基于乳的蛋白水解物和由其制备的婴儿配方和营养组合物的制作方法

专利名称：基于乳的蛋白水解物和由其制备的婴儿配方和营养组合物的制作方法
基于乳的蛋白水解物和由其制备的婴儿配方和营养组合物参照的序列表本申请包含计算机可读形式的序列表。将该计算机可读形式引入本文作为参考。发明领域本发明涉及包含基于乳的蛋白水解物的组合物，所述基于乳的蛋白水解物可通过用来自微生物来源的酶处理基于乳的蛋白质材料溶液得到。可以将该组合物掺入婴儿配方和成人食品补充剂。本发明涉及两种不同类型的目的在于预防过敏反应和治疗过敏反应的蛋白水解物。在第一种情况中，婴儿是健康的，但因处于家庭中有过敏反应史而处于过敏反应的风险中。在第二种情况中，婴儿或成人是过敏性的或由此处于发病的风险中。
背景技术：
人母乳和母乳喂养代表了婴儿营养方式中无争议的黄金标准。用作人母乳替代物或补充剂的婴儿配方应满足婴儿的营养需求、具有可接受的味道和在目标在于处于过敏反应风险中的·婴儿时低过敏反应和可耐受(即能够诱导口服免疫耐受)。给牛奶诱导口服免疫耐受已经描述在EP0827697中。已知对牛奶和包含牛奶蛋白的婴儿配方的过敏反应因如下事实所致:牛奶蛋白不同于母乳蛋白且可以构成人的过敏原。主要公认的牛奶过敏原是α乳清蛋白(aLA)、i3-乳球蛋白(bLG)和牛血清白蛋白(BSA)。牛乳清蛋白和/或酪蛋白通常用作婴儿配方中的乳蛋白源。为了降低过敏反应性，用酶水解牛奶蛋白且由此还原成肽类。目前由这种目的在于预防过敏反应的牛奶蛋白水解物组成的低过敏反应配方还包含其他营养物，例如动物油、植物油、淀粉、麦芽糖糊精、乳糖和蔗糖。还可以将这些蛋白水解物掺入成人乳饮料或食品补充剂中。用于生产这些水解物的水解方法必须得到谨慎地监测，使得最终产品的水解物保持其营养价值和期望的物理特性，而且是低过敏反应和可耐受的。可以将水解物表征为“部分”或“彻底”的，视进行水解反应的程度而定。根据WAO(World Allergy Organization)有关牛奶蛋白过敏反应(CMA)的指导原则，目前没有彻底水解产物的法定/临床定义，但同意WAO水解配方已经证实是有用的并且是广泛使用的用于患有CMA的婴儿的蛋白质源。在本发明中，部分水解物是这样一种水解物，其中60%的蛋白质/肽群体具有小于1000道尔顿的分子量，而彻底水解物是这样一种水解物，其中至少95%的蛋白质/肽群体具有小于1000道尔顿的分子量。这些定义目前用于本行业。部分水解物被视为低过敏反应的(HA)，而彻底水解物被视为无过敏反应的。许多团体已经进行了研究以便优化水解方法。水解反应条件包括温度和反应器体积、水解循环次数、蛋白质底物、酶的类型和浓度的选择是许多因素中的一些，它们影响水解反应且由此影响终产品的物理、化学和最终的生物特性。在EP0353122中，胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物以胰蛋白酶/糜蛋白酶0.33与0.66的活性比用于制备低过敏反应乳清蛋白水解物。W09304593 Al和US5039532A还公开了使用胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解方法，包括两步水解反应，其中在两者之间的热变性步骤确保最终的水解物基本上不含完整的过敏原蛋白。用于这些方法的胰蛋白酶和糜蛋白酶是通过提取猪胰腺生产的制品。包含制备的蛋白水解物的基于这些方法的许多产品存在于市场上。例如，NestM HA 婴儿配方可以使用水解物制备，该水解物使用提取自动物胰腺的胰蛋白酶和糜蛋白酶生产且其低过敏反应特征已经得到充分研究和记录。已经公布了三篇主要的报道在德国进行的大的随机化和双盲干预性研究的论文，其目的在于比较水解配方与标准牛奶配方在预防处于风险中的婴儿过敏反应表现、尤其是特应性湿疹中的效果。将公开文献列举如下:水解的牛奶配方在生命的第一年中预防过敏反应中的效果:德国婴儿营养干预性研究-一项随机化双盲试验，von Berg A, Koletzko S, Griibl A, Filipiak-Pittroff B, Wichmann HE, BauerCP, Reinhardt D，Berdel D ；German Infant Nutritional Intervention Study Group.JAllergy Clin Immunol.2003 Mar ；111:533_40。一些水 解配方降低了特应性皮炎的发病率，但无法降低哮喘的发病率:德国婴儿营养干预性研究的三年结果，von Berg A, Koletzko S, Filipiak-Pittroff B, LaubereauB,Griibl A,Wichmann HE,Bauer CP,Reinhardt D,Berdel D；German Infant NutritionalIntervention Study Group.J Allergy Clin Immunol.2007 Mar ;119:718_25。持续至6岁的水解婴儿配方的预防效果:来自德国婴儿营养干预性研究(GINI研究)的长期结果，yon Berg A, Filipiak-Pittroff B,Kramer U, Link E, Bollrath C,Brockow I,Koletzko S,Griibl A,Heinrich J,Wichmann HE,Bauer CP,Reinhardt D,BerdelD ；GINIplus study group,J Allergy Clin TmmunodoI 2008;121:1442-7。后期GINI研究结论是使用Nestl6 H.A.婴儿配方NAN HA ,在高危儿童中的早期营养干预对特应性皮炎具有长期预防效果，直到6岁为止，表明确切的疾病减少而不是延缓疾病发作。长期预防效应即远超喂养Nan HA 期限的预防效果显示诱导了口服免疫耐受，不过，这种耐受性诱导中涉及的免疫机制尚未在GINI研究中得到检验。除低过敏反应外，高度期望用作母乳补充物或替代物的婴儿配方具有诱导婴儿口服免疫耐受的能力。口服免疫耐受是通过在先通过口腔途径给予抗原而对于细胞和/或体液免疫反应性的特异性抑制。它是生命前几个月中免疫系统发育的重要部分并且能够使得婴儿消费食品而无不良反应。口服免疫耐受建立的失败导致过敏反应。口服免疫耐受的发育与免疫系统训练相关，终止于对食物抗原的反应降低。认为一些可以特别地存在于部分水解婴儿配方中的肽类具有与免疫系统发生相互作用和诱导口服免疫耐受诱导的能力。认为这些肽类应具有特定的特性，包括相当小的大小，以更好地支持免疫系统的训练而不会作为过敏原自身起作用。还认为特异性肽类的序列可以起到显著作用。特异性水解物肽特性实际上可以处于诱导口服免疫耐受的核心。目前存在一种广泛的趋势，即远离应用来自动物的酶，而倾向于应用来自微生物来源的酶。在近20年来在酶的生产领域通过遗传工程取得了显著进展。这使得能够在相对短的时间期限内可再现地制备大量高质量、高纯度的酶。由于这些原因，所以期望能够使用来自微生物来源的酶生产用于低过敏原婴儿配方的乳蛋白水解物。此外，高度期望这些乳蛋白水解物具有诱导婴儿口服免疫耐受的能力。因此，为了保留哺乳动物酶衍生的水解物的低过敏原性，使用微生物酶生产的那些水解物必须具有类似的化学、物理和生物特性。此外，市场上销售的任何新的婴儿配方必须在严格的管理指导原则下进行管理，例如适用于Europe Directive 2006/141/EC。因此，期望任何新的产品具有与已经使用哺乳动物酶制备的经验证的产品极为相似的肽特性，以便保持预防过敏反应的效果。此外，高度期望这些乳蛋白水解物具有诱导婴儿口服免疫耐受的能力。类似地，期望促进减少过敏反应或不良反应，促进蛋白质或氨基酸吸收，有利于蛋白质或氨基酸利用和/或调节病患者的炎症过程，尤其是通过在完全营养组合物中提供特定的蛋白水解物。需要通过非哺乳动物酶、优选微生物酶作用制备的乳衍生的蛋白水解物，所述的酶可以提供低过敏原性，同时提供诱导口服免疫耐受的能力。需要目标在于处于过敏反应风险中的个体的婴儿配方和/或营养组合物中优选包含的这种水解物。需要这种降低生命中随后发生的过敏反应风险或严重性并且有助于调节过敏反应症状发生的组合物。需要得到基于细菌酶的水解物，其与获自哺乳动物酶的水解物共有一些相似性的肽特性，由此甚至更能够再现随后的口服免疫耐受特性并且显示预防过敏反应症状。需要应用与上述制备用于风险或脆弱患者的营养组合物相同的酶。只有生产“部分”水解物，则这些微生物酶还可以用于生产存在于治疗配方中的“彻底”蛋白水解物，例如预以喂养牛乳过敏反应婴儿和儿童的那些配方。在这种情况中，目标人群可以是已经对牛乳蛋白致敏的患病(过敏反应)婴儿和儿童。这些微生物酶还可以用于生产任意类型的用于婴儿、儿童或成人产品的蛋白水解物，这些产品的目的在于其他有益性而非与过敏反应相关，例如促进消化、促进氨基酸、肽类和蛋白质吸收和代谢，促进从疾病中恢复，优化氮源利用，促进组织构建和能量储备。为了解决这一问题，发明人已经进行了广泛研究规划，并且比较了许多用于进行水解反应的作为潜在候选者的微生物酶。他们监测了参数，包括水解反应性能、酶特异性和肽分子量特性并且确定许多特异性酶混合物提供了具有期望物理、化学和生物特性的水解物。可以有效和可再现地生产本文公开的乳蛋白水解物，它们具有可接受的味道、所需的营养价值和低过敏反应性。此外，本发明的水解物可以诱导口服免疫耐受。发明概述本发明涉及组合物，其包含基于乳的蛋白水解物，该水解物可通过用如下成分处理基于乳的蛋白质材料的溶液得到:a)至少一种由微生物产生的胰蛋白酶-样内肽酶；和b)至少一种由微生物产生`的糜蛋白酶-样内肽酶。正如通过肽分子量特性、肽序列特性(内肽酶特异性)和内肽酶的水解效率所表征的，本发明的水解物具有与那些哺乳动物酶产生的基于乳的蛋白水解物相似的特性。本发明的水解物具有治疗和预防作用，并且尤其可以用于对有此需要的婴儿或患者诱导口服免疫耐受或用于降低有此需要的婴儿或患者的过敏反应风险，或用于降低婴儿期或随后的生命期过程中、尤其是对有此需要的婴儿或患者的过敏反应风险。可以将所述的水解物掺入婴儿I段配方、婴儿后续配方、婴儿食品配方、婴儿谷类食品配方或成长牛奶或成人营养组合物或成人疗法需要个体的基于乳的饮料，且优选所述组合物是I段婴儿配方。
在本发明的一个方面中，至少一种胰蛋白酶-样内肽酶来源于镰孢属(Fusarium)、优选尖孢镰孢(Fusarium oxysporun)的菌株或库茨涅尔氏菌属(Kutzneria)、优选白色库茨涅尔氏菌(Kutzneria albida)的菌株。在本发明的另一个方面中，至少一种糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、优选拟诺卡氏菌属物种或绿僵菌属(Metarhizium)、优选金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)或小枝抱属(Brachysporiella)、优选小枝抱(Brachysporiella gayana)的菌株。在本发明的另一个方面中，基于酶重量，胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶之比在5: 1-35: 1，优选20: 1-30: 1，更优选27: I的范围。在本发明的另一个方面中，当胰蛋白酶-样内肽酶来源于镰孢属菌株且糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属菌株时，基于酶重量，胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶之比为9: I。附图简述

图1.实施例1的水解物的肽大小排阻色谱分离。基于其分子量(MW)、使用大小排阻色谱柱(来自GE的Supe rdex Peptide 10/300GL)分离肽类。在215nm通过UV监测肽的洗脱。结果显示组合2、4和6的大小分布与参比物PTN(实验1，参见正文)极为相近，正如与更确切地观察到坪值的组合3和5相比，分子量从高到低骤降所示例的(参见趋势线)。这些结果启示实验2、4和6的酶促效率生成了在大小上极为相似的肽群体，而3和5更多地富集在比参比物小的肽中。图2.实施例1的水解物的酶特异性分析。通过LC-MS/MS (来自ThermoScientific的具有Allegro HPLC泵的LTQ-Orbitrap MS))鉴定肽序列。对每一鉴定的序列而言，提取裂解位点(位置-1)前后的5个氨基酸，构建频率图(和序列保守图)。对氨基酸从最高(顶点)到(底部)频率与和其频率成正比的其垂直大小绘制图。结果显示用于实验4和6的酶混合物具有与参比物PTN(实验I)相差无几的酶特异性。图3.实施例1的水解过程中OH-消耗动力学(ii mole OH-消耗的/g蛋白质)。发明详述 本发明基于乳的蛋白水解物通过用来自微生物来源的胰蛋白酶-样内肽酶和糜蛋白酶-样内肽酶处理基于乳的蛋白质材料得到。基于乳的蛋白质材料在本发明的组合物中，原料是基于乳的蛋白质材料。它可以是基于乳清的蛋白质材料、酪蛋白或基于乳清的蛋白质材料与酪蛋白的混合物。酪蛋白来源可以是酸性酪蛋白或脱脂乳固体。基于乳清的蛋白质材料可以是来自干酪制造的乳清，特别是甜乳清，例如由粗制凝乳酶凝固酪蛋白产生的甜乳清、酸或酸化发酵物凝固酪蛋白产生的酸性乳清，乃至由酸化和粗制凝乳酶凝固产生的混合乳清。这种原料可以是已经通过离子交换和/或电渗析脱矿物质的乳清并且称作软化乳清蛋白(DWP)。在一个优选的实施方案中，这种基于乳清的蛋白质材料的来源是来自完全或部分除去酪蛋白-糖-巨肽(CGMP)的甜乳清。称作改性的甜乳清(MSW)。从甜乳清中除去CGMP产生了蛋白质材料，其具有的苏氨酸和色氨酸含量更接近于人乳。从甜乳清中除去CGMP的方法描述在EP 880902中。原料可以是DWP和MSW的混合物。它可以是乳清蛋白35-80%蛋白质(WPC)浓缩物或分离物，条件是乳清蛋白浓度大于95%蛋白质(WPI)。作为WPC的实例，可以举证购自Arla Foods，Denmark的WPC 87 Lacprodan ，作为WPI的实例，可以举证来自的Davisco Foods International (Minnesota USA) 的 Bipr ο 。基于乳的蛋白质材料可以是溶液或混悬液形式，并且以2-30%重量的蛋白质材料、更优选5-20 %、更优选6-10 %的浓度存在。原料甚至可以是上述举出的原料和乳糖的组合。乳糖可以作为乳清蛋白浓缩物的组成部分存在或可以加入。向原料中添加乳糖用于水解具有如下优点:任何包含在乳糖中的残留蛋白被水解。乳糖可以以0.05-30% w/w、优选0.10-20% w/w的浓度存在，或就优选较低乳糖浓度的情况而言，其浓度为0.10-1%、优选0.10-0.20% (w/w)。在后面的情况中，将终产品指定用于具有低乳糖耐受的婴儿或成人。例如，可以通过超滤(得到UF乳清)、任选随后透析除去乳糖。原料可以是真或胶体水溶液的形式或粉末形式。在后面的情况中，优选将粉末溶于软化水以形成水溶液。微牛物产牛的酶本发明的胰蛋白酶-样内肽酶和糜蛋白酶-样内肽酶可以由任意属的微生物产生。本文的“由...产生”的含义是指通过发酵指定生物体细胞产生。后面的酶对产生它们的生物体而言是天然的或可以通过插入编码内肽酶的核苷酸序列改造成宿主生物体。胰蛋白酶-样内肽酶:胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是在许多脊椎动物消化系统中发现的丝氨酸蛋白酶，其中它水解蛋白质。它在胰腺中作为无活性酶原胰蛋白酶原产生。胰蛋白酶裂解肽链或主要在氨基酸赖氨酸或精氨酸羧基侧链上的的键，除外后面跟随脯氨酸的情况。在本发明中所谓“胰蛋白酶-样内肽酶” 是指具有类似于哺乳动物胰蛋白酶例如提取自猪胰腺组织的胰蛋白酶活性的酶。所谓“胰蛋白酶-样内肽酶”还指内肽酶，其优先裂解精氨酸和/或赖氨酸的L-异构体、优选精氨酸和赖氨酸的C-末端侧链上的肽类或蛋白质。胰蛋白酶-样内肽酶可以来源于:革兰氏阳性菌株，例如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、库茨涅尔氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属；或革兰氏阴性菌株，例如弯曲杆菌属、埃希氏菌属(优选大肠杆菌)、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、Ilyobacter、奈瑟氏球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属或尿枝原体属；或真菌菌株，例如酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属、曲霉属、青霉属、镰孢属和麦角菌属。在一个优选的实施方案中，胰蛋白酶-样内肽酶是真菌内肽酶，优选自镰孢属、更优选尖孢镰孢的菌株，其具有在名称SWISSPROT N0.P35049下登记的序列。胰蛋白酶_样内肽酶可以与SWISSPROT N0.P35049具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。已经描述了由后面的序列编码的酶(US5, 288，627 ；US5, 693，520)。在另一个优选的实施方案中，胰蛋白酶-样内肽酶来源于革兰氏阳性菌，优选库茨涅尔氏菌属、更优选自白色库茨涅尔氏菌的菌株。在另一个优选的实施方案中，胰蛋白酶-样内肽酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。胰蛋白酶-样内肽酶的浓度可以为100-500,000 USP胰蛋白酶单位/g食物蛋白，例如250-250, 000或500-100，000。一个USP胰蛋白酶单位是在pH7.6和25°C使用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)作为底物导致在253nm的吸光度0.003改变的活性。另外以mg > 95%纯度酶蛋白/ml的表示意味着胰蛋白酶-样内肽酶浓度可以在
0.5-4,优选自1-3.5,更优选1.5-3mg/g乳蛋白。它不依赖于存在的糜蛋白酶样内肽酶。酶:糜蛋白酶-样内肽酶-糜蛋白酶(EC3.4.21.4)是优先裂解肽酰胺键的丝氨酸蛋白酶，其中酰胺键的羧基侧(P1位)是酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。糜蛋白酶还以较为缓慢的速率水解肽类上的其他酰胺键，特别是在P1位上包含亮氨酸的那些。所谓“糜蛋白酶-样内肽酶”是指具有与哺乳动物糜蛋白酶类似活性的酶，例如提取自猪胰腺组织的糜蛋白酶。还指这样一种酶，其在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸残基各自的羧基末端侧上裂解的特异性高于精氨酸和赖氨酸的羧基末端侧上裂解的特异性。本发明的糜蛋白酶-样内肽酶可以来源于:革兰氏阳性菌株，例如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、库茨涅尔氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属或革兰氏阴性菌株，例如弯曲杆菌属、埃希氏菌属(优选大肠杆菌)、拟诺卡氏菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、Ilyobacter、奈瑟氏球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属或尿枝原体属；或真菌菌株，例如酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属、曲霉属、青霉属、镰孢属和麦角菌属。优选本发明的糜蛋白酶-样内肽酶可以来源于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌菌株。在一个更优选的实施方案中，糜蛋白酶来源于拟诺卡氏菌属、优选自拟诺卡氏菌属物种EMBL CDS CAI94179(例如上述WO 88/03947中所述)的菌株。在另一个优选的实施方案中，糜蛋白酶-样内肽酶具有与多肽EMBL CDSCAI94179至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。

在另一个更优选的实施方案中，糜蛋白酶-样内肽酶来源于绿僵菌属(Metarhizium)、优选金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，例如其具有序列TREMBL:Q9Y843的成熟多肽的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，糜蛋白酶-样内肽酶具有与多肽TREMBL:Q9Y843至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在另一个更优选的实施方案中，糜蛋白酶-样内肽酶来源于枝孢属(Brachysporiella)、优选小枝孢(Brachysporiella gayana)、CGMCC 0865、TO2004/072279 中公开的氨基酸 1-186。在另一个优选的实施方案中，糜蛋白酶-样内肽酶具有与后面的参比多肽至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。糜蛋白酶-样内肽酶的浓度优选为100-100，000USP糜蛋白酶单位/g基于乳的蛋白质，更优选500-50，000，最优选1，000-20, 000。一个USP糜蛋白酶单位是在pH7.0和25°C使用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯(ATEE)作为底物导致在237nm的吸光度0.0075改变的活性。另外以mg > 95%纯度酶蛋白/ml的表示意味着糜蛋白酶-样内肽酶浓度可以在0.05-2,优选自0.1-1，更优选0.15-0.4mg/g乳蛋白的范围。它不依赖于存在的胰蛋白酶-样内肽酶。在水解过程中，将酶作为混合物一起使用。例如，来源于白色库茨涅尔氏菌的胰蛋白酶-样内肽酶可以与来自例如拟诺卡氏菌属物种或金龟子绿僵菌或小枝孢的糜蛋白酶-样内肽酶合并。来源于尖孢镰孢的胰蛋白酶-样内肽酶可以与来自拟诺卡氏菌属物种或金龟子绿僵菌或小枝孢的糜蛋白酶-样内肽酶合并。发明人已经发现，胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶基于酶重量之比(T/C之比)应在5: 1-35: I的范围，优选20: 1-30: 1，更优选27: I。此外，当胰蛋白酶-样内肽酶来源于镰孢属的菌株且糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属的菌株时，T/C之比的优选范围在8: 1-11: 1，更优选9: I。特别确切的是，来自尖孢镰孢的胰蛋白酶-样内肽酶⑴与来自拟诺卡氏菌属的糜蛋白酶-样内肽酶(C)组合的T/C之比为9: 1，来自白色库茨涅尔氏菌的胰蛋白酶-样内肽酶(T)与来自拟诺卡氏菌属的糜蛋白酶-样内肽酶(C)组合的T/C之比为27: 1，来自尖孢镰孢的胰蛋白酶-样内肽酶⑴与来自拟诺卡氏菌属的糜蛋白酶-样内肽酶(C)组合的T/C之比为27: I。水解讨稈:现有技术中已经描述了用于进行水解过程的典型条件。温度可以在约40 0C -60°C，优选在50°C，反应时间为1-6小时，优选4小时，pH值可以在6.5-8.5的范围，优选7.0-8.0。可以使用已知的试剂例如Ca(OH)2调整pH。在对比文件US5039532或EP0631731A1中描述了两步水解反应，其中在两者之间存在热变性步骤，从而确保最终的水解物基本上不含乳蛋白过敏原。这种热变性步骤优选在95°C进行5分钟。任选可以预加热基于乳的蛋白质溶液或混悬液(例如预加热至80-100°C持续5-30分钟或130°C约30-60秒)，以确保乳清蛋白例如α乳清蛋白、β -乳球蛋白和血清白蛋白(BSA)变性。

无论水解进行程度如何，水解产物都需要进行热处理，以使进行水解的酶失活。这种热处理包含将水解物预加热至75°C或以上的温度，将其保持在该温度(优选在750C -850C )下约0.1-30分钟，以促进酶的自身消化，随后该处理有利地进行灭菌，优选在超高温下，例如在125°C -135°C下30秒-3分钟。通过注射蒸汽或使用热交换器。可以净化、过滤或超滤由此得到的水解物。还可以将其浓缩。然后干燥，例如通过冻干、喷雾干燥或冷冻干燥以便不同的应用，或甚至可以随后进行处理。在后面的情况中，可以在随后的处理过程中使酶失活。本发明的水解物可以具有特征在于NPN/TN%的水解度。NPN/TN%是指非蛋白氮除以总氮X100。非蛋白氮是氨基氮，其可以自由地与试剂例如三硝基苯磺酸(TNBS)反应。可以如 Adler-Nissen J-, 1979, J.Agric.Food Chem.，27 (6)，1256-1262 中详细描述的测定NPN/TN%。一般而言，将彻底水解物表征为NPN/TN%大于95%，而将部分水解的水解物表征为册~了^^%在75% -85%的范围。在一个优选的实施方案中，本发明的水解物具有70-90 %、优选75-85 %的NPN/TN%。后面的水解物是“部分”水解物。这些水解物的特征还可以在于60-70%的其蛋白/肽群体具有< 1000道尔顿的分子量。在另一个优选的实施方案中，其中“彻底”水解物是期望的，本发明的水解物具有大于95%范围的NPN/TN%。这些水解物的特征还可以在于至少95%的其蛋白/肽群体具有< 1000道尔顿的分子量。本发明的水解物可以具有特征在于NPN/TN%的水解度。非蛋白氮除以总氮广泛用作酶促水解生成的可溶性肽类的量度。用于测定NPN的典型方法与AOAC方法991.21等同。在100%基于乳清蛋白的水解物中，NPN/TN含量典型地在70-90%的范围。在一个优选的实施方案中，本发明的水解物具有70-90%、优选75-85%范围的NPN/TN%。在另一个优选的实施方案中，其中彻底水解的水解物是期望的，本发明的水解物具有大于95 %范围
的 NPN/TN%。例如，可以通过大小排阻色谱法(SEC)测定得到的蛋白水解物中肽类的分子量发布。在一个优选的实施方案中，本发明的水解物是部分水解物并且由肽类组成，其中小于I %重量具有高于20，OOOkDa的分子量。在一个更优选的实施方案中，本发明的水解物具有的肽重量分布与使用哺乳动物酶得到的类似，特别是猪酶，例如来自Novozyme (Denmark)的PTN 6.0S (也称作PTN)(参见实施例1图1)。这种参比酶是提取自猪胰腺的胰蛋白酶，这种猪胰腺包含胰蛋白酶作为主要成分，而且还包含残留的糜蛋白酶。它具有的胰蛋白酶活性为1350 USP胰蛋白酶/g，且糜蛋白酶活性为80 USP糜蛋白酶/g。这导致基于活性的T/C之比为16。水解过程中使用的酶混合物的酶特异性可以通过对得到的水解物中包含的肽类进行测序评价。通过LC-MS/MS鉴定肽序列。在一个更优选的实施方案中，本发明的水解物具有的酶特异性与使用哺乳动物酶得到的接近，特别是猪酶，例如上述的PTN 6.0S(参见实施例1图2)。 可以通过测定水解过程中的碱(OH)消耗评价水解效率。在一个更优选的实施方案中，本发明的水解物具有与使用哺乳动物酶、特别是猪酶例如上述PTN得到的接近的水解性能(参见实施例1图3)。可以使用标准免疫测定法如ELISA试验评价水解物的残留抗原性。优选本发明的水解物呈现< 3mg BLG当量/g蛋白质当量的残留￠-乳球蛋白(BLG),更优选< 2mg BLG当量/g蛋白质当量，最优选< Img BLG当量/g蛋白质当量(参见实施例1)。可以将本发明的水解物掺入婴儿配方、婴儿后续配方、婴儿食品、婴儿谷类产品、成长奶、婴儿或儿童食品补充剂或成人营养组合物，即全部制品的目标在于预防或治疗过敏反应和任意其他有益性，即蛋白水解物可以提供给人，且优选所述组合物是I段婴儿配方。在本发明的一个实施方案中，本发明的水解物与选择的益生菌联用，例如用于婴儿配方。所选择的益生菌可以是常用于婴儿配方的任意益生菌。优选益生菌是能够提供对过敏反应和/或诱导口服免疫耐受和/或炎症过程额外的或协同的作用的那些。可以用于本发明的适合的益生菌微生物的实例包括:酵母菌，例如酵母属、德巴利酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属；霉菌，例如曲霉属、根霉属菌、毛霉菌属和青霉属以及球拟酵母属；细菌，例如双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、梭杆菌属、蜜蜂球菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、葡菌球菌属、消化链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、微球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、气球菌属、酒球菌属和乳杆菌属。适合的益生菌微生物的具体实例为 :啤酒酵母、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、长双歧杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、消化乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、代田乳酸菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、香肠乳杆菌(Lactococcusfarciminus)、格式乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(乳杆菌GG)、米酒乳杆菌、乳酸乳球菌、变异微球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜盐片球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌。优选的益生菌株包括可获自Finland Valio Oy的商标为LGG的鼠李糖乳杆菌ATCC 53103、可获自BioGaia AB的鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724、类干酪乳杆菌CNCM1-2116、路氏乳杆菌ATCC 55730和路氏乳杆菌DSM 17938、特别由Denmark的ChristianHansen公司在商标Bb 12下销售的乳双岐杆菌CNCM 1-3446和Japan的Morinaga MilkIndustry C0.Ltd.在商标BB536下销售的长双歧杆菌ATCC BAA-999。如果本发明组合物中存在，则益生菌优选以103_1012cfu/g的量存在，更优选106-10ncfu/g,甚至更优选104-109cfu/g,最优选107-109cfu/g组合物或每mL组合物。实施例:实施例1:使用相同的乳蛋白底物和6种酶溶液的组进行一系列水解反应，所述6种酶溶液由根据表I的I种标准PTN溶液和5种不同的胰蛋白酶和糜蛋白酶-样内肽酶混合物组成。原料是基于蛋白质重量的83/17之比的500ml底物乳蛋白MWP28/DWP28的8%溶液。底物的最终组成是27.7%总固体、8%蛋白质和18.48%乳糖。将蛋白质底物溶解成8 % w/v水溶液。为了进行反应，使用500ml总体积。使温度平衡至55°C。然后使用10% Ca(OH)2溶液将pH调整至pH7.4。添加酶(总有用酶的一半用于第一个水解步骤)后，在55°C 4h过程中通过添加0.25M NaOH、使用AutotitratorDL50Graphix (Mettler Toledo将pH维持恒定在ρΗ7.4。将水解物在93°C加热5min。温度至55°C平衡后，再导入酶(总酶的一半用于第二个水解步骤)且如上所述维持pH。2小时水解后，通过热处理(在85°C 5min)使酶失活终止酶促反应。表I显示了使用不同比例的酶进行的系列实验。TLl和TL2表示分别来自尖孢镰孢和白色库茨涅尔氏菌的胰蛋白酶-样内肽酶。CTL2和CTL3表示分别来自金龟子绿僵菌和拟诺卡氏菌属物种的糜蛋白酶-样内肽酶。
权利要求
1.组合物，其包含可通过使用如下酶处理基于乳的蛋白质材料的溶液得到的基于乳的蛋白水解物: a)至少一种来源于微生物的胰蛋白酶-样内肽酶；和 b)至少一种来源于微生物的糜蛋白酶-样内肽酶，该组合物用作具有治疗或预防效果的药物或组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其用于诱导有此需要的婴儿或患者口服免疫耐受或用于降低有此需要的婴儿或患者的过敏反应风险，或用于降低婴儿其或随后的生命期过程中、尤其是有此需要的婴儿或患者的过敏反应严重性或频率。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中至少一种胰蛋白酶-样内肽酶来源于镰孢属(Fusarium)、优选尖抱键抱(Fusarium oxysporum)的菌株并且与 SWISSPROT N0.P35049 表示的序列具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
4.根据权利要求1、2或3的组合物，其中至少一种胰蛋白酶-样内肽酶来源于库茨涅尔氏菌属(Kutzneria)、优选白色库茨涅尔氏菌(Kutzneria albida)的菌株并且与成熟多肽SEQ ID NO:1具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
5.权利要求1-4任一项的组合物，其中至少一种糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、优选拟诺卡氏菌属物种(Nocardiopsis Sp.)或绿僵菌属(Metarhizium)、优选金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)或小枝孢属(Brachysporiella)、优选小枝抱(Brachysporiella gayana)的菌株。
6.根据权利要求1-5任一项的组合物，其中至少一种糜蛋白酶-样内肽酶与EMBL⑶SCAI94179 或 TREMBL:Q9Y843 或 CGMCC 0865 的多肽序列、W02004/072279 中公开的氨基酸1-186具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
7.根据上述权利要求任一项的组合物，其特征在于胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶之比在5: 1-35: 1，优选20: 1-30: 1，更优选27: I的范围，其中该比例基于酶的重量。
8.根据权利要求6的组合物，其特征在于当胰蛋白酶-样内肽酶来源于镰孢属菌株和糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属菌株时，胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶之比为9: 1，其中该比例基于酶的重量。
9.根据上述权利要求任一项的组合物，其特征在于基于乳的蛋白质材料是乳清蛋白、酪蛋白或两者的混合物，优选乳清/酪蛋白基于重量之比至少为50/50、60/40或70/30，最优选基于乳的蛋白质材料是乳清蛋白。
10.根据权利要求9的组合物，其特征在于基于乳的蛋白质材料是甜乳清蛋白，优选自甜乳清蛋白中酪蛋白-糖-巨肽已经被完全或部分除去，或是乳清蛋白分离物或这些蛋白质来源的混合物。
11.根据权利要求9或10的组合物，其特征在于基于乳的蛋白质材料是改性的甜乳清和去矿化乳清蛋白的混合物。
12.组合物，其包含基于乳的蛋白水解物，该水解物可通过用如下酶处理基于乳的蛋白质材料的溶液得到: a)至少一种胰蛋白酶-样内肽酶，其来源于镰孢属、优选尖孢镰孢的菌株且优选与序列SWISSPROT N0.P35049具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性； b)至少一种糜蛋白酶-样内肽酶，其来源于拟诺卡氏菌属、优选拟诺卡氏菌属物种的菌株并且优选与序列EMBL⑶S 0八194179具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性； 其特征在于胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶基于酶重量之比为20: 1-35: 1，优选 25: 1-30: 1，更优选 27: I。
13.组合物，包含基于乳的蛋白水解物，该水解物可通过用如下酶处理基于乳的蛋白质材料的溶液得到: a)至少一种胰蛋白酶-样内肽酶，其来源于库茨涅尔氏菌属、优选白色库茨涅尔氏菌的菌株并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽序列具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性；和 b)至少一种来源于微生物的糜蛋白酶-样内肽酶。
14.根据权利要求13的组合物，其特征在于糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属、优选拟诺卡氏菌属物种或绿僵菌属、优选金龟子绿僵菌或小枝孢属、优选小枝孢的菌株。
15.根据权利要求13或14的组合物，其特征在于基于酶重量，胰蛋白酶-样内肽酶与糜蛋白酶-样内肽酶之比在5: 1-35: 1、优选20: 1-30: 1、最优选27: I的范围。`
16.根据上述权利要求任一项的组合物，其特征在于存在于蛋白水解物中的乳糖含量在 0.05-30% w/w，优选 0.10-20% w/w，更优选 0.10-0.20% (w/w)。
17.上述权利要求任一项的组合物，其中该组合物是婴儿配方、婴儿后续配方、婴儿食品配方、婴儿谷类食品配方或成长牛奶、婴儿或儿童食品补充剂或成人营养组合物，目标在于预防或治疗过敏反应，且优选该组合物是I段婴儿配方。
18.组合物的用途，该组合物包含基于乳的蛋白水解物，该水解物可通过用如下酶处理基于乳的蛋白质材料的溶液得到: a)至少一种从微生物产生的胰蛋白酶-样内肽酶；和 b)至少一种从微生物产生的糜蛋白酶-样内肽酶， 该组合物作为婴儿配方或食品补充剂，用于对有此需要的婴儿或患者诱导口服免疫耐受，或用于降低有此需要的婴儿或患者的过敏反应风险，或用于降低婴儿期或随后的生命期过程中、尤其是有此需要的婴儿或患者的过敏反应严重性。
19.根据权利要求18的组合物的用途，特征在于胰蛋白酶-样内肽酶来源于镰孢属、优选尖孢镰孢的菌株并且与SWISSPR0T N0.P35049表示的序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一丨I"生，或来源于库茨涅尔氏菌属、优选白色库茨涅尔氏菌的菌株，且与SEQ ID No:1的多肽具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
20.根据权利要求18或19的组合物的用途，特征在于糜蛋白酶-样内肽酶来源于拟诺卡氏菌属、优选拟诺卡氏菌属物种或绿僵菌属、优选金龟子绿僵菌或小枝孢属、优选小枝孢的菌株。
21.根据权利要求20的组合物的用途，其中糜蛋白酶-样内肽酶与序列EMBLCDSCAI94179 或 TREMBL:Q9Y843 或 CGMCC 0865.W02004/072279 中公开的氨基酸 1-186 具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
22.根据权利要求18、19、20或21的组合物的用途，特征在于该组合物用作婴儿配方、婴儿后续配方、婴儿食品配方、婴儿谷类食品配方或成长牛奶、婴儿或儿童食品补充剂或目标在于预防过敏反应的成人营养组合物、或用于疾病个体的成人乳饮料，且优选该组合物是I段婴 儿配方。
全文摘要
组合物，其包含来源于乳的蛋白水解物，该水解物可通过用来源于微生物的酶处理得到。使用胰蛋白酶-样酶和糜胰蛋白酶-样酶。该组合物特别预以用于诱导婴儿的耐受性，其效果可调节随后生命过程中发生的过敏反应的可能性。该组合物还可以用于疾病成人患者。优选该组合物是婴儿配方、婴儿后续配方、成长乳品或婴儿食品或肠完全营养组合物。
文档编号A61P37/08GK103153325SQ201180047728
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月30日 优先权日2010年10月1日
发明者M·阿福尔特尔, I·比罗-弗朗斯, F·梅纳尔, A·梅赛尼尔, A·潘乔德 申请人:雀巢产品技术援助有限公司