)。生产融合蛋白的方 法对本领域技术人员为公知。例如，所述蛋白可通过下述方法生产使用 双功能交联试剂进行化学连接，从头合成完整的融合蛋白，或将编码笫一 个蛋白质或肽的DNA序列连接至编码第二个肽或蛋白质的DNA序列，然 后表达完整的融合蛋白。双特异性抗体在某些实施方案中，可使用双特异性或多特异性抗体或片段。此类抗 体或片段包含至少一个HIV-相关抗原的结合位点和至少一个，例如针对偶 合至治疗和/或诊断剂的载体分子、细胞因子、细胞表面受体或其它抗原的 其它结合位点。一般而言，通过重组DNA技术产生的离散的抗体Vh和Vl結枸域可 彼此配对形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利第4,642,334 号)。但是，此类非共价締合的分子在生理条件下不够稳定，因而没有任何实际的用途。同类的Vh和VL结构域可用具有适当组成和长度的肽连接体(通常由超过12个的氨基酸残基组成)连接以形成具有结合活性的单链Fv (scFv)。生产scFv的方法公开于美国专利第4,946,778号和美国专利第 5,132,405号。将所述肽连接体的长度减至小于12个氨基酸残基阻止位于 同一条链的Vh和Vt结构域配对，而强制在不同链上的具有互补结构域的 Vh和VL结构域进行配对，形成有功能的多聚体。用3至12个氨基酸残基 的连接体连接的Vh和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为二链抗体)。 使用0至2个氨基酸残基的连接体，则有利于形成三聚体(称为三链抗体) 和四聚体(称为四链抗体)，但是除连接体长度之外，寡聚化的准确模式似乎还依赖于V-结构域的组成以及方向(VH-连接体-VL或Vl-連接体-Vh)。使用由5个或更少氨基酸残基组成的肽连接体获得了多价的单特异性 二链抗体、三链抗体和四链抗体。还使用双顺反子表达载体制备了双特异 性二链抗体，所述双特异性二链抗体是两个不同scFv的异二聚体，每个24scFv均由用短的肽连接体连接的一个抗体的VH结构域和另一抗体的VL
结构域组成；所述双顺反子表达载体在一个顺反子中含有包含Vm-连接体
-丫!^的重组基因构建体，而在另一顺反子中含有包含vh2-连接体-Vu的重
组基因构建体(Holliger等Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 6444-6448; Atwell等Mollmmunol. 1996; 33:1301-1302; Holliger等Nature Biotechnol. 1997; 15:632-631; Helfrich等Int. J Cancer. 1998; 76:232-239; Kipnyanov 等Int J Cancer. 1998; 77: 763-772; Holliger等Cancer Res. 1999; 59: 2909-2916)。
近来，还报告了具有双特异性的四价串联二链抗体(称为tandab) (Cochlovius等Cancer Res. 2000; 60: 4336-4341)。所述双特异性tandab是 两个相同多肽的二聚体，每个多肽均含有两个不同抗体的四个可变结构域 (vm、 vu、 vm、 VL2)，所述四个可变结构域的连接方向有利于在自締合
后形成两个各自具有两个不同特异性的潜在的结合位点。
通过改变连接体长度制备基于scFv的多价和多特异性剂的方法公开 于美国专利第5,844,094号、美国专利第5,837,242号和WO 98/44001。通 过构建一个包含来自至少两个抗体的Vh結枸，而另一个包含相应的Vl結 构域的两个多肽链制备基于scFv的多价和多特异性剂的方法公开于美国 专利第5,989,830号和美国专利第6,239,259号。美国专利第6,809,185号 公开了重组制备的双特异性或三特异性抗体，其中Fab的CHI和Cl的c-末端均与衍生自相同或不同单克隆抗体的scFv融合。
构建和使用双特异性和多特异性抗体的方法参见，例如2004年2月 11日提交的美国专利申请公布第20050002945号，其完整内容通过引用结 合入本文。多种重组方法可用于生产双特异性抗体和抗体片段。例如，可 在转基因家畜的乳中生产双特异性抗体和抗体片段(例如参见Colman, A.， Biochem. Soc. Symp.， 63:141-147， 1998;美国专利号5,827,690，其均通 过引用结合入本文。)制备两个DNA构建体，所述构建体分别含有编码配 对的免疫球蛋白重链和轻链的DNA区段。将所述片段克隆至含有优先在 乳腺上皮细胞表达的启动子序列的表达载体。实例包括但不限于下述基因 的启动子兔、牛和羊酪蛋白基因，牛a-乳球蛋白基因，羊P-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸蛋白基因。优选地，所述插入片段的3'端侧翼是来自乳腺 特异性基因的同类基因组序列。这提供了多聚腺苷酸化位点和转录子稳定 序列。将所述表达盒共注射至受精的哺乳动物卵的原核中，然后将所述卵
移植到受体雌性的子宫中进行孕育。通过Southern分析对出生的后代进行 筛选，筛选同时存在两个转基因的后代。为了形成所述抗体，两个重链和 轻链基因必须同时表达于同 一细胞。使用本领域已知的标准免疫学方法分 析转基因雌性的乳中所述抗体或抗体片段的存在和功能。可使用本领域已 知的标准方法从乳中纯化所述抗体。
辦-
使用双特异性抗体的一个策略包括预靶向方法，其中效应分子在施用 双特异性抗体之后施用至受治疗者。所述双特异性抗体(其应包括HIV抗 原的结合位点和一个针对偶合至一个或多个效应分子的载体的结合位点) 定位至发病组织，增加效应子定位至发病组织的特异性(美国专利申请第 20050002945号)。因为所述效应分子从循环中清除的速度大大快于所述双 特异性抗体，所以使用预耙向策略时正常组织接触效应分子的机会小于直 接将效应分子连接至疾病靶向抗体的情况。
已开发了预靶向方法以增加检测或治疗剂的靶:本底比值。预靶向和生 物素/亲和素方法的实例参见，例如，Goodwin等，美国专利第4,863,713 号；Goodwin等，J. Nucl. Med. 29:226， 1988; Hnatowich等，J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr等,J. Nucl. Med. 29:728， 1988; Klibanov等，J. Nucl. Med. 29:1951， 1988; Sinitsyn等，J, Nucl. Med. 30:66， 1989; Kalofonos 等，J, Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter等，Int. J. Cancer 48:167, 1991; Paganelli等，Cancer Res. 51:5960， 1991; Paganelli等，Nucl. Med. Commun. 12:211， 1991;美国专利第5,256,395号；Stickney等，Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan等,Cancer Res. 51:3119, 1991;美国专利第6,077,499号；美 国序列第09/597,580号；美国序列第10/361,026号；美国序列第09/337,756 号；美国序列第09/823,746号；美国序列第10/116,116号；美国序列第 09/382,186号;美国序列第10/150,654号；美国专利第6,090,381号；美国 专利第6,472,511号；美国序列第10/114,315号；美国临时申请第60/386,411号；美国临时申请第60/345,641号；美国临时申请第60/3328,835号；美 国临时申请第60/426,379号；美国序列第09/823,746号；美国序列第 09/337,756号；和美国临时申请第60/342,103号，其均通过引用结合入本 文。
在某些实施方案中，双特异性抗体和可靶向的构建体可用于治疗和/ 或成像发病组织，例如使用美国专利第6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5，128,119; 5,101,827;和4,735,210号(其均通过引用结合入本 文)所述的方法。其它方法参见1999年6月22日提交的美国申请序列第 09/337,756号和2001年4月3日提交的美国申请序列第09/823，746号。
停靠和锁定(DNL)
在某些实施方案中，双特异性抗体或片段、或抗体或片段的偶合物可 使用称为停靠和锁定(DNL)的技术进行组装。DNL技术的进一步详情可参 见2005年3月24日提交的美国专利申请序列第11/389,358号；2006年3 月28日提交的11/391,584号;2006年6月29日提交的11/478,021; 2007 年6月21日提交的11/633,729;和2006年11月6日提交的美国临时专利 申请序列第60/864,530号，其内容均通过引用整体结合入本文。
概要而言，DNL技术包括两个或多个互补序列之间的靶向结合，所述 互补序列如，例如c-AMP依赖性蛋白激酶A的调节亚基的二聚化和停靠 结构域(DDD)和介导与PKA的R亚基締合的各种A-激酶锚定蛋白(AKAP) 中发现的锚定结构域。但是，本领域技术人员应理解已知存在其它二聚化 和停靠结构域以及锚定结构域，并且任何此类已知的结构域均可在本发明 要求保护的主题范围内使用。其他示例性4-螺旋束型DDD结构域可获自 p53、 DCoH(蝶呤4a甲醇胺脱水酶/肝细胞核因子la(TCFl)二聚化的辅因 子)和HNF-1(肝细胞核因子1)。具有潜在用途的其它AD序列可参见美国 专利申请序列第20003/0232420A1号，其完整内容通过引用结合入本文。
这些互补结合对可共价连接至各种功能单元，如抗体或抗体片段，或 治疗或诊断剂，形成具有确定特异性和活性的治疗或诊断复合体。熟练的 技术人员应理解可通过多种途径形成所述复合体，例如通过将AD或DDD序列掺入包含Fab、 Fab'、 IgG、 scFc或具有已知的结合特异性的其它抗体 或片段的融合蛋白。例如，可通过将AD和DDD序列掺入对两个不同靶 抗原的具有特异性的抗体或片段形成双特异性复合体。可选地，连接至 DDD或AD部分的抗体或片段可与治疗蛋白质或肽，如激素、酶、核糖核 酸酶、豹蛙酶(onconase)或连接至互补AD或DDD部分的其它试剂结合。 许多此类潜在的复合体在上文列出的专利申请中已有描述，可以使用任何 此类已知的复合体。
治疗或诊断剂与抗-HIV抗体的偶合
在不同的实施方案中，治疗剂可偶合至抗-HIV抗体、片段或其它靶向 分子以递送至感染HIV的细胞。使用的治疗剂可包含一个或多个aplidin、 阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白 消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸 氮芥、顺柏、伊立替康(CPT-ll)、 SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿 糖胞苷、氮烯咪胺、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、 2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉 素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊普葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、 氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、 3',5'-0-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、 氟他胺、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷 酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基噪呤、6-巯基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯 酯、甲基千肼、喷司他丁、 PSI-341、司莫司汀、链脲菌素、紫杉烷类、硫 鸟噤呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、万珂(velcade)、长 春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙 酶、rapLRl、 DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花 白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷 酸、干扰RNA或其组合。
本文所述HIV靶向分子还可与其它部分偶合。例如，药物、毒素、放 射性化合物、酶、激素、细胞毒蛋白、螯合剂、细胞因子和其它功能剂可 偶合至所述HIV靶向分子。例如，可通过共价连接与侧链含有氨基、羧基、硫醇或羟基的氨基酸残基偶合。各种常规连接体均可用于此目的，例如， 二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰 亚胺-幾基丁二酰亚胺酯、戊二醛和类似物。与未^f'务饰结构相比，试剂与所 述HIV靶向分子的偶合优选不显著影响其结合活性或特异性。此外，可首 先将细胞毒剂和/或抑制病毒生长剂偶联至多聚物载体，然后将所述载体偶
合至HIV耙向分子。有关此方法，参见Ryser等，Ato/.爿cat/. OSM， 75:3867-3870， 1978， U.S. 4,699,784和U.S. 4,046,722，其通过引用结合入 本文。
本文所述偶合物可通过已知的连接抗体和脂类、糖类、蛋白、放射性 核素或其它原子和分子的方法制备。例如，本文所述HIV靶向分子可连接 至一个或多个本文所迷载体(例如，脂类、聚合体、脂质体、胶团或纳米粒 子)以形成偶合物，然后所述偶合物可以共价、非共价或其它方式结合治疗 或诊断剂。可选地，本文所述的任何HIV靶向分子均可直接偶合至本文所 述的一个或多个治疗或诊断剂。
例如，H1V輩巴向分子可用1311进行放射性标记，然后偶合至脂，以便 得到的偶合物可形成脂质体。所述脂质体可包括一个或多个治疗剂(例如药 物，如FUdR-dO)或诊断剂。脂质体和胶团的形成在本领域为已知。例如， 参见Wrobel和Collins,Biochimica et Biophysica Acta (1995)， 1235: 296-304; Lundberg等,J. Pharm. Pharmacol. (1999)， 51:1099-1105; Lundberg等，Int. J. Pharm. (2000)， 205:101-108; Lundberg, J. Pharm. Sci. (1994)， 83:72-75; Xu等，Molec. Cancer Ther. (2002), 1:337-346; Torchilin等，Proc. Nat'l. Acad. Sci.、 U.S.A. (2003), 100:6039-6044; U.S. 5,565,215; U.S. 6,379,698;和 U.S. 2003/0082154。
聚合体、二氧化硅或金属形成的纳米粒子或纳米胶嚢(nanocapsule)也 已有报道，其可用于药物递送或成像。例如，参见West等，Applications of Nanotechnology to Biotechnology (2000)， 11:215-217; U.S. 5,620,708; U.S. 5,702,727;和U.S. 6,530,944。还报道了将抗体或结合分子偶合至脂质体以 形成治疗或诊断剂的靶向载体。例如，参见Bendas， Biodrugs (2001), 15:215-224; Xu等,Mol. Cancer Ther (2002)， 1:337-346; Torchilin等，Proc.
29Nat'l. Acad. Sci. U.S.A(2003)， 100:6039-6044; Bally等，J. Liposome Res. (1998)， 8:299-335; Lundberg, Tnt. J. Pharm. (1994)， 109:73-81; Lundberg, J. Pharm. Pharmacol. (1997)， 49:16-21; Lundberg, Anti-cancer Drug Design (1998)， 13:453-461。另请参见U.S. 6,306,393;美国序列第10/350,096号； 美国序列第09/590,284号和1999年6月9日提交的美国序列第60/138,284 号。所有这些参考文献均通过引用结合入本文。
多种诊断和治疗剂可有利地用于形成所述HIV靶向分子的偶合物或 可连接至与所述HIV靶向分子上的识别位点结合的半抗原。诊断剂可包括 放射性同位素、用于MRI的增强剂或用于超声成像的造影剂和荧光化合 物。许多适当的显像剂以及将它们与蛋白质或肽连接的方法在本领域为已 知(例如，参见美国专利5,021,236和4,472,509， 二者均通过引用结合入本 文)。某些连接方法涉及金属螯合物复合体的使用，所述复合体使用例如有 机螯合剂如与蛋白质或肽连接的DTPA(美国专利4,472,509)。
为了向HIV靶向分子加载放射性金属或顺磁离子，可能有必要首先将 其与已连接了多个拷贝的螯合基团的载体反应，所述螯合基团用于结合所 述放射性金属或顺磁离子。所述载体可以是聚赖氨酸、多糖或已衍生的或 可衍生的具有可与螯合基团结合的侧基的聚合物，所述螯合基团如，例如 乙二胺四乙酸(EDTA)、 二乙三胺五乙酸(DTPA)、叶。林、多胺、冠醚、双缩 氨基硫脲、聚將(polyoxime)和已知可用于此目的的类似物。使用标准化学 方法以最大限度地减少聚集和免疫反应性损失的方式将含有螯合剂的载 体偶合至所述HIV靶向分子。
可用于制备所述偶合物的其它更罕见的方法和试剂参见U.S. 4,824,659,其通过引用整体结合入本文。特别有用的金属-螯合剂组合包括 2-千基-DTPA和其单曱基和环己基类似物，与总能量在60至4,000 keV范 围内的诊断同位素配合使用。 一些有用的诊断核素可包括18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 S6Y、 89Zr、 94Tc、 94mTc、 99mTc或mIn。当与本文 所述的HIV靶向分子和载体一起使用时，与非放射性金属如锰、铁和钆复 合的相同的螯合剂可用于MRI。大环螯合剂如NOTA、 DOTA和TETA可 与多种金属和放射性金属，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜，配合
30使用。通过调节环大小使之适合所感兴趣的金属，可使此类金属-螯合剂复
合体非常稳定。也可使用其它环型的螯合剂，如用于复合223Ra的大环聚酯。
治疗剂包括，例如化疗药物如长春碱类、蒽环类、表叶毒素
(epid叩hyllotoxin )、紫杉烷类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制 剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是来自这些和其它细 胞毒剂类别的阿霉素、甲氨蝶呤、红豆衫醇(taxol)、 CPT-ll、喜树碱和 其它物质。其它细胞毒剂包括氮齐类、烷基磺酸盐、亚硝基脲类、三氮烯 类、叶酸类似物、嘧。定类似物、噪呤类似物、铂配合物和类似物。合适的 细胞毒剂参见REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SC正NCES(雷明顿氏 药物科学)，第19版(Mack Publishing Co. 1995)和古德曼和吉尔曼的THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (治疗学的药理学基 础)，第7版(MacMillan Publishing Co. 1985)，以及这些出版物的修订版。 其它合适的细胞毒剂(如实验药)对本领域技术人员为已知，并可用本领 域已知的方法偶合至本文所述的HTV靶向分子。
另一类治疗剂由发射a-粒子(如"2pb、 212Bi、 213Bi、 211At、 223Ra、 225Ac)、 P-粒子(如32p、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 89Sr、 9。Y、川Ag、 125I、 13'I、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 166Ho、 166Dy、 177Lu、 186Re、 188Re、 189Re)，或俄歇电子(如 mIn、 125I、 67Ga、 191Os、 193mPt、 195mPt、 195111地)的放射性核素组成。所述 HIV靶向分子可使用上述一个或多个放射性核素进行标记，使用方法同上 文对诊断剂所述方法。
在某些实施方案中，所用的治疗剂可包含一个或多个聚集体抑制剂。 聚集体是大的分子内复合体，认为其形成是响应错误折叠的蛋白(例如，参 见Heath等,J. Cell Biol. 153:449-55， 2001; Johnstone等,J. Cell Biol. 143:1883-98、 1998; Wileman, Science 312:875-78, 2006)。近来，已暗示 聚集体可能在病毒粒子的组装中发挥作用(Heath等，2001; Wileman， 2006)。 因此，聚集体抑制剂可以发挥作用以阻止或抑制感染HIV或其他病毒的细 胞形成新的感染性病毒粒子。多种聚集体抑制剂为已知，如ALLN、红豆 衫醇、秋水仙碱和长春碱(Johnston等，1998)、其它微管抑制剂(Gerdes和Katsanis， Hum. Molec. Genet. 14:R291-300， 2005);硼替佐米(万珂)(Catley 等，Blood 108:3441-49, 2006)、 tubacin、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Corcoran 等，Curr. Biol. 14:488-92, 2004)，可使用任何此类已知的聚集体抑制剂。
在不同的实施方案中， 一个或多个免疫调节剂可被偶合至抗-HIV抗体 或片段以施用至患者，或可选地被共施用至患者。如本文所用，术语"免 疫调节剂，，包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素和造血因子，如白 介素、集落刺激因子、干扰素(例如，千扰素-a、 -p和-力和命名为"SI因 子"的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、 IL-6、 IL画IO、 IL-12、 IL-18、 IL-21、干扰素-y、 TNF-a和类似物。
术语"细胞因子"是对由一个细胞群体释放的、作为细胞间介导子作 用于另一细胞的蛋白质或肽的总称。如本文广泛所用，细胞因子的实例包 括淋巴因子、单核因子、生长因子和常规的多肽激素。属于细胞因子的有 生长激素如人生长激素、N-曱硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺 激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如 促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH);肝细胞生长因 子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白； 肿瘤坏死因子-a和-(3;苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素； 激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长 因子如NGF-P;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-a和TGF-(3; 胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子 (osteoinductive factor);千扰素如千扰素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF) 如巨噬细胞-CSF (M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF (GM-CSF)和粒细胞-CSF (G陽CSF);白介素(1L)如1L-1、 1L-la、 1L画2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、止画6、 1L誦7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12; IL-13、 IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 IL隱21、 LIF、 G画CSF、 GM-CSF、 M-CSF 、 EPO、 kit配体或FLT-3、 血管抑制素、血小板反应素、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。如本文所 用，术语细胞因子包括天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白和天然序列 细胞因子的生物活性同等物。
趋化因子一般充当化学引诱物，以将免疫效应细胞募集至趋化因子表达位点。组合表达特定的趋化因子基因和例如细胞因子基因可能是有利 的，以增强治疗位点其它免疫系统组分的募集。趋化因子包括但不限于
RANTES、 MCAF、 MIPl-a、 MIP1-(3和IP-IO。熟练的才支术人员应理解，
甘，tk aA ra工口 4"曰目古乂P A 21 ^来A4 J^7 乂"5T曰,1=1工去'五j么OH 取"ST卩W/JOH J l_17、H ITIT "^"化J "T画V I W入/乂 ， 乂l— J l一J '11 " J '|、kO/*<_IUH J
下。相似地，术语免疫调节剂和细胞因子各自的成员也有重叠。
含有可检测标记物(例如，焚光分子)或抑制病毒生长剂和/或细胞毒剂 (例如》t射殃;)的合适的肽可共价、非共价或以其它方式与Hiv靶向分子締
合。例如，通过将光敏剂或染料掺入HIV靶向分子可获得治疗上有用的偶
合物。荧光组合物如荧光染料和对可见光敏感的其它色原或染料(如卟啉) 已用于纟全测和治疗病变，方法是用合适的光照射病变部位。在治疗中，这
被称为光辐射、光疗法或光动力学治疗。参见Jori等编，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (胂瘤和其它疾病的光动 力学治疗)(Libreria Progetto 1985); van den Bergh， Chem. Britain (1986)， 22:430。此外，已将单克隆抗体与光活化染料偶联以实现光治疗。参见Mew 等，J. Immunol. (1983), 130:1473; idem., Cancer Res. (1985)， 45:4380; Oseroff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986), 83:8744; idem., Photochem. Photobiol. (1987)， 46:83; Hasan等，Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta等，Lasers Surg. Med. (1989), 9:422; Pelegrin等，Cancer (1991), 67:2529。
适体
在可选实施方案中，本发明公开的组合物和方法可利用抗体或抗体片 段的可选结合分子形式，如适体。适体典型地是可采用为所选择的靶分子 提供抗体样结合亲和性和特异性的三维构象的合成的寡核香酸。构建适体 和确定适体结合特性的方法在本领域为公知。例如，此类技术可参见美国 专利第5,582,981、 5,595,877和5,637,459号，其均通过引用结合入本文。
适体可通过任何已知的方法，包括合成、重组和纯化方法制备，并可 单独或与对相同靶具有特异性的其它配体组合使用。 一般而言，必须有最 少约3个核香酸，优选地至少5个核普酸以实现特异性结合。虽然适体的 序列长度可短于10个碱基，但是优选具有10、 20、 30或40个核苷酸的适体。
适体需要含有赋予结合特异性的序列，但是可以用侧翼区对其进行扩 展和以其它方式对其进行衍生。在优选的实施方案中，适体的结合序列的
侧翼可具有引物结合序列，以便通过PCR或其它扩增技术扩增所述适体。
在进一步的实施方案中，所述侧翼序列可包含特异序列，该特异序列优先 识别或结合能够增强所述适体对底物的固定作用的部分。
适体可像常规DNA或RNA分子一样进行分离、测序和/或扩增或合 成。可选地，所感兴趣的适体可包含经过修饰的低聚物。适体内通常包含 的任何羟基都可替换为膦酸酯基、磷酸酯基团，用标准保护基保护，或被 活化以生成与其它核普酸的附加连接，或可被偶合至固体支持物。 一个或 多个磷酸二酯连接可替换为可选的连接基团，如P(O)O替换为P(O)S、 P(0)NR2、 P(O)R、 P(0)OR，、 CO或CNR2，其中R是H或烷基(1-20C)， 并且R'是烷基(1-20C);此外，此基团可通过O或S连接至相邻的核苷酸。 低聚物中的所有连接不必全部相同。
制备和筛选与感兴趣的特定靶结合的适体的方法为公知，例如美国专 利第5,475,096号和美国专利第5,270,163号，其均通过引用结合入本文。 该技术一般包括从候选适体混合物中进行选择和逐步反复结合，分离结合 适体与未结合适体，和扩增。由于所述混合物中仅有少量序列(也许仅有
一个适体分子)对应具有最高的亲和力的适体，因此通常需要设定分离标 准，以便分离过程中混合物中能够保留大量适体(大约5-50%)。每个循环 都富集对靶具有高亲和性的适体。可重复3-6个选择和扩增循环，以产生 以高亲和性和特异性结合所述靶的适体。适体可通过本领域公知的标准核 酸标记技术偶合至治疗剂。
Avimer
在某些实施方案中，本发明公开的组合物或方法可利用一个或多个 avimer序列。Avimer是针对各种耙分子的亲和性和特异性有些类似于抗体 的一类结合蛋白。它们是通过体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体 结构域生成的(Silverman等，2005, Nat. Biotedinol. 23:1493-94; Silverman 等，2006， Nat. Biotedinol. 24:220。)得到的多结构域蛋白可包含多个独立
34的结合结构域，与单表位结合蛋白相比，此蛋白可表现出改善的亲和性(一 些情况下为次纳摩)和特异性。(W.)在不同的实施方案中，可使用本文讨论
的标准蛋白交联或标记技术将avimer连接至治疗剂以用于本发明要求保 护的方法和组合物。有关构建和使用avimer的方法的其它详情，请参见， 例如美国专利申请公布第20040175756、 20050048512、 20050053973、 20050089932和20050221384号，其各自的实施例部分均通过引用结合入 本文。
制剂和施用
HIV靶向分子(包括其偶合物)可进一步配制，以获得包括一个或多 个药学合适的赋形剂、 一个或多个附加成分或赋形剂和附加成分的某种组 合的组合物。这些可通过制备药学有用的制剂的已知方法实现，其中活性 成分(即HIV耙向分子或偶合物)与一个或多个药学合适的赋形剂组合成混 合物。无菌磷酸盐緩沖液是药学合适的赋形剂的一个实例。其它合适的赋 形剂对本领域技术人员为公知。例如，参见Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (药物制剂形式和药 物释放系统)，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro编，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。
本文所述组合物的一个施用路径是肠胃外注射。在肠胃外施用中，所 述组合物将与药学可接受赋形剂一起配制成可单位剂量注射形式，如溶 液、悬浮液或乳剂。所述赋形剂本身无毒，并且无治疗作用。所述赋形剂 的实例有生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。也可使用非水 性赋形剂如固定油和油酸乙酯。优选的赋形剂为5%葡萄糖生理盐水溶液。 赋形剂可包含少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质，包括緩冲 液和防腐剂。也考虑包括口服在内的其它施用方法。
包含HIV靶向分子的配制组合物可用于静脉内施用，例如通过推注或 持续输注。用于注射的组合物可与添加的防腐剂制成单位剂量形式，如用 安瓿或多次给药容器。组合物还可采取诸如油性或水性介质的悬浮液、溶 液或乳剂的形式，并可包含制剂用剂，如悬浮、稳定和/或分散剂。可选地，
35所述组合物可以是粉末形式，以便在使用前用合适介质(例如，无菌无热 原水)制成溶液。
所述组合物可以溶液形式施用。所述溶液的pH应在pH5至9.5，优选 地pH6.5至7.5范围内。其制剂应为含有合适的药学可接受緩冲剂的溶液， 所述药学可接受緩沖剂如磷酸盐、三(羟甲基)氨基曱烷-HCl或柠檬酸盐和 类似物。緩沖剂浓度应在1-100 mM范围内。配制的溶液还可包含盐，如 50-150 mM浓度的氯化钠或氯化钾。还可包括有效量的稳定剂，如甘油、 白蛋白、球蛋白、去污剂、明胶、精蛋白或精蛋白盐。如果所述HIV靶向 分子使用抗体的人源化形式作为才莫板，则配制的组合物的全身用药通常为 每两天、三天一次或者一周一次。可选地，每天施用是有效的。通常的施 用方式为肌肉注射或血管内输注。
所述组合物可通过皮下或其它肠胃外途径施用至哺乳动物。此外，可 通过持续输注或者单次或多次推注施用。对抗体或免疫偶合物有用的方法 可用于本文所述组合物。 一般而言，人的免疫偶合物、融合蛋白或棵露抗 体施用剂量根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、身体总体状况和先前 的治疗历史等因素而变化。典型地，需要向受体提供约1 mg/kg至20 mg/kg 范围内的活性成分剂量作为单次静脉内输注量，但是也可根据情况需要而 施用更低或更高的剂量。可按需要重复此剂量，例如，每周一次，共计4-10 周；优选为每周一次，共计8周；更优选地，每周一次，共计4周。给药 频率也可降低，如每两周一次，共计若干个月。可通过不同的肠胃外途径 给药，并相应调整剂量和用药时间。
可对本文所述的配制组合物应用用于控制免疫偶合物或抗体作用持 续时间的药学方法。控释释放制剂可通过使生物相容性聚合物复合或者吸 附所述免疫偶合物或棵露抗体来实现，所述生物相容性聚合物例如聚(乙 烯_共_醋酸乙烯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。请
参见Sherwood等，Bio/Technology (1992)， 10:1446。免疫偶合物或抗体从
偶合物、抗体量和分散粒子的大小。请参见Saltzman等，Biophys. J (1989)， 55: 163 ; Sherwood等，同上。其它固体制剂请参见Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (药物制剂形式和药物释放系统)，第5版(Lea & Febiger 1990), 和Gennaro编，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明顿 氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。
用于治疗目的时，所述组合物按有效治疗量施用至哺乳动物。本发明 公开的治疗和诊断方法的合适受治疗者通常为人，但是也考虑非人动物受 治疗者。
所述组合物可通过气溶胶施用，以实现到肺部的局部递送。可使用水 性气溶胶或非水性(如氟碳推进剂)悬浮液。制备气溶胶时优选使用声波
样会导致其降解和活性的损失。
连接放射性核素的HIV靶向分子可有效用于治疗。确定所述HIV靶 向分子位于受治疗者的 一个或多个感染部位之后，注射更高剂量的标记的 组合物， 一般为单位剂量20mCi至150mCi (131I)，单位剂量5mCi至30 mCi (9°Y),或者单位剂量5 mCi至20 mCi (186Re)，均根据患者体重为 70 kg确定。可采取静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内、或腔内(即肠胃 外)注射，并可重复注射。对于某些治疗，施用多次、分开的剂量是有利 的，从而提供较高的毒性剂量，而没有通常导致正常组织辐射的相应增加。
在其它实施方案中，抗-HIV抗体或片段可通过偶合至某些蛋白(如 IgGl的Fc区)进行修饰，以用于口服或吸入施用(参见实施例3-7)。制备 和使用肽-Fc偶合物的方法参见，例如Low等(2005， //ww. ifepraJ. 20:1805-13)和Dumont等(2005, </. y4era^/. Afe/. 18:294-303),其均通过引 用结合入本文。Low等(2005)公开了通过在CHO细胞中重组表达，将FSH 的a和P亚基以单链或异型二聚体形式偶合至IgGl的Fc区。所述偶合Fc 的肽通过肺或肠的表皮细胞被新生Fc受体介导的运输系统吸附。与原来 的肽相比，所述偶合的Fc肽表现出增强的体内稳定性和吸收性。同时还 观察到异型二聚体共轭物的活性要高于单链形式。使用Fc偶合，更大的 蛋白如促红细胞生成素也可通过吸入有效递送(Dumont等，2005)。治疗和诊断用途不包括预把向的应用
预期可使用连接至HIV靶向分子的放射性和非放射性诊断剂。合适的 非放射性诊断剂是那些用于磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)或超 声的诊断剂。例如，MRI剂包括与合适的螯合剂(如2-千基-DTPA及其单 甲基类似物和环己基类似物)复合的非放射性金属，如锰、铁和钆。请参 见2001年10月10日提交的美国序列第09/921,290号，其通过引用整体 结合入本文。
可使用有助于进行诊断成像的放射性同位素标记所述HIV靶向分子。 合适的放射性同位素可包括处于60-4,000 KeV能量范围内的同位素，或者 更具体地，18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 86Y、 89Zr、 94mTc、 94Tc、 99mTc、 45Ti、 mTn、 123I、 124I、 125I、 131T、 154.158Gd、 177Lu、 32P、 188Re 和类似物或其组合。例如，参见题为"Labeling Targeting Agents with Gallium-68"(使用镓-68标记靶向剂)的美国专利申请(发明人G丄.Gri迅ths 和W.J. McBnde )，和美国临时申请第60/342,104号，其公开了用于成像的 正电子辐射源，如18F、 68Ga、 94mTc和类似物；(通过引用结合入本文)。 例如，可通过单光子发射计算机断层显像(SPECT)或正电子发射断层显像 (PET)进行一企测。
在另一实施方案中，可使用有效杀伤感染HIV的细胞的放射性同位素 标记所述HIV靶向分子，所述放射性同位素包括P-辐射源(如"P、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 89Sr、 90Y、 mAg、 125I、 131I、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 166Ho、 166Dy、 177Lu、 186Re、 188Re、 189Re )，俄歇电子辐射源(如111111、 125I、 67Ga、 1910s、 193mPt、 195mPt、 195mHg)， a-辐射源(如"2pb、 212Bi、 21^、 211At、 223Ra、 225Ac),或其组合。
所述HIV靶向分子可通过连接一个或多个成像增强剂而用于MRI,所
述成像增强剂可包括金属的复合体，所述金属选自由铬(m)、锰(n)、铁(m)、 铁(n)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、凝口(ni)、钐(m)、镱(ni)、礼(ni)、钒(n)、铽 (m)、镝(in)、钬(m)和铒(in)组成的组。相似地，所述Hiv靶向分子可通 过连接一个或多个市售的成像增强剂而用于超声成像。美国专利第
6,331,175号介绍了 MRI技术和偶合MRI增强剂的抗体的制备，其通过引功能蛋白(如毒素)可以多种方式存在于所述HIV靶向分子中。例如， 使用标准分子生物学技术可将功能蛋白直接连接至抗-HIV抗体或片段成 为融合蛋白。可选地，可通过已知的化学交联方法将功能蛋白共价偶合至
抗-HIV抗体或片段。可用于此用途的毒素包括荒麻毒素、相思豆毒素、核 糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、 多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和绿脓杆菌内毒素。(例如， 请参见Pastan等，Cell (1986)， 47:641; Goldenberg， CA - A Cancer Journal for Clinicians (1994), 44:43; Sharkey和Goldenberg, CA Cancer J. Clin. 56:226 (2006),其均通过引用结合入本文。)适合用于本发明的其它毒素对本领域 技术人员为已知，并可参见U.S. 6,077,499，其通过引用整体结合入本文。 其它值得关注的功能蛋白包括各种细胞因子、酶和荧光蛋白。
治疗和诊断用途包括预靶向的应用
预靶向是最初为了解决直接靶向的抗体血液清除慢而开发的多步骤 过程，直接靶向的抗体对正常组织(特别是骨髓)有不良毒性。在预靶向 中，放射性核素或其它治疗剂连接至可在几分钟内从血液中清除的小化合 物。先施用能够识别放射标记的小化合物和靶抗原的预靶向剂；当所述预 靶向剂稍后从血液中充分清除时再施用所述放射标记化合物。
治疗或诊断受治疗者的疾病或病症的预靶向方法提供如下(l)向受治 疗者施用上述双特异性HIV-靶向分子，其中至少一个抗原结合位点是针对 HIV标志物，且另 一抗原结合位点是针对含有双价半抗原的可靶向构建体； (2)任选地向该受治疗者施用清除组合物，并允许该组合物将所述结合结构 从循环中清除；和(3)向该受治疗者施用所述含有双价半抗原的可靶向构建 体，其中所述可靶向构建体进一步含有一个或多个螯合或者化学结合的治 疗或诊断剂。多种清除剂和方法在本领域为已知，并可用于预耙向(如与 HIV-靶向抗体复合的抗-独特型抗体)或将标签或标记物(例如，单糖)连接 至HIV-靶向抗体，所述HIV-靶向抗体可与其它试剂(如单糖-结合抗体)复 合。将亲和素-生物素结合相互作用用于清除方法在本领域同样为已知。
还提供了抗体依赖性酶前体药物疗法(ADEPT): (l)如上向患者施用
39HIV靶向分子，其中该结构包含共价连接的、能够激活前体药物的酶，(2) 任选地向该患者施用清除组合物，并允许该组合物将所述结合结构从循环
中清除，和(3)向该患者施用所述前体药物。
在优选的实施方案中，可靶向的构建体可包含一个或多个组胺-琥珀酰
-甘氨酸(HSG)部分，而抗原结合位点可与HSG-结合抗体或片段，如679 抗体或片段締合(例如，参见美国专利第6,962,702号，通过引用结合入本 文)。可使用已知的预靶向技术将可靶向的构建体偶合至任何已知的诊断和 /或治疗剂(例如，美国专利第6,962,702号)。包含两个HSG部分的示例性 可靶向构建体(称为IMP 411)具有式DOTA-D-Cys(3-SP-Gly-20-O-SN38)-D-Ala陽D-Lys(HSG)画D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 。例如，如上 式所示，IMP411可连接至SN38化疗剂。可选地，其它治疗或诊断剂可掺 入或偶合至相同的肽主链。
其它用途
在某些实施方案中，mv靶向分子可用于感染hiv的组织的治疗和/
或成像，例如使用下述专利中介绍的方法美国专利第6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5,128,119; 5,101,827;和4,735,210号， 其均通过引用结合入本文。其它方法参见1999年6月22日提交的美国申 请序列第09/337,756号和2001年4月3日提交的美国申请序列第 09/823,746号。所述成像可通过直接标记所述HIV靶向分子或者通过预靶 向成像方法执行,请参见Goldenberg等，"Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy" (4元体予贞草巴向？文善 了放射免疫检测和放射免疫治疗)，(J. Clin. Oncol， 2006 24:823-34)，另请 参见美国专利公布第20050002945 , 20040018557 , 20030148409和 20050014207号，其均通过引用结合入本文。
在一些实施方案中，本发明公开和要求保护的HIV靶向分子可用于放 射性核素治疗或》t射免疫治疗方法(例如，请参见Govmdan等，2005， Technology in Cancer Research & Treatment ， 4:375-91 ; Sharkey 和
40Goldenberg, 2005， J. Nucl. Med. 46:115S-127S; Goldenberg等，2006， J. Clin. Oncol. 24:823-34，其均通过引用结合入本文。)
在另一实施方案中，放射增敏剂可与棵露或偶合的HIV靶向分子、抗 体或抗体片段组合使用。例如，所述放射增敏剂可与放射标记的HIV靶向 分子组合使用。与单独使用放射标记的HIV靶向分子进行治疗相比，加入 放射增敏剂可增强效力。放射增敏剂请参见D. M. Goldenberg编，CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES (使用力文射标记的抗体 治疗癌症)，CRC Press (1995),其通过引用结合入本文。
对于本发明要求保护的任何方法，所使用的HIV靶向分子均可与细胞 因子和免疫调节剂締合或与其一起施用。这些细胞因子和免疫调节剂至少 包括a、 (3和Y干扰素以及集落刺激因子。但是，其它免疫调节剂为已知， 并可使用，如IL-1、 IL誦2、 IL-3、 IL國6、 IL國10、 IL-12、 IL-18、 TNF隱a、干 细胞生长因子、淋巴毒素、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、 GM-CSF、 Sl因子或其组合。
可选的实施方案涉及通过施用有效量的HIV靶向分子和可靶向的构 建体，血管内确定受治疗者感染HIV的组织的方法。所述HIV靶向分子 包含至少一个特异性结合HIV抗原的ABS和至少一个特异性结合可靶向 的构建体的ABS。
试剂盒
一些实施方案涉及用于实施本发明要求保护的方法的试剂盒。所述试 剂盒可包括HIV靶向分子。所述靶向分子可使用上述任何试剂进行标记。 此外，所述靶向分子可不进行标记，但是所述试剂盒可包含标记所述靶向 分子的标记试剂。所述标记试剂(如果包括)可包含标记物和交联剂。所 述试剂盒还可含有HIV靶向分子，所述HIV靶向分子包含至少一个特异 性针对HIV抗原的抗体和至少一个特异性针对载体的抗体。所述试剂盒可 任选地含有清除组合物，以从循环中清除HIV靶向分子。
所述试剂盒组分可包装在一起或者分开包装在两个或更多独立的容 器中。在一些实施方案中，所述容器可以是包含适合重建的组合物的无菌、冻千制剂的小瓶。试剂盒还可包含适于重建和/或稀释其它试剂的一种或多 种緩冲液。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管或类似容器。 试剂盒组成部分可无菌包装并保存在所述容器中。可包括的另 一组成部分 为给使用试剂盒的人员的使用说明。
疾病组织检测、诊断和成像的方法
抗-HIV抗体或片段可用于体内诊断。使用标记的Mab进行诊断成像 的方法为公知。例如，在免疫显像技术中，抗-HIV抗体使用y辐射放射性 同位素标记，然后导入患者体内。使用y摄像机检测y辐射放射性同位素 的位置和分布。例如，请参见Snvastava (编)，RADIOLABELED
和治疗的放射性标记单克隆抗体)(Plenum Press 1988); Chase, "Medical Applications of Radioisotopes"(放射性同位素的医学应用)，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明顿氏药物科学)，第18版，Gennaro 等(编)，第624-652页(Mack Publishing Co., 19卯);和Brown， "Clinical Use of Monoclonal Antibodies"(单克隆抗体的临床应用)，选自 BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY (生物才支术与制药)227-49, Pezzuto 等(编)(Chapman & Hall l"3)。同样优选的还有正电子辐射放射性核素 (PET同位素)，如能量为511 keV的放射性核素，如氟-18 ("F)、镓-68 (68Ga) 和碘-124 (124I)。所述成像可通过直接标记所述抗-HIV抗体或片段或使用预 靶向成像方法执行，请参见Goldenberg等，2006, J. Clin. Oncol. 24:823-834; 另请参见美国专利公布第20050002945、 20040018557、 20030148409和 20050014207号，其均通过引用结合入本文。
对于诊断成像，可通过使用中间官能团将放射性同位素直接或间接结 合至所述抗-HIV抗体或片段。有用的中间官能团包括螯合剂，如乙二胺四 乙酸和二乙三胺五乙酸。例如，参见Shih等(同上)和美国专利第5,057,313 号。
向患者施用的放射剂量保持在尽可能低的水平，这通过选择半衰期最 短，在体内停留时间最短，以及进行检测和精确测量所需的同位素量最小的最佳组合同位素实现。可与抗-HIV抗体结合并适合进行诊断成像的力丈射
性同位素的实例包括99mTc和mTn。
所述抗-HIV抗体或其片段也可用顺磁离子和多种放射性造影剂进行 标记，以用于体内诊断。对磁共振成像特别有用的造影剂包括钆、锰、镝、 镧或铁离子。其它试剂包括铬、铜、钴、镍、铼、铕、铽、钬或钕。抗-HIV 抗体或其片段也可偶合至超声造影剂/增强剂。例如， 一个超声造影剂为包 含人源化抗-HIVIgG或其片段的脂质体。同样优选地，所述超声造影剂为 充气的脂质体。
在优选实施方案中，双特异性抗体可与造影剂偶合。例如，所述双特 异性抗体可包含多于一个成像增强剂以用于超声成像。在优选实施方案 中，所述造影剂是脂质体。优选地，所述脂质体包含共价连接至所述脂质 体的外表面的二价DTPA-肽。更优选地，所述脂质体是充气的脂质体。
^谬^在#在某些实施方案中，本发明要求保护的肽或蛋白质可连接至用于不同 发病器官、组织或细胞类型的成像和诊断的显像剂。许多合适的显像剂， 以及将它们连接至蛋白质或肽的方法在本领域为已知(例如，参见美国专利 5,021,236和4,472,509， 二者均通过引用结合入本文)。某些连接方法包括 使用金属螯合复合体，例如，所述复合体使用连接至蛋白质或肽的有机螯 合剂(如DTPA)(美国专利4,472,509)。蛋白质或肽也可在存在偶联剂(如 戊二醛或高碘酸)下与酶反应。在存在这些偶联剂下，或者通过与异硫氰 酸酯反应来制备具有焚光标记的偶合物。
可用作显像剂的顺磁离子的非限制性实例包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、
铁(n)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、铷(m)、钐(m)、镱(ni)、钆(m)、钒(n)、铽 (in)、镝(m)、钬(m)和铒(ni)，其中特別优选的为礼。可用于其它方法(如 x射线成像)的离子包括但不限于镧(ni)、金(ni)、铅(n)，尤其是铋(in)。
可用作显像剂或治疗剂的放射性同位素包括砹211、 14碳、51铬、36氯、
57钴、58钴、铜62、铜64、铜67、 '52EU、氟'8、镓67、镓68、 3氩、碘'"、 碘124、碘125、碘m、铟1U、 52铁、59铁、32磷、33磷、铼賜、铼鹏、Sc47、75硒、银111、"硫、锝94111、锝""1、钇86和钇9°。某些实施方案经常优选 使用T125,而锝"m和铟m也由于其低能量和适合远程探测而经常是优选的。
放射性标记的蛋白质或肽可根据本领域公知的方法制备。例如，它们 可以通过与碘化钠或碘化钾，和化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶氧化剂(如 乳过氧化物酶)接触进行碘标记。蛋白质或肽可通过配体交换过程或直接 标记技术进行锝"m标记，所述配体交换过程例如，使用亚锡溶液还原高
锝酸盐，将还原的锝螯合至Sephadex柱，然后将所述肽加至此柱；所述直 接标记技术例如，将高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、緩冲液(如邻苯二甲 酸钠钾溶液)和所述肽一起孵育。经常用于将金属离子形式的放射性同位 素结合至肽的中间官能团包括二乙三胺五乙酸(DTPA)、 DOTA、 NOTA、 卟啉螯合剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。同样可用的还有荧光标记物，包括若 丹明、荧光素异硫氰酸酯和肾造影剂。
在某些实施方案中，所述抗HIV抗体或片段可连接至二级结合配体或 与显色底物接触后生成有色产物的酶(酶标签)。合适酶的实例包括脲酶、 碱性磷酸酶、(辣根过氧化物酶)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的二级 结合配体为生物素和亲和素或链霉亲和素化合物。此类标记物的用途对本 领域的技术人员为公知，并可参见，例如美国专利3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149和4,366,241;其均通过引用 结合入本文。这些荧光标记物优选用于体外用途，但也可用于体内用途， 特别是内窥镜或血管内检测程序。
在可选实施方案中，抗-HIV抗体或片段可用荧光标志物进行标记。光 检测标记物的非限制性实例包括Alexa 350、 Alexa 430、 AMCA、氨基吖 咬、BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665、 BODIPY-FL、 BODIPY誦R6G、 BODTPY-TMR、 BODTPY-TRX、 5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二曱氧基荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、 6-羧基四甲基胺、Cascade Blue、 Cy2、 Cy3、 Cy5,6-FAM、丹磺酰氯、荧光 素、HEX、 6隱JOE、 NBD(7-硝基苯并-2-噁-l,3-二唑)、俄勒冈绿488、俄勒 冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、邻苯二甲酸、对苯二曱酸、间苯二 甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮曱酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、
44甲亚胺、菁、黄噪呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、铕三二吡啶
二胺、铕穴状化合物或螯合物、二胺、二花青苷、LaJolla蓝染料、别藻蓝 蛋白(allopycocyanin )、 allococyanin B 、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、石克胺素、 藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、 REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸酯、若丹明 红、ROX、 TAMRA、 TET、 TRJT (四曱基若丹明异石克醇)、四甲基若丹明 和得克萨斯红。这些和其它荧光标记物可获自商业来源，如Molecular Probes (Eugene， OR)。
有用的化学发光标记化合物可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳基吖啶酯、 咪唑、吖啶盐和草酸酯或生物发光化合物，如荧光素、荧光素酶和水母素。
在不同的实施方案中，有用的标记物可包含金属纳米粒子。制备纳米 粒子的方法为已知(例如，参见美国专利第6,054,495; 6,127,120; 6,149,868 号；Lee和Meisel， </.Oe附.86:3391-3395， 1982)。纳米粒子也可获 自商业来源(例如，Nanoprobes Inc., Yaphank， NY; Polysciences, Inc.， Warrington, PA)。经过修饰的纳米粒子已实现商业化，如Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY)的Nanogold⑧纳米粒子。用于偶合蛋白质或肽的功能化纳 米粒子也可通过商业途径购得。
交联剂
在一些实施方案中，抗-HIV抗体或片段或其它HIV靶向分子可使用 本领域已知的各种交联试剂进行标记，所述交联试剂如同型双功能、异型 双功能和/或光敏交联试剂。所述试剂的非限制性实例包括双亚氨酸酯； 1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯；二琥珀酰亚胺酒 石酸酯；二曱基-3,3'-二硫-双丙亚氨酸酯；N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)丙 酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯叠氮化物(nitrophenylazide);和4-叠氮乙二 醛。在示例性实施方案中，碳二亚胺交联剂，如DCCD或EDC可用于将 酸性残基交联至氨基或其它基团。此类试剂可进行修饰，以连接不同类型 的标^己物，如荧光标i己物。
双功能交联试剂已广泛用于各种用途。携带两个相同官能团的同型双 功能试剂已证明在诱导相同和不同大分子或大分子的亚基之间的交联，以 及将多肽配体连接至其特异性结合位点方面非常有效。异型双功能试剂包含两个不同的官能团。通过利用所述两个不同官能团的不同反应活性，可 以同时控制交联的选择性和顺序性。所述双功能交联试剂可根据其官能团 的特异性进行划分，例如，氨基、巯基、胍基、口引哚、羧基特异性基团。 其中，针对自由氨基的试剂由于其已实现商业化、易于合成和它们能够应 用的反应条件温和而特别受欢迎。大部分异型双功能交联试剂包含伯胺反 应基团和硫醇反应基团。
另 一 实例描述了异型双功能交联试剂和使用这些交联试剂的方法(美
国专利5,889,155,通过引用结合入本文)。所述交联试剂使亲核肼残基和 亲电马来酰亚胺残基结合，允许在一个实例中将醛偶联至自由兢基。所述 交联试剂可进行修饰以交联不同的官能团。
实施例
下列实施例的并入是为了示范本发明的优选实施方案。本领域技术人 员应理解，下列实施例中公开的技术代表被发现在实施本发明时表现好的 技术，因此可被视为构成实施本发明的优选方式。但是，根据本公开，本 领域技术人员应理解，可对本发明公开的具体实施方案进行许多变化并仍 得到类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1.使用偶合的抗-HIV抗体在体外和体内抑制HIV感染
概述
为了证明针对HIV-1的免疫偶合物的效力，将针对HIV的包膜抗原 的鼠单克隆抗体(Mab) (P4/D10)与常规抗癌药物阿霉素偶合，并进行针对感 染病毒和感染细胞的体外和体内测试。P4/D10抗体与游离病毒(中和)或感 染HIV的细胞(抑制)孵育，通过p24捕获酶联免疫吸附分析测量造成的感 染。在HIV-l/MuLV小鼠攻击模型中，测量了偶合物在体内抑制感染的能 力。
在体外，阿霉素-偶合的P4/D10中和HIV-1翻，消除感染的Jurkat细 胞中的细胞间传播和HIV复制。其还在比游离抗体需要的浓度低8倍的浓 度下保护小鼠免受HIV-lIIIB/MuLV的攻击，而游离药物或无关的偶合物对
46照则未观察到效果。
这些结果表明，阿霉素被P4/D10抗体集中至感染HIV的细胞，显著 Cp^.0001)促进HIV的消除。相同的组合物和方法可用于根除进行ART (抗 逆转录病毒治疗)治疗的患者中残留的表达抗原的T-细胞。
在此研究中，我们将在患者中具有已知的药理学、毒理学和抗癌活性 的蒽环类抗癌药物阿霉素，偶合至针对H1V-1外包膜gpUO (第三可变环区) 而开发的中和性和ADCC-介导性单克隆抗体(Mab)。
测试了偶合至阿霉素的P4/D10抗体在体外从非感染细胞中消除感染 HIV-1的细胞的效力，和其在小鼠模型中从腹腔清除感染HIV-l/MuLV (小 鼠白血病病毒)的同源细胞的效力。抗-gpl20抗体P4/D10中和HIV-1病毒 并介导ADCC (Broliden等，1990)。其还以未偶合形式用于晚期HIV-1感 染个体的I期临床试验，在所述试验中，其减少HIV抗原持续延长的时段 (Hinkula等，1994)。本研究首次在临床前HIV模型中检验了以药物偶合形 式组合的P4/D10，并与游离Mab、游离药物和无关抗体hRS7 (Stein等， /加/Qwcw 1993, 55:938-946)和hLLl Griffiths等，(:/,w Q/"ce厂Wra 2003, 9:6567-6571; Sapra等，C/," C朋cw2005， 11:5257-5264)进行了比较， 所述无关抗体以相似方式与阿霉素偶合。
材料和方法
戎傳斧秀務偶合。阿霉素与IgGlK抗-gp120抗体P4/D10 (Broliden等， 1990)和对照抗体的偶合、以及具有马来酰亚胺基团的双功能阿霉素腙衍生 物的制备根据Gri伍ths等(2003)执行。简单而言，终浓度为大约9 mg/ml 的抗体P4/D10、 hLLl (人源化抗-CD74)和hRS7 (人源化抗-EGP-l)用 DTT(二硫苏糖醇)(PBS (pH 7.5)，含有5 mM EDTA)进行温和还原，使 用大约2.2 mM的DTT终浓度，相当于还原剂相对抗体过量38倍。所述 溶液在"。C孵育40分钟。还原的Mab用Sephadex G50/80离心柱 (spin-column),含有150 mM NaCl和2 mM EDTA(pH 5.3)的50 mM醋酸 钠緩冲液纯化。所述抗体上产生的硫醇基团的数量通过Ellman's分析确定。 对于偶合，将温和还原的抗体(6.5mg/ml)与所述双功能阿霉素混合。孵 育物在冰上》丈置15分钟，用G50/80离心柱，0.1 M醋酸钠(pH6.5)纯化，
47然后通过用相同緩冲液平4衧的Bio-Beads SM2 (Bio-Rad, Hercules， CA)短 柱纯化。通过测量吸光度分析产物的阿霉素艇ab替换比率。尺寸排阻HPLC 分析在分析型BioSil 250柱上才丸行。
使用GMP-生产的感染HIV的患者的IgG批次(HIVIgG) (Guay等AIDS 2002, 16:1391-1400)作为阳性对照，HIV-阴性个体的血清作为阴性对照。 包括游离阿霉素，以及抗癌人源化Mab LL1和RS7 (以相似方式与阿霉素 偶合)以作为偶合的P4/D10抗体的对照。
,和》V〃f。阿霉素P4/D10、未标记的P4/D10、 HIV免疫球蛋白 (HIVIgG)和HIV-阴性血清与所述HIV-1分离物HIV-1 ■ (LAI)混合，在37 。C孵育1小时，然后加入50，000个JurkatT-细胞/孔。孵育1小时后，用培 养基漂洗细胞并加入新的完全培养基(200 pl/孔)。培养7天后，通过p24 捕获ELISA(酶联免疫吸附分析)测量产生的p24的量，并计算HIV-1 p24 产生的抑制百分比。
#教。用HIV-1脂感染Jurkat T-细胞，方法是将5-10xl06 个细胞与100x TCID50 HIV-lnro混合，在37。C孵育1小时。用培养基漂洗 所述细胞并在37。C孵育。每三天更换一次培养基并检查上清液中的p24产 生。当接近100%的所述细胞被感染时，将不同比例的感染HIV-1IIIB的细 胞与未感染细胞混合。用100至0.00001吗/ml系列稀释的抗体、血清或游 离阿霉素处理所述细胞。在37。C培养7天后，测量HIV-lp24抑制，收集 先前用0.1-10昭/ml阿霉素-P4/D10、未偶合的P4/D10和0.05-0.5 mg/ml HIV-阴性血清处理的细胞的上清液，并转移至新鲜的Jurkat T-细胞，以测 试培养开始后3、 7、 10、 12和15天能否通过p24ELISA鉴定感染性HIV。 /f/F-7/Afw丄F攻去^#型。使用HIV-lmB感染遗传整合了 MuLV基因组 的人T-细胞系CEM-1B，这将导致产生具有H1V-1基因组和MuLV包膜的 假病毒(Adang等，PNAS USA 1999， 96:12749-753; Hinkula等，Ce〃s
2004,177:169-184)。使用这些病毒上清液感染C57Bl/6xDBAFl Kb/d 小鼠(HLA-A201转基因)的脾细胞。使用感染HIV-lmB/MuLV的脾细胞 i.p.攻击同基因的小鼠，并立即向其i.p.给予偶合的抗体、游离抗体或游离 阿霉素。攻击后10天，处死小鼠并收集腹膜细胞。沉淀腹膜细胞并加入lxl(f个HIV易感的Jurkat T-细胞或在24孔板中生长的人PBMC。每3-4 天除去这些二级培养物的上清液并加入新鲜培养基。3周内通过p24 ELTSA 测量所述上清液中回收的感染性HIV的量。
鍵/ ^Vvf。为了比较抗-gpl20 Mab和对照抗体的体外HIV-1中和能力， 使用了 Student t检验和非参数Kmskal-Wallis检验。使用非参数 Mann-Whitney U和Kmskal-Wallis 4企验执行用不同抗体处理的小鼠组之间 的统计比较。当获得<0.05的p值时，认为差异显著。非参数单向ANOVA 检验^f吏用GraphPad Prism 4.0a版(GraphPad Software, San Diego， CA)执行， 并用于比4支研究组之间的HIV-1分离和p24抗原阳性。
结果
所述各个抗体通过温和还原产生的硫醇基团的数量，以及最终的纯化 偶合物中阿霉素/Mab替换比率在8.8 (P4/D10, hRS7)至9.4 (hLLl)范围内， 比率为每个IgG替换大约9个药物分子。高压液相层析分析显示所述偶合 物和天然Mab具有相似的保留时间，零至最小聚集(数据未显示)。
阿霉素-偶合的P4/D10 Mab和未偶合的P4/D10 Mab或HIVIgG抗体之 间未显示对游离HIV-1病毒(图1A)的HIV-1中和能力的显著差异。但是， 所有抗HIV-1特异性抗体在中和HIV-1IIIB方面均显著好于阴性对照血清 (p=0.001)。
当3%感染HIV-1IIIB的Jurkat细胞与97%未感染的细胞混合时，在0.5 或0.05 pg/ml浓度下，阿霉素-P4/D10介导的对HIV-1感染细胞间传播的 抑制显著&=0.002)强于游离P4/D10、阿霉素偶合的对照抗体、hLLl或游 离阿霉素(图1B)。所有其它浓度的感染和未感染细胞得到了相似的结果。 特别值得关注的是，对感染的细胞间传播的抑制甚至比使用阿霉素-P4/D10 作为中和试剂时获得的效应更强。此外，用高剂量阿霉素-P4/D10处理的 培养物中未发现感染性病毒，因为将这些细胞培养物的上清液转移至未感 染的Jurkat细胞后未^r测到p24产生(数据未显示)。无法从游离HIV-1病 毒的中和结果中预知阿霉素-P4/Dl0和未偶合的P4/D10之间的效应存在显 著差异(图1A)。为了测试阿霉素-P4/D10抗体在体内的效力，腹腔内给予小鼠同基因 的感染HTV/MuLV的细胞和偶合物。IO天后收集腹膜细胞，所有对照中均 显示感染性HIV,此结果与先箭研究的结果相似(Hinkula等，2004)。阿霉 素-P4/D10抗体保护小鼠完全抗感染HIV-1的初生淋巴样(lympoid)细胞的 攻击(p二0.0001)(图2)。用100吗阿霉素-P4/D10抗体进行攻击和治疗后的 腹膜细胞中未回收到感染性HIV。当用100 pg未偶合的P4/D10抗体处理 小鼠时，p24产生全部为阳性。抗体单独提供完全保护仅见于当剂量增加 8倍，至每只小鼠800貼未偶合的P4/D10时。阿霉素-偶合的对照抗体(hLLl 或hPvS7)在100-200貼剂量下，以及100-400吗游离阿霉素剂量均未提供 任何保护。
讨论
上述结果显示可通过与阿霉素偶联显著增强抗体针对HIV-1包膜的总 病毒抑制特性。阿霉素-P4/D10能够在体外以及实验性体内攻击模型中消 除感染HIV-1的细胞。未偶合的P4/D10 Mab介导针对感染HIV-1的靶细 胞的ADCC，以及中和H1V-1的能力(Broliden等，1990; Hinkula等，1994) 可以无毒的方式增强其作为药物免疫偶合物的效力。
在非常低的剂量下，抗癌的抗-CD74 Mab LL1 (以相似方式与阿霉素 偶合)在体外和在非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤的人异种移植物模型中 显示出非凡的活性(Gri伍ths等，20(B; Sapra等，200"。这些研究以及猴 中的毒理学研究表明只有非常高剂量的免疫偶合物能产生明显的骨髓抑 制，但是未观察到与阿霉素相关的心脏毒性(Sapra等，2005)。为了避免病 毒逃逸，应同时测试针对HIV可及表位的保守和可变位点的抗体(Trkola 等，2005; Ferrantelli等，J/"/e"D,s 2004， 189:2167-2173)。
在先前的体外研究中，偶合至绿脓杆菌外毒素A(PE40)的H1V-1特异 性免疫球蛋白清除感染HIV-1的细胞(Pincus等，2003; Ashorn等，Ato/ v4o^5W WX4 1990， 87:8889-8893)。但是，在临床试验中，与CD4细胞偶 联的PE40证明具有免疫原性和肝毒性(Davey等，1994; Ramachandran等， 1994)。因此，本结果显示具有^L少或无副作用的阿霉素-Mab偶合物的效 力是令人惊讶和出乎意料的。PE40-CD4的毒性可解释为与游离gpl20形
50成毒性复合体，游离gpl20以高浓度存在于具有高病毒载量的非ART治疗 患者中(Berger等，1998)。为了避免与高病毒载量相关的潜在毒性问题， 应优选在病毒负荷低时，如在ART过程中、HIV感染早期或甚至在已知或 可能接触HIV感染后立即使用靶向HIV-包膜特异性表位的分子。例如， 医务工作人员意外受到含有HIV污染的或可能污染的血液或其它液体的 针刺时，可根据本发明公开的方法用偶合的抗体进行治疗。由于阿霉素 -P4/D10偶合物的抗细胞活性，向进行ART治疗的患者添加药物偶合物可 消除携带抗原的细胞以及游离的病毒粒子，从而可进一步减少病毒载量。 熟练的技术人员应理解，本发明要求保护的组合物和方法不限于P4/D10 的阿霉素偶合物，而可能利用与P4/D10或与其它已知的抗-HIV抗体的偶 合的其它已知的细胞毒剂。
在其它实施方案中，为了避免非特异性毒性，可使用双特异性抗体和 其它预靶向策略，其中抗体靶向和毒性试剂的递送是分开的(Wu等，2005)。 此策略在临床前和在临床癌症试验中均显示出有希望的结果(Forero等， 胁od2004， 104:227-236; Rossi等，a/wC縦erU05, 11:7122s-7129s)。 对于在人受治疗者中的体内应用，优选人抗体或抗体的人源化形式进行重 复的临床应用。
实施例2.治疗接受过ART的感染HIV的患者
一位47岁的男性患者被确定为HIV血清反应阳性。该患者的CD4计 数小于200/mm3。使用非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案对该患 者进行治疗。CD4细胞计数增加至300/mm3，但是该患者仍为HIV血清反 应阳性。使用人源化阿霉素-P4/D10抗体治疗该患者。该患者的CD4计数 增加至超过350/mm3,并且该患者不再显示HIV血清反应阳性。 一年后， 该患者保持无症状，并且未^r测到HIV感染的存在。
实施例3.治疗意外被针刺的医务工作人员
一位30岁的从业护士意外受到HIV阳性血液的针刺。在1小时内对 该受治疗者进行人源化阿霉素-P4/D10抗体治疗。 一年后，该受治疗者无 HIV感染迹象。
51实施例4.使用其它细胞毒素和/或抗体进行治疗
一位28岁的男性患者被确定为HIV血清反应阳性。该患者的CD4计 数小于200/mm3。使用非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案对该患 者进行治疗。CD4细胞计数增加至300/mm3，但是该患者仍为HIV血清反 应阳性。使用包含人源化4E10 Fab-734 scFv的双特异性抗体治疗该患者， 所述双特异性抗体使用美国专利第7,052,872号(通过引用结合入本文)公 开的方法制备。注射后24小时孵育用以允许游离的双特异性抗体从循环 中清除，然后注射偶合至耙向肽IMP-156 (似)的5-氟尿嘧啶。该患者的CD4 计数增加至超过350/mm3,并且该患者不再显示HIV血清反应阳性。 一年 后，该患者保持无症状，并且未检测到HIV感染的存在。
实施例5.使用IMP411进行预把向
一位35岁的男性患者被确定为HIV血清反应阳性。该患者的CD4计 数小于180/mm3。使用非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案对该患 者进行治疗。CD4细胞计数增加至250/mm3，但是该患者仍为HIV血清反 应阳性。使用包含双特异性抗-gp120 P4/D10 IgGl x Fab-679的双特异性抗 体治疗该患者，所述双特异性抗体使用美国专利申请序列第11/389,358、 11/391,584、 11/478,021和11/633,729号(通过引用结合入本文)公开的方 法通过DNL技术制备。注射后24小时孵育用以允许游离的双特异性抗体 从循环中清除，然后注射偶合至靶向肽IMP-411的SN38。该患者的CD4 计数增加至超过325/mm3，并且该患者不再显示HIV血清反应阳性。 一年 后，该患者保持无症状，并且未检测到HIV感染的存在。
实施例6.抗-HIV抗体的人源化
分离编码针对HIV包膜蛋白的小鼠单克隆抗体的VL和VH区的 cDNA，并将其分别重组亚克隆至含有分别编码人抗体k和IgGi的恒定区 的基因的哺乳动物表达载体。使用这两个重组DNA共转染哺乳动物细胞， 以表达与亲本小鼠Mab具有相同结合和治疗特性的人源化Mab。
将VK和VH DNA的CDR分别重组连接至人VK和VH区的构架(FR) 序列，然后将后者分别连接至人k和IgG,恒定区，以在哺乳动物细胞中进行表达。 一般而言，如此处所述，"嵌合"Mab是通过将鼠VK和VH区分 别连接或亚克隆至人恒定轻链和重(heay)链形成的，而"人源化"Mab则 通过将嵌合Mab中的鼠构架(FR)序列替换为相应的人FR序列而进一步衍 生的。如下文所述，可通过用相应的鼠FR氨基酸替换一个或多个人FR氨 基酸，特别是接触或靠近CDR氨基酸残基的FR残基，对所述人源化Mab 进行进一步的优化。
在不同的实施方案中，可通过计算机建模模拟抗体可变结构域(例如， 参见Dion, "Humanization of Monoclonal Antibodies: Molecular Approaches and Applications"(单克隆抗体的人源化分子方法和应用)，选自 Goldenberg等编，Cancer Therapy With Radiolabeled Antibodies (使用放射 标记的抗体治疗癌症)，第19章，CRC Press, BocaRaton， Fla.， 1994)， 其通过引用结合入本文。 一般而言，通过同源性实现对Mab的3-D结构的 最好模拟，优选通过鉴定显示与待替换的鼠FR序列具有高(75o/。以上、优 选85%以上、更优选90%以上、更优选95。/。以上)同源性的人FR序列。只 要可能，应进行侧基替换以保持Ca和C|3之间的扭转角。可使用收敛方法 通过AMBER力场(Weiner等，J. Amer. Chem. Soc. 106:765， 1984)实现能 量最小化。可通过初始模拟轻链和重链的可变链确定可能重要的FR-CDR 相互作用。因而可确定每个CDR内所有原子4.5埃半径以内的所有鼠FR 残基，并将其保留在所述人源化抗体的最终设计模型中。
设计好VK和VH结构域的序列之后，即可通过基因合成实现CDR嫁 接，所述基因合成是使用长的合成DNA寡核普酸作为模板和短的寡核苷 酸作为引物在PCR反应中进行的。在大多数情况下，编码VK或VH结构 域的DNA为大约350 bp长。通过利用密码子简并性，可容易地在靠近V 基因DNA序列中部的区域引入独特的限制性位点，而不改变所编码的氨 基酸。可通过自动化DNA寡核苷酸合成仪(Cyclone Plus DNA Synthesizer, Milligen-Biosearch)生成所述限制性位点上游和下游大约150 bp处的两个 长的非重叠单链DNA寡核苷酸。由于可预期到全长DNA寡核苷酸的产量 非常低，因此可以通过两对侧翼引物对它们进行PCR反应扩增。
可在所述引物中设计必要的限制性位点以利于后续的亚克隆。低聚物
53A和低聚物B的引物应在所述限制性位点处含有重叠序列，以便分别得到
的低聚物A和B的PCR产物可以在所述限制性位点处进行符合读码框架 的连接，以形成编码VH结构域的全长DNA序歹'j(约350 bp)。
低聚物A和B的PCR产物的连接和它们向工作载体(staging vector)的 合适限制性位点的亚克隆可通过一个三片段连接步骤完成。可首先通过限 制酶切消化分析对正确序列亚克隆至所述工作载体进行分析，然后通过测 序反应(根据Sanger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977))对其
进行确认。
可将含有Ig启动子、先导序列和VH序列的限制性片段从所述工作载 体上切下，然后亚克隆至基于pSVgpt的载体的相应位点，所述载体含有 形成最终表达载体的人IgG恒定区、Tg增强子和即t选择标志物基因组序 列。VK序列的构建可釆用相似的策略。
可通过用适当的核酸内切酶处理将含有Ig启动子、先导序列和抗-HIV VK序列的DNA序列从所述工作载体上切下，然后亚克隆至基于pSVhyg 的载体pKh的相应位点，pKh含有形成最终表达载体的人k链恒定区、潮 霉素选择标志物、Ig和k增强子基因组序列。
由于人源化有时造成抗体亲和性的降低或者甚至损失，因此可能需要 其它修饰以恢复原始亲和性(例如，参见Tempest等，Bio/Technology 9: 266 (1991); Verhoeyen等，Science 239: 1534 (1988))，其通过引用结合入本文。 一般而言，为了制备嵌合抗-HTV Mab,可使用DNA产物和引物通过PCR 克隆获得所述抗-HIV Mab的VH和VK链。Orlandi等(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1989, 86: 3833)和Leung等(Biotechniques, 1993， 15:286)。 VKPCR 引物可按上述方法亚克隆至基于pBR327的工作载体(VKpBR)。 VH PCR 产物可按上述方法亚克隆至相似的基于pBluescript的工作载体(VHpBS)。 可使用适当的限制性内切酶将含有VK和VH序列，以及启动子和信号肽 序列的片段从所述工作载体上切下。VK片段(大约600 bp)可按传统方法亚 克隆至哺乳动物表达载体(例如，pKh)。 pKh是含有人k恒定区、Ig增强子、 k增强子和潮霉素抗性基因基因组序列的基于pSVhyg的表达载体。相似 地，大约800 bp的VH片段可亚克隆至pGlg， pGlg是携带人IgGl恒定区、
54Ig增强子和黄噪呤-鸟噪呤磷酸核糖基转移酶(即t)基因的基因组序列的基 于pSVgpt的表达载体。所述的两个质粒可通过电穿孔转染哺乳动物表达
细胞，如Sp2/0—Agl4细胞，并通过潮霉素抗性进行选择。扩增选择中存 活的克隆，通过ELISA方法监控上清液中嵌合抗-HIV Mab的产生。理想 的转染效率为大约1-10 x 106个细胞。此系统的抗体表达水平预期为0.10 至2.5昭/ml。
可按下述方法执行RNA分离、cDNA合成和扩增。从抗-HIV杂交瘤 细胞系中制备总细胞RNA,使用总计大约107个细胞，根据Sambrook等， (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)，第二版， Cold Spring Harbor Press, 1989)，其通过引用结合入本文。使用传统方法 从总RNA逆转录生成第 一链cDNA，如通过使用Superscript预扩增系统 (Gibco/BRL， Ga池ersburg， MD)。简单而言，在20pl反应体积中，50 ng 随机引物可与5吗RNA在下述物质存在下退火2 pi 10X合成緩沖液 [200mM Tris画HCl (pH 8.4) ， 500 mM KC1, 25 mM MgCl2， 1 mg/ml BSA]、 1 ^10 mM dNTP混合物、2 ^ 0.1 M DTT和200单位Superscript逆转录酶。 延伸步骤开始在室温下进行10分钟，然后在'42。C孵育50分钟。将反应混 合物在90。C加热5分钟可终止反应。
可通过PCR扩增嵌合或人抗-HIV Mab的VK和VH序列，参见Orlandi 等，(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989》，其通过引用结合入本文。 VK序列可使用引物CK3BH和VK5-3进行扩增(Leung等，Biotechniques， 15:286 (1993),其通过引用结合入本文)，而VH序列可使用引物CH1B和 VHIBACK进行扩增，CH1B可与鼠IgG的CHI区退火(Orlandi等，1989)。 含有10 jxl第一链cDNA产物、9 pi 10X PCR緩冲液[500 mM KCl、 100 mM Tris-HCl (pH 8.3)、 15 mM MgCl2和0.01% (w/v)明胶](Perkin Elmer Cetus， Norwalk, Conn.)的PCR反应混合物可进行30个PCR循环。每个PCR循 环优选由94。C变性1分钟，5(TC退火1.5分钟和72。C聚合1.5分钟组成。 扩增的VK和VH片段可在2。/。琼脂糖(BioRad, Richmond, Calif)上进行纯 化。
VK的PCR产物可亚克隆至含有Ig启动子、信号肽序列和方便的限制性位点的工作载体(如基于pBR327的工作载体VKpBR)，以利于VKPCR 产物进行符合读码框架的连接。VH的PCR产物可亚克隆至相似的工作载 体，如基于pBluescript的VHpBS。含有各自PCR产物的各个克隆可通过 例如Sanger等，Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463 (1977)(其通过引用 结合入本文)的方法进行测序。
所述的两个质粒可共转染合适的细胞，例如，骨髓瘤Sp2/0—Agl4， 对克隆进行潮霉素抗性选择，通过例如ELISA分析监控上清液中嵌合或人 源化抗-HIV抗体的产生。
可按下述方法执行转染和通过ELISA分析分泌抗体的克隆。可使用大 约10 轻链表达载体和20 重链表达载体通过电穿孔(BioRad， Richmond, Calif.)转染5 x 106个SP2/0骨髓瘤细胞，参见Co等，J. Immunol, 148:1149 (1992)，其通过引用结合入本文。转染后，细胞可在96孔微滴定 板，完全HSFM培养基(GIBCO, Gakhersburg， Md.), 37°C， 5%(302下培 养。两天后可通过添加潮霉素终浓度为500吗/ml的潮霉素选择培养基 (Calbiochem， San Diego， Calif.)开始选择过程。克隆典型地在电穿孔后2-3 周出现。然后扩增所述培养物以用于进一步的分析。
分泌嵌合或人源化重链阳性转染瘤克隆可通过ELISA分析鉴定。简单 而言，将转染瘤培养物的上清液样品(100^il)加入预涂了羊抗人(GAH)-IgG, F(ab')2片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove,Pa.)的ELISA 微滴定板中，三份重复。平板在室温孵育1小时。用漂洗緩冲液(含有0.05% 聚山梨醇酯20的PBS)漂洗三次以除去未结合的蛋白。向孔中加入偶合辣 根过氧化物酶(HRP)的GAH-IgG , Fc片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)(IOO pi抗体贝i液稀释x 104，添加未偶 合的抗体至终浓度为1.0叱/ml)。孵育1小时后漂洗所述平板，典型地为三 次。向孔中加入反应溶液[100 pl，含有167吗邻苯二胺(OPD) (Sigma, St. Louis, MO)、 0.025。/。过氧化氢PBS溶液]。在黑暗条件下显色30分钟。向 每个孔中加入50 pi 4 N HC1溶液终止反应，然后使用自动化ELISA读取 仪(Bio-Tek instruments, Winooski， Vt.)测量490 nm处的吸光度。然后才艮据 无关的嵌合抗体标准品(可从Scotgen, Ltd.， Edinburg， Scotland获得)确定结合的嵌合抗体。
可按下述方法从细胞培养基中分离抗体。转染瘤培养适合使用无血清
培养基。对于嵌合抗体的生产，使用HSFM在滚瓶中培养细胞(500 ml培 养物)。将培养物离心，上清液通过0.2微米膜过滤。过滤后的培养基以1 m1/ 分钟的流速通过蛋白A柱(l x 3 cm)。然后用大约10倍柱体积的PBS漂洗 树脂，用含有10 mM EDTA的0.1 M甘氨酸緩冲液(pH 3.5)从柱中洗脱结 合蛋白A的抗体。使用含有10 3 M Tris (pH 8.6)的管收集1.0 ml组分， 根据280/260 nm的吸光度确定蛋白浓度。合并峰组分，对PBS透析，然 后^f吏用例如Centricon30 (Amicon， Beverly, MA)浓缩抗体。4姿前述方法通 过ELISA确定抗体浓度，使用PBS将其浓度调节至大约1 mg/ml。向样品 中方便地加入0.01% (w/v)叠氮化钠作为防腐剂。
可通过直接放射免疫分析确定由此分离的小鼠、嵌合和人源化抗体的 对比结合亲和性。经确定，所述嵌合和人源化抗-HIV抗体具有与所述小鼠 Mab相同的结合特异性和亲和性。
氺 承 承
可在无过量实验下根据本公开制备和实施本发明公开和要求保护的 所有组合物和方法。虽然已通过优选实施方案描述了所述组合物和方法， 但是对本领域技术人员明显的是，可对本文所述组合物和方法以及所述方 法的步骤或步骤的顺序进行变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。 更具体地，当可获得相同或相似的结果时，某些同时在化学和生理学上相 关的试剂可替换本文所述试剂。对本领域技术人员明显的所有此类相似的 替换和修饰均被视为在所附权利要求中确定的本发明的精神、范围和概念 内。
权利要求
1. 一种用于在受治疗者中治疗HIV感染的方法，所述方法包括为受治疗者施用针对HIV表面包膜抗原的抗体或其片段，所述抗体或片段偶合至治疗剂，其中与所述偶合的抗体或片段的接触在体内有效减少、消除或防止HIV感染或防止HIV向未感染的细胞的细胞间传播。
2. 如权利要求l所述的方法，其中所述治疗剂是细胞毒药物、抑制病 毒生长剂、毒素、力文射性同位素、寡核苷酸、免疫调节剂、细胞因子、趋 化因子、小干扰RNA (siRNA)或酶。
3. 如权利要求l所述的方法，其中所述治疗剂是阿霉素。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段是阿霉素 -P4/D10。
5. 如权利要求l所述的方法，其中所述抗体或片段是P4/D10。
6. 如权利要求l所述的方法，其中所述受治疗者是人受治疗者。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合、人源化或 人抗体或片段。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段在已知或可 能感染HIV后施用至受治疗者。
9. 如权利要求8所述的方法，其中已知或可能的感染和为受治疗者施 用所述偶合的抗体或片段之间的时间段为小于1小时、1至5小时、小于 12小时、l天或更少、2天或更少、l周或更少、或l个月或更少。
10. 如权利要求8所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段的施用有 效阻止受治疗者的HIV感染。
11. 如权利要求6所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段在受治疗 者用抗-逆转录病毒治疗(ART)来治疗之后施用至所述受治疗者。
12. 如权利要求2所述的方法，其中所述治疗剂是aplidin、阿扎立平、 阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺粕、伊立替康(CPT-n)、 SN-38、卡铂、克拉屈滨、环-畴酰胺、阿糖胞苷、氮烯 咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、 2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉 素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、 氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、 3',5'-0-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、 氟他胺、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬 酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲 氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、甲基千肼、 紫杉醇、喷司他丁、 PST-341、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、 红豆衫醇、沙利度胺、硫鸟。票呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶 氮芥、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核 糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、 DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗 病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒 素、反义寡核苷酸、千扰RNA、 siRNA、聚集体抑制剂或其组合。
13. 如权利要求2所述的方法，其中所述放射性同位素选自由下述同 位素组成的组225Ac、 211At、 212Bi、 2l3Bi、 14C、 51Cr、 36C1、 45Ti、 57Co、 58Go、 62Gu、 64Gu、 67Gu、 166Dy、 152Eu、 18F、 67Ga、 68Ga、 195mHg、 166Ho、 3H、 mIn、 123I、 124I、 125I、 131I、 52Fe、 59Fe、 177Lu、 191Os、 212Pb、 32P、 33P、 142Pr、 195mPt、 223Ra、賜Re、 188Re、 189Re、 47Sc、 75Se、 mAg、 153Sm、 89Sr、35S、 16'Tb、 94川Tc、 99川Tc、 86Y、 9()y和的&。
14. 如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或片段是双特异性抗体、 双特异性抗体片段、scFv、 Fab、 Fab'、 F(ab)2、 F(ab')2、 Fv、 sFv、 scFv、 scFv-Fc融合体、单链抗体、二链抗体、三链抗体或四链抗体。
15. 如权利要求11所述的方法，其中所述ART是HAART(高效抗逆 转录病毒治疗)。
16. 如权利要求11所述的方法，其中所述抗逆转录病毒治疗包括使用 施多宁、齐多夫定、替诺福韦、拉米夫定、恩曲他滨、去羟肌苷、阿巴卡 韦、司他夫定、奈韦拉平、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、福沙那韦、茚地那韦、奈非那韦、沙奎那韦或其组合进行治疗。
17. 如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或片段是中和抗体或片段。
18. 如权利要求2所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由细胞因子、千细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、白介素、集落刺激因子、干扰素、干扰素-a、干扰素-|3、千扰素-Y、命名为"S1因子"的干细胞生长因子、 IL画2、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-18、 IL-21和TNF隱a组成的组。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述细胞因子选自由下述细胞因 子组成的组淋巴因子、单核因子、生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰 人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、 松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促曱状腺激素(TSH)、黄体生成素 (LH)、肝细胞生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘 催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-a、肿瘤坏死因子-|3、苗勒管抑制物质、 小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、 血小板生成素(TPO)、 NGF-P、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、 TGF-a、 TGF-(3、胰岛素样生长因子-I和-II、促红细胞生成素(EPO)、骨生 成因子、千扰素-a、干扰素-(3、千扰素，、集落刺激因子、巨噬细胞 -CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、 IL-1、 IL-la、 IL-2、 IL國3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL画7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL誦ll、 IL-12、 IL-13、 IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL國17、 IL曙18、 IL-21、 LIF、 kit配体、 FLT-3、血管抑制素、血小板反应素、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。
20. 如权利要求2所述的方法，其中所述趋化因子选自由RANTES、 MCAF、 MIPl-a、 MIP1-(3和IP-10组成的组。
21. 如权利要求1所述的方法，其中所述施用是口服、鼻、口腔、吸 入、直肠、阴道、局部、原位、皮内、皮下、肌内、腹腔内、动脉内、鞘 内或静乐:K内施用。
22. 如权利要求2所述的方法，其中所述放射性同位素是a辐射源或 俄歇电子辐射源。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述a辐射源是^Pb、^Bi、^Bi、 211At、 223Ra或225八c，或其中所述俄歇电子辐射源是11111！、 125T、 67Ga、 1910s、 193mPt、 195mPt或195mHg。
24. —种用于在受治疗者中成像、检测或诊断HIV感染的方法，所述 方法包括a) 为受治疗者施用针对HIV表面包膜抗原的抗体或抗体片段，所述 抗体偶合至显像剂；和b) 检测结合至感染HIV的细胞的偶合抗体或片段的存在，其中所述 偶合抗体或片段与感染HIV的细胞的结合有效成像、诊断或检测HIV感 染在受治疗者中的存在。
25. 如权利要求24所述的方法，其中所述显像剂是放射性同位素、酶、 光片全测标记物、造影剂、超声标记物或顺磁标记物。
26. 如权利要求25所述的方法，其中所述显像剂选自由下述显像剂组成的组铬(ni)、锰(n)、铁(in)、铁(n)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、钕(m)、 钐(m)、镜(in)、札(ni)、钒(n)、铽(ni)、镝(m)、钬(ni)、铒(m)、铜(iii)、 金(ni)、铅(n)和铋(m)。
27. 如权利要求25所述的方法，其中所述显像剂是"F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 86Y、 89Zr、 94mTc、 94Tc、 99mTc、 45Tl川In、 123I、 124I、 125I、 L3'I、 '54-158Gd、 '77Lu、 "P或'88Re。
28. 如权利要求25所述的方法，其中所述显像剂是Alexa350、 Alexa 430、 AMCA、氨基吖咬、BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665、 BODIPY-FL、 B0DIPY-R6G、 BODIPY-TMR、 BODIPY-TRX、 5-羧基-4'，5'-二氯-2',7'-二甲 氧基荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、 6-羧基若丹明、6-羧基四曱基氨基、Cascade Blue、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 6-FAM、 丹磺酰氯、焚光素、HEX、 6-JOE、 NBD (7-硝基苯并-2』惡-l,3-二唑)、俄 勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、邻苯二甲酸、对苯 二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、曱酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、 赤藓红、酞菁、甲亚胺、菁、黄。票呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、铕三二吡啶二胺、铕穴状化合物或蝥合物、二胺、二花青苷、LaJolla 蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninB、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、 藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、 REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸酯、若丹明 红、ROX、 TAMRA、 TET、 TRIT (四曱基若丹明异硫醇)、四曱基若丹明 或得克萨斯红。
29. —种用于在受治疗者中治疗HIV感染的方法，所述方法包括a) 为受治疗者施用双特异性抗体或其片段，所述双特异性抗体包含一 个或多个HIV表面包膜抗原特异的结合位点和一个或多个载体的结合位点；b) 任选地为所述受治疗者施用清除剂；和c) 为所述受治疗者施用偶合至治疗剂的载体，所述载体的所述施用在 所述受治疗者中有效减少、消除或防止HTV感染或防止HIV向未感染细 胞的细胞间传播。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述治疗剂是细胞毒药物、抑制 病毒生长剂、毒素、放射性同位素、寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或酶。
31. 如权利要求30所述的方法，其中所述治疗剂是阿霉素。
32. 如权利要求29所述的方法，其中所述受治疗者是人受治疗者。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合、人源化 或人抗体或片段。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述抗体或片段、任选的清除剂 和载体在受治疗者用抗逆转录病毒治疗来治疗后施用至所述受治疗者。
35. 如权利要求29所述的方法，其中所述治疗剂是aplidin、阿扎立平、 阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢 霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺柏、 伊立替康(CPT-ll)、 SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯 咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、 2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、 3',5'-0-二油酖基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、 氟他胺、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬 酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基噤呤、6-巯基嘌呤、甲 氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、甲基苄肼、 紫杉醇、喷司他丁、 PSI-341、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、 红豆衫醇、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶 氮芥、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核 糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、 DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗 病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒 素、反义寡核苷酸、干扰RNA、 siRNA、聚集体抑制剂或其组合。
36. 如权利要求30所述的方法，其中所述放射性同位素选自由下述同 位素组成的组225Ac、 211At、 212Bi、 21&、 14C、 51Cr、 36C1、 45Ti、 57Co、 58Co、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 166Dy、 152Eu、 18F、 67Ga、 68Ga、 195mHg、 166Ho、 3H、 mTt!、 123I、 124I、 125T、 131T、 52Fe、 59Fe、 177Lu、 1910s、 212Pb、 32P、 33P、 142Pr、 195mPt、 223Ra、 186Re、 188Re、 189Re、 47Sc、 75Se、 mAg、 153Sm、 89Sr、 35S、 161Tb、 94mTc、 99mTc、 86Y、 ，Y和89Zr。
37. 如权利要求29所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含至 少一个scFv、 Fab、 Fab'、 F(ab)2、 F(ab')2、 Fv、 sFv、 scFv-Fc融合体、单链 抗体、二4连4元体、三链4元体或四链^t体。
38. 如权利要求29所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含至 少 一个P4/D10抗体或片段。
39. 如权利要求29所述的方法，其中所述载体包含一个或多个HSG(组 胺-琥珀酰-甘氨酸)部分，并且所述双特异性抗体或片段与HSG结合。
40. 如权利要求39所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含一 个或多个与HSG结合的679抗体或抗体片段。
41. 如权利要求40所述的方法，其中所述载体是 DOTA誦D-Cys(3-SP-Gly隱20-O-SN38)-D画Ala-D-Lys(HSG)画D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP-411)。
42. 如权利要求29所述的方法，其中所迷双特异性抗体或片段包含停 靠和锁定(DNL)结构。
43. —种组合物，其包含偶合至治疗剂的抗-HIV抗体或其片段，所述 偶合的抗体或其片段在施用至受治疗者时有效减少、消除或防止HIV感染 或防止H1V向未感染细胞的细胞间传播。
44. 如权利要求43所述的组合物，其中所述受治疗者是人受治疗者。
45. 如权利要求43所述的组合物，其中所述偶合的抗体或片段是嵌 合、人源化或人抗体或片段。
46. 如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段是P4/D10。
47. 如权利要求46所述的组合物，其中所述偶合的抗体或其片段是阿 霉素-P4/D10。
48. 如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段偶合至aplidin、 阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白 消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸 氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-ll)、 SN-38、卡铂、克拉屈滨、环石粦酰胺、阿 糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉 素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖 苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依 托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、 3',5'-0-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比 星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯 基嘌呤、6-疏基噤呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托 坦、丁酸苯酯、曱基千肼、紫杉醇、喷司他丁、 PSI-341、司莫司汀、链脲 菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、红豆衫醇、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、 替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、 蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、 DNA酶I、葡萄 球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA、 siRNA、聚集 体抑制剂或其组合。
49. 如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段偶合至^Pb、212Bi、 "Bl 211At、 223Ra、 225Ac、 32P、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 89Sr、 90Y、 mAg、 ，、 131l、 142pr、 153sm、 16ltb、 166ho、 166dy、 177lu、 186re、 188re、189Re、 mIn、 125I、 67Ga、 1910s、 193mPt、 195mPt或195mHg。
50. 如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段是双特异性抗 体、双特异性抗体片段、scFv、 Fab、 Fab'、 F(ab)2、 F(ab')2、 Fv、 sFv、 scFv、 scFv-Fc融合体、单链抗体、二4连4元体、三《连抗体或四链抗体。
51. 如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段是中和抗体。
52. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括为受治疗者施用 两种或多种抗体或片段，其中每种抗体或片段均与HTV表面包膜抗原结 合。
53. 如权利要求52所述的方法，其中所述两种或多种抗体或片段结合 相同的HIV表面包膜抗原。
54. 如权利要求52所述的方法，其中所述两种或多种抗体或片段结合 不同的HIV表面包膜抗原。
55. 如权利要求52所述的方法，其中所述两种或多种抗体或片段与 HIV可及表位的保守和可变位点结合。
56. 如权利要求l所述的方法，其中所述抗体或其片段选自由4E10、 2F5、 3D6、 C37、 1ACY、 1F58、 1GGGC、 2G12和X5组成的组。
57. 如权利要求56所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合、人源化 或人抗体或片段。
全文摘要
本发明涉及在受治疗者中治疗HIV感染的方法和组合物。所述组合物可包含针对HIV抗原的靶向分子，如抗-HIV抗体或抗体片段。所述抗-HIV抗体或片段可偶合至多种细胞毒剂，如阿霉素。在优选实施方案中，所述抗体或片段是P4/D10。其它实施方案可涉及使用偶合至诊断剂的抗-HIV抗体或片段在受治疗者中成像、检测或诊断HIV感染的方法。在可选实施方案中，可施用具有至少一个HIV抗原结合位点和至少一个载体分子结合位点的双特异性抗体，任选地接着施用清除剂，接着施用偶合至治疗剂的载体分子。
文档编号C12N7/00GK101506358SQ200780026776
公开日2009年8月12日 申请日期2007年5月8日 优先权日2006年5月15日
发明者大卫·M·高德寳, 威廉·J·麦克布莱德, 张健行, 爱得盟·A·罗希 申请人:免疫医学股份有限公司