一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法，取猪脑，去杂，加纯化水匀浆；匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；清液调节pH至1.7～3，加热至100～110℃，保温15～45min，然后调pH至8.0～9.0；8～10kd膜超滤，收集滤液；滤液上柱层析，收集洗脱液，调pH至8.0～9.0，阴离子交换膜浓缩，0.2μm膜过滤得原液；原液冻结，然后解冻，加抗氧化剂，调pH至6.9～7.5，8～10kd膜超滤，0.2μm膜过滤。所得脑蛋白水解物注射液中多肽与对照品相似≥0.90，含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例≥85％，无需额外补充添加氨基酸，完全依靠猪脑水解制得，稳定安全。
【专利说明】一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脑蛋白水解物注射液广品是由原材料经检验、检疫合格，提取，精制，灭菌等生广 工艺制备得到；脑蛋白水解物的主要成分是低分子肽和游离氨基酸。易通过血脑屏障进入 脑神经细胞，低分子肽具有与天然存在的神经营养因子相同的作用，能诱导神经元分化、维 持正常神经细胞的功能、增加神经递质的产生和突触传递，保护神经细胞免受各种损害，调 节人体脑代谢、神经传递及神经生长；能提高葡萄糖分解酶活性，增加脑对葡萄糖的无氧能 量代谢，降低脑内乳酸的浓度，在缺血缺氧时对神经细胞的线粒体有保护作用。
[0003] 脑蛋白水解物注射液上世纪由奥地利EBEWE药厂进口注册，到2010年底，已有公 开的涉及脑蛋白水解物制剂及工艺的专利申请29件。
[0004] 例如中国发明专利文献CN01130523. 1公开了一种脑蛋白水解物注射液生产工 艺：新鲜猪脑去除表面的粘膜及血渍等，匀浆，双层纱布过滤，胃蛋白酶水解，加胰酶水解， 加盐酸调pH值2. 5?3. 0, -20?10°C下静置10?30小时；室温，双层纱布过滤，加水， 调pH值到中性，微孔滤膜过滤澄清，超滤膜超滤，超滤膜进行浓缩，浓缩液加热沸腾15分 钟，然后迅速冷却，再微孔滤膜和超滤膜，得到的超滤液，再经121°C蒸汽灭菌；根据所需药 液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准（编号WS1-XG-25-2000) 计算需要添加的氨基酸用量，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配装针成成品药液，灭菌成 无菌制剂。又如CN1857711A公开了一种脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法：将猪脑匀 浆，胃蛋白酶、胰酶水解，上羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化，调配肽图，收集目标物， 采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，进行定氮、氨基酸分析，添加相应氨基酸配制成浓 配液，滤膜过滤，即得。现有的制备工艺在生产制剂时需要额外添加相应氨基酸才能制得符 合标准的脑蛋白水解物，而根据国家食品药品监督管理局2008年734号关文件要求，脑蛋 白水解物不得添加外源性氨基酸。因而我们需要进行不添加外源性氨基酸的脑蛋白水解物 的制备方法的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有脑蛋白水解物制备技术中需要额外添加相应氨基酸 的缺陷，提供一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法，采用该制备方法制备的脑蛋白水解 物注射液中小分子肽反相肽图色谱鉴别与对照品相似度> 〇. 90,无需补充添加外源性氨基 酸，完全依靠猪脑水解制得。
[0006] 本发明的第一个方面是提供一种脑蛋白水解物注射液，所述脑蛋白水解物注射液 中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697?200602中的小分子多肽的相似度> 90% ; 所述脑蛋白水解物注射液含有16种游离氨基酸：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨 酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、 脯氨酸；所述脑蛋白水解物注射液中总的氨基酸的氮含量占所述脑蛋白水解物注射液的总 氮量的85%以上。
[0007] 优选地，所述脑蛋白水解物注射液采用下述步骤制备而成：
[0008] 1)取检验合格猪脑，去杂（去除血管、脂肪等杂质），加纯化水匀浆；
[0009] 2)将步骤1)得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
[0010] 3)将步骤2)得到的清液调节pH至1. 7?3,加热至100?110°C，保温15? 45min (优选为20?40min，更优选为25?35min)，然后调节pH至8. 0?9. 0 ;
[0011] 4)冷处理，取清液，8?10kd膜超滤，收集滤液；
[0012] 5)将步骤4)得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至 8. 0?9. 0,阴离子交换膜浓缩，0. 2 μ m膜过滤得原液；
[0013] 6)将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为 0· 01?0· 05wt%，调节pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超滤，0· 2μπι膜过滤，既得。
[0014] 其中，步骤4)中所述冷处理，是指将液体冷却到10°C以下。
[0015] 优选地，在步骤1)之后，进行步骤2)之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
[0016] 进一步优选地，使蛋白质变性具体可采用下述步骤：将匀浆液与75?85°C下保温 15 ?30min〇
[0017] 优选地，步骤6)中所述的抗氧化剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸 氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。
[0018] 优选地，步骤5)中上柱层析所使用的层析填料为Amberlite IRA-200。
[0019] 优选地，步骤5)中所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜（孔径 0· 001 μ m)。
[0020] 优选地，步骤2)具体为：调节pH至1.7?3.0,加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解 于35?45°C下进行，保温3?5h，然后调节pH至7. 2?7. 8,加入胰酶水解，胰酶水解于 35?45 °C下进行，保温2?4h，灭活酶，终止水解，收集清液。
[0021] 其中，步骤2)中收集清液可以通过过滤、离心等本领域已知的方式实现。
[0022] 本发明的第二个方面是提供一种脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步 骤：
[0023] 步骤1，取检验合格猪脑，去杂（去除血管、脂肪等杂质），加纯化水匀浆；
[0024] 步骤2,将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
[0025] 步骤3,将步骤2得到的清液调节pH至1. 7?3,加热至100?110°C，保温15? 45min (优选为20?40min，更优选为25?35min)，然后调节pH至8. 0?9. 0 ;
[0026] 步骤4,冷处理，取清液，8?10kd膜超滤，收集滤液；
[0027] 步骤5,将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节 pH至8. 0?9. 0,阴离子交换膜浓缩，0. 2 μ m膜过滤得原液；
[0028] 步骤6,将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量 为0· 01?0· 05wt %，调节pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超滤，0· 2 μ m膜过滤。
[0029] 其中，步骤4中所述冷处理，是指将液体冷却到10°C以下。
[0030] 优选地，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
[0031] 进一步优选地，使蛋白质变性具体可采用下述步骤：将匀浆液于75?85°C下保温 15 ?30min〇
[0032] 优选地，所述制备方法还包括步骤7 :灌装，100?120°C灭菌,检漏。
[0033] 优选地，步骤6中所述的抗氧化剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸 氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。
[0034] 优选地，步骤5中上柱层析所使用的层析填料为Amberlite IRA-200。
[0035] 优选地，步骤5中所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜。
[0036] 优选地，步骤2具体为：调节pH至1.7?3.0,加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解 于35?45°C下进行，保温3?5h，然后调节pH至7. 2?7. 8,加入胰酶水解，胰酶水解于 35?45 °C下进行，保温2?4h，灭活酶，终止水解，收集清液。
[0037] 其中，步骤2中收集清液可以通过过滤、离心等本领域已知的方式实现。与现有技 术相比，本发明制备工艺具有如下优点：
[0038] 1、本发明在胃蛋白酶、胰酶水解成多肽与游离氨基酸的清液后，调pH至1.7? 3. 0,100?110°C加热30分钟，可防止水解液中游离氨基酸再次结合成肽键，形成短肽，同 时可以灭活人畜共患病毒，比现有专利更合理，防止多肽与游离氨基酸可逆结合和灭活人 畜共患病毒在双酶水解后进行，属于末端控制，无其它生物材料加入，更安全；
[0039] 2、采用Amberlite IRA-200交换填料可大大改善现有阴离子交换不能吸附全部氨 基酸的问题；
[0040] 3、采用阴离子交换膜，在ph8. 0?9. 0溶液中，氨基酸带负电荷，与膜表面电荷相 互排斥，游离氨基酸和多肽被截留；阳离子交换膜优选美国进口膜DUS-8040C离子膜，孔径 为0. OOlum，孔径50d分子量，游离氨基酸可进一步被截留；
[0041] 4、本发明工艺中采用了 2次超滤，2次过滤，最大限度降低大分子致敏物质、保证 了不溶性微粒和无菌保证值SAL ;
[0042] 5、本发明工艺中采用超滤后冻结，超滤去除大分子后冻结可减少氨基酸析出，冻 结后解冻可以进一步去除少量杂质；
[0043] 6、本发明提供的脑蛋白水解物注射液中小分子肽反相肽图色谱鉴别与脑蛋白水 解物140697?200602的相似度> 0. 90 ;含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量 比例> 85%，含有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨 酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸等16种氨基酸。
[0044] 本发明工艺简单，制得的脑蛋白水解物注射液中小分子多肽与16种游离氨基酸 含量恒定，所得脑蛋白水解物注射液中多肽与对照品相似> 0.90,含有16种氨基酸，总氨 基酸的氮量占总氮含量比例>85%，无需额外补充添加氨基酸，完全依靠猪脑水解制得，药 效稳定，更安全；注射液为最终可灭菌注射剂，SAL保证值更高，安瓿封装，更密封，提高用 药安全。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物注射液与中检所脑蛋白水解物 140697?200602的指纹图谱；
[0046] 图2为中检所脑蛋白水解物140697?200602的16种氨基酸高效液相图谱；
[0047] 图3为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物注射液的游离氨基酸高效液相图谱；
[0048] 图4为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物注射液的总氨基酸高效液相图谱；
[0049] 图5为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物注射液与中检所脑蛋白水解物 140697?200602的指纹图谱；
[0050] 图6为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物注射液的游离氨基酸高效液相图谱；
[0051] 图7为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物注射液的总氨基酸高效液相图谱。
【具体实施方式】
[0052] 下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明做进一步的描述，以更好地理解本 发明。
[0053] 实施例1
[0054] 脑组织（检疫合格）去除血管、脂肪等杂质后取100kg，加1倍体积纯化水匀浆，于 82 °C保温15分钟，冷却；盐酸调pHl. 8，胃蛋白酶水解，42 °C保温3小时，氢氧化钠调pH7. 6， 胰酶水解，42°C保温2小时，离心收集清液；盐酸调pH2,105°C下保温30分钟，然后氢氧化 钠调pH8. 8 ;冷处理，抽取上清液，10kd膜超滤去除大分子，收集滤液100L ;上柱层析，用纯 化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至8. 0?9. 0,用DUS-8040C离子膜浓缩至50L， 0. 2 μ m膜过滤，得原液，-15°C以下冻结保存；原液解冻，调配，加入亚硫酸氢钠0. Olwt %， 调节pH6. 9?7. 5,8?10kd膜超滤，0. 2 μ m膜过滤，灌装；115°C，30分钟，检漏等，制备得 到5ml规格小容量注射液。
[0055] 相似度测定：
[0056] 对照品为中检所脑蛋白水解物140697?200602。以十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂（250mm X 4mm，粒径5μπι);以0.1 %三氟醋酸溶液为流动相A ;以0.085 %三氟醋酸 乙腈溶液一0. 1 %三氟醋酸溶液（80:20)为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟 0.8ml ;检测波长为276nm。柱温40°C;按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，结果如图 1和表2所示。
[0057] 表1相似度测定中的梯度洗脱表
[0058]
【权利要求】
1. 一种脑蛋白水解物注射液，其特征在于，所述脑蛋白水解物注射液中小分子多肽与 中检所脑蛋白水解物140697?200602中的小分子多肽的相似度> 90% ;所述脑蛋白水解 物注射液含有16种游离氨基酸：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨 酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；所述脑 蛋白水解物注射液中总的氨基酸的氮含量占所述脑蛋白水解物注射液的总氮量的85 %以 上。
2. 根据权利要求1所述脑蛋白水解物注射液，其特征在于，所述脑蛋白水解物注射液 采用下述步骤制备而成： 1) 取检验合格猪脑，去杂，加纯化水匀浆； 2) 将步骤1)得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液； 3) 将步骤2)得到的清液调节pH至1. 7?3,加热至100?110°C，保温15?45min， 然后调节pH至8. 0?9. 0 ; 4) 冷处理，取清液，8?10kd膜超滤，收集滤液； 5) 将步骤4)得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至 8. 0?9. 0,阴离子交换膜浓缩，0. 2 μ m膜过滤得原液； 6) 将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为0. 01? 0· 05wt %，调节pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超滤，0· 2 μ m膜过滤，既得。
3. 根据权利要求2所述的脑蛋白水解物注射液，其特征在于，在步骤1)之后，进行步骤 2)之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。
4. 根据权利要求2所述的脑蛋白水解物注射液，其特征在于，步骤6)中所述的抗氧化 剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。
5. 根据权利要求2所述的脑蛋白水解物注射液，其特征在于，步骤5)中上柱层析所使 用的层析填料为Amberlite IRA-200,所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子 膜。
6. -种脑蛋白水解物注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，取检验合格猪脑，去杂，加纯化水匀浆； 步骤2,将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液； 步骤3,将步骤2得到的清液调节pH至1. 7?3,加热至100?110°C，保温15?45min， 然后调节pH至8. 0?9. 0 ; 步骤4,冷处理，取清液，8?10kd膜超滤，收集滤液； 步骤5,将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节pH至 8. 0?9. 0,阴离子交换膜浓缩，0. 2 μ m膜过滤得原液； 步骤6,将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为 0· 01?0· 05wt %，调节pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超滤，0· 2 μ m膜过滤。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀 浆液加热使蛋白质变性。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤7 :灌装，100?120°C灭 菌，检漏。
9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤6中所述的抗氧化剂为亚硫酸 钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5中上柱层析所使用的层析填 料为Amberlite IRA-200,阴离子交换膜采用美国进口膜DUS-8040C离子膜。
【文档编号】A61P3/02GK104043099SQ201410255461
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】张莉, 李捍雄 申请人:广州一品红制药有限公司