专利名称：由乳蛋白制备蛋白水解物的方法
技术领域：
本发明涉及利用真菌蛋白酶由乳蛋白制备蛋白水解物的方法。更具体地，本发明提供了一种利用获自曲霉属(Aspergillus sp.)的真菌蛋白酶由酪蛋白制备蛋白水解物的方法。
背景技术：
酪蛋白为氨基酸组成很均衡的优良蛋白质。因此，酪蛋白的功能特性有限。酪蛋白约占乳蛋白的80％。酪蛋白为磷蛋白，其中磷以丝氨酸酯键共价结合于多肽链上并且酪蛋白由异质的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和其它少量蛋白质构成。在食品工业中，酪蛋白用于制备人造肉、葡萄酒和啤酒澄清剂及富含蛋白质的乳制品(Evans，E.W.乳蛋白在合成食品中的应用(Uses of milk proteins in formulated foods)食品蛋白质发展(Developments in Food Proteins)第一版，B.J.F.Hudson，应用科学出版社(Applied Science Publishers)，伦敦，131-169页)。其也用于饼干、点心和其它的食物制剂中以增加功能和营养特性。在食品中使用酪蛋白水解物。
可使用酸、碱或酶的方法打开肽键来降低蛋白质的分子大小。蛋白质的酸水解和碱水解由于必需氨基酸的破坏和消旋作用、产生毒性成分如赖-丙氨酸而导致营养价值降低。
酶解方法选择性地完成蛋白质的水解，并不引起组成蛋白质的氨基酸的结构变化。人们已很好地阐释了通过酶解方法产生的肽剖析图。通过酶水解的蛋白质比任何传统的酸/碱水解的蛋白质保持了更好的营养价值。熟知酪蛋白和乳清蛋白质极易形成苦味的水解物。几乎所有的开发问题，特别是酪蛋白水解过程都围绕着苦味问题进行。通过酶水解是获得和修饰蛋白质的通用工具。水解对于特定的蛋白酶-蛋白质体系是精确和独特的。水解程度决定了水解蛋白质的溶解性、功能和味道等特性。蛋白水解物可以成为提高终产物的功能特性和营养价值的很好的添加剂。在印度，可商购的大多数蛋白质水解物为酸性蛋白质水解物。酸性水解物的一些缺点为形成腐黑物、需要高温参与、形成褐色、高盐浓度、破坏一些必需氨基酸和产量低。在植物蛋白质的酸水解过程中，产生氯代醇，需将液体水解物在减压下蒸汽蒸馏从中除去氯代醇。
由于底物酪蛋白优良的营养价值，其为广泛用于制备水解物的蛋白质。传统上酪蛋白水解物用于食疗食物。酪蛋白水解物用于婴儿制剂和特殊的营养制剂中。
可以参考以下公开文献，名称通过酶修饰提高食物蛋白质的功能(enhancing the functionality of food proteins by enzymatic modification)，Panyan，D.和Kilara，A.Trends Food Sci.Tech.，7(4)，120-125，其中，酶水解影响蛋白质的乳化能力和疏水性。本方法的缺点是没有明确的水解程度。
可以参考以下公开文献，名称苦味减少的蛋白质食用性酶水解物(dietary enzymic hydrolysates of protein with reduced bitterness)Clegg，K.M.和McMillan，A.D.(1974)J.Food Tech.9(1)，21-29，其中，将蛋清和酪蛋白作为蛋白质底物进行研究并用木瓜蛋白酶处理，选择性地用氯仿处理后用内肽酶处理，并且以猪肾组织作为内肽酶的来源。所述水解物相对来说没有苦味并且获得了连续的小肽和超过50％的游离氨基酸。本方法的缺点是产量低(60.6-86.5％)。而且，本方法包括多个步骤，双酶体系和使用动物来源的蛋白酶。
可以参考以下公开文献，名称酶解酪蛋白水解物的苦味去除和营养增值(debittering and nutritional upgrading of enzymic caseinhydrolysates)Cogan，V.，Moshe，M.，Mokady，S.(1981)J.Sci.Food.Agric.32(5)，459-466，其中，利用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶消化获得的酪蛋白水解物主要根据Clegg和McMillan(1974)的方法进行。首先，在40℃利用木瓜蛋白酶处理酪蛋白溶液(pH7.2)，酶浓度为4.0％，并加入0.2％甲苯以防止微生物生长。在培养18个小时结束时，利用盐酸将pH调整为3.0，继续在37℃用0.5％胃蛋白酶进一步处理22小时。
在以下的pH(以1M NaOH调整)和温度条件下，用Rhozyme酶以特定的酶浓度进行处理50℃，pH8.5，Rhozyme P-11和Rhozyme 41浓缩物；60℃，pH7.5，Rhozyme P-53浓缩物；60℃，pH8.3，Rhozyme 62浓缩物。
除了消化的样品以10％三氯乙酸溶液稀释21倍外，按照以前描述的方法测定蛋白水解消化的程度。通过将含有298mg酪蛋白和6mg蛋白酶的100ml溶液温育(37℃)15小时彻底完成了酶解消化。在温育结束阶段，溶液为澄清的，采用合适的蛋白质和酶空白在280nm估算其吸收值。
通过用“0.5g活性碳/g水解物”进行处理，可以进一步减少苦味。本方法的缺点是该方法包括多个步骤，顺次并连续的多种酶和为了得到水解物使用多种溶剂，最终导致该方法成本升高。在生产酪蛋白水解物的过程中，还要额外加入活性碳以减少苦味。
可以参考以下公开文献，名称利用formel-in-place膜反应器生产的酪蛋白水解物(Casein hydrolysate produced using a formel-in-placemembrance reactor)Chland，W.D.，Cordle，C.T.，Thomas，R.L.J.Food.Sci.60，1349-1352，1995。报告的水解程度为4-51％之间。水解时间在18-66小时变化。本方法的缺点是其水解过程时间长。
可以参考以下公开文献，名称在千克级水平制备酪蛋白的酶水解物(production of an enzymic hydrolysate of casein on a kilogram scale)Clegg，K.M.，Smith，G.和Walker，A.L.，1974 J，Food Tech.，9(4)，425-431，1974，其中，描述了水解酪蛋白的实验室方法。将商购的12kg酪蛋白悬浮于pH6.2的220升水中，并且用木瓜蛋白酶于40℃消化8小时。然后，用猪肾组织匀浆在pH7.8-8.0处理24小时，以氯仿代替甲苯作为防腐剂。将水解物通过拉塞尔分离器(Russell separator)以除去不溶性物质，再于83-88℃巴氏灭菌3-5分钟。将产品喷雾干燥。整个过程60小时完成。细菌计数也是令人满意的。本方法的缺点是水解过程太长。而且，使用的酶不同，水解是多步骤的，因此成本升高且浪费时间。
可以参考英国专利1595499(专利权人VEB Berlin-Chemie，1981)，其中，通过与稀硫酸一起煮沸来水解酪蛋白并且将其喷雾干燥。在200ml甲醇中将粉末(100g)回流加热10分钟并滤去不溶物，用50ml甲醇洗涤2次并干燥，产生80g水解物，其为具有所有氨基酸、无色、无气味、无味道的粉末。本发明的缺点是其使用无机酸，其可能引起氨基酸的消旋作用并产生毒性成分。
可以参考日本专利5134465，Morinaga乳制品工业有限公司(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.，)(1976)，其中，描述了含有酪蛋白的酶降解成分的浓缩液体的制备方法。该方法的缺点是最终产物是液体形式，处理困难。
可以参考美国专利5405 637，Martinez，S.B.，Leary，H.L.J.，Nichols，D.J.(1995)，其中，描述了一种通过酶水解制备的乳蛋白水解物和由所述水解物制备的婴儿制剂。水解物具有降低的抗原性并且由乳清蛋白质和酪蛋白的混合物制备。水解程度在4％至10％之间。该方法的缺点是水解程度低。
可以参考欧洲专利0321603A1，Jost，R.，Meister，N.和Monti，J.C.(1989)其中，通过以下方法制备低变应原性的乳清蛋白质水解物将最初的蛋白水解物在80-100℃，pH6-8下热处理3至10分钟；冷却至40-60℃；进行第二次酶水解(采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、或胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶/胰酶制剂的混合物)。然后，将蛋白水解酶加热至75-85℃灭活。低变应原性的蛋白水解物可以加入饮食制剂中、婴儿食品中等。本方法的缺点是使用非常高的温度和来源于动物的蛋白水解酶。
可以参考美国专利4293571，Olofsson，M.，Buhler，M.，Wood，R.(1981)，其中描述了一种制备精制蛋白水解物的方法，该方法的一个典型的例子为将干蛋清的水溶液于115℃通过蒸气喷射灭菌10-30秒；冷却至55℃后，用氢氧化钙(Ca(OH)2)将pH调至7.2并加入8％胰酶制剂；于50-55℃，使水解进行5小时。然后，用磷酸(H3PO4)将pH调至6.7，再进行热处理，例如，98℃，30分钟以使蛋白变性，接着采用超滤(作用)将变性的蛋白从热处理的水解物中除去，剩下构成精制蛋白水解物的滤过物。水解物适于婴儿食品、食疗食品和康复食品。本方法的缺点是使用非常高的温度和来源于动物的蛋白水解酶。
可以参考瑞士专利570121，Mueller，H.，其中描述了一种由乳蛋白制备浅色的含量高的谷氨酸盐调味品水解物的方法。对于该方法，含有约4.5％平均乳糖含量的乳清与具有高的谷氨酸含量的酵母菌株于有氧条件下发酵。浓缩后，发酵产物用盐酸(HCl)水解，然后可以进行干燥，采用常用方法将水解物中和、过滤和可选择地浓缩。通过超滤浓缩发酵液使乳球蛋白和乳清蛋白保留在浓缩物中，其使水解后产量增加了15-25％。如果在发酵前进行超滤，在水解前将保留的乳清蛋白质加至事先浓缩的酵母中。浅色的水解产物没有酵母的味道。本方法的缺点是所述的有机体和酶的种类。发酵也不同。
可以参考美国专利3778514，Olson，F.C.，(1973)，其中描述了一种乳清蛋白质和胶原蛋白水解物的营养性产物，所述方法的说明书覆盖了乳清浓缩物和胶原蛋白水解物(为获自脂肪的蒸汽炼油后的油罐浮水废物)的多种混合物。在一个实施例中，通过将9份减少了乳糖的乳清浓缩物(40％固体)与1份胶原水解物(40％固体)混合而获得人造奶制品。该产品含有33.6％蛋白质、42.0％乳糖、19.1％矿物和4.2％水分并且其氨基酸剖析图处于豆奶和酪蛋白的氨基酸剖析图之间。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种利用真菌蛋白酶由乳蛋白制备蛋白水解物的方法。
本发明的另一个目的是提供利用获自曲霉属的真菌蛋白酶由乳清/酪蛋白制备蛋白水解物的方法。
本发明的另一目的是提供一种在40±5℃温度下，水解程度高的蛋白水解物。
本发明进一步的目的是提供一种制备在大范围pH(即pH2-11)可溶的蛋白水解物的方法。
因此，本发明提供了一种由乳制备蛋白水解物的方法，该方法包括在pH7.5-8.5，40±5℃温度下，利用真菌蛋白酶处理乳蛋白30分钟至2小时；在65-70℃加热至少3分钟，利用已知方法分离澄清的上清液并将澄清的液体干燥，由此获得蛋白水解物。
因此，本发明提供一种由乳蛋白制备蛋白水解物的方法，该方法包括在pH7.5-8.5，40±5℃温度下，利用真菌蛋白酶处理乳蛋白30分钟至2小时；在65-70℃加热至少3分钟，利用已知方法分离澄清的上清液并且将澄清的液体干燥，由此获得蛋白水解物。
在本发明的一个实施方式中，所述的真菌蛋白酶获自曲霉属。
在本发明的另一个实施方式中，曲霉属真菌选自黄曲霉(A.flavus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)。
在本发明的另一个实施方式中，乳蛋白选自乳清和酪蛋白。
在本发明的另一个实施方式中，为使真菌蛋白酶的活性最大，将pH值保持在7.6至8.0之间。
在本发明的进一步实施方式中，蛋白质的水解过程中工作温度为40-45℃。
在本发明的进一步实施方式中，水解过程进行1.5至2小时。
在本发明的一个实施方式中，通过冷冻干燥、喷雾干燥和转鼓式干燥进行干燥。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物具有0.4-0.5％的可感觉到的阈值苦味。
在本发明的另一个实施方式中，由使用的原料获得了具有50％水解程度的高产量的蛋白水解物。
在本发明的另一个实施方式中，获得的蛋白水解物为乳白色。
在本发明的另一个实施方式中，获得了95％的蛋白水解物。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物含有11.5-12.5％的氮和4.5-5％的灰分。
在本发明的一个实施方式中，蛋白水解物在所有的pH范围内溶于水。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物的氨基酸组成与起始原料的氨基酸组成相似。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物保留了起始原料的所有营养价值。
在本发明的进一步实施方式中，通过将pH和温度同时调节至蛋白酶酶体系对热破坏最敏感的点并将浆液置于65-70℃高温下3-5分钟，由此破坏酶活性和终止水解过程。
本发明还提供一种乳白色的蛋白水解物。
在本发明的一个实施方式中，获得了95％的蛋白水解物。
在本发明的另一实施方式中，蛋白水解物含有11.5-12.5％的氮和4.5-5％的灰分。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物具有0.4-0.5％的可感觉到的阈值苦味。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物在所有的pH范围内溶于水。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物的氨基酸组成与起始原料的氨基酸组成相似。
在本发明的另一个实施方式中，蛋白水解物保留了起始原料的所有营养价值。
在本发明的一个实施方式中，获得了具有50％水解程度的蛋白水解物。
具体实施例方式
本发明包括以下过程步骤酪蛋白酪蛋白为含有0.7-0.9％磷的磷蛋白，其中磷以丝氨酸酯键共价连接于多酚链上。该结构中还含有钙和柠檬酸盐。利用酸，例如，HCl、硫酸或乳酸，使乳沉淀获得酸性酪蛋白。由于凝乳酶的作用获得甜酪蛋白。通过利用蛋白水解酶/和酸处理乳蛋白获得低粘性的酪蛋白。与产生的酪蛋白种类无关，在生产酪蛋白中的基本操作是相同的。这些操作包括凝乳的沉淀，其洗涤、压榨和干燥。在许多国家，大量的酪蛋白是通过酸解过程获得的。用于蛋白水解物的酪蛋白必须是可食用的且细菌学纯的。
酶使用的酶为真菌蛋白酶，酶活性为30,000单位/克。
水解程度的检测三硝基苯磺酸(TNBS)方法是一种测定食物蛋白水解物的水解程度的准确、可重复的且常用的方法。蛋白水解物溶解于/分散于热的1％十二烷基磺酸钠中至浓度为0.25-2.5×10-3氨基当量/L。将溶液样品(0.25ml)与2ml的0.2125 M磷酸钠缓冲液(pH8.2)和2ml 0.1％三硝基苯磺酸混合，然后，于50℃黑暗中温育60分钟。通过加入4ml 0.100 N HCl终止反应。于340nm读取吸光度值，使用1.5mM L-亮氨酸溶液作为标准。通过每一种特定的蛋白质底物的标准曲线将检测的亮氨酸氨基当量转化为水解程度(参见Jens Adler-Nissen，J.Agr.Food Chem.卷27，No.6，1979)。
将酪蛋白分散于含有合适溶剂的水中至溶质率并用15N氢氧化钠将分散体的pH调至7.6-8.0。使用机械搅拌器将其持续搅拌几分钟，然后，将温度升至40-45℃。在本阶段，加入以原料的蛋白质含量为基准的1％真菌蛋白酶并继续搅拌1.5-2小时。在上述时间段结束时，将浆液温度升高至65-70℃保持3-5分钟。然后将浆液冷却至室温并利用离心将分散体中的不溶物质除去。将澄清的蛋白水解物喷雾干燥以获得蛋白水解物。
以阐释本发明的方式提供以下实施例，因此，其不能解释为对本发明范围的限制。
实施例1将200g酪蛋白分散于2L水中并用15％氢氧化钠(NaOH)将分散体的pH调至7.8，同时将浆液保持在40℃。向浆液中加入溶解于水中的真菌蛋白酶。1.5小时后，将浆液的温度升高至65℃保持3分钟，然后将其冷却和离心。将澄清的上清液喷雾干燥。产物的水解程度为45％，产量为90％。
实施例2
将1kg酪蛋白分散于10L水中并用15％NaOH将pH调至7.8，同时将浆液保持在40℃。向浆液中加入溶解于水中的真菌蛋白酶。2小时后，将浆液的温度升高至65℃保持3分钟，然后将其冷却和离心。将澄清的上清液喷雾干燥。产物的水解程度为45％，产量为95％。
实施例3将5kg酪蛋白分散于50L水中并用15％NaOH将pH调至7.8-8.0，同时将浆液保持在45℃。向浆液中加入溶解于水中的真菌蛋白酶。2小时后，将浆液的温度升高至70℃保持5分钟，然后将其冷却和离心。将澄清的上清液喷雾干燥。产物的水解程度为50％，产量为93％。
实施例4将5kg酪蛋白分散于50L水中并用15％NaOH将分散体的pH调至8.0，同时将浆液保持在45℃。向浆液中加入溶解于水中的真菌蛋白酶。2小时后，将浆液的温度升高至70℃保持5分钟，然后冷却和离心。将澄清的上清液喷雾干燥。
产物的水解程度为50％，产量为95％。获得的酪蛋白水解物为乳白色，具有奶味，产量为90％(基于蛋白质)。产物含有11.5-12.5％的氮，4.5-5％的灰分含量，水解程度为45-50％。产物在所有的pH范围内高度溶于水。蛋白水解物具有0.4-0.5％的可感觉到的阈值苦味。其保留了起始原料的所有营养价值。
本发明的主要优点1、水与蛋白质的比率相对低，并且只有一步pH调节，盐含量最少。
2、使用的真菌来源的真菌蛋白酶可商购，并且蛋白酶水解时间非常短。
3、使用一种酶并在短时间内获得高的水解程度(45-50％)。
4、产量非常高为90-95％，并且具有11.5-12.5％的较高的氮含量。
5、由于水解过程在1.5-2小时完成，没有必要加入抗菌剂来防止微生物的生长。
6、以必需氨基酸的最小损失保持了起始原料的营养价值。
权利要求
1.一种由乳蛋白制备蛋白水解物的方法，所述方法包括在pH7.5-8.5，40±5℃温度下，利用真菌蛋白酶处理乳蛋白30分钟至2小时；在65-70℃加热至少3分钟，利用已知方法分离澄清的上清液并将澄清的液体干燥，由此获得蛋白水解物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的真菌蛋白酶获自曲霉属。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的曲霉属真菌选自黄曲霉、日本曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的乳蛋白选自乳清和酪蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其中为使真菌蛋白酶的活性最大，将pH值保持在7.6-8.0之间。
6.如权利要求1所述的方法，其中蛋白质的水解过程中工作温度为40-45℃。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的水解过程进行1.5至2小时。
8.如权利要求1所述的方法，其中通过冷冻干燥、喷雾干燥和转鼓式干燥进行所述的干燥。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白水解物具有0.4-0.5％的可感觉到的阈值苦味。
10.如权利要求1所述的方法，其中从使用的原料获得45-50％水解程度的高产量的蛋白水解物。
11.如权利要求1所述的方法，其中获得的所述蛋白水解物为乳白色。
12.如权利要求1所述的方法，其中获得了95％的蛋白水解物。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白水解物含有11.5-12.5％的氮，4.5-5％的灰分。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白水解物在所有的pH范围内溶于水。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白水解物的氨基酸组成与起始原料的氨基酸组成相似。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白水解物保留了起始原料的所有营养价值。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述的水解过程通过同时调节pH和温度并将浆液置于65-70℃高温下3-5分钟终止，由此破坏酶活性和终止水解过程。
18.如权利要求1所述方法制备的蛋白水解物，该蛋白水解物为乳白色。
19.一种获自乳蛋白的蛋白水解物，该蛋白水解物含有11.5-12.5％的氮，4.5-5％的灰分，0.4-0.5％的可感觉到的阈值苦味和50％的水解程度。
20.一种获自如权利要求1所述方法的蛋白水解物。
全文摘要
本发明提供了一种由乳蛋白制备蛋白水解物的方法，所述方法为在pH7.5－8.5，40±5℃温度下，利用真菌蛋白酶处理乳蛋白30分钟至2小时；在65－70℃加热至少3分钟，利用已知方法分离澄清的上清液并将澄清的液体干燥，由此获得蛋白水解物。
文档编号A23J3/10GK1494384SQ01823108
公开日2004年5月5日 申请日期2001年3月5日 优先权日2001年3月5日
发明者巴格亚·斯瓦米林伽帕, 约翰伊·约瑟夫, 孔萨亚·尚卡拉·默斯, 维什韦舍瓦瑞阿·普拉卡什, 梅索·彻鲁瓦拉亚·沙马萨卡·萨斯特, 特如马库达鲁·奇卡拉伽·辛徒·坎亚, 尚卡拉 默斯, 约瑟夫, 巴格亚 斯瓦米林伽帕, 库达鲁 奇卡拉伽 辛徒 坎亚, 彻鲁瓦拉亚 沙马萨卡 萨斯特, 舍瓦瑞阿 普拉卡什 申请人:科学和工业研究委员会