专利名称：水解的卵蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及降低卵蛋白变应原性的方法。
背景技术：
在大部分情况下，食物变态反应主要由与食物中蛋白质的反应引起， 所述食物变态反应中最常见的是牛乳变态反应。在生命的早几年中，免疫 系统仍在发育并且可能不能识别和耐受这样的膳食蛋白质。结果是婴儿或 儿童或年幼动物将膳食蛋白质作为外源物质对待，并对其产生变应性应答。 食物变态反应可不仅影响人，而且影响其他动物如犬和猫。
通常，食物过敏性反应仅出现在易感的婴儿、儿童或年幼动物第一次 遭遇新食物后。人类婴儿普遍遭遇的第 一种膳食蛋白质至少为牛乳蛋白质， 并且如上所述，牛乳变态反应是最常见的食物变态反应。普遍接受的是具 有确定的牛乳变态反应的婴儿具有提高的对其他膳食蛋白质如卵蛋白和谷 物蛋白发生变态反应的风险，但是当这些膳食蛋白质被引入断奶膳食中时， 即便是已经成功地对牛乳蛋白质产生口服耐受的那些婴儿仍可随后发生对 这些膳食蛋白质的变态反应。
从膳食的观点来看，存在治疗确定的变态反应的两种途径或者必须 完全避免含有变应原的食物，或者必须处理食物以降低其变应原能力，例 如通过充分水解进行。为后一目的制备含有^f皮充分水解的牛乳蛋白质(由 不多于五种氮基酸组成的肽)的婴儿配方。
已经提出含更少的广泛水解的牛乳蛋白的婴儿配方帮助降低发生牛乳 变态反应的风险，尤其是对于被认为处于该风险的儿童(即具有至少一个 亲近的家庭成员遭受变态反应的儿童)。这类产品通常4皮描述为低变应原性 的，该术语在欧洲导则^M/EC(Eur叩ean Directive MA4/EC)中在乳的语境中被定义为含有水解蛋白质，所述水解蛋白质的变应原性比未水解蛋白质
的变应原性低至少100倍。制^f氐变应原性牛乳蛋白质的一种方法描述于 美国专利号No. 5,039,532中。
已提出了降低牛乳蛋白质变应原性的许多其他途径，但是通过与之比 较，对频繁引发变应性反应的其他膳食蛋白质(如卵蛋白)关注相对较少。 卵是高品质蛋白质的极好来源，所述高品质蛋白质通常占卵的可食部分按 重量计的约12%。卵不仅可以以其天然状态被消耗(例如作为煮蛋或荷包 蛋或煎蛋)，而且也通常为了营养和功能两种目的被用作其他食品中的成 分。例如，在例如意大利面(pasta)的盘装茱里卵可被用作着色剂和结合 剂，并在例如布丁、乳蛋饼(quiche)和沙司的盘装菜中被用作增稠剂和胶凝 剂。
然而，卵蛋白尤其是卵清蛋白已与变态反应的发生相关。事实上，考 虑到对牛乳蛋白质的变态反应通常在2和5岁的年龄之间自发消失而对卵 蛋白的变态反应一般较晚消失并甚至可以持续终生，卵蛋白变应原性的降 低可以是比牛乳蛋白变应原性降低甚至需要更大。因此，本发明的一个对 象；
p口,
发明概述
因此，本发明提供了制备酶水解的卵蛋白的方法，其包括第一水解步 骤，其中由第一蛋白酶对完整的卵蛋白进行酶水解；中间加热步骤，其中 第一水解的产物4皮加热至不超过75。C的温度；第二水解步骤，其中由第二 蛋白酶对中间加热步骤的产物进行酶水解；和失活步骤，其中第二水解的 产物被加热至85和90'C之间的温度，并在该温度下维持至少30分钟。
本发明还扩展至包含水解的卵蛋白的含卵意大利面(egg pasta)产品。 例如，该产品可含有50到85%面粉、5到15%水解全卵和10到40%水。
附图概述
图1显示印水解产物残余的OVA-特异的抗原性。图2显示功能性肥大细胞触发(trigger)测定中降低的变应原性。 发明详述
在该说明书中，以下的术语具有以下的含义
蛋白质的"水解度，，或"DH，，表示游离NH2基团中的氮数量除以总 氮数量(NH和NH2基团)，以百分比表达；
"水解全卵"表示全卵，其中卵蛋白已^皮部分水解； "低变应原性水解全卵"表示水解的全卵，其中水解卵蛋白具有比未 水解卵蛋白的变应原性低至少IOO倍的变应原性；
"低变应原性卵蛋白"表示水解的卵蛋白，其变应原性比未水解的卵 蛋白低至少100倍。
除非另有说明，所有涉及的百分比均是按重量计的百分比。 第一蛋白酶可选自来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的细菌蛋白酶或其混合物、胰蛋白酶 和胰酶制剂。
第二蛋白酶可选自来自地衣芽孢杆菌的细菌蛋白酶、来自米曲霉 (Aspergillus oryzae)的真菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶制剂。
来自解淀粉芽孢杆菌的细菌蛋白酶的一个实例是以商标名Neutrase 出售的酶。来自地衣芽孢杆菌的细菌蛋白酶#:称作枯草杆菌蛋白酶，该酶 的一个实例以商标名Alcalase⑧出售。来自解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆 菌的细菌蛋白酶的混合物的一个实例是以商标名Protamex 出售的酶混合 物。来自米曲霉的真菌蛋白质的一个实例是以商标名Flavourzyme 出售 的酶。如本领域技术人员所公知的，胰酶制剂是胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合物，其可得自猪的胰腺，且胰蛋白酶自身尤其可得自胰腺。
尤其优选的第一和第二蛋白酶的组合是来自解淀粉芽孢杆菌和地衣芽 孢杆菌的细菌蛋白酶作为第一蛋白酶，和来自米曲霉的真菌蛋白酶作为第 二蛋白酶。或者，可使用枯草杆菌蛋白酶作为第一蛋白酶和第二蛋白酶。
用于本发明方法的起始材料是任何便利的液体形式的完整卵蛋白。合适的起始材料的一个实例是巴氏灭菌的液体全卵。本发明的方法可在第一
水解步骤前包含额外的预加热步骤。预加热可在不超过65'C的温度下进行2到15分钟。
进行第 一和第二水解步骤的温度和这些步骤的持续时间以及待使用的笫一和第二蛋白酶的用量将由本领域技术人员基于下述因素决定终产物
的期望水解度和本领域公知的选定的蛋白酶的特性。然而，作为普遍性的规则，所需要的水解度越大，则蛋白酶越强，水解的持续时间越长且使用的蛋白酶浓度越大。例如，为了获得具有20和25%之间DH的水解产物，应当在各水解步骤中使用2到10%的賴以待水解的起始材料重量为基础)且各水解步骤应当持续约两个小时。特定的酶组合可包括以下(为了简洁
的目的，仅^f吏用示例的细菌和真菌起源酶的商品名)
第一蛋白酶Protamex 5%Protamex 2%Alcalase 10%Alc由sc 5%Alcalase 5-10%Alcalase 5-10%Neutrase 5 - 10%Neutrase 5-10%Trypsin 1-5%Trypsin 1 -5%Pancreatin 1 -5%Pancreatin 1 -5%
第二蛋白酶Flavourzyme 5%Flavourzyme 2%Alcalase 10%Alc由se 5%Protamex 5%Flavourzyme 5%Protamex 5%Flavourzyme 5%Protamex 5%Flavourzyme 5%Protamex 5%
Flavourzyme 5%
同样，应根据所使用的蛋白酶选择进行水解步骤的温度，因为酶活性的最适温度是酶特异的。酶的制造商会给出该情况的足量指导。
苦味可以是一些蛋白质水解产物的问题，且发明人已发现某些蛋白酶和蛋白酶的组合在这点上给出了尤其好的结果。将来自解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的细菌蛋白酶的组合作为第一蛋白酶，和来自米曲霉的真菌蛋白酶作为第二蛋白酶是尤其优选的就是因为这个原因。还发现使用这两
种酶时，通过分次添加第二蛋白酶(从而10到60%的第二蛋白酶在中间加热步骤期间添加，而剩余的第二蛋白酶在完成中间加热步骤后添加)可制备下述水解产物，所述水解产物具有感官特性和降低的变应原性的尤其好的组合。
通过Fritsch6等(Int. Arch. Aller and Appl Imm.， 93， 289-293， 1990)所
述的技术测量发现，通过本发明的方法制备的水解卵蛋白具有与完整卵蛋白相比降低至少IOO倍的变应原性。这些水解卵蛋白和含有它们的水解全卵因此4皮描述为低变应原性的。
根据本发明的方法制备的低变应原性水解全卵是均一液体的形式。其可作为液体^f吏用或以本领域已知的方式(如滚筒干燥、喷雾干燥或冷冻干燥)干燥产生均一粉末，所述粉末是货架稳定的并可储存直至需要。当用水重溶该粉末时，其再次形成均一的液体。
水解全卵可在常规掺入全卵的任何食品中代替全卵使用。例如，粉末或液体形式的水解全卵可代替全卵在如烘焙的蛋挞(custard)、乳蛋饼、焦糖布丁(creme caramel)、蛋糕饼干和诸如米布丁(rice pudding)的布丁的配方使用。或者，水解全卵在用水重溶(如果需要的话)后用于制备盘装菜如煎蛋和炒蛋。低变应原性的水解全卵是尤其合适的婴儿和幼儿食物成分，尤其是适用于断奶早期阶段的食物中。水解全卵也可以代替常规用于制备这类产物的全卵使用。
如上所述，对膳食蛋白质的变态反应不仅限于人，且通过本发明的方法制备的水解卵也可以用于制造下述食品，所述食品用于动物，尤其是伴倡动物如犬和猫。因此水解卵也可以用于代替下述食物中的全卵，所述食物旨在用于例如断奶中的幼犬和幼猫。
本发明还扩展至包含水解的卵蛋白的含卵意大利面食(egg pastaproduct)。例如，该产品可含有50到85%面粉、5到15%水解全卵和10到40%水。优选面粉是粗粒^t^小麦粉(durum wheat semolina flour )。可以如下制备意大利面食将粉末形式的水解全卵与水掺在一起，然后将面粉与卵和水混合，并将得到的混合物挤塑为期望的形状，如通心粉(macaroni)、意大利干面条(tagliatelle)、壳瓣(shell)、意大利式细面条(spaghetti)等。
可以将挤出的形状漂白、用油涂布、速冻、填充进合适的容器中并储存在制冷器中，例如在-25'C下直至需要。本发明的冷冻意大利面的典型组成可以是56,5%粗粒硬质小麦(粉)、6，2%水解全卵、34.6%水和2.7%葵花子油。
或者，可以将挤出的形状漂白、用油涂布、填充进合适的容器中并冷藏在例如5到7'C下。本发明的冷藏意大利面的典型组成可以是53.7%粗粒硬质小麦(粉)、8.9%水解全卵、34.8%水和2.7%葵花子油。
或者，可使用本领域已知的技术将挤出的形状干燥、填充进合适的容器中并储存于室温下直至需要。本发明的干燥意大利面的典型组成可以是80.4。/。粗粒硬质小麦(粉)、7.6%水解全卵和12.0%水和2.75葵花子油。
现在将参考以下的实施例进一 步描述本发明。
制备卵水解产物
初始材料为经巴氏灭菌的全卵，FT/OVO/0105 R， ABCD S. A.， AvicoleBretonne Cecab Distribution (Plogrmel，法国)。
实施例1
将30 Kg液态全卵在65'C加热10分钟并以250转/分钟搅拌。冷却至55。C后，添加2% Protamex⑧酶(批次PW2A1006， NOVOZYMES A/SBagsvaerd，丹麦)并将混合物在55。C保持2小时。在该第一步水解步骤后，添加1% Flavourzyme 1000 L酶(批次400904， NOVOZYMES A/SBagsvaerd,丹麦)并将混合物在75"C加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C ，再添加1 % Flavourzyme酶并将混合物在55。C保持2小时。该第二水解步骤后，将混合物在卯X:加热30分钟然后喷雾千燥获得水解卵粉，所述卵粉保存于铝袋中。
实施例2
将35Kg液态全卵在65。C加热10分钟并以250转/分钟搅拌。冷却至55。C后，添加5% Protamex⑧酶(批次PW2A1006, NOVOZYMES A/SBagsvaerd，丹麦)并将混合物在55。C保持2小时。在该第一步水解步骤后，添加1% Flavourzyme 1000 L酶(批次400卯4， NOVOZYMES A/SBagsvaerd，丹麦)并将混合物在75。C加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C,再添加4% Flavourzyme酶并将混合物在55。C保持2小时。该第二水解步骤后，将混合物在9(TC加热30分钟然后喷雾干燥获得水解卵粉，所述卵粉保存于铝袋中。
实施例3
将30 Kg液态全卵在65。C加热10分钟并以250转/分钟搅拌。冷却至55。C后，添加10% Alcalase⑧2.4L酶(批号500357， NOVOZYMES A/SBagsvaerd,丹麦)并将混合物在55。C保持2小时。在该第一步水解步骤后，将混合物在75。C加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C，再添加10%Alcalase酶并将混合物在55。C保持2小时。该第二水解步骤后，将混合物在卯。C加热30分钟然后喷雾干燥获得水解卵粉，所述卵粉保存于铝袋中。
通过Dumas步骤(Carlo Erba方法)测定水解产物中的总氮。通过根据Adler画Nissen的TNBS方法(J. Agric. Food. Chem. 1979 27: 1256-1262)测量水解度。发现实施例1的水解产物具有20。/。的DH，实施例2的水解产物具有23%的DH，且实施例3的水解产物具有25%的DH。
含有水解全印的产物实施例4
含水解印的甜卵布丁的成分的一个实例如下成分 ％
全乳(3.5 %脂肪) 62.0
水 24.3
糖 5.5
低变应原性卵粉 2.5
玉米淀粉 3.0
木薯淀粉 2.0
香草矫味剂 0.7
可以通过本领域已知的任何合适方法制备布丁 。
实施例5
含水解卵的可口卵布丁的成分的一个实例如下:
成分 ％
全乳(3.5%脂肪) 62.0
水 21.5
冷冻胡萝卜块 10.0
低变应原性卵粉 1.5
玉米淀粉 3.0
木薯淀粉 2.0
可以通过本领域已知的任何合适方法制备布丁 。
实施例6
含水解卵的含卵意大利面产物的成分的一个实例如下
成分 ％
粗粒硬质小麦(粉) 72
水 22
低变应原性卵粉 6
可以通过本领域已知的任何合适方法制备意大利面。
10卵7JC解产物的残余抗原性
用多克隆兔抗OVA蛋白抗血清通过ELISA抑制测定实施例1、 2和3 的水解产物中蛋白质卵清蛋白(OVA)的残余抗原性。用碳酸盐-碳酸氢盐 緩沖液中50 ng/ml的OVA (100 fd)包被」微量滴定板的孔，并在4'C下孵 育24小时。将平板在PBS-Tween緩冲液中洗涤4次，通过添加200^1/孔 鱼明胶(PBS-Tween中0.5% )封闭游离的反应位点。将平板在室温(RT) 下孵育1小时并在PBS-Tween中再次洗涂4次。
在分离的管中，将l份标准OVA制剂或测试样品与l份兔抗OVA蛋 白抗体(1: 20'000稀释)在RT下孵育1小时。孵育后向上述被包被和封 闭的微量滴定孔中添加100 pl该抑制混合物并在室温下孵育2小时。将平 板在PBS-Tween中洗涤4次。然后添加山羊抗兔过氧化物酶标记的缀合物 (0.1 ml 1:2000的稀释液)，将平板在室温下孵育1小时并在PBS-Tween 中洗涤4次。添加显色底物(0.1 ml邻苯二胺)。孵育15分钟后，在ELISA 平板读数器上于492 nm处读数光密度。
结果显示在图1中，从图1中可以看出来自实施例l到3的水解产物 的OVA特异抗原性与完整的卵蛋白相比被降低了超过10,000倍。
卵水解产物的残余变应原性
如先前所述(Fritsch6等人，J. Allergy Clin, Immunol,第100巻，第2 期，第266-273页)，使用由致敏的大鼠肥大细騰释放的氚标记的5-羟色胺 的功能性体外测定法测定抗原分子(OVA)的IgE依赖的变应原性。简言之， 通过在含10%胎牛血清的Dulbecco's改良的Eagle's培养基中的腹膜洗涤 物获得来自正常Sprague-Dawley大鼠的肥大细胞。在该培养基中洗涤细 胞并在4。C保持过夜。在pH 7.0的磷酸盐-HEPES-鱼明胶緩冲液(PHG)中 洗涤两次后，将细胞以5xl()S细胞/ml重悬于相同的緩冲液中，并用一倍体 积的富含IgE抗OVA抗体的大鼠血清稀释，所述血清含5 nCi/ml 3H 5-轻色胺。在37"C孵育2小时后，将细胞在PHG中再洗涤三次并以2.5xl05细胞/ml重悬于PHG中。致敏的肥大细胞被分配至微量滴定板(0.1 ml/ 孔)中并与0.05 ml根据实施例2制备的水解卵蛋白的连续稀释液(从IO mg/ml开始1/10稀释)混合。将混合物在37t:孵育60分钟并离心。将上 清液的等分式样(0.05 ml)与2 ml闪烁液混合并使用Packard |3-计数器测量 3H释放。
结果显示于图2中，从中可以看出水解卵具有显著降低的变应原性(25 网OVA/g蛋白质当量)，并且当水解卵被掺入果馅饼(flan)型甜点中时维持 该低值。
权利要求
1. 制备酶水解的卵蛋白的方法，其包括第一水解步骤，其中由第一蛋白酶对完整的卵蛋白进行酶水解；中间加热步骤，其中第一水解的产物被加热至不超过75℃的温度；第二水解步骤，其中由第二蛋白酶对中间加热步骤的产物进行酶水解；和失活步骤，其中第二水解的产物被加热至85和90℃之间的温度，并在该温度下维持至少30分钟。
2. 权利要求l的方法，其中第一蛋白酶选自来自解淀粉芽孢杆菌和地 衣芽孢杆菌的细菌蛋白酶及其混合物、胰蛋白酶和胰酶制剂。
3. 权利要求1或2的方法，其中第二蛋白酶选自来自地衣芽孢杆菌的 细菌蛋白酶、来自米曲霉的真菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶制剂。
4. 前述权利要求中任一项的方法，其中第一蛋白酶是来自解淀粉芽孢 杆菌和地衣芽孢杆菌的细菌蛋白酶的混合物，第二蛋白酶是来自米曲霉的 真菌蛋白酶。
5. 权利要求4的方法，其中10到60%的来自米曲霉的真菌蛋白酶在 中间加热步骤期间添加，剩余的来自米曲霉的真菌蛋白酶在完成中间加热 步骤后添加。
6. 权利要求1到3中任一项的方法，其中使用枯草杆菌蛋白,为第 一蛋白酶和第二蛋白酶。
7. 前述权利要求中任一项的方法，其在第一水解步骤前还包括在不超 过65。C的温度下将完整的卵蛋白预加热2至15分钟。
8. 含卵意大利面食，其包含50到85。/。面粉、5到15%水解全卵，以 及10到40%水。
全文摘要
本发明涉及制备酶水解的卵蛋白的方法，其包括第一水解步骤，其中由第一蛋白酶对完整的卵蛋白进行酶水解；中间加热步骤，其中第一水解的产物被加热至不超过75℃的温度；第二水解步骤，其中由第二蛋白酶对中间加热步骤的产物进行酶水解；和失活步骤，其中第二水解的产物被加热至85和90℃之间的温度，并在该温度下维持至少30分钟。本发明扩展至含水解全卵的含卵意大利面食。
文档编号A23J3/04GK101489409SQ200780026683
公开日2009年7月22日 申请日期2007年6月14日 优先权日2006年6月15日
发明者I·卡尔图, R·夏勒, R·弗里切 申请人:雀巢产品技术援助有限公司