专利名称：复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方法及所得蛋白胨的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种蛋白胨及其制备方法，具体是指一种复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方法及所得蛋白胨。本发明进一步还涉及该蛋白胨作为氮源在制备培养乳酸菌的培养基中的应用以及所述的培养乳酸菌的培养基。
背景技术：
蛋白胨作为培养基的主要成分之一，正广泛应用于食品、医药、微生物培养、生物发酵等很多领域。一种好的蛋白胨产品不仅价格要低廉，营养价值也要很高。目前，生产蛋白胨的主要原料多为大豆、及动物产品生产加工过程中的边角料,如骨头、血液、内脏等，由 于原材料及生产工艺的不同，蛋白胨产品的内在质量各异，营养价值也有所区别。目前，生产蛋白胨常用的工艺方法有酸水解法、碱水解法和蛋白酶水解法。酸、碱水解工艺生产蛋白胨过程中虽然得率较高，但水解时严重破坏了产品中的氨基酸，使蛋白胨产品的营养价值降低，另外该方法生产过程中还会带入大量盐分，必要时还要做脱盐处理。相比之下，酶法生产蛋白胨的工艺条件较为缓和，生产过程中不会造成氨基酸的破坏，同时在生产过程中还会产生一定量的多肽，所以酶法制得的蛋白胨产品营养价值更高。CN1418562A和CN1393148A公开了两种以大豆为原料生产蛋白胨的工艺方法，两种方法制得的试剂级蛋白胨的得率最高只有30%，且两种方法并没有对大豆原料的水解程度进行详细描述。CN101548709A和CN101538601A分别公布了以动物血液和骨头为原料生产蛋白胨
的生产工艺，两种工艺的蛋白胨得率最高为15%左右，且加工过程中需要高温高压蒸煮，工艺较为复杂。US6372452B1公布了一种复合酶水解和膜滤分离技术生产蛋白胨类产品的工艺，但此工艺所用的原料为葵花籽、油菜籽和葡萄废料等植物性原料，且所得蛋白胨产品主要应用于临床治疗中使用的保健品。US6787168BI公布了一种利用酶解技术水解乳清浓缩蛋白(WPC)为生产蛋白胨的工艺，此工艺的主要目的是为了水解乳清蛋白中的过敏性蛋白，产品主要作为乳制品生产中的配料进行使用。中国专利申请201110325755. 5提供了一种利用复合酶技术水解乳清蛋白制备蛋白胨的工艺，该工艺使用碱性蛋白酶与风味蛋白酶同时添加的工艺进行水解，蛋白胨得率在50%左右，且所制得的蛋白胨只是作为一般的微生物氮源替代产品。
发明内容
本发明主要是基于现有技术中蛋白胨及其制备方法的状况，研发一种新的制备蛋白胨的方法，采用特定的复合酶水解乳清蛋白技术，提高所制得的蛋白胨的得率，且制得营养价值高的蛋白胨，其可替代常规培养培养基MRS中的酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一氮源用于乳酸菌的培养，利于乳酸菌生长。因此，本发明的一个目的在于提供一种复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方法。
本发明的另一目的在于提供一种按照所述方法制备得到的蛋白胨。本发明的另一目的在于提供所述蛋白胨作为氮源在制备培养乳酸菌的培养基中的应用。本发明的另一目的在于提供含有所述蛋白胨的培养乳酸菌的培养基。为达上述目的，一方面，本发明提供了一种复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方·法，该方法包括如下步骤(I)配制乳清蛋白水溶液，并进行热处理使蛋白变性；(2)向蛋白变性后的乳清蛋白水溶液中加入蛋白酶进行水解，其中是先加入胰蛋白酶水解至水解度达到40 50%，再加入风味蛋白酶共同水解至水解度达到70%以上，终止水解；其中优选加入风味蛋白酶共同水解至水解度达到70 80% ；(3)终止水解后的溶液经超滤膜超滤，浓缩，干燥，得到所述蛋白胨。本发明中所用乳清蛋白可以是通过本领域已知的方法生产得到的乳清蛋白，如乳清分离蛋白(WPI)或乳清浓缩蛋白(WPC)等。在本发明的制备蛋白胨的方法中，采用了胰蛋白酶(Trypsin Enzyme)先行水解、而后与风味蛋白酶(Flavourzyme)共同作用水解乳清蛋白的方法,按本发明的该水解方法生产的蛋白胨得率比同时加入胰蛋白酶和风味蛋白酶进行水解更高，可以达到70%以上，且蛋白胨营养价值也更高，可以替代MRS培养基中的酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一的氮源对乳酸菌进行培养。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，优选控制步骤(I)配制的乳清蛋白水溶液中乳清蛋白重量浓度为2% 10% (w/w，按总固形物的含量计算，除特别标注和说明外，本发明中所述含量与比例均为重量含量与比例)，更优选为5% 8%。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，优选控制步骤(I)配制的乳清蛋白水溶液中脂肪含量小于O. 1%，更优选在O. 09%以下。所配制的乳清蛋白水溶液可视需要进行适当的离心脱脂以使其中脂肪含量满足该浓度限定。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，乳清蛋白水溶液的蛋白变性处理可以采用所属领域任何已经的热处理方法，本发明中优选是将乳清蛋白水溶液在60°C 90°C下保温5 20min而使蛋白变性。根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述胰蛋白酶与风味蛋白酶均可商购获得，各酶制剂符合相关行业标准要求即可。例如，诺维信(中国)有限公司的PTN和i I uuurzyme 。通常在确定所用酶制剂后,适合酶水解的pH值范围及温度即可获知。本发明的方法优选根据需要还包括在向蛋白变性后的乳清蛋白水溶液中加入蛋白酶进行水解前，将蛋白变性后的乳清蛋白水溶液的PH值调节至7. O 9. O的过程。调节pH值的调节剂可以采用所属领域中常用的调节剂，如NaOH溶液等。具体的酶制剂的用量及水解温度、水解时间可以根据本发明中对水解度的要求进行适当确定及调整。在本发明的优选方案中，以乳清蛋白水溶液中乳清蛋白的含量为基准，控制步骤(2)中胰蛋白酶用量为乳清蛋白重量的O. 5% 2%，风味蛋白酶用量为乳清蛋白重量的2% 5% ;更优选地，控制胰蛋白酶和风味蛋白酶的总用量为乳清蛋白重量的3% 6%，且胰蛋白酶与风味蛋白酶的重量比为O. 2 I O. 5 I。更具体地，加入胰蛋白酶水解条件为45°C 55°C水解O. 5 1. 5小时，加入风味蛋白酶共同水解条件为45°C 55°C水解2. 5 3. 5小时。在这些优选的方案中，能够获得更高的蛋白胨得率。根据本发明的优选具体实施方案，本发明的方法中，控制加入胰蛋白酶水解至水解度在45 %左右时加入风味蛋白酶共同水解，共同水解至水解度达到70 %以上时灭活终止水解。本发明中，所述水解度的测定按照所属领域的常规操作进行。灭活终止水解的方式也可采用所属领域的常规操作，本发明中优选是在水解度达到要求后将水解溶液在85°C 95°C维持5 15min、优选85°C 95°C维持5 IOmin以灭活酶而终止水解。根据本发明的优选具体实施方案，本发明的方法中，步骤(3)中所述超滤条件为超滤膜分子量孔径5000 lOOOODa，进膜工作压力O. 2 O. 5MPa，出膜工作压力O. 05 O. 20MPa。此外，所述超滤膜的工作温度可以为30°C 50°C。超滤后的水解液可根据需求进一步浓缩干燥以制备得到干 粉形式的蛋白胨。所述的浓缩干燥可以参考现有技术中任何可行的浓缩操作，例如反渗透膜浓缩处理、冷冻干燥等。通常先浓缩至固形物含量在37% 42%范围之间，再进行冷冻干燥，所得冻干粉即为苯发明的蛋白胨产品。通过采用本发明的水解方法，所获得的蛋白胨得率高，可达70%以上，且寡肽含量
高，营养价值高。另一方面，本发明还提供了一种蛋白胨，该蛋白胨是按照本发明所述的方法制备得到的。根据的具体实施方案，本发明的蛋白胨中，分子量为180 IOOODa的寡肽含量为95%以上(以蛋白胨的总固形物含量为基准)，分子量小于ISODa的游离氨基酸含量小于5%,脂肪含量小于1%。另一方面，本发明还提供了所述蛋白胨在制备培养乳酸菌的培养基中的应用。本发明的蛋白胨可替代常规培养基MRS中的酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一氮源用于乳酸菌的培养，且培养效果要优于传统的MRS培养基，说明本发明的蛋白胨产品利于乳酸菌的快速生长繁殖，营养价值较高。另一方面，本发明还提供了一种能用于培养乳酸菌的培养基，其中含有本发明的蛋白胨。根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白胨在培养基中的含量通常为O. 5
5.0g/100ml (液态培养基)或0. 5 5. 0g/100g (固态培养基)，具体用量所属领域的技术人员可根据需要进行适当调整。本发明的培养中的其他组分可以参照现有技术培养基中除氮源外的其他组分，例如可以参照传统的MRS培养基中除酪胨(酪蛋白)、牛肉粉(牛肉膏)、酵母粉(酵母膏)等以外的其他组分。相关实验证明，本发明的含有所述蛋白胨的培养基，与传统的MRS培养基相比,培养效果要好。本发明中，各数据的测量均是按照所属领域的常规方法，例如，蛋白肽分子量分布采用高效凝胶过滤色谱法测定。综上所述，本发明采用复合酶技术水解乳清蛋白技术制备得到了一种蛋白胨，按照本发明的工艺方法，蛋白胨得率在70%以上，且所得蛋白胨产品易溶于水，寡肽含量高，营养价值高，该蛋白胨可以替代MRS培养基中酪蛋白、酵母粉、牛肉膏等作为唯一的氮源用于乳酸菌的培养，且利于乳酸菌的快速生长繁殖。
图1为本发明所述蛋白胨制备方法的流程图。
具体实施例方式以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。下面各实施例中，所用胰蛋白酶和风味蛋白酶为购自诺维信(中国)有限公司的PTN和Flavourzymc^,其中风味蛋白酶是由米曲霉发酵并经过微滤、超滤真空冷冻干燥等工艺制备而成。实施例1参见图1流程，将乳清蛋白用水配制成5%的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/ min，55°C )，脱脂后的蛋白溶液脂肪含量O. 07%，将脱脂后的溶液在80°C热水浴中保温20分钟使蛋白变性，用lmol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂变性后的溶液的pH值调至8. O。然后将乳清蛋白溶液置于55°C水浴保温，向乳清蛋白溶液中加入约占原料乳清蛋白用量1.66%的胰蛋白酶，水解O. 5h至水解度约45%，然后加入约占原料乳清蛋白用量3. 33%的风味蛋白酶再共同水解约3h至水解度达到75%，在90°C的条件下水浴灭活10分钟终止水解，再利用超滤膜将此水解溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为8000Da，超滤膜的进膜工作压力为O. 5MPa，出膜工作压力为O. 05MPa，超滤膜的工作温度为40°C ;再将膜透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，之后冷冻干燥，制得本实施例的蛋白胨。经检测，本实施例的蛋白胨得率为76%，其中分子量180 IOOODa的寡肽含量为95%,分子量小于180Da的游尚氨基酸含量为3. 01 %,脂肪含量O. 7%。用该蛋白胨可以替代MRS培养基中酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一的氮源用于乳酸菌的培养，且培养效果要优于MRS培养基。实施例2将乳清蛋白用水配制成7%的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55°C )，脱脂后的蛋白溶液脂肪含量O. 06%，将脱脂后的溶液在85°C热水浴中保温15分钟使蛋白变性，用lmol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂变性后的溶液的pH值调至9. O。然后将乳清蛋白溶液置于50°C水浴保温，向乳清蛋白溶液中加入约占原料乳清蛋白用量O. 7%的胰蛋白酶，水解Ih至水解度约45%，然后加入约占原料乳清蛋白用量2.3%的风味蛋白酶再共同水解约2. 5h至水解度达到71 %，在85°C的条件下水浴灭活15分钟终止水解，再利用超滤膜将此水解溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为7000Da，超滤膜的进膜工作压力为O. 3MPa，出膜工作压力为O. 2MPa，超滤膜的工作温度为45°C;再将膜透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，之后冷冻干燥，制得本实施例的蛋白胨。经检测，本实施例的蛋白胨得率为70%，其中分子量180 IOOODa的寡肽含量为95%,分子量小于180Da的游尚氨基酸含量为2. 95%,脂肪含量O. 8%。用该蛋白胨可以替代MRS培养基中酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一的氮源用于乳酸菌的培养，且培养效果要优于MRS培养基。实施例3将乳清蛋白用水配制成2%的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55°C )，脱脂后的蛋白溶液脂肪含量O. 05%以下，将脱脂后的溶液在85°C热水浴中保温15分钟使蛋白变性，用lmol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂变性后的溶液的pH值调至7. O。然后将乳清蛋白溶液置于45°C水浴保温，向乳清蛋白溶液中加入约占原料乳清蛋白用量1. 0%的胰蛋白酶，水解1. 5h至水解度约45%，然后加入约占原料乳清蛋白用量2. 5%的风味蛋白酶再共同水解约3. 5h至水解度达到73%，在85°C的条件下水浴灭活10分钟终止水解，再利用超滤膜将此水解溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为lOOOODa，超滤膜的进膜工作压力为O. 3MPa，出膜工作压力为O. 2MPa，超滤膜的工作温度为50°C ;再将膜透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，之后冷冻干燥，制得本实施例的蛋白胨。经检测，本实施例的蛋白胨得率为72%，其中分子量180 IOOODa的寡肽含量为96%,分子量小于180Da的游尚氨基酸含量为3. 12%,脂肪含量0. 7%。用该蛋白胨可以替代MRS培养基中酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一的氮源用于乳酸菌的培养，且培养效果要优于MRS培养基。 实施例4将乳清蛋白用水配制成10%的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55°C )，脱脂后的蛋白溶液脂肪含量0. 08%以下，将脱脂后的溶液在80°C热水浴中保温20分钟使蛋白变性，用lmol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂变性后的溶液的pH值调至8.0。然后将乳清蛋白溶液置于50°C水浴保温，向乳清蛋白溶液中加入约占原料乳清蛋白用量1. 0%的胰蛋白酶，水解0. 5h至水解度约40 %，然后加入约占原料乳清蛋白用量5 %的风味蛋白酶再共同水解约2. 5h至水解度达到78%，在90°C的条件下水浴灭活10分钟终止水解，再利用超滤膜将此水解溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为8000Da，超滤膜的进膜工作压力为
0.5MPa，出膜工作压力为0. 05MPa，超滤膜的工作温度为40°C ;再将膜透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，之后冷冻干燥，制得本实施例的蛋白胨。经检测，本实施例的蛋白胨得率为75%，其中分子量180 IOOODa的寡肽含量为96%,分子量小于180Da的游尚氨基酸含量为2. 65%,脂肪含量0. 7%。用该蛋白胨可以替代MRS培养基中酪蛋白、酵母粉、牛肉膏作为唯一的氮源用于乳酸菌的培养，且培养效果要优于MRS培养基。对比例I将与实施例1相同来源的乳清蛋白加水配制成5%的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min,55°C )，脱脂后的蛋白溶液脂肪含量0. 07%，将脱脂后的溶液在80°C热水浴中保温20分钟使蛋白变性，用lmol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂变性后的溶液的pH值调至8.0。然后将乳清蛋白溶液置于55°C水浴保温，向乳清蛋白溶液中同时加入约占原料乳清蛋白用量1. 5%的胰蛋白酶以及占原料乳清蛋白用量1. 5%的风味蛋白酶，共同水解3. 5h，测定其水解度达到55%，在90°C的条件下水浴灭活10分钟终止水解,再利用超滤膜将此水解溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为8000Da，超滤膜的进膜工作压力为0. 5MPa，出膜工作压力为0. 05MPa，超滤膜的工作温度为40°C;再将膜透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，之后冷冻干燥，制得本对比例的蛋白胨。经检测，本对比例的蛋白胨得率为46%，其中分子量180 IOOODa的寡肽含量为80%，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为4. 44 %，其余物质基本为分子量1000 10000之间的多肽。对比例2
将与实施例1相同来源的乳清蛋白加水配制成2%的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min,55°C )，脱脂后的蛋白溶液脂肪含量O. 06%，将脱脂后的溶液在75°C热水浴中保温15分钟使蛋白变性，用lmol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂变性后的溶液的pH值调至9. O。然后将乳清蛋白溶液置于40°C水浴保温，向乳清蛋白溶液中加入约占原料乳清蛋白用量I %的胰蛋白酶水解O. 5小时至水解度达到40 %，再加入占原料乳清蛋白用量2. 5 %的风味蛋白酶，共同水解O. 5小时，测定其水解度达到50%，在85°C的条件下水浴灭活10分钟终止水解，再利用超滤膜将此水解溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为3000Da，超滤膜的进膜工作压力为O. 3MPa，出膜工作压力为O.1MPa，超滤膜的工作温度为30°C ;再将膜透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，之后冷冻干燥，制得本对比例的蛋白胨。经检测，本对比例的蛋白胨得率为39%，其中分子量180 IOOODa的寡肽含量为70%，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为5. 12 %，其余物质基本为分子量1000 10000的多肽。
蛋白胨培养基培养乳酸菌的考察实验本实验考察了利用本发明实施例1的蛋白胨配制的培养基与传统的MRS培养基培
养乳酸菌的效果对比。结果见下表
权利要求
1.一种复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方法，该方法包括如下步骤(1)配制乳清蛋白水溶液，并进行热处理使蛋白变性；(2)向蛋白变性后的乳清蛋白水溶液中加入蛋白酶进行水解，其中是先加入胰蛋白酶水解至水解度达到40 50%,再加入风味蛋白酶共同水解至水解度达到70%以上,终止水解；(3)终止水解后的溶液经超滤膜超滤，浓缩，干燥，得到所述蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，控制步骤(I)配制的乳清蛋白水溶液中乳清蛋白重量浓度为2% 10%，并控制该乳清蛋白水溶液中脂肪含量小于O. 1% ;该乳清蛋白水溶液是在60V 90°C下保温5 20min而使蛋白变性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，以乳清蛋白水溶液中乳清蛋白的含量为基准，控制步骤(2)中胰蛋白酶用量为乳清蛋白重量的0.5% 2%，风味蛋白酶用量为乳清蛋白重量的2% 5% ;优选地，控制胰蛋白酶和风味蛋白酶的总用量为乳清蛋白重量的3% 6%，且胰蛋白酶与风味蛋白酶的重量比为O. 2 :1 0.5 :1。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，步骤(2)中加入胰蛋白酶水解条件为45°C 55°C水解O. 5 1. 5小时，加入风味蛋白酶共同水解条件为45°C 55°C水解2. 5 3. 5小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中水解度达到要求后将水解溶液在 85°C 95°C维持5 15min以灭活酶而终止水解。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中所述超滤条件为超滤膜分子量孔径 5000 lOOOODa，进膜工作压力O. 2 O. 5MPa,出膜工作压力O. 05 O. 20MPa。
7.一种蛋白胨，该蛋白胨是按照权利要求1 6任意一项所述方法制备得到的。
8.根据权利要求7所述的蛋白胨，其中分子量为180 IOOODa的寡肽含量为95%以上，分子量小于ISODa的游离氨基酸含量小于5 %，脂肪含量小于I %。
9.权利要求7或8所述的蛋白胨作为氮源在制备培养乳酸菌的培养基中的应用。
10.一种能用于培养乳酸菌的培养基，其中含有权利要求7或8所述的蛋白胨。
全文摘要
本发明提供了一种复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方法及所得蛋白胨。所述的复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨的方法包括如下步骤配制乳清蛋白水溶液，并进行热处理使蛋白变性；向蛋白变性后的乳清蛋白水溶液中加入蛋白酶进行水解，其中是先加入胰蛋白酶水解至水解度达到40～50％，再加入风味蛋白酶共同水解至水解度达到70％以上，终止水解；终止水解后的溶液经超滤膜超滤，浓缩，干燥，得到所述蛋白胨。本发明中采用特定的复合酶水解乳清蛋白制备蛋白胨，所得蛋白胨得率高，寡肽含量高，营养价值高，可作为唯一氮源替代常规培养基MRS用于乳酸菌的培养。
文档编号C12P21/06GK103014109SQ20121053857
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者石丹, 刘彪 申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司