专利名称：用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物的制作方法
用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物
本发明涉及用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物。
一段时间以来已知，可以通过经口摄入胶原蛋白水解物获得在人类皮肤、毛发和/或指甲的健康方面的有利效果(参见例如Vivian Zague 关于胶原蛋白水解物的摄入对皮月夫性质的影响的新观点(A new view concerning the effects of Collagen hydrolysateintake on skin properties)，，，Arch.Dermatol.Res.2008 (9) 479-483)。皮肤健康的改进在本文中被理解为对皮肤的天然性质和功能的各种积极影响，其中所述性质和功能既可以由于老化而受损，也可以额外地通过不同的消极环境影响而受损。摄入胶原蛋白水解物也对毛发和/或指甲的性质产生有利影响。
本发明所基于的目的是，进一步提高胶原蛋白水解物对皮肤、毛发和/或指甲的健康的积极效果，并且提出对于这种应用特别有效的胶原蛋白水解物。
就一开始所述种类的胶原蛋白水解物而言，根据本发明通过以下方式来实现所述目的，其中至少90重量％的胶原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且胶原蛋白水解物包含至少四种分子量在600和1200Da之间的特征肽。
胶原蛋白水解物包含具有不同链长或分子量的肽，所述肽在胶原蛋白的蛋白链切割期间产生，其中所述肽的分子量分布可以取决于水解物的制备条件而显著变化。目前已经出人意料地表明，相比于目前使用的包含明显更少比例的低分子量肽和/或不包含特征肽的胶原蛋白水解物，具有上述性质的胶原蛋白水解物在多种不同方面对皮肤健康产生特别有利的影响，即显示出显著更好的结果。
以至少90重量％低于3500Da的极限值为基础的胶原蛋白水解物的分子量分布可以例如通过凝胶渗透色谱法使用限定的胶原蛋白片段的校准标样极精确和可重复地确定。
至少45重量％的胶原蛋白水解物优选具有小于1500Da的分子量，即胶原蛋白水解物的一定比例的肽是特别短链的。已经表明，通过这种特别低分子的比例(其在目前使用的胶原蛋白水解物中仅以明显更少的量存在)，可以获得皮肤健康方面的极为突出的效果。
根据本发明使用的胶原蛋白水解物的平均分子量(重均Mw)通常在约1700至约2300Da的范围内。
胶原蛋白水解物的特征肽(其有趣地对胶原蛋白水解物的效力做出重大贡献)的存在可以特别通过MALD1-质谱法确定，其中特征肽在质谱中以峰的形式出现。在通过MALD1-质谱法确定的分子量分布中，至少四种特征肽优选具有相比于其周围至少两倍的强度，进一步优选至少四倍的强度。
在本发明的优选的实施方案中，胶原蛋白水解物包含620和690Da之间的肽、790和860Da之间的肽、980和1050Da之间的肽以及1175和1245Da之间的肽。这些肽以特有方式使根据本发明的胶原蛋白水解物区别于已知的胶原蛋白水解物。
胶原蛋白水解物还可额外地具有1500和3500Da之间的特征肽，所述特征肽也构成与根据现有技术的胶原蛋白水解物的区别特征。
胶原蛋白水解物优选具有12重量％或更大的羟基脯氨酸比例。通过脯氨酸的翻译后羟基化形成的氨基酸羟基脯氨酸仅存在于胶原蛋白中，因此胶原蛋白水解物中高比例的羟基脯氨酸是基本不存在其他结缔组织蛋白(例如弹性蛋白和蛋白聚糖)的度量，所述其他结缔组织蛋白的片段取决于制备方法也可以以一定量被包含在胶原蛋白水解物中。
有利的是，胶原蛋白水解物通过明胶的酶促水解制得。明胶包含变性胶原蛋白并且通过本领域技术人员已知的不同方法从不同动物种类的结缔组织或从骨骼获得。在本发明的范围内，作为胶原蛋白水解物的起始材料使用的明胶优选从哺乳动物的皮肤，特别是从猪皮或牛皮获得，但是也不排除使用来自家禽的明胶。
明胶的酶促水解通常通过至少一种内切蛋白酶进行，其中在本发明的范围内优选的是，使用多种内切蛋白酶(即至少两种不同的内切蛋白酶)，从而由此相应地影响所得胶原蛋白水解物的氨基酸分布情况(AminosaurepiOfil)并且提高水解物对皮肤、毛发和/或指甲的健康的积极效果。
根据本发明的优选的实施方案，胶原蛋白水解物通过至少两种具有不同特异性的内切蛋白酶，特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶的依次作用制得，即通过分别在特定氨基酸之前或之后切割胶原蛋白分子的氨基酸序列的蛋白酶的依次作用制得。金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶有利地为来自于微生物枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的酶。
通过选择合适的内切蛋白酶不仅可以获得胶原蛋白水解物的特征性分子量分布，而且也可以影响水解物中包含的肽的末端处的氨基酸种类。就此而言，例如优选的是，胶原蛋白水解物的至少50%的N-端氨基酸为疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明还特 别涉及胶原蛋白水解物用于刺激通过皮肤细胞生物合成细胞外基质蛋白的用途。皮肤细胞特别包括成纤维细胞，所述成纤维细胞尤其合成胶原蛋白(主要为I型)、弹性蛋白以及蛋白聚糖。这些蛋白以足够量形成对于皮肤的细胞外基质的建立或再生是决定性的，皮肤的细胞外基质又对于皮肤的性质例如张力和弹性及其水分平衡是非常决定性的。
皮肤细胞也包括角化细胞，所述角化细胞不仅负责皮肤最外层的角质化，而且负责毛发和指甲的形成。因此可以通过根据本发明使用的胶原蛋白水解物刺激这些细胞从而改进皮肤的屏障功能以及毛发和/或指甲的健康。
本发明的一个重要方面涉及胶原蛋白水解物用于提高皮肤的张力和/或减少皱纹形成的用途。皮肤的这些性质通常由于老化以及由于环境影响例如紫外线辐射或有毒物质而变差。由于基质蛋白胶原蛋白和弹性蛋白特别对皮肤的张力和弹性负责，可以通过受根据本发明使用的胶原蛋白水解物大幅刺激的所述基质蛋白的增加的合成来抵抗这些影响并且显著改进皮肤健康。
本发明的另一重要方面涉及胶原蛋白水解物用于提高皮肤的水分含量的用途。细胞外基质中包含的蛋白聚糖(例如多能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖)(也证实其合成受根据本发明使用的胶原蛋白水解物刺激)对皮肤结合足够量的水分的能力做出巨大贡献。皮肤的水分含量也可以通过有害的环境影响例如紫外线辐射而降低，其中水分损失通常伴有皮肤的柔韧性降低、皲裂和过度角质化。
本发明的另一方面涉及胶原蛋白水解物用于改进皮肤的屏障功能的用途。所谓的CE-蛋白(“角质化包膜蛋白)，尤其是外皮蛋白、兜甲蛋白和丝聚蛋白对屏障功能起重要作用，已证实它们的生物合成受低分子量的胶原蛋白水解物刺激。因此，通过根据本发明使用胶原蛋白水解物，改进了皮肤的水分损失的减少、屏障功能以及针对病原菌和有毒物质的天然保护。
根据本发明使用胶原蛋白水解物还额外导致皮肤区域内的抗氧化作用，由此可以降低例如由紫外线辐射或突变物质造成的DNA损伤(突变)的频率。这种突变构成细胞过早老化的原因并且因此促进皮肤的老化症状(张力降低、形成皱纹等)，因此可以通过根据本发明的用途抑制所述过程。
根据本发明的优选的实施方案，胶原蛋白水解物用于经口摄入。在经口摄入时，胶原蛋白水解物通常通过血液循环比在局部应用时更有效地转运至作用位点，即特别是转运至皮肤细胞。此外，这种应用形式对于使用者来说通常不费事。
胶原蛋白水解物优选以营养增补剂的形式使用。胶原蛋白水解物在此通常用于在一般保健的意义上改进皮肤健康或者也用于美容应用；这种营养增补剂可被称为“营养食品”或“营养美容品”。但是在本发明的范围内，例如在存在特应性皮炎时(其中患者具有干燥皲裂皮肤的趋势增加)，胶原蛋白水解物用于治疗临床病症的用途也是可能的。
营养增补剂可以几乎以任意形式提供，例如以片剂、胶囊、糖衣片剂、锭剂或溶液(例如在单个安瓿中或在饮料中)的形式。
胶原蛋白 水解物也可以被包含在食品或高档食品中，例如甜食或用于配制饮料的速溶粉中。因此，水解物可以在正常营养的过程中被使用者摄入而无需额外的花费(所谓的“功能食物”)。就此而言特别有利的是，胶原蛋白水解物基本上是无味的。
有利的是，每日摄入约1.5至5g，优选约2至3g，进一步优选约2.3至2.7g胶原蛋白水解物。已经表明，通过经口摄入所述量的水解物在数周内即可显著改进皮肤健康。
本发明的另一优选实施方案涉及胶原蛋白水解物的局部应用，即以美容产品的形式应用从而施用在皮肤、毛发和/或指甲上。胶原蛋白水解物在此可以被特别包含在乳霜、膏剂、洗剂或凝胶中。还有利的是，胶原蛋白水解物例如以约5至10重量％的量被添加到身体护理产品，例如沐浴凝胶或洗发剂。
根据如下实施例参考附图更详细地描述本发明的这些和其他优点。附图分别显示了:
图1A至IC:与I型胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖或多能蛋白聚糖的合成的刺激相关的图2A和2B:与无毛小鼠的皮肤水分的提高相关的图3:与CE-蛋白的合成的刺激相关的图4A至4C:不同胶原蛋白水解物的MALDI_质谱；和
图5A和5B:与I型胶原蛋白、核心蛋白聚糖和多能蛋白聚糖的合成的刺激相关的图。
具体实施方式
1.胶原蛋白水解物的制备和性质
为了制备根据本发明的胶原蛋白水解物，使用猪皮明胶(A型，200至250g Bloom)的浓度为20至40重量％ (干物质)的水溶液作为起始材料。明胶通过两种不同的微生物来源的内切蛋白酶在50至60° C下依次作用120至180分钟进行酶促水解，其中使用枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的内切蛋白酶作为第一种酶，并且使用地衣芽孢杆菌的内切蛋白酶作为第二种酶。然后使酶热灭活并将溶液喷雾干燥。
所得胶原蛋白水解物的分子量分布可以通过凝胶渗透色谱法使用如下参数确定:
固定相:TSK2000 Sff XL (Tosoh Bioscience 股份有限公司)
移动相:0.4mol/l磷酸二氢钠ρΗ5.3
流速:0.5ml/min
校准标样:限定的I型胶原蛋白片段(FILK, Freiberg)
检测:UV-检测器Knauer K_2501，在 214nm 下
确定得到根据下表I所示的根据本发明的胶原蛋白水解物(在下文中称为低分子量水解物)的分子量分布。为了对比，表I中也给出用相同方法确定的市售获得的胶原蛋白水解物(在下文中称为闻分子量水解物)的分子量分布:
表I
权利要求
1.用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物，其特征在于，至少90重量％的胶原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且胶原蛋白水解物包含至少四种分子量在600和1200Da之间的特征肽。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白水解物，其中至少45重量％的胶原蛋白水解物具有小于1500Da的分子量。
3.根据权利要求1或2所述的胶原蛋白水解物，其中所述至少四种特征肽在通过MALD1-质谱法确定的分子量分布中具有相比于其周围至少两倍的强度，优选至少四倍的强度。
4.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物包含620和690Da之间的肽、790和860Da之间的肽、980和1050Da之间的肽以及1175和1245Da之间的肽。
5.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物还包含分子量在1500和3500Da之间的特征肽。
6.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物具有12重量％或更大的羟基脯氨酸比例。
7.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物通过明胶的酶促水解制得。
8.根据权利要求7所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物通过至少两种具有不同特异性的内切蛋白酶，特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶的依次作用制得。
9.根据权利要求8所述的胶原蛋白水解物，其中金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶选自来自于微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、角军淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的酶。
10.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物的至少50%的N-端氨基酸为疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
11.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于刺激通过皮肤细胞生物合成细胞外基质蛋白。
12.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于提高皮肤的张力和/或较少皱纹形成。
13.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于提高皮肤的水分含量。
14.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于改进皮肤的屏障功能。
15.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物用于经口摄入。
16.根据权利要求15所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物为营养增补剂。
17.根据权利要求15所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物被包含在食品或高档食品中。
18.根据权利要求15至17任一项所述的胶原蛋白水解物，其中每日摄入约1.5至5g，优选约2至3g，进一步优选约2.3至2.7g胶原蛋白水解物。
19.根据权利要求1至14任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物用于局部应用。
20.根据权利要求19所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物被包含在乳霜、膏齐U、洗剂、凝胶或洗 发剂中。
全文摘要
本发明涉及用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物，其中至少90重量%的胶原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且其中胶原蛋白水解物包含至少四种分子量在600和1200Da之间的特征肽。
文档编号A61Q19/08GK103209678SQ201180054946
公开日2013年7月17日 申请日期2011年9月29日 优先权日2010年11月15日
发明者斯特凡·豪斯曼斯, 莫尼卡·吉森-维泽尔, 斯特芬·厄塞尔 申请人:格利达股份公司