源于里氏木霉的转录调控因子及编码基因和应用的制作方法

专利名称：源于里氏木霉的转录调控因子及编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从真菌中分离的转录调控因子，尤其涉及一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的环境pH应答转录调控因子TrPacl及其cDNA序列,本发明还提供了涉及含有该PH调控因子cDNA序列的重组表达载体及重组宿主细胞，以及它们在调控里氏木霉生长发育和抗逆性中的应用，属于真菌的转录调控因子的分离和应用领域。
背景技术：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种广泛存在自然界的嗜温腐生真菌,最初在第二次世界大战期间从棉帆布中分离得到(Mandels et al.，1957)。里氏木霉是工业上重要的纤维素酶生产菌株，同时也是用于研究纤维素酶和半纤维素酶基因表达调控机制的模式菌株。里氏木霉具有较全的纤维素酶系，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(又称纤维二糖水解酶)以及β_葡萄糖苷酶。一直以来，各国科研学者对这些酶结构、生理生化功能等方而进行了较为全而系统的研究，但对于纤维素酶表达调控过程中的诸多起始生物学问题至今尚不明确，纤维素酶的调控过程中还存在哪些其他途径的参与，纤维素酶表达过程中的关键限制因素是什么等一些问题。近年来，里氏木霉分子生物学方而研究进展迅速，尤其是2008年公布了里氏木霉基因组序列，里氏木霉分子水平上的相关研究多集中在纤维素酶的诱导表达方而，尤其是基因转录调控方而的相关控制因子的研究。目前已经克隆和分析参与纤维素酶代谢途径的转录调控因子有ACE1, ACE2, XYRl, CREI, HAP2/3/5 复合体，XYLl 等(Ilmen et al.，1996 ；Aro et al. ,2001 ；Aro et al. , 2002 ；Mach~Aigner et al. ,2008 ；Stricker et al.，2006 ；Stricker et al. , 2008) 0但最近5年的研究中，发现很多其他代谢途径直接或间接参与到里氏木霉纤维素酶代谢的调控中，如光照信号GNA1，GNA3, PGLl对纤维素酶代谢的影响(Seibel et al. , 2009 ；Schmo11 et al. , 2009 ；Limonet al. ,2011)。说明纤维素酶的代谢调控远不止受到这些转录因子的调节，还受到其他代谢途径中的关键因子的调控。里氏木霉的生长过程中受到诸多环境因素的影响，这些外界的环境因素也或多或少的影响里氏木霉中纤维素酶的代谢。尤其是PH对微生物的生命活动有很大的影响，主要是使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷变化影响生物活性；弓I起细胞膜电荷变化改变微生物细胞吸收营养物质能力等等。除上述对生长发育的影响，环境PH也影响纤维素酶的表达。环境PH作为一个信号因子，通过环境pH感应信号转导途径的传递对纤维素酶的表达起到调控作用，PH感应信号转导途径的终端是环境pH应答转录调控因子，由其激活或抑制被PH信号所调控基因的表达与产物分泌。酸性条件更适合里氏木霉纤维素酶的产生，一般PH值范围为4-7。 综上所述，鉴定、克隆新的pH转录调控因子，不仅对里氏木霉中纤维素酶的调控机理研究有着非常重要的作用，而且还可以利用分子生物学的手段对这些关键因子进行改造，以提高里氏木霉的纤维素酶产率。到目前为止，并没有一株通过分子生物学手段改造的工程菌株用于大规模工业生产。因此，不断的发现和研究里氏木霉中新的参与纤维素酶调控的关键因子对于构建整个代谢网络有着非常重要的意义，同时也为通过分子生物学手段改造的工程菌株早日用于工业生产奠定了理论基础。

发明内容
鉴于上述状况，本发明目的之一在于提供一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离得到的转录调控因子TrPacl及其c DNA序列以及全基因序列。本发明的另一目的在于构建一种涉及包括所述转录调控因子TrPacl cDNA的重组表达载体及重组宿主细胞。本发明的目的之三是将含有该转录调控因子TrPacl或其cDNA应用于调控里氏木霉生长发育或提高里氏木霉的抗环境胁迫抗性。为实现上述目的,本发明一方而提供一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离得到的环境PH应答转录调控因子TrPacl cDNA序列，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(C)所示(a)、SEQ ID No. 2所示的多核苷酸；(b)、编码SEQ ID No. 3所示的氨基酸的多核苷酸；(c)、与SEQ ID NO. 2的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有转录调控因子的功能或活性。

优选的,本发明所述的从里氏木霉(Trichoderma reesei)中所克隆的pH应答转录调控因子TrPaclcDNA序列为SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列。本发明所述pH应答转录调控因子TrPaclcDNA序列包含完整的开放阅读框。本发明还提供了编码pH应答转录调控因子TrPacl的全基因序列，所述全基因的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明提供了上述环境pH应答转录调控因子TrPacl cDNA所编码的能够激活或抑制被PH信号所调控基因的环境pH应答转录因子，其氨基酸序列为(a)或(b)所示(a) SEQ ID No. 3 所示的氨基酸；(b)将SEQ ID No. 3所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 3所示转录调控因子功能或活性的蛋白变体。优选的，本发明所述的转录因子为SEQ ID No. 3所示的氨基酸。所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本发明进一步构建了一种涉及该pH调控因子TrPacl cDNA序列或全基因序列的重组表达载体及含有该重组表达载体或表达盒的重组宿主细胞或转化体。本发明将克隆得到的TrPacl cDNA或全基因可操作的与表达调控元件相连接，构建获得重组表达载体，将重组表达载体转化到里氏木霉中调控里氏木霉的生长发育或用以提高里氏木霉抗逆性。所述重组表达载体或表达盒包括启动子、TrPacl cDNA或全基因、终止子；其中，TrPacl cDNA序列或全基因位于启动子的下游，终止子在TrPacl cDNA序列的下游。为了确证本发明所分离的TrPacl cDNA或全基因是否具有转录因子功能或活性，本发明构建了 PH调控因子TrPaclcDNA敲除载体以及该敲除载体的互补载体。所述基因敲除载体或表达盒包括pH调控因子TrPacl cDNA的上游1000bp-2000bp长度序列，报告基因，pH调控因子TrPac I cDNA的下游1000bp-2000bp长度序列；其中，报告基因在pH调控因子TrPaclcDNA的上游序列的下游，pH调控因子TrPaclcDNA的下游序列在报告基因的下游。通过将该基因敲除载体转化至里氏木霉中得到重组转化体，即PH调控因子TrPacl基因功能缺失的突变体。本发明构建的TrPaclcDNA敲除载体包含pH调控因子TrPacl cDNA序列的上下游同源重组片段，完全避开TrPacl cDNA的开放阅读框，这样在利用重组质粒进行基因敲除时，TrPaclcDNA基因就能被报告基因完全敲除。通过将该敲除基因互补载体转化至里氏木霉中得到重组转化体即PH调控因子TrPacl基因功能缺失的互补体。TrPacl敲除突变体菌落形态试验结果表明，pH值为6和8时，菌落形态有明显差异，敲除了 TrPacl的突变体菌落较小，产孢量明显低于野生型和互补菌株；根据产孢量及萌发率的试验结果可见，敲除了 TrPacl的突变体菌株的产孢量为野生型和互补突变体的1/2，而萌发率并未有明显变化；敲出了 TrPacl的突变体菌株的产孢量为野生型和互补突变体的71. 8%。 根据TrPacl敲除突变体抗逆敏感性的测定试验结果可见，敲除了 TrPacl的突变体菌株随着培养时间的增加，其生长速度远低于野生型和突变体，说明由于TrPacl基因的缺失影响了菌株对H2O2的抗逆能力。上述试验结果证明，本发明从从里氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的TrPacl cDNA所编码的蛋白具有转录因子活性能够调控里氏木霉的生长发育以及提高里氏木霉的抗逆性。此外，本发明提供了利用上述TrPacl编码的蛋白质为目标，在NCBI数据库中搜索其他亲缘关系较近的丝状真菌中寻找同源蛋白，如镰刀菌(Fusarium oxysporum),小麦赤霉菌(Gibberella zeae)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)
坐寸ο 本发明所涉及到的术语定义。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes， " Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays. 1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度PH下的热熔点(Tm)约5-10°C。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、PH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50%的探针被占据)。严谨条件可为以下条件其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1. OM钠离子浓度，通常为约O. 01到1. OM钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30°C，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60°C。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下50%甲酰胺，5\33(和1% SDS，在42°C下培养；*5XSSC，1% SDS，在65°C下培养，在0. 2XSSC中洗涤和在65°C下于0. 1% SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。术语“基因敲除”意指在所属领域中外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，使机体特定的基因失活或缺失的技术从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。用于基因突变，也用于正确纠正机体的基因突变，及推测相应基因的功能，还包括引入新基因及引入定点突变。本发明中意指向PH应答转录调控因子TrPacl中插入外源抗性标记基因使pH应答转录调控因子TrPacl基因失活而代替该转录调控因子TrPacl基因，经基因敲除后，即获得含有抗性标记基因的敲除载体。术语“基因互补”意指本发明中恢复被敲除的转录调控因子TrPacl基因，且包括该基因上下游的启动子，终 止子区域，确保被恢复的TrPacl基因顺利表达。术语“转化子”或“重组宿主菌株”意指涉及本发明pH应答转录调控因子TrPacl或其编码的cDNA的重组质粒载体的受体细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生受体细胞，例如直接吸取、转导或所属领域中已知的其它方法。术语“转化”:将外源基因序列引入到宿主细胞或有机体的方法。术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ;0htsuka 等人,J. Biol.Chem. 260 :2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes8 :91-98(1994))。
术语“转录调控因子”能够识别并结合转录起始位点上游的调控序列的一类特定蛋白质因子。术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。术语“编码序列”:转录成RNA的核苷酸序列。


图1是源于里氏木霉环境pH应答转录调控因子TrPacl基因敲除载体构建示意图；图2是源于里氏木霉环境pH应答转录调控因子TrPacl基因互补载体示意图；图3是源于里氏木霉环境pH应答转录调控因子TrPacl基因敲除过程示意图；图4是源于里氏木霉环境pH应答转录调控因子TrPacl基因敲除杂交图；图5是野生里氏木霉菌株、敲除TrPacl基因突变菌株、敲除TrPacl基因突变菌株的互补菌株在不同PH值的平板上的菌落形态图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和 替换均落入本发明的保护范围内。实施例1 :里氏木霉中转录调控因子TrPacl全基因克隆1、TrPacl基因DNA序列的克隆从里氏木霉菌株QM9414(本发明人实验室保存)中提取基因组DNA作为模板，再根据里氏木霉基因组数据库中的信息设计引物，采用高保真PCR获得目的片段。(I)里氏木霉基因组DNA的提取将生长于PDA平板上的里氏木霉孢子用灭菌水清洗，清洗后用灭菌三层擦镜纸过滤，浓度稀释至IO6个/ml ;将Iml孢子悬液接种于含有80ml CM培养基的三角瓶中，28°C，ISOrpm培养24h。培养好的菌丝用灭菌三层擦镜纸过滤，并用蒸馏水清洗菌丝2_3次后收集，用吸水纸吸干，冻存于_20°C。直接提取里氏木霉基因组DNA将收集得到的菌丝用液氮研磨，2-3次；所得的菌丝粉末转移到1. 5ml离心管中，每管加入2%的CTAB 700 μ L ;将1. 5ml离心管上下颠倒混匀，65°C保温30min，每隔IOmin摇匀I次；再加入等体积氯仿异戊醇(24 1，V/V)，平板摇床上轻摇IOmin后，12000r/min离心IOmin ;取上清,加入等体积异丙醇,颠倒混勻后,室温放置IOmin, 12000r/min离心IOmin,倒掉上清，加70%的酒精500 μ L洗沉淀，室温干燥加入50 μ LTE dd H2O使DNA完全溶解，加入 RNase A(10mg/mL)，65°C保温 30min，最后 DNA 溶于 30 μ L ddH20 中。(2) TrPacl基因DNA序列的扩增引物序列如下TrPac IDNApl :5’ -CCGACAATGTCGGCCCAAGTCCCCG-3’
TrPac lDNAp2 :5’ -TCAGGTTCCAGGAACAGGAAGGAC-3’PCR反应条件为94°C 5分钟，(94°C 30秒，55 °C 2分钟，68°C I分30秒)共计35个循环，72 °C 10分钟。PCR反应体系为里氏木霉基因组DNA I μ l,Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各 O. 4 μ 1，Taq plus 缓冲液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水补足至 50 μ I。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，与pUCM-T载体连接，经大肠杆菌DH-5 α转化，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后送样测序，序列见SEQID No.1。实施例2 :里氏木霉中转录调控因子TrPacl基因cDNA序列的克隆1、里氏木霉总RNA的提取将生长于PDA平板上的里氏木霉孢子用灭菌水清洗，清洗后用灭菌三层擦镜纸过滤，浓度稀释至IO6个/ml ;将Iml孢子悬液接种于含有80ml CM培养基的三角瓶中，28°C，ISOrpm培养24h。培养好的菌丝用灭菌三层擦镜纸过滤，并用蒸馏水清洗菌丝2_3次后收集，用吸水纸吸干，将收集好的菌丝采用RNA提取试剂盒立即提取RNA或者先在液氮中冻存后置于_80°C冻存用于后续提取。RNA提取样品立即进行反转录，获得单链cDNA。反转录产物用作模板进行后续PCR扩增。引物序列如下

TrPaclcDNAp1:5，-ATGTCGGCCCAAGTCCCCGACC-3’TrPaccDNAp2 :5， -TCAGGTTCCAGGAACAGGAAGGAC-3，PCR反应条件为94°C 5分钟，(94°C 30秒，55 °C 2分钟，68 °C I分30秒)共计35个循环，72 °C 10分钟。PCR反应体系为里氏木霉cDNAly 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各O. 4 μ 1，Taq plus 缓冲液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水补足至 50 μ I。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，与pUCM-T载体连接，经大肠杆菌DH-5 α转化，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后送样测序，序列见SEQID No. 2。实施例3 =TrPacl基因敲除载体的构建采用三段式方法构建基因敲除载体，即分别将TrPacl基因的上游和下游1000bp-2000bp长度的序列插入到潮霉素抗性基因的两端。首先从里氏木霉基因组中分别扩增TrPacl基因的上下游片段，各片段长约lOOObp，先分别连接pGEM-T载体，上游采用KpnI和SalI限制性内切酶双酶切位点，下游采用HidIII和XbaI限制性内切酶双酶切位点，从T载体切下后，先将上游片段连到用同样酶切位点的pBS-Hyr上，然后再用HidIII和XbaI酶切上述载体，将T载体酶切后的下游片段连到该酶切位点处，即构建好基因敲除载体。引物序列如下Pacupl :5，-ATggtaccGGCCGTGTGACCGCTGGAGAGT-3，Pacup2 :5， -ATgtcgacCAGGCCTGGGATTGCGATGGAC-3，Pacdnl :5’ -AAaagcttGGCGTTTCCATTTTCTATCATTCT_3’Pacdn2 :5’ -AAtctagaCTCGGCCCTTCTGCTCCTCTCCAT_3’
引物序列中，小写字母表示酶切位点。PCR反应条件为94°C 5分钟，(94°C 30秒，55 °C I分钟，68 °C I分30秒)共计35个循环，72 °C 10分钟。PCR反应体系为里氏木霉基因组DNAl μ 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各 O. 4 μ 1，Taq plus 缓冲液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水补足至 50 μ I。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化与pGEM-T载体连接，经大肠杆菌DH-5a转化，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后提取质粒，用KpnI和SalI酶切。连接到同样酶切的pBS-Hyr上；采用同样的方法连接下游片段至上述载体上，即构建完成基因敲除载体pTrPacl-K0(图1)。实施例4 =TrPacl基因敲除载体的互补载体的构建采用高保真长片段PCR方法、以里氏木霉基因组DNA为模板扩增得到含有TrPacl基因全长、启动子区域和终止子区域的DNA片段，先将该片段插入到pGEM-T载体中，然后用限制性内切酶BamHI和SmaI限制性内切双酶切从pGEM_T载体上切下目的片段，插入到含有氯嘧磺隆抗性基因的载体pBS-SUR上，即构建好TrPacl基因的互补载体pTrPacl_HB。引物序列如下TrPaclHBpl :5，-ATggatccAGGCCGTGTGACCGCTGGAGAGT-3，TrPacIHBp2 :5， -TTcccgggTCTTCAACATAACACCCACCGCAA-3’弓丨物序列中，小写字母表示酶切位点。PCR 反应条件为94°C 5 分钟，(94°C 30 秒，55°C 3 分钟 50 秒，68°C I 分 30 秒)共计35个循环，72 0C 10分钟。`PCR反应体系为里氏木霉cDNAly 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各
O.4μ I, T aq plus 缓冲液 5 μ I，dNTP(25mM) I μ 1，其余用水补足至 50 μ I。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，与pGEM-T载体连接，经大肠杆菌DH-5 α转化，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后提取质粒，用BamHI和SmaI酶切，并连接到同样酶切的pBS-SUR上，重复转化步骤，验证正确，即构建好TrPacl基因的互补载体pTrPacl-HB(图2，图3)。实施例5 :里氏木霉原生质体制备将里氏木霉接于PDA平板上，于28°C培养3天左右后，用蒸馏水洗平板，收集孢子，调整浓度至IO6个/ml。按5%的接种量将上述浓度的孢子悬液接于IOOml CM培养基中，28°C，180rpm培养24小时。培养好的菌丝用3层纱布过滤，并用无菌水洗涤2_3次，压干水分。得到的菌丝置于50ml三角瓶中，用酶解液(崩溃酶，浓度为5mg/ml，每克菌丝5ml酶解液)30°C，80rpm酶解2_3h。取出酶解液，O. 7MNaCl洗涤，三层滤纸过滤，除去残渣，滤液收集到50ml的离心管中，并置于冰上。收集得到的滤液4°C，3000rpm，离心lOmin。沉淀用 10-20ml STC(1. 2M Sorbitol, IOmM Tris-HCl pH7. 5,20mM CaCl2)悬浮沉淀，用剪过的枪头轻轻的吹打。悬浮液4°C，3000rpm离心，IOmin并重复两次。所得到的原生质体沉淀用STC悬浮，调节其终浓度为IO8个/ml。实施例6 =TrPacl敲除突变体的获得和鉴定UTrPacl敲除突变体的获得将实施例5中制备的原生质体分装于50ml离心管中，每管150 μ I。每管中加入已线性化的 DNA2y 1，4°C放置 25min。缓慢加入 Iml PTC (60% PEG4000, IOmM Tris-HCl pH7. 5,20mM CaCl2),轻轻混匀，4°C放置25min。缓慢加入5ml OCM液体培养基(Liu et al.，2007)，轻轻摇匀，置于28°C，IOOrpm,摇过夜。过夜培养的原生质体，每管加入含有200 μ g/ml潮霉素的固体OCM培养基，混匀，倒平板。28°C黑暗培养3_4天后挑取转化子。初步筛选得到的转化子再次接于含有潮霉素的抗性平板上进行2次筛选。2、里氏木霉转化子的筛选和鉴定将具有潮霉素抗性的转化子挑出，CM培养基液体培养，获得的菌丝DNA，进行初步的PCR验证引物如下Paccheckl :5’ -GCGCCGCCAGATCGACCCTACC-3，Pac check2 :5， -GACGCCATGCTTGCCGCTGAGAC-3，PCR扩增条件如下 940C 2 分钟，(94°C 30 秒，55 V 30 秒，68°C I 分 30 秒)共计 25 个循环，72 °C 3分钟。选取没有扩增得到的目的条带的转化子挑出，再次CM液体培养，获得菌丝。获得的菌丝大量提取基因组DNA，纯化后酶切进行Southern杂交验证。实施例7 =TrPacl互补突变体的获得和鉴定将实施例2构建好的互补突变体通过实施例3中的原生质体转化方法转化到突变体中，挑取具有氯嘧磺隆抗性的转化子再次培养，获得大量菌丝并提取DNA，纯化酶切后进行Southern杂交验证(图4)，WT为野生型菌株，18，24为突变体菌株，18HB为突变体18的互补菌株。从图4中可以看出18，24为突变体菌株基因条带与WT为野生型菌株和互补菌株相比，大小有差异，，说明TrPacl基因被敲除。实施例8 =TrPacl敲除突变体菌落形态、产孢量、萌发率及生长速率的测定1、菌落形态的观察将野生型和突变体菌株分别接于不同pH值的PDA平板上，PDA培养基配方为每升培养基中土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g。PDA的pH采用HCl和NaOH调节至4，6，8。30°c培养3天后拍摄菌落形态(图5)。其中，18为突变体，18HB为互补菌株。从图5中可以看到，在pH为4时，各个菌株之间形态上无明显差异，pH值为6和8时，菌落形态有明显差异，突变体菌落较小，产孢量明显低于野生型和互补菌株。2、产孢量及萌发率在pH值为6和8的条件下，将培养3天的PDA平板用打孔器打3个孔，位置分别在靠近菌落中心，菌落中间位置和菌落边缘；将打好的菌块置于IOml离心管中，同时离心管里加入5个玻璃珠，每个管中加入5m I ddH20;漩涡振荡器上震荡5分钟后，用血球计数板计数(表I)。其中，WT为野生型菌株，18为突变体菌株，18HB为突变体18的互补菌株。将培养3天的PDA平板上的孢子用无菌水冲洗，并稀释到IO6个/ml ;将载玻片用无水乙醇冲洗并擦干，吸取10 μ I孢子悬液滴于载玻片上，保湿培养。每隔2小时取出，观察萌发情况(表1，表2)。其中，WT为野生型菌株，18为突变体菌株，18ΗΒ为突变体18的互补菌株。
表I不同菌株的产孢量及萌发率(pH = 6)
权利要求
1.一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离得到的转录调控因子TrPacl cDNA,其特征在于，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(C)所示 (a)、SEQID No. 2所示的多核苷酸； (b)、编码SEQID No. 3所示的氨基酸的多核苷酸； (c)、与SEQID NO. 2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有PH调控因子的功能或活性。
2.一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离得到的编码转录调控因子TrPacl的全基因，其特征在于其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
3.里氏木霉(Trichodermareesei)转录调控因子TrPacl,其特征在于,其氨基酸序列为(a)或(b)所示 (a)、SEQID No. 3所示的氨基酸； (b)jfSEQ ID No. 3所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 3所示转录调控因子功能或活性的蛋白变体。
4.含有权利要求1所述转录调控因子TrPaclcDNA的重组表达载体。
5.含有权利要求2所述全基因的重组表达载体。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包括启动子、权利要求1所述的转录调控因子TrPacl cDNA或权利要求2所述的全基因，终止子；其中，权利要求1所述的转录调控因子TrPacl cDNA或权利要求2所述的全基因在启动子的下游，终止子在TrPacl cDNA或全基因的下游。
7.用以敲除权利要求1所述的转录调控因子TrPaclcDNA或权利要求2所述全基因的基因敲除载体。
8.与权利要求6所述基因敲除载体相互补的互补载体。
9.含有权利要求4-6任何一项所述重组表达载体的重组宿主细胞。
10.权利要求1所述的转录调控因子TrPaclcDNA或权利要求2所述的全基因在调控里氏木霉的生长发育或提高里氏木霉抗逆性中的应用。
全文摘要
本发明公开了源于里氏木霉转录调控因子及编码基因和应用。本发明涉及一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的环境pH应答转录调控因子TrPac1全基因和cDNA序列，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。本发明还构建了包含有该pH转录调控因子TrPac1 cDNA序列的重组表达载体及重组宿主细胞，本发明进一步提供了pH转录调控因子TrPac1 cDNA在调控里氏木霉生长发育或抗逆性中的应用。
文档编号C12N15/80GK103060341SQ201210538579
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者赫荣琳, 马立娟, 张东远, 陈树林 申请人:天津工业生物技术研究所