专利名称：注射用曲克芦丁脑蛋白水解物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种注射用曲克芦丁脑蛋白水解物，是用于治疗脑血管及中枢神经系统疾病的复方制剂。
背景技术：
脑血管疾病主要有脑血栓、脑栓塞、腔障性梗塞、脑出血、脑动脉硬化等多种，这些疾病表现的症状有完全或不完全的失语、肢体瘫痪、痛觉或思维障碍、失眠、发呆、记忆减退、耳鸣、脑功能衰退等症状，这些症状给病人带来了极大的痛苦，现有治疗药物治愈率低，不能根治，只能缓解症状，疗效慢。
曲克芦丁的相关制剂已大量应用于临床，具有抑制红细胞和血小板聚集，防止血栓形成，增加血中氧饱和度，改善微循环等作用。同时曲克芦丁能对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管性损伤，增加毛细血管抵抗力，降低毛细血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水肿。适用于脑血栓形成和脑栓塞所致的偏瘫、失语以及心肌梗死前综合征、动脉硬化、中心性视网膜炎、血栓性静脉炎、静脉曲张、血管通透性升高引起的水肿等。单用本品对改善脑细胞生理功能和脑神经的保护无效。
脑蛋白水解物(Cerebroprotein Hydrolysate)是经分离纯化的不含蛋白质的小分子多肽，内含16种人体必需的游离氨基酸，其各种氨基酸之间保持了恒定的比例。具有优良的脑保护作用和脑神经营养作用，临床实践证明，脑蛋白水解物能有效地维护中枢神经系统免受有毒物质的侵害，可提高大脑的抗缺氧能力。临床上用于脑中风急性期、恢复期偏瘫、失语、痴呆、嗜睡、乏力、头昏等症状的辅助治疗。同时，本品还有降低血浆纤维蛋白原、血小板聚集率及升高高密度脂蛋自作用。使脑代谢增强，改善脑细胞的供血状态，使神经介质更好地发挥作用，对于老年痴呆症有明显的改善疗效。本品单用对改善脑梗塞、脑中风，脑动脉硬化无直接的作用，而是作为一种营养物质供及脑细胞、脑神经，从而改善脑功能代谢。
发明内容
本发明的目的是提供一种组方合理、制备工艺简单，用药安全的注射用曲克芦丁脑蛋白水解物及其制备工艺，以能弥补曲克芦丁和脑蛋白水解物各单体药物注射液在治疗效果上的不足。
本发明注射用曲克芦丁脑蛋白水解物由曲克芦丁和脑蛋白水解物组成，二者重量配比为曲克芦丁50～100∶脑蛋白水解物1～20，其中脑蛋白水解物含量按游离氨基酸总氮计(下同)，组合物的PH值5.5～7.5，性状为黄色至浅棕黄色无定型固体或粉末，溶解后成黄色澄清液体，所述原料按由下列重量的最佳适用配比配制是80∶1(曲克芦丁∶脑蛋白水解物总氮)本发明注射用曲克芦丁脑蛋白水解物的制备工艺如下将曲克芦丁和脑蛋白水解物原液按比例混合，加入适量注射用水至规定体积，按液体量0.07％加入注射级药用炭，常温下搅拌吸附30分钟，先经粗滤，测定合格后经0.22μm的微孔滤膜精滤，取滤液，分装，置冷冻干燥箱中(已预冻至-40C)，在该温度下保温2小时；开动捕水器开关、开动真空泵，在4Pa下，逐渐以每小时1℃提高温度。当到达室温度，继续抽真空3小时。冻干完毕，开启冻干机的升降机，将胶塞完全压入西林瓶中，然后通入无菌空气，开箱取出冻干好的产品扎盖即可。
本发明曲克芦丁和脑蛋白水解物既能有效地抑制血小板聚集，防止血栓的形成，又因富含多种游离氨基酸和小分子多肽，能透过血脑屏障以多种方式作用于中枢神经，直接向脑细胞提供神经营养因子，改善神经元代谢，诱导并促进神经细胞的修复与再生，同时诱导神经细胞形成新的轴突，从而形成新的神经连接。两药复方产生协同互补作用，具有离子通道门控效应，产生类钙拮抗剂药物治疗脑血管疾病的作用。同时，还能增强各种神经营养物质进入血脑屏障，改善脑神经组织的代谢功能。由于本品具有较强的抗氧化抗自由基作用，能迅速修复脑血管内壁内膜损伤，也有助于稳定保持脑血管完整性及代谢过程的完整性，对于各类脑血管疾病的治疗及康复意义重大。为临床对不同患者的用药、不同给药方式和联合用药提供方便。该复方制剂能治疗用于治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病，以及颅脑外伤所致的脑血管疾病以及所引起的脑功能障碍等后遗引起的水肿。
图1是家兔耳缘刺激性试验病理切片图。
图2是家兔股四头肌刺激性病理切片图。
具体实施例方式
实施例1 注射用曲克芦丁脑蛋白水解物的制备称取曲克芦丁80g、脑蛋白水解物原液200g(总氮以5.0mg/ml计)、注射用水700g，混合，加注射用水至1000ml，按液体量0.07％加入注射级药用炭，常温下搅拌吸附30分钟，先经粗滤，测定合格后经0.22μm的微孔滤膜精滤，分装入西林瓶中，置冷冻干燥箱中(已预冻至-40℃)，在该温度下保温2小时；开动捕水器开关、开动真空泵，在4Pa下，逐渐以每小时1℃提高温度。当到达室温度，继续抽真空3小时。冻干完毕，开启冻干机的升降机，将胶塞完全压入，然后通入无菌空气，开箱取出冻干好的产品扎盖即可。
实施例2 注射用曲克芦丁脑蛋白水解物的制备称取曲克芦丁200g、脑蛋白水解物原液500g(总氮以5.0mg/ml计)、注射用水700g，混合，加入适量注射用水至2300ml，按液体量0.07％加入注射级药用炭，常温下搅拌吸附30分钟，先经粗滤，测定合格后经0.22μm的微孔滤膜精滤，分装，置冷冻干燥箱中(已预冻至-40℃)，在该温度下保温3小时；开动捕水器开关、开动真空泵，在4Pa下，逐渐以每小时1℃提高温度。当到达室温度，继续抽真空3小时。冻干完毕，开启冻干机的升降机，将胶塞完全压入西林瓶中，然后通入无菌空气，开箱取出冻干好的产品扎盖即可。
实施例3 注射用曲克芦丁脑蛋白水解物的制备称取曲克芦丁400g、脑蛋白水解物原液1000g(总氮以5.0mg/ml计)、注射用水700g，混合，加注射用水至5000ml，按液体量0.07％加入注射级药用炭，常温下搅拌吸附30分钟，先经粗滤，测定合格后经0.22μm的微孔滤膜精滤，分装，置冷冻干燥箱中(已预冻至-40℃)，在该温度下保温3小时；开动捕水器开关、开动真空泵，在4Pa下，逐渐以每小时1℃提高温度。当到达室温度，继续抽真空3小时。冻干完毕，开启冻干机的升降机，将胶塞完全压入西林瓶中，然后通入无菌空气，开箱取出冻干好的产品扎盖即可。
实施例5 安全性试验该复方制剂进行了特殊安全性试验，为临床用药的安全性提供了科学而客观的依据。其试验方法和结果分别如下试验药物本发明注射用曲克芦丁脑蛋白水解物，黄色冻干粉末，规格80mg曲克芦丁与1.0mg总氮。由海南惠普森医药生物技术有限公司提供。
试验动物日本大耳白雌兔1只，体重2.3kg，一级，由海南省实验动物中心提供。动物合格证号医动字30-003号。豚鼠60只，体重230～300g，由湖北省实验动物研究中心提供并提供。许可证号SCXK(鄂)2003-2005。
一、溶血性试验(1)2％兔血细胞混悬液的制备取家兔心脏血15ml，用玻璃珠去除纤维蛋白，合成脱纤血液，移入刻度离心管内，加生理盐水，摇匀，离心，丢去上清液，用生理盐水直洗至上清液呈无色透明为止，然后用生理盐水将红细胞稀释成2％的混悬液。
(2)试验方法本发明曲克芦丁脑蛋白水解物，取试管7支，按表1加入各种液体，第6管不加入供试品溶液作空白对照管，第7管仍不加供试品溶液并用蒸馏水代替生理盐水，作为溶血的阳性对照。各管轻轻摇匀后送入37℃恒温水浴箱中孵育，分别于0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h观察一次，连续6次，如溶液澄明红色，管底无细胞残留为全溶血；溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留为部分溶血；如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不能分散，表示有红细胞凝聚作用；如红细胞全部下沉，上层液无色澄明，可判断为无溶血。
(3)试验结果从表1可见，浓度为每毫升含2mg曲克芦丁脑蛋白水解物的本发明药物，在0.1、0.2、0.3、0.3、04、0.5ml管，37℃保温4h，未见有溶血和凝集反应。上层液无色透明，红细胞全部下沉，表明每毫升含2mg曲克芦丁脑蛋白水解物与无明显溶血作用，符合静脉注射用安全性检查的要求。
表1 曲克芦丁脑蛋白水解物溶液溶血性试验结果
注结果中“+”表示溶血；“-”表示不溶血和没有红细胞凝集。
二.刺激性试验(1)家兔耳缘静脉刺激试验取家兔3只，每日每只兔一侧耳缘静脉按无菌操作方法分别隔日滴注浓度为每毫升含曲克芦丁脑蛋白水解物2mg的溶液20ml/kg，每日一次，另侧滴注等体积的生理盐水，连续五次，于末次给药后24h肉眼观察滴注部位有无充血消肿和组织坏死现象并放血处死，在距注射点向心端1.5～3cm处分离出血管，取材常规石蜡包埋、切片，H.E染色后作病理组织检查，观察有无血管扩张，管壁破坏、内皮细胞肿胀、腔内血栓形成、组织变性或坏死等显著性刺激反应。
试验结果表明未见明显充血及水肿，血管边缘清晰，病理组织检查未见组织变性及坏死等病理改变(见图1、家兔耳缘血管刺激性试验病理切片)。
(2)家兔股四头肌刺激试验注射用曲克芦丁脑蛋白水解物各取家兔2只，于一侧股四头肌肉按无菌操作方法分别注入浓度为32mg/ml的注射用曲克芦丁脑蛋白水解物1ml，另侧注射等体积的无菌注射用水，48h后放血处死，观察受试物的刺激反应，按表2换算成相应的反应分值，以算出4块股四头肌反应分值的总和。
表2 肌肉刺激反应评分标准
试验结果表明，家兔每块股四头肌均未见明显刺激反应；4块股四头肌反应分值均为0，病理组织检查未见组织变性及坏死等病理改变(见图2、家兔股四头肌刺激性试验病理切片)，表明本发明受试药对家兔股四头肌无明显刺激作用。
三.全身致过敏试验(1)试验动物健康白色豚鼠，雌雄兼用(雌性豚鼠无孕)，体重230～300g，由湖北省实验动物研究中心提供。许可证号SCXK(鄂)2003-0005。
(2)受试药物注射用曲克芦丁脑蛋白水解物，规格80mg∶1mg(曲克芦丁∶总氮)，批号20030701。由海南惠普森医药生物技术有限公司提供。冷柜保存，临用前用5％葡萄糖注射液(湖南科伦制药有限公司生产，批号A040903-01)溶解，并稀释成每毫升含2mg曲克芦丁脑蛋白水解物作为致敏液。
(3)受试用鸡蛋购自市场，使用时按无菌操作取出蛋清，以蒸馏水配成1％浓度。
(4)试验方法取白色豚鼠18只，按性别、体重随机分为生理盐水组、1％新鲜蛋清组、本发明曲克芦丁脑蛋白水解物组，每组6只动物。3组动物分别间日腹腔注射生理盐水、1％新鲜蛋清、本发明曲克芦丁脑蛋白水解物溶液，0.5ml/只，共3次。然后，每组分别各取3只于第1次给药后第14天和第21天，耳缘静脉注射生理盐水、1％新鲜蛋清、本发明曲克芦丁脑蛋白水解物溶液，1.0ml/只。观察豚鼠注射后15分钟内是否有竖毛、兴奋不安、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽等现象，如出现两种或两种以上症状者，或有抽搐、虚脱、死亡现象之一者，视为过敏反应阳性。
(5)试验结果在生理盐水或本发明曲克芦丁脑蛋白水解物溶液腹腔注射后第14天和第21天，分别耳缘静脉注射生理盐水或本发明曲克芦丁脑蛋白水解物溶液，注射后15分钟内，豚鼠没有出现竖毛、兴奋不安、呼吸困难、喷嚏、咳嗽、干呕、抽搐、虚脱、死亡等过敏反应症状。
在1％新鲜蛋清腹腔注射后第14天，耳缘静脉注射1％新鲜蛋清，注射后3只豚鼠均表现兴奋不安、呼吸困难、喷嚏，其中2只抽搐、在8分钟内死亡。在1％新鲜蛋清腹腔注射后21天，耳缘静脉注射1％新鲜蛋清，注射后3只豚鼠均表现兴奋不安、呼吸困难、喷嚏、抽搐，均在3分钟内死亡。
试验结论浓度为每毫升含2mg的曲克芦丁脑蛋白水解物未见明显溶血作用，其结果符合静脉注射用药安全性要求。
家兔每日耳缘静脉滴注浓度为每毫升含2mg的曲克芦丁脑蛋白水解物20ml/kg，连续5次，于末次给药后24h，对家兔耳静脉未见明显刺激反应；家兔股四头肌肌内注射浓度为每毫升32mg含曲克芦丁脑蛋白水解物1ml，未见对家兔股四头肌明显刺激反应，表明本发明曲克芦丁脑蛋白水解物的局部刺激试验符合注射用药规定。
白色豚鼠腹腔注射浓度为每毫升含2mg的曲克芦丁脑蛋白水解物三次，从静脉分别进行14和21d攻击后，未见动物发生抓鼻、咳嗽、肌颤和竖毛等全身过敏反应，反应分值为零，表明曲克芦丁脑蛋白水解物对豚鼠无致过敏性。
权利要求
1.注射用曲克芦丁脑蛋白水解物，其特征是由曲克芦丁和脑蛋白水解物组成，二者重量配比为曲克芦丁∶脑蛋白水解物＝50～100∶1～20，其中脑蛋白水解物含量按游离氨基酸总氮计，组合物的PH值5.5～7.5。
2.根据权利要求1所述的注射用曲克芦丁脑蛋白水解物，其特征是曲克芦丁∶脑蛋白水解物＝80∶1，其中脑蛋白水解物含量按游离氨基酸总氮计脑蛋白水解物总氮计。
3.一种权利要求1的注射用曲克芦丁脑蛋白水解物的制备方法，其特征是将曲克芦丁和脑蛋白水解物原液按比例混合，加入适量注射用水至规定体积，按液体量0.07％加入注射级药用炭，常温下搅拌吸附30分钟，先经粗滤，然后经0.22μm的微孔滤膜精滤，滤液分装入西林瓶中，置冷冻干燥箱中(已预冻至-40℃)，在该温度下保温2小时；开动捕水器开关、开动真空泵，在4Pa下，逐渐以每小时1℃)提高温度，当到达室温度，继续抽真空3小时，冻干完毕，无菌封装。
全文摘要
本发明涉及一种注射用曲克芦丁脑蛋白水解物，是用于治疗脑血管及中枢神经系统疾病的复方制剂。由曲克芦丁和脑蛋白水解物组成，曲克芦丁和脑蛋白水解物按50～100∶1～20的重量配比，最佳80∶1，其中脑蛋白水解物含量按游离氨基酸总氮计，组合物的PH值5.5～7.5，性状为黄色至浅棕黄色无定型固体或粉末。其制备方法是将曲克芦丁和脑蛋白水解物原液按比例混合，加入适量注射用水和注射级药用炭，搅拌吸附30分钟，经粗滤，后经0.22μm的微孔滤膜精滤，滤液分装后放入冻干箱中冻干完毕后无菌封装。利用两药复方协同互补作用，具有类钙拮抗剂药物治疗脑血管疾病的作用，同时能增强各种神经营养物质进入血脑屏障，改善脑神经组织的代谢功能，对于各类脑血管疾病的治疗及康复意义重大。
文档编号A61P7/00GK1736475SQ20051009404
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月26日 优先权日2005年8月26日
发明者李志林, 黄瑶, 蔡鹤其 申请人:李志林