一种利用酸性蛋白酶水解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用酸性蛋白酶水解鱼皮胶原蛋白制备的抗冻多肽，以鱼皮胶原蛋白为原料，通过酸性蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性抗冻多肽，氨基酸全序列为：GAIGPAGPLGP。本发明突破了国内外现存的抗冻蛋白（多肽）的研究思路和方法，克服从天然生物体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。
【专利说明】一种利用酸性蛋白酶水解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗冻多肽，更具体地涉及了一种利用酸性蛋白酶水解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]食品和医药产品在低温储存和运输过程中由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。世界范围内的科学家正面临严肃的挑战:如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药广品品质的关键所在。
[0003]抗冻蛋白，也称“冰结构蛋白”，是一类附着在冰晶体表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性蛋白质。抗冻蛋白由于其具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质的特点和突出意义而成为热点研究主题。同样的研究还表明，抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异多肽链结构域而并不是整体蛋白质在起作用，即使是纯化了的抗冻蛋白，抗冻活性往往不高，仍然需要探究其活性域来进一步提高抗冻效率。所以，如何获得食品源的结构紧凑的高活性抗冻多肽，就成为抗冻蛋白迫切的研究方向。
[0004]
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种利用酸性蛋白酶水解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽，使抗冻活性得以高效地实现。
[0006]本发明的一种利用酸性蛋`白酶水解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽，是由11个氨基酸所构成的多肽。所述多肽的氨基酸序列为:GAIGPAGPLGP。
[0007]所述抗冻多肽的制备方法如下:
以包括来自鱼皮、鱼鳞的鱼源胶原蛋白为原料，采用酸性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽。
[0008]其中，酶解条件为:pH为5.4、温度是37°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15 (w/w)。
[0009]所述分离纯化的具体步骤为:酶解产物首先利用Sephadex G_50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱进行分离,洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min ;收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为lmL/min，收集20%乙腈和80%水(v/v)处的洗脱峰，得到抗冻多肽。
[0010]为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下:(I)明胶酶解条件的优化
本技术所采用的酶和鱼(鱼皮、鱼鳞)胶原蛋白购自Sigma生物试剂公司(中国?上海)。采用单因素实验，分别对三个酶解因素即酶解温度(37°C，45°C和50°C )、酶解时间(10，20，30，40和60分钟)以及酶-底物配比(1: 100，1:50，1:20，1:15和1:10 w/w)，进行考察。称取1.65克鱼源胶原蛋白溶解于6ml Mil1-Q水中，然后用2mol/L HCL将其pH调节至5.4。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再IOOOrpm离心10分钟。上清液收集后，分别对其抗冻活性进行测定，以确定最佳酶解条件。
[0011]得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是:pH为5.4、温度是37°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15-1:20 (w/w)。
[0012](2)酶解产物的分离、纯化
先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过Sephadex G-50凝胶色谱(长100cm,直径2.6cm)进行分离,洗脱液为去离子水,流速为2mL/min,洗脱峰在225nm下进行测量。收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱(长55cm,直径2.0cm)进行分离,洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽。
[0013](3)抗冻活性的测试
本发明按照国际抗冻蛋白活性检测的标准，建立抗冻活性检测系统。抗冻活性采用检测抗冻多肽对低温冻融细菌的 保护作用来测试。
[0014]将活化的保加利亚乳酸杆菌接种到液体培养基中37°C，130r/min培养过夜作为种子液，将种子液以1:100的比例接种到新的液体培养基中，37°C，130r/min摇床培养至OD600=L O左右。取若干1.5mL已灭菌的离心管，加入经过滤除菌的浓度为250 μ g/mL待测样品900 μ L，将菌液稀释IO4倍，吸取100 μ L加入至待测样品中，混匀，涂布，37°C倒置培养18h，计菌落数。将剩余的样品-菌液混合液置于_20°C低温处理24h，取出融化并涂布，37°C倒置培养18h，计菌落数，每组做两个平行。然后根据公式计算保加利亚乳酸杆菌的存活率。
[0015]
【权利要求】
1.一种利用酸性蛋白酶水解鱼源胶原蛋白制备的抗冻多肽，其特征在于:多肽的氨基酸序列为:GAIGPAGPLGP。
2.一种如权利要求1所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于:以包括来自鱼皮、鱼鳞的鱼源胶原蛋白为原料，采用酸性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽。
3.如权利要求2所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于:所述的酶解条件为:pH为5.4、温度是37°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15 (w/w)0
4.如权利要求2所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于:所述的分离纯化具体步骤为:酶解产物首先利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min,洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰,再用Sulfopropyl-SepadexC-25阳离子交换色谱进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0.5 M的0.0lmol/L pH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min ;收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为lmL/min，收集20%乙腈和80%水(v/v)处的洗脱峰，得到抗冻多肽。
【文档编号】C07K1/20GK103467587SQ201310441150
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】汪少芸, 蔡茜茜, 何庆燕, 饶平凡 申请人:福州大学