专利名称：利用骨粉提取水解胶原蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用骨粉提取水解胶原蛋白的方法，具体涉及一种从牛骨粉中提取水解胶原蛋白的方法。
背景技术：
明胶是用动物的骨头或者皮肤筋腱制成的多肽分子混合物，在食品、医药等领域有着广泛应用。从上世纪80年代开始，国内外明胶生产厂家逐渐淘汰了整骨浸酸的工艺，改用骨粒浸酸来生产明胶。骨粒是生产食用明胶和药用明胶的主要原料，牛骨经过分级破碎、除油、干燥、分选等工艺变成了 5至25_的骨粒。实践生产中，在制造骨粒的同时产生了副产物骨粉，该骨粉是不能用于明胶生产的粒径小于5mm的骨头渣。现有技术中，骨粒生产厂家利用每100吨牛骨生产骨粒45吨的同时会产生副产物骨粉4.5吨。由于骨粉的粒径过小，无法用于明胶的生产，只能用作蛋白饲料，大大降低了明胶生产原料骨头的附加值。以2012午中国国内市场情况看，每吨骨粒市场价6500元，而每吨骨粉市场价2600元，水解胶原蛋白平均市场价200元/kg。本发明将骨粉加工成水解胶原蛋白，每吨骨粉可生产水解胶原蛋白至少130kg，从而极大提高骨粉价值，提高明胶生产原料的利用率。水解胶原蛋白是哺乳动物体内含量最为丰富的动物蛋白，主要存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白，起着支撑器官和保护肌体的功能，也是组成细胞间质的最重要功能蛋白质。水解胶原蛋白可应用于医疗、饲料、食品、化妆品等工业领域。胶原蛋白是一种性能优异、应用广泛的生物材料，可制成止血粉剂、烧伤敷料、药物载体、心脏辨膜、血管、食管和气管的替代材料、外科用缝线等多种形态。可用作生物发酵的培养基，能够有效的促进菌丝的生长，替代进口鱼粉用于混、配合饲料生产以及颗粒饲 料粘结剂。可用作胶原类功能性食品和保健品。还可以改善肉类的品质、用作食品包装材料、饮料澄清剂。还可用于生产高级化妆品，可以补充皮肤层所需的养分，补充17种对人体有益的氨基酸；修复组织；保湿；调节和稳定pH值，稳定泡沫，乳化胶体。水解胶原蛋白的制备方法主要分为高温水解、酸水解、碱水解和酶水解等几种，目前国内外在生产水解胶原蛋白过程中，通过常规方法水解动物的皮、骨以及鱼鳞等组织得到的水解胶原蛋白大多分子量分布范围广、分子量均一差；而且水解过程中产生的大量游离氨基酸使得产品的生物活性大大降低，既影响产品口味，义影响功效。水解胶原蛋白生产通常采用的原料有动物的皮、骨以及鱼鳞等组织。由于原料成本的制约，水解胶原蛋白的价格一直远高于乳清蛋白、大豆蛋白等蛋白类产品。
发明内容
本发明克服现有技术的上述缺陷，提出一种利用骨粒生产的副产物骨粉提取水解胶原蛋白，首先将骨粒生产的副产物骨粉进行浸酸处理，清洗干净后采用高压处理，然后采用两种蛋白酶定向酶解，同时加入复合酶解保护剂，有效保证产品的生物活性；高温灭酶后过滤去除未能水解的杂质后，再进行脱色、脱盐浓缩和喷雾干燥，最终得到了分子量专一、符合食品和保健品、化妆品要求的水解胶原蛋白产品。本发明以骨粒生产的副产物骨粉为基础原料，解决了骨粉难于水解、水解产物分子量不均一、产品有异味的难题，同时也大大降低了水解胶原蛋白的原料成本。本发明提出一种利用骨粉提取水解胶原蛋白的方法，所述骨粉经浸酸处理、高压处理后，在复合酶解保护剂条件下经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的水解，然后，依次经高温灭酶、过滤、脱色、脱盐浓缩、喷雾干燥，得到目的产物水解胶原蛋白。本发明中，所述骨粉是骨粒制备过程中的副产物——粒径小于5mm的骨粉。S卩，所述骨粉是指在制备骨明胶的主要原料骨粒的过程中产生的副产物即粒径小于5mm的骨头渣子。优选地，是指牛骨粉。
本发明中，所述浸酸处理是以骨粒生产的副产物骨粉为原料，按一定梯度逐渐增加浓度的盐酸为浸酸处理溶剂，以避免直接用高浓度酸处理造成的骨粉堵塞。优选地，采用适宜的任何梯度浓度的盐酸用于浸酸处理。更优选地，所述浸酸处理是将所述骨粉分别以0.9%,1.8%,2.7%,3.6%,4.5%浓度的稀盐酸各浸泡6 8小时。进一步地，浸泡时定期翻动骨粉，使其浸泡更加均匀。优选地，浸酸完毕后滤出骨粉并清洗干净。本发明中，采用浸酸处理以尽量去除骨粉中的钙质等无机盐，且尽量减少胶原质的损失。本发明采用以0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%五个浓度的稀盐酸进行浸酸处理，其目的在于去除骨头中的无机盐和钙质。本发明采用低浓度盐酸按一定梯度处理，酸解反应比较温和，不会短时间产生大量的产物，在每隔一定时间的搅拌翻动过程中，让酸解产物溶解在酸液中，不至于造成堵塞。当酸液逐渐变浓后，则可深入到骨粉的内部，能够比较透彻地进行浸酸处理。如果直接用高浓度酸处理，骨粉表面很快被浸透，产生的酸解产物会分布在骨粉的表面造成的骨粉堵塞，导致酸液不能进入骨粉内部。本发明中，所述高压处理是将浸酸处理后的骨粉置于0.14 0.15MPa高压下处理100 120分钟。优选地，将骨粉放入126°C高压反应釜中，高压处理120分钟。本发明中，所述在复合酶解保护剂条件下进行木瓜蛋白酶水解反应，是指在恒温反应罐中放入水以及经高压处理后的骨粉，按16000 18000U/g底物的比例加入自植物提取的木瓜蛋白酶，再加入复合酶解保护剂，水解温度为48 50°C，搅拌，酶解4 6小时。具体地，在恒温反应罐中加入骨粉重量2.6倍的纯水，放入经高压处理后的骨粉，升温并保持反应罐料液温度在48 50°C之间。本发明中，所述在复合酶解保护剂条件下进行碱性蛋白酶水解反应，是用氢氧化钠调节pH至9.0 9.5，按9000U/g底物的比例加入经微生物发酵制备的碱性蛋白酶，水解温度为48 50°C，搅拌，酶解4 6小时。本发明中，木瓜蛋白酶水解反应、碱性蛋白酶水解反应是在48 50°C的中温条件下进行。在这一温度下，骨粉中的肽链能够在蛋白酶的作用下缓慢的分解成分子量均一的多肽，保持了较高的生物活性。本发明中，所述高温灭酶是升温至80 85°C，灭酶15 20分钟，冷却至30 40°C，调节至 pH6.5 7.0。本发明中，所述脱色处理是加入活性炭，保温30 40°C搅拌2 3小时。本发明中，所述脱盐及浓缩处理是将脱色后的料液经澄清滤板过滤，再经纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，收集截留液。进一步地，将收集的截留液进行喷雾干燥，得到所述水解胶原蛋白。优选地，所述纳滤膜的规格为200Da。本发明制备得到的产物是分子量专一、符合食品和保健品、化妆品要求的水解胶原蛋白，该产物水解胶原蛋白中包含的胶原蛋白含量达95%以上，分子量均一分布在IOOODa 至 2200Da 范围。现有技术是利用骨粒加工成明胶。骨粒生产过程中，以骨头为原料，采用分级破碎、蒸煮、离心、干燥分选等公知的技术加工制备得到骨粒，同时得到副产物骨粉。现有技术中明胶生产的后续工艺中必须要经过一个月以上的浸灰处理(即将骨粒浸入氢氧化钙溶液中使得骨胶中的胶原肽链缓慢的打开，变成有较高冻力的明胶)。但是，由于骨粉的粒径过小，导致在上述浸灰处理中骨粉与氢氧化钙溶液接触的面积过大，从而造成了过分碱解的情况，导致只能得到很低冻力的明胶。而且，由于骨粉的粒径不均一，粒径范围自小于
0.5mm到4 5mm，因此，即使将骨粉单独浸灰处理，也很难控制浸灰的时间和浓度。因此，目前制备明胶或水解胶原蛋白的厂家均无法利用骨粉作为生产原料。现有技术中因骨粉不能用于生产明胶，通常被当做蛋白饲料作廉价处理，其利用率和附加值都很低。本发明首次创新地提出利用骨粒生产过程的副产物骨粉为生产原料。本发明中采用浸酸处理步骤，是以0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%五个浓度的稀盐酸，按照一定梯度逐渐增加盐酸浓度来处理骨粉，从而避免直接用高浓度酸处理造成的骨粉堵塞情况。本发明中采用的水解温度是48 50°C的中温条件，保证了骨粉中的肽链能够在蛋白酶作用下缓慢分解成分子量均一的多肽，从而保持较高的生物活性。
本发明采用的复合酶解保护剂，是指在采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解反应过程中加入的复合酶解保护剂。具体是指“MO111-9酶解保护剂”，“MO111-9 ”是该试剂的型号，其主要作用是保护酶解过程中的特定肽链不被破坏，从而得到分子量均一的产物。中华人民共和国轻工行业标准规定，水解胶原蛋白分子量范围为500道尔顿至20000道尔顿之间，而分子量为1000至2200道尔顿的水解胶原蛋白，更加适合被人体吸收。本发明采用的碱性蛋白酶，是指“2709碱性蛋白酶”，即是一种由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。本发明目的在于充分高效利用骨粒生产的副产物骨粉提取水解胶原蛋白。在工艺技术上，改进了常规技术原料成本高、生物活性被破坏、产物中分子量分布范围广、有效成分含量低、产品有异味等缺陷。本发明利用骨粒生产的副产物骨粉为原料，进行浸酸和高压等预处理后，在复合酶解保护剂条件下经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的水解，再依次经灭酶、过滤，脱色，脱盐浓缩和喷雾干燥，得到分子量专一、符合食品和保健品、化妆品要求的水解胶原蛋白。水解胶原蛋白是哺乳动物体内含量最为丰富的动物蛋白，可以应用于医疗、食品、化妆品工业中，可制成止血粉剂、烧伤敖料、药物载体、心脏辨膜、血管、食管和气管的替代材料、外科用缝线等多种形态，用作生物发酵的培养基，配合饲料生产以及颗粒饲料粘结剂；胶原类功能性食品和保健品；还可以改善肉类的品质、用作食品包装材料、饮料澄清剂和生广闻级化妆品。
本发明优点包括，采用来源于骨粒生产的副产物骨粉为主要原料，大大降低了原料成本。以牛骨粉为原料，采用植物提取的木瓜蛋白酶，采用微生物发酵制备的碱性蛋白酶，不加入其他动物源性酶制剂，不采用其他非清真原料，可保证产物的清真性，符合向穆斯林国家供应食品和保健品、日化原料的要求。采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的两步定向酶解的工艺，同时采用复合酶解保护剂，保证了蛋白酶在进行定向酶解反应的同时不破坏水解产物的生物活性，保证了产物分子量的均一生，有效保障了产物的生物活性和优良品质。采用的水解温度是48 50°C的中温条件，在这一温度下，骨粉中的肽链能够在蛋白酶的作用下缓慢的分解成分子量均一的多肽，保持了较高的生物活性。采用200Da的纳滤膜进行膜分离，有效去除了小分子杂质，同时还对料液进行了浓缩，大幅降低了喷雾干燥过程的能耗。本发明采用木瓜蛋白酶和2709碱性蛋白酶两步定向酶解的工艺，同时加入MOl11-9复合酶解保护剂，综合利用膜分离和高速离心喷雾干燥等生化提取分离方法，最大程度上将原料水解为IOOODa至2200Da的蛋白产品，有效确保其生物活性，并有效去除产品中的小分子杂质，提高料液中有效成分含量，节省干燥过程消耗的能量，得到分子量专一、符合清真品质要求、符合食品和保健品及化妆品要求的水解胶原蛋白产品。本发明适合于工业化生产。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。以下实施本发明的过程及方法，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。以下实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。本发明利用骨粉提取水解胶原蛋白的方法的工艺路线:骨粉(骨粒生产的副产物)一浸酸一高压处理一一次定向保护酶解一二次定向保护酶解一灭酶一脱色一过滤一膜分离一喷雾干燥一水解胶原蛋白本发明方法的工·艺过程(按以下次序进行):(I)以骨粒生产的副产物骨粉为原料，以0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%五个浓度的稀盐酸各浸泡6 8小时，浸泡时每I小时翻动一次使浸泡更加均匀；浸酸完毕后滤出骨粉并清洗干净；(2)将上述处理好的骨粉放入126°C高压反应釜中，高压处理120分钟；(3)向恒温反应罐中加入骨粉重量2.6倍的纯水，放入高压处理好的骨粉，升温并保持反应罐料液温度在48 50°C之间；按16000 18000U/g底物的比例加入自植物提取的木瓜蛋白酶，再加入0.03% MOl11-9复合酶解保护剂，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；(4) 一次酶解后，用氢氧化钠调节pH至9.0 9.5，按9000U/g底物的比例加入2709碱性蛋白酶，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；(5)酶解结束后，升温至80 85°C，灭酶15 20分钟，冷却至30 40°C，调节至ρΗ6.5 7.0 ;(6)再向上述料液中加入料液量3.2%的活性炭，保温30 40°C搅拌3小时；(7)将上述脱色后的料液经澄清滤板过滤，得到的滤液再经纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，收集截留液；(8)将收集的截留液在180°C进风温度/85°C出风温度条件下进行喷雾干燥，得到所述水解胶原蛋白。本发明所述步骤(I)是以骨粒生产的副产物骨粉为原料，以按一定梯度逐渐增加的稀盐酸为浸酸处理溶剂。所述步骤(3)、(4)是48 50°C的中温条件下进行的。所述步骤(7)中所述纳滤膜的规格为200Da。本发明所述步骤(8)得到的水解胶原蛋白中，其中的蛋白含量达到95%以上，分子量均一分布在IOOODa至2200Da范围内。将本发明方法提取的产物水解胶原蛋白用于动物实验和临床实验，实验结果表明，该产物水解胶原蛋白可以使皮肤恢复弹性、重现结实紧致、减少松垂现象、平滑细纹及皱纹；令疲惫、老化的肌肤重振活力及恢复生气；可加速皮肤的更生过程，焕发光采。实施例1称量骨粒生产的副产物牛骨粉为500kg，以0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%五个浓度的稀盐酸各750kg分别浸泡8小时，浸泡时每I小时翻动一次使浸泡更加均匀；浸酸完毕后滤出骨粉并清洗干净；再放入126°C高压反应釜中，高压处理120分钟。向2000L恒温反应罐中加入1300kg的纯水，放入高压处理好的骨粉，升温并保持反应罐料液温度在48 50°C之间；加入1320g80万U/g的木瓜蛋白酶，再加入150克M0111-9复合酶解保护齐[J，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；一次酶解后，用氢氧化钠调节pH至9.0 9.5，加入594gl00万U/g的2709碱性蛋白酶，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；酶解结束后，升温至80 85°C，灭酶15 20分钟，冷却至30 40°C，调节至pH6.5 7.0 ;再向上述料液中加入42kg的活性炭，保温30 40°C搅拌3小时；将上述脱色后的料液经澄清滤板过滤，得到的滤液再经纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，收集截留液；将收集的截留液在180°C进风温度/85°C出风温度条件下进行喷雾干燥，得水解胶原蛋白66.5kg。按照QB2732规定的方法对产物进行测定，水解胶原蛋白中蛋白含量为96.1 %，其平均分子全部分布在IOOODa至2200Da范围内，透光率A450nm = 80.2%、A620nm = 93.0%,其他各项指标都符合QB2732中华人民共和国轻工行业部标准。实施例2称量骨粒生产的副产物牛骨粉为500kg,以0.9%U.8%,2.7%,3.6%,4.5%五个浓度的稀盐酸各750kg分别浸泡6小时，浸泡时每I小时翻动一次使浸泡更加均匀；浸酸完毕后滤出骨粉并清洗干净；再放入126°C高压反应釜中，高压处理100分钟。向2000L恒温反应罐中加入1300kg的纯水，放入高压处理好的骨粉，升温并保持反应罐料液温度在48 50°C之间；加入1320g80万U/g的木瓜蛋白酶，再加入150克MOlll — 9复合酶解保护剂，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；一次酶解后，用氢氧化钠调节pH至9.0 9.5，加入594gl00万U/g的2709碱性蛋白酶，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；酶解结束后，升温至80 85°C，灭酶15 20分钟，冷却至30 40°C，调节至pH6.5 7.0 ;再向上述料液中加入42kg的活性炭，保温30 40°C搅拌3小时；将上述脱色后的料液经澄清滤板过滤，得到的滤液再经纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，收集截留液；将收集的截留液在180°C进风温度/85°C出风温度条件下进行喷雾干燥，得水解胶原蛋白59.5kg。
按照QB2732规定的方法对产物进行测定，水解胶原蛋白中蛋白含量为97.2%，其平均分子全部分布在IOOODa至2200Da范围内，透光率A450nm = 82.0%、A620nm = 94.7%,其他各项指标都符合QB2732中华人民共和国轻工行业部标准。实施例3称量骨粒生产的副产物牛骨粉为500kg，以2%、4%两个浓度的稀盐酸各1500kg分别浸泡24小时，浸泡时每I小时翻动一次使浸泡更加均匀；浸酸完毕后滤出骨粉并清洗干净。向2000L恒温反应罐中加入1300kg的纯水，放入处理好的骨粉，升温并保持反应罐料液温度在48 50°C之间；加入1980g80万U/g的木瓜蛋白酶，再加入150克MOlll — 9复合酶解保护剂，保温48 50 V搅拌，酶解4小时；一次酶解后，用氢氧化钠调节pH至9.0
9.5，加入891gl00万U/g的2709碱性蛋白酶，保温48 50°C搅拌，酶解4小时；酶解结束后，升温至80 85°C，灭酶15 20分钟，冷却至30 40°C，调节至pH6.5 7.0 ;再向上述料液中加入42kg的活性炭，保温30 40°C搅拌3小时；将上述脱色后的料液经澄清滤板过滤，得到的滤液再经纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，收集截留液；将收集的截留液在180°C进风温度/85°C出风温度条件下进行喷雾干燥，得水解胶原蛋白36.8kg。按照QB2732规定的方法对产物进行测定，水解胶原蛋白中蛋白含量为90.7%，其平均分子全部分布在IOOODa至2200Da范围内，透光率A450nm = 78.7%、A620nm = 86.1%,其他各项指标都符合QB2732中华人民共和国轻工行业部标准。实施例2中，减少了浸酸时间和高压处理时间，收率略有偏低，成品其他指标与实施例I相当。在实施例3中，采用常规的两种浓度浸酸的方法进行处理，并且不采用高压处理，而采用直接加大酶用量的常规方法进行水解，收率只有实施例1的55%，大量的胶原蛋白并没有从骨粉重水解出来；产品的检测指标也有所下降。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围。即凡依本发明的内容所作 的等效变化与修饰，都应属于本发明的范畴。
权利要求
1.一种利用骨粉提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，所述骨粉经浸酸处理、高压处理后，在复合酶解保护剂条件下经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的水解，再依次经高温灭酶、过滤、脱色、脱盐浓缩和喷雾干燥，得到目的产物水解胶原蛋白；其中，所述骨粉是骨粒制备过程中的副产物，所述骨粉粒径小于5mm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸酸处理是指将所述骨粉分别以0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%浓度的稀盐酸各浸泡6 8小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压处理是将浸酸处理后的骨粉置于0.14 0.15Mpa高压下蒸煮100 120分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在复合酶解保护剂条件下进行木瓜蛋白酶水解是指，在恒温反应罐中放入水以及经高压处理后的骨粉，按16000 18000U/g底物的比例加入自植物提取的木瓜蛋白酶，再加入复合酶解保护剂，水解温度为48 50°C，持续搅拌酶解4 6小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在复合酶解保护剂条件下进行碱性蛋白酶水解，是用氢氧化钠调节PH至9.0 9.5，按9000U/g底物的比例加入经微生物发酵制备的碱性蛋白酶，水解温度为48 50°C，持续搅拌酶解4 6小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高温灭酶是升温至80 85°C，灭酶15 20分钟，冷却至30 40°C，调节至pH6.5 7.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤及脱色处理是加入活性炭，30 40°C搅拌2 3小时。
8.如权利要求1所述的·方法，其特征在于，所述脱盐及浓缩处理是将脱色后的料液经澄清滤板过滤，再经纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，收集截留液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产物水解胶原蛋白中的胶原蛋白含量达95%以上，分子量均一分布在IOOODa至2200Da范围。
全文摘要
本发明提供一种利用骨粉提取水解胶原蛋白的方法，所述骨粉经浸酸处理、高压处理后，在复合酶解保护剂条件下经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的水解，再依次经高温灭酶、过滤、脱色、脱盐浓缩和喷雾干燥，得到目的产物水解胶原蛋白；其中，所述骨粉是骨粒制备过程中的副产物，所述骨粉粒径小于5mm。本发明制备得到分子量专一、符合食品和保健品、化妆品要求的水解胶原蛋白，同时解决了骨粉难于水解、水解产物分子量不均一、产品有异味等技术难题，大大降低水解胶原蛋白的原料成本。
文档编号C12P21/06GK103243143SQ20131016990
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者苏翰, 唐甜, 唐信, 沙漠 申请人:上海阿敏生物技术有限公司