人类抗-kir抗体的制作方法

人类抗-kir抗体的制作方法
【专利摘要】本发明描述了用于调节受试者中免疫反应的组合物和方法。更特别地，描述了调节哺乳动物受试者中NK细胞活性并允许增强NK细胞细胞毒性的人类抗体，以及具有与人类单克隆抗体1-7F9或14F1的那些相似的抗原结合特性的抗体。还描述了该抗体的片段和衍生物，以及含有该抗体的药物组合物和它们的用途，尤其用于治疗中，以增加受试者中NK细胞活性或细胞毒性。
【专利说明】人类抗-K IR抗体
[0001]本申请是申请日为2005年7月I日、申请号为200580022633.1、发明名称为“人类抗-KIR抗体”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及人类抗体，以及其片段和衍生物，其与存在于NK细胞表面上的两种或更多种抑制性KIR受体交叉反应和/或阻断它们，并且增强哺乳动物受试者或生物样品中NK细胞细胞毒性。本发明还涉及制备该抗体、片段、变体和衍生物的方法；含有该抗体的药物组合物；以及该分子及组合物的用途，尤其在治疗中的用途，以增加受试者中NK细胞活性或细胞毒性。
【背景技术】
[0003]自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞的一个亚群，涉及免疫和宿主免疫监视系统。
[0004]NK细胞是在骨髓中从淋巴祖细胞发育的单核细胞，并且形态学特征和生物学特性典型地包括簇决定子(OTs)⑶16，⑶56，和/或⑶57的表达；细胞表面上α / β或gamma / δ TCR复合物的缺乏；结合并杀伤未能表达“自我”主要组织相容性复合体(MHC)/人白细胞抗原(HLA)蛋白质的靶细胞的能力；和杀伤表达活化NK受体的配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力。NK细胞的特征在于其结合并杀伤几种类型的肿瘤细胞系而不需要预先免疫或活化的能力。NK细胞也能释放对免疫系统产生调节作用的可溶性蛋白质和细胞因子；而且能经受多轮细胞分裂并产生具有与母细胞相似生物学特性的子细胞。在通过干扰素和/或细胞因子的活化后，通过需要在NK细胞和靶细胞之间直接的、物理接触的机理，NK细胞介导肿瘤细胞和由细胞内病原体感染的细胞的裂解。靶细胞的裂解包括细胞毒性颗粒从NK细胞释放到结合靶标的表面上，以及效应物蛋白例如穿孔素和粒酶B上，穿孔素和粒酶穿透靶标质膜并诱导细胞凋亡或程序化细胞死亡。正常的健康细胞被保护免于被NK细胞裂解。
[0005]基于它们的生物学特性，在本领域已经提议了不同的治疗和疫苗策略，它们依靠NK细胞的调节。然而，NK细胞活性通过包括刺激和抑制信号二者的复杂机制来调节。
[0006]简要地，NK细胞的裂解活性是通过不同的细胞表面受体来调节的，该受体在与靶细胞上的配体相互作用后，转导正或负细胞内信号。通过这些受体传输的正和负信号之间的平衡，决定靶细胞是否被NK细胞裂解(杀伤)。NK细胞刺激性信号可以通过自然细胞毒性受体(NCR)例如NKp30、NKp44和NKp46 ；以及NKG2C受体、NKG2D受体、某些活化杀伤免疫球蛋白样受体(KIRs)和其他活化NK受体进行介导(Lanier, Annual Review ofImmunology2005 ；23:225-74)。NK细胞抑制性信号可以通过受体象Ly49，CD94/NKG2A，以及某些抑制性KIRs (其识别主要组织相容性复合体(MHC) I类分子)进行介导( KMrre等，Nature 1986 ；319:675-8 ；Ohlen 等，Sciencel989 ；246:666-8)。这些抑制性受体结合存在于其他细胞上的MHC I类分子(包括HLA I类)的多态性决定簇并抑制NK细胞介导的裂解。
[0007]KIRs，有时也被称作杀伤抑制性受体，已经在人类和非人灵长类中进行表征，并且是存在于某些淋巴细胞亚类，包括NK细胞和一些T细胞上的多态性I型跨膜分子。KIRs与MHCl类分子的α I和2域中的决定簇相互作用，并且如上所述，对NK细胞，独特的KIRs为刺激性或抑制性。
[0008]对KIRs的命名是基于细胞外域的数目(KIR2D和KIR3D分别具有两个和三个细胞外免疫球蛋白域)和胞质尾区是长(KIR2DL或KIR3DL)或短(KIR2DS或KIR3DS)。在存在于单一个体中的NK群体中，所给的KIR的存在或缺少从一个NK细胞到另一个是变化的。在人类中，也存在相对高水平的KIR基因多态性，一些KIR等位基因存在于一些，但不是所有的个体中。在NK细胞上的KIR基因的表达是随机调节的，意思是在所给的个体中，根据个体的基因型，所给的淋巴细胞可以表达一个、两个或更多个不同的KIRs。单一个体的NK细胞典型地表达不同的KIRs组合，为全套NK细胞提供了对MHC I类分子的不同特异性。
[0009]当结合到合适的配体时，某些KIR基因产物引起淋巴细胞活性的刺激。活化的KIRs全部有带电的跨膜残基的短胞质尾区，其与具有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(Motifs)(ITAMs)的衔接分子结合，ITAMs转导刺激性信号到NK细胞。相反，抑制性KIRs具有包含免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的长胞质尾区，在他们的MHC I类配体结合时，就转导抑制信号到NK细胞。已知的抑制性KIRs包括KIR2DL和KIR3DL亚家族成员。有两个免疫球蛋白域的(KIR2DL)识别HLA — C同种异型:KIR2DL2 (原来叫做p58.2)和密切相关的等位基因产物KIR2DL3都识别“I群"HLA-C同种异型(包括HLA_Cwl、-3、-7和-8)，而 KIR2DL1 (ρ58.I)识别“2 群”HLA-C 同种异型(例如 HLA_Cw2、-4、-5 和-6)。KIR2DL1 的识别是通过在HLA-C等位基因的第80位存在赖氨酸残基支配的。KIR2DL2和KIR2DL3识别是通过在HLA-C第80位存在天冬酰胺残基支配的。重要地，绝大多数的HLA-C等位基因在第80位有天冬酰胺或赖氨酸残基。因此，KIR2DL1、-2和-3共同地识别基本上所有的在人类中发现的HLA-C同种异型。一个KIR带有三个免疫球蛋白域，KIR3DLl(p70)识别与HLA-Bw4等位基因共享的一个表位。最后，KIR3DL2(pl40)，带有三个免疫球蛋白域分子的同型二聚体，识别HLA-A3和-All。
[0010]虽然多种抑制性KIRs和 /或其它MHC I类特异的抑制性受体(Moretta等，Eur JImmunogenet.1997 ；24(6):455-68 ;Valiante 等，Tmmunol Revl997 ； 155: 155-64 ；Lanier,Annu Rev Immunol 1998 ; 16:359-93)可以通过NK细胞共表达,在任何所给个体的NK全部组成部分中，有仅仅表达单个KIR的细胞，并且因而仅被特异的MHC I类等位基因(或属于同群MHC I类同种异型的等位基因)所抑制。人类MHC I类分子通常被称为人组织相容性抗原(HLA) I类。
[0011]为相对于他们的靶标不匹配的KIR配体，也就是，表达不识别宿主任何HLA分子KIRs的NK细胞种群或克隆，在白血病患者中在同种异体骨髓移植后已经显示介导强力、挽救生命的抗肿瘤反应(Ruggeri等，Science2002, 295 =2097-2100)。人们认为潜在的机理是HLA不匹配的造血移植导致表达KIR的供体来源的NK细胞的扩张，其在接受体中不识别任何HLA配体，并且因而不通过KIR进行抑制。这些同种异体NK克隆发挥强有力地抗肿瘤活性。在诊断为急性骨髓性白血病(AML)，并用KIR-MHC不匹配的单倍同一性的移植治疗的患者中，该反应非常强烈。通过药理学治疗患者再现该作用的一个途径是施用阻断KIR/HLA相互作用的试剂以活化患者的内源性NK细胞。
[0012]对KIR2DL1特异的某些单克隆抗体已经显示阻断KIR2DL1与“2群”HLA-C同种异型，例如HLA-Cw4的相互作用(Moretta等，J Exp Medl993 ；178 =597-604)，并且促进了 NK介导的表达那些HLA-C同种异型的靶细胞的裂解。针对KIR2DL2/3，阻断KIR2DL2/3与HLA-Cw3相互作用的单克隆抗体或类似的同种异型已经进行了描述(Moretta等，J ExpMedl993 ；178 =597-604)。对在临床环境中使用，这样的抗体是不理想的，因为两种治疗性单克隆抗体(mAbs)的开发和两种这样的抗体或选择一种这样抗体的施用(在适当的诊断之后)，将根据是否任何所给的患者表达I群或2群HLA-C同种异型，要求其治疗所有潜在患者。
[0013]Watzl 等(Tissue Antigens2000 ；56:240-247)产生识别多种同种型 KIRs的交叉反应鼠抗体，但那些抗体并不加强NK细胞的裂解活性。更进一步，Spaggiari等(Blood2002 ；99:1706-1714 和 Blood2002；100:4098-4107)应用许多针对不同KIRs的鼠单克隆抗体进行了实验。已报道那些抗体之一，NKVSFl (也称为Pan2D)识别 KIR2DLl(CD158a)、KIR2DL2(CD158b)和 KIR2DS4(ρ50.3)的共同表位。Shin 等(Hybridoma1999 ；18:521-7)也报道了生产两种单克隆抗体，表示为A210和A803g，能结合所有的KIR2DL1、KIR2DL3和KIR2DS4。然而，对在阻断患者NK细胞的抑制性KIRs中抗体的治疗用途，抗体与之交叉反应的活化KIR分子越少越好，因为活化受体的阻断可能损害NK细胞的刺激。因而，具有NKVSFl、A210或A803g抗原结合特征的抗体在临床环境中将不是最佳的。另外，在治疗人类患者中使用鼠单克隆抗体可能导致宿主对抗该抗体的免疫反应，因而损害治疗的效力。
[0014]因此在本领域中，到目前为止还没有使用于治疗性调节抑制性KIRs的实用和有效的手段成为可利用的手段。
[0015]发明概述
[0016]本发明提供了新的和有用的人类抗体，其特异地结合KIR2DL1和KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一个，或结合这些KIRs的全部三个，和/或通过阻断在一个或多个这种KIRs和HLA-C之间的相互作用，加强NK细胞裂解活性的人类抗体。也提供了这类抗体的片段和衍生物。本发明也与新的、有用的抗体、抗体片段和抗体的衍生物有关，其含有与如在本文描述的人类抗体1-7F9和1-4F1的那些实质上相同的VH和VL序列。本发明也提供了含有编码这类抗体的核苷酸序列的核酸、含有这类核酸的载体、含有这类核酸和/或载体的宿主细胞和生物体，和组合物，例如药学上可接受的组合物和试剂盒，其含有这些蛋白质、核酸、载体和/或细胞和典型地含一种或多种附加成分，这些附加成分可以是促进组合物的配制、输送、稳定性或其他特征的活性或非活性成分(例如不同的载体)。本发明进一步提供了不同的新的和有用的制造和使用这类抗体、核酸、载体、细胞、生物体和/或组合物的方法，例如在KIR介导的生物学活性的调节中，例如与其在相关的疾病的治疗中。
[0017]在一方面，本发明提供了结合KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一个，但不结合KIR2DS4的人类或人源化抗体。在一个【具体实施方式】中，抗体进一步不结合KIR2DS3。在另一个【具体实施方式】中，人类或人源化抗体阻断KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一个结合I类HLA-C分子。在进一步的【具体实施方式】中，抗体可能阻断HLA-Cw4分子结合KIR2DL1，和HLA-Cw3分子结合KIR2DL2或KIR2DL3中的至少一个。例如，抗体可以阻断HLA-Cw4分子结合KIR2DL1胞外部分(SEQ ID NO:23)的M44，F45和D72残基。在还有另一个【具体实施方式】中，抗体加强了 NK细胞针对表达I类HLA-C分子的人类靶细胞的裂解活性。
[0018]在另一方面，本发明提供了在与KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一个结合中，与包含含有SEQ ID NO: 15氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQ ID N0:17氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争的人类或人源化抗体。在一个【具体实施方式】中，在与KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一个结合中，该抗体与包含含有SEQ ID NO:15氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQ ID NO:17氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争。在另一个【具体实施方式】中，该抗体包含含有SEQ ID NO:15氨基酸序列的轻链可变区。在还有另一个【具体实施方式】中，该抗体含有(a)对应于SEQ ID NO:17的31-35残基的重链⑶Rl氨基酸序列；(b)对应于SEQ ID NO:17的50-65残基的重链CDR2氨基酸序列；和(c)对应于SEQ ID NO:17的99-112残基的重链⑶R3氨基酸序列。例如，该抗体可以包含含有SEQ ID N0:17氨基酸序列的重链可变区。
[0019]在另一方面，本发明提供了分离的结合KIR2DL1表位的人类或人源化抗体，该表位实质上含有 L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88
氣基酸残基。
[0020]在另一方面，本发明提供了分离的人类或人源化抗体，其具有对KIR2DL1解离常数(Kd)不大于大约0.45nM和/或对KIR2DL3的Kd不大于大约0.025nM。
[0021]本发明也提供了人类或人源化抗体或抗体片段，或其衍生物，其单独或以任意适当的组合具有任意上述特性。在一个【具体实施方式】中，抗体为单克隆抗体。在另一个【具体实施方式】中，抗体为IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。例如，抗体可以为IgG4抗体。
[0022]本发明也提供了编码具有任意上述特性的人类或人源化抗体或抗体片段的核酸、含有这种核酸的载体、含有这种载体的细胞，和生产人类抗KIR抗体的方法，包含在适于表达抗KIR抗体的条件下培养这种细胞。
[0023]本发明也提供了药物组合物，它含有具有一种或多种上述特性，或通过任意方法生产，以在患者中有效可检测地加强NK细胞细胞毒性的量的人类或人源化抗体或抗体片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。该组合物可以，例如含有吐温-80、蔗糖或吐温-80和
蔗糖二者。
[0024]本发明也提供了在需要它的受试者中加强NK细胞活性的方法，该方法包括给受试者施用有效量的任意上述的组合物。在一个【具体实施方式】中，受试者是患有癌症的患者。例如，患者可以患有选自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤和非何杰金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤的癌症。或者，患者可以患有选自结直肠癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤的癌症。在另一个【具体实施方式】中，受试者是患有感染性疾病的患者。还有另一个【具体实施方式】中，该方法进一步包括施用选自免疫调节剂、激素药剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、结合抑制性KIR的第二抗体、抗感染药、靶向剂和辅助化合物的治疗药。
[0025]应该理解，本发明“提供”的抗体或本发明“涉及”抗体等等的描述，也含蓄地，指的是在本文描述的创造性方法的实践中可能有用的抗体，除非另作说明或明显地与上下文相矛盾。
[0026]本发明的这些和其它方面和特征在本文进一步详细描述。
[0027]附图简要说明[0028]图1描述了结合不同人KIR2DL受体的共同决定簇的鼠单克隆抗体DF200。(A)克隆 CP11、KIR2DL1+、DF200 ； (B)克隆 CP502、KIR2DL3+ ； (C)克隆 CP11、KIR2DL1+、抗 KIR2DL1 ；(D)克隆 CP5。2、KIR2DL3+、抗 KIR2DL2/3。
[0029]图2描述了鼠单克隆抗体DF200，其中和KIR2DL1介导的NK细胞对Cw4表达靶细胞的细胞毒性抑制，显示在C1R-Cw4靶上用抗KIR mAb的裂解的重建，效应物/靶(E/T)t匕率为4/1。
[0030]图 3 描述了对 KIR2DL1 (mAbs EB6 和 XA-141)或 KIR2DL2/3 (mAbs GL183 和 Y249)特异的鼠单克隆抗体DF200，DF200的Fab片段和常规鼠抗体，其中和KIR2DL1介导的对Cw4阳性靶细胞细胞毒性的抑制，和KIR2DL2/3介导的对Cw3阳性靶细胞的NK细胞细胞毒性的抑制。(A)和(C)KIR2DL1+，靶细胞 721.221-Cw4+。(B)KIR2DL2+，靶细胞 72L 221_Cw3+。(D)KIR2DL3+，靶细胞 721.221_Cw3+。
[0031]图4描述了通过NK细胞的细胞裂解的重建，该NK细胞在DF200和EB6抗体的卩(&13’)2片段存在时，表达针对!11^-0￥4阳性靶细胞的KIR2DL1。(A)靶细胞721.221_Cw4 ；E/T比=1。(B)革巴细胞B-EBV细胞表达性Cw4, E/T比=2。
[0032]图5描述了通过交叉反应性鼠(DF200和NKVSFl (Pan2D))和人(1-7F9、1-4F1、1-6F5和l-6Fl)mAbs，以及鼠常规KIR2DL1特异性mAb(EB6)的NK介导的杀伤作用的诱导。这些mAbs通过用HLA-Cw4转染的721.221靶细胞的表达KIR2DL1的NK细胞(YTS-KIR2DL1)诱导(重建)杀伤作用。E/T 比=1。(A) 30 μ g/ml mAb。(B) 10 μ g/ml mAb。
[0033]图6描述了通过与图5中相同的抗体诱导NK介导的杀伤作用。mAbs通过表达内源性HLA-Cw4的B-EBV细胞的表达KIR2DL1的NK细胞(YTS-KIR2DL1)诱导(重建)杀伤作用。E/T 比=2。(A) 30 μ g/ml mAb。(B) 10 μ g/ml mAb。
[0034]图7描述了表位图，其显示了用对KIR2DL1的抗KIR抗体，通过表面细胞质基因共振(BIAcore?)分析获得的竞争性结合实验结果，其中在结合KIR2DL1中，重叠环指的是mAbs之中的重叠。结果显示在KIR2DL1上，1-7F9与EB6和1-4F1竞争，但不与NKVSFl (Pan2D)和 DF200 竞争。抗体 1-4F1 依次与 EB6、DF200、NKVSF1 (Pan2D)和 1-7F9 竞争。在 KIR2DL1 上，抗体 NKVSFl(Pan2D)与 DF200、1-4F1 和 EB6 竞争，但不与 1-7F9 竞争。在 KIR2DL1 上，DF200 与 NKVSFl (Pan2D)、1-4F1 和 EB6 竞争，但不与 1-7F9 竞争。
[0035]图8描述了表位图，其显示了用对KIR2DL3的抗KiR抗体，通过BIAcore?分析获得的竞争性结合实验结果，其中重叠环指的是在结合KIR2DL3中的重叠。结果显示在KIR2DL3 上，1-4F1 与 NKVSFl (Pan2D)、DF200、gll83 和 1-7F9 竞争。在 KIR2DL3 上，1-7F9 与DF200, gll83，和 1-4F1 竞争，但不与 NKVSFl (Pan2D)竞争。在 KIR2DL3 上，NKVSFl (Pan2D)与DF200U-4F1 和 GL183 竞争，但不与 1-7F9 竞争。在 KIR2DL3 上，DF200 与 NKVSFl (Pan2D)、1-4F1和1-7F9竞争，但不与GL183竞争。
[0036]图9描述了表位图，其显示了用对KIR2DS1的抗KiR抗体，通过BI Acore?分析获得的竞争性结合实验结果，其中重叠环指的是在结合KIR2DS1中的重叠。结果显示在KIR2DS1 上，抗体 1-4F1 与 NKVSFl (Pan2D)、DF200 和 1-7F9 竞争。在 KIR2DS1 上，抗体 1-7F9与 1-4F1 竞争，但与 DF200 和 NKVSFl (Pan2D)不竞争。在 KIR2DS1 上，NKVSFl 与 DF200 和1-4F1竞争，但不与1-7F9竞争。在KIR2DS1上，DF200与NKVSFl和1-4F1竞争，但不与1-7F9竞争 。[0037]图10描述了证明mAb结合猕猴NK细胞的Pan2D (NKVSFl)mAb滴定。猕猴NK细胞(第16天的NK团块)用不同量的NKVSFl (Pan2D)mAb孵育，继之以PE结合的山羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)抗体。阳性细胞的百分比用同种型对照(纯化的小鼠IgGl)确定。样品制作一式两份，平均荧光强度=MFI。
[0038]图11显示了可溶性KIR2DL1和KIR2DL1 (R131W)突变体与细胞的结合。(A)增加浓度的可溶性KIR2DL1-Fc，和KIR2DL1 (R131W) -hFc突变体与表达HLA_Cw3或-Cw4的细胞的结合。结合的KIR-Fc蛋白质使用荧光染料结合的二抗体进行检测，并通过流式细胞仪显示。平均荧光显示于 y 轴。(B)指示的抗KIRmAbs(GL183、EB6、DF200 和Pan2D(NKVSFl))结合KIR2DL1-FC和2DL1(R131W)突变体蛋白质，使用人免疫球蛋白作为对照。该图显示DF200和Pan2D (NKVSFl)结合突变体稍差于野生型KIR2DLl_Fc，提示两个mAbs受到R131W突变的影响。因此，在KIR2DL1上，对DF200和Pan2D，R131是构成表位的残基之一。
[0039]图12提供了抗体DF200和Pan2D (NKVSFl)的轻链可变区和轻链⑶Rs氨基酸序列的比对。(A)DF200 (SEQ ID NO:1)和 Pan_2D(SEQ ID NO:2)的抗 KIR 可变轻(VL)区的比对。上述氨基酸序列数目提示了分别对于在未成熟的(未分泌)免疫球蛋白中翻译Met (+1)的起始的位置。(B)CDR-Ll序列的比对。前残基:通常为半胱氨酸(Cys)。之后残基:色氨M (Trp)0典型地Trp-Tyr-Leu。长度:10-17氨基酸(aa)。(C)CDR_L2序列的比对。之前残基:通常为Ile-Tyr。长度:7aa。开始ADR-Ll末端后大约16aa。开始:从分泌蛋白开始大约24aa。(D)CDR_L3序列的比对。之前残基:Cys。之后残基:Phe-Gly-XXX-Gly。长度:7-1 laa。开始:CDR_L2末端后大约33aa。
[0040]图13提供了抗体DF200的重链可变区和重链CDRs。(A)DF_200VH区，未成熟蛋白质。分泌的、成熟VH开始于2 0位:残基Q。VH区末端为残基S而且此后恒定区(未显示)继续。(B)CDR-Hl。之前残基:Cys-XXX-XXX-XXX。之后残基:Trp。通常为Trp-Val或Trp-1le。长度:10_14aa。开始:从分泌的蛋白质开始大约22_26aa。(C)CDR_H2。之前残基:Leu-Glu-Trp-1Ie-Gly但是其他变体是可能的。之后残基:Lys或Arg/Leu或Ile或Val 或 Phe 或 Thr 或 Ala/Thr 或 Ser 或 Ile 或 Ala。长度:16_20aa。开始:CDR_H1 末端后大约15aa。(D)CDR-H3。之前残基:Cys-XXX-XXX(典型地为Cys-Ala-Arg)。之后残基:Trp-Gly-XXX-Gly。长度:3_25aa。开始:CDR_H2 末端后大约 33。
[0041]图14描述了人类抗体1-7F9的VH和VL序列的核苷酸和氨基酸序列。(A)HuKIRl-7F9成熟可变轻链的翻译。(B)编码HuKIRl_7F9成熟可变轻链的核苷酸序列。(C)HuKIRl-7F9成熟可变重链的翻译。(D)编码HuKIRl_7F9成熟重链的核苷酸序列。
[0042]图15 显示了单克隆抗体 1-7F9、DF200 (VH 序列:SEQ ID NO:19 ；VL 序列:SEQ IDNO:21)和 Pan2D (NKVSF1 ；VH 序列:SEQ ID NO:20 ；VL 序列:SEQ ID NO:22)的 VH 和 VL 的氨基酸序列。⑶Rs是盒状的。
[0043]图16描述了流式细胞仪数据，其显示鼠抗体，Pan2D(NKVSFl)和人类mAbsl_7F9和1-4F1 结合用 KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3 或 KIR2DS4 转染的细胞，如所提示(纯化的抗体:1 μ g/ml)。(A)-(R)NKVSFl (pan2D)、1-7F9 和 1-4F1 全部结合KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS1 和 KIR2DS2。它们都不结合 KIR2DS3。NKVSF1，但不是 1-7F9 或 1-4F1，结合 KIR2DS4。
[0044]图17描述了 FACS分析结果。㈧抗体介导的在细胞上可溶性KIR-Fc结合HLA-Cw4的中和作用，通过流式细胞仪(FACS)进行检测。在用不同浓度的交叉反应的mAb DF200 或 KIR2DL2/3-特异的 mAb GL183 预孵育后，FACS-测量 KIR2DLl_mFc 结合LCL721.221-Cw4细胞。DF200，但不是GL183降低了 KIR2DL1结合HLA_Cw4。测量以抑制性抗体缺乏时KIR2DLl-hFc-结合百分比进行作图。(B)在用不同浓度的1-1F4和1-7F9预孵育后，结合LCL721.221-Cw4细胞的KIR2DLl_mFc的FACS-测量。测量以抑制性抗体缺乏时KIR2DLl-mFc-结合百分比进行绘图。
[0045]图18描述了 51Cr-释放细胞毒性试验的结果。(A)以不同的E:T比率，YTS细胞(菱形)和YTS-2DL1细胞(三角)可以有效地杀伤LCL721.221-03细胞。与此相反，YTS细胞(正方形)可以有效地杀伤LCL721.221-04细胞，但是，由于KIR-限制，YTS-2DL1细胞(十字)不能将其杀伤。(B)在缺乏抗体时，YTS-2DL1细胞不能杀伤LCL-721.221_Cw4(Ε:T比率12:1)。1-7F9诱导YTS-2DL1细胞以剂量依赖方式杀伤LCL721.221_Cw4细胞。
[0046]图19描述了两个晶体复合结构的叠加；KIR2DLl/l-7F9Fab’和KIR2DL1/MHC I类，PDB-编码 lM9(Fan 等，Nat.1mmunol.2001 ；2:452-460)，使用普通 KIR 分子(标记 ‘KIR’)的Ca-原子作为模板。KIR2DLl/l-7F9Fab’显示为灰色线状带型而KIR2DL1/MHC I类为黑色管状型。l_7F9Fab’标记为‘1-7F9’而MHC I类标记为‘MHC’。可以看到在在叠加中MHC和Fab’之间的重叠，证明l_7F9Fab’阻碍MHC I类结合KIR2DL1受体的能力。见实施例11。
[0047]图20显示KIR2DL1上1-7F9的结合表位，如在KIR2DL1序列中所提示。从1-7F9，在4.0人距离之内的氨基酸以灰色和黑色背景突出。通过黑色背景突出的氨基酸参与氢键结合至1-7F9。
[0048]定义
[0049]为了方便，在本文定义几个术语。然而，在本文提供的定义术语的列表不是全部的。其他术语可以在本发明说明书中进行定义。
[0050]在本发明的上下文中，“活性的”NK细胞指的是生物学活性的NK细胞，包括具有裂解靶细胞和增强其他细胞免疫功能的能力的NK细胞。例如，“活性的”NK细胞可以能够杀伤表达活化NK受体的配体和/或不能表达由NK细胞上的KIR识别的MHC/HLA抗原的细胞。NK细胞可以通过不同的本领域已知技术获得，例如从血液样品、细胞单采法、组织或细胞采集等中分离。在自然杀伤细胞方案(Natural Killer Cells Protocols) (Campbell KS和Colonna M编辑^Human Press, pp.219-238 (2000)中可以发现关于涉及NK细胞的试验的有用方案。
[0051]如在本文所使用，“杀伤免疫球蛋白样受体”、“杀伤抑制性受体”或“KIR”指的是由为KIR基因家族成员的基因或从这种基因制备的cDNA编码的蛋白质或多肽。KIR基因家族的详细的评论，包括KIR基因和KIR基因产物命名，和典型KIRs的Genbank登记号，是 M.Carrington 和 P.Norman 的“KIR 基因族”(“The KIR Gene Cluster”)，其可以在NCBI网站称为“书架(Bookshelf )”中获得(可通过万维网(WWW)地址ncb1.nlm.nih.gov/books获得)。人类KIR基因和cDNAs序列，以及他们的蛋白质产物，可以在公共数据库，包括GenBank中取得。人类KIRs的非限制性代表性GenBank入口有下列登记号:KIR2DL1:Genbank 登记号 U24076、NM_014218、AAR16197 或 L41267 ；KIR2DL2 =Genbank 登记号 U24075或 L76669 ；KIR2DL3 =Genbank 登记号 U24074 或 L41268 ；KIR2DL4 =Genbank 登记号 X97229 ；KIR2DS1 =Genbank 登记号 X89892 ；KIR2DS2 =Genbank 登记号 L76667 ；KIR2DS3 =Genbank 登记号 NM_012312 或 L76670(剪接变体)；KIR3DL1:Genbank 登记号 L41269 ;和 KIR2DS4:Genbank登记号AAR26325。KIR可以含有从I到3细胞外域，并可有长(也就是超过40个氨基酸)或短(也就是少于40个氨基酸)的胞质尾区。在本文如前所述，这些特征决定了KIR的命名。代表性的KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS4分子分别含有下列氨基酸序列:
[0052]KIR2DL1 胞外域:
[0053]HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQXGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH (SEQ ID NO:23)，其中“X”在16位为P或R，并且其中“X”在114位为P或L，代表等位基
因变体。
[0054]KIR2DL2 胞外域:
[0055]HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ ID NO:24)
[0056]KIR2DL3 胞外域:
[0057]HEGVHRKPSLLAHP GPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLH (SEQ ID NO:25).[0058]KIR2DS4 胞外域:
[0059]QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV(SEQ ID NO:38)
[0060]术语“KIR2DL2/3”指的是KIR2DL2和KIR2DL3两个受体或其任一受体。这两个受体具有很高的同源性，它们是相同基因的等位基因形式，并且本领域技术人员认为功能上是相似的。
[0061]除非另有说明，术语“MHC”包含所有哺乳动物的MHC分子，而“HLA”分子指的是人类MHC分子。
[0062]在本发明上下文中，声明抗体“结合”决定簇(也就是在抗体上下文中单词“结合”:决定簇相互作用)指的是抗体带有特异性和/或亲和力结合决定簇。例如GL183是结合KIR2DL2/3的常规单克隆抗体。EB6是结合KIR2DL1的常规单克隆抗体。EB6和GL183两个可以在商业上取得(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)。
[0063]“交叉反应性”抗-KIR抗体是带有特异性和/或亲合性结合超过一个KIR分子的抗体。例如，DF200和1-7F9是与KIR2DL1、-2和-3交叉反应的单克隆抗体。产生抗体DF200的杂交瘤已经在CNCM培养物收集中心保藏，鉴定号"DF200"，注册号CNCM 1-3224，2004 年 6 月 10 日注册，Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724Paris Cedexl5,法国。NKVSF1,在本文也称“Pan2D”，与KIR2DLl、-2和-3和KIR2DS4交叉反应。该抗体可从Serotec (CergySainte-Christophe, France)商业获得，目录参考号码为 MCA2243。[0064]“特异结合”或“特异性”指抗体或其他物质可检测到的结合存在于抗原，例如KIR上的表位的能力，而同其他蛋白质或结构(例如存在于NK细胞，或其他细胞类型上的其他蛋白质)有相对很小的可检测到的反应性。特异性可以通过结合或竞争性结合试验，使用例如在本文别处描述的Biacore仪器，相对地进行确定。在结合特异性抗原相对非特异性结合其他不相关分子(在这种情况下特异性抗原是KIR)，特异性可以通过例如大约10:1、大约20:1、大约50:1、大约100:1、10000:1或更大比率的亲和力/亲合力来显示。对存在于特殊生物，例如人类的NK细胞上KIR特异的KIR结合抗体，有时可以显示对其他物种类似的KIRs结合(也就是，KIR结合抗体，或其他KIR结合性物质，可以与不同物种的KIRs交叉反应)。
[0065]“选择性”指的是与一个或多个其他生物学分子、结构、细胞、组织等对比，蛋白质优先结合特殊区域、靶标或肽。KIR结合抗体对在特殊生物中(例如与在灵长类中对比，在人类中)产生的KIRJP /或对特殊类型的KIR(例如带有长胞质尾区的KIR)，特别是该抗体与在特殊生物中产生的超过一种类型的KIR交叉反应，和/或KIR的特殊部分(例如特殊表位或抗原决定簇区域)也可以是选择性的。例如，选择性可以通过竞争性ELISA或Biacore测试进行确定。标记选择性的亲和力/亲合力中差异可以是任意可检测到的优选(例如，超过1: 1.1，或超过大约1:5的比率，如果可检测到，将是适合的，包括1:10、1 =IOOU:1000或更多)。除非另有说明，在本文介绍的对“亲和力”的任何定量资料指的是二价(与单价对比)结合的测量。
[0066]“表位”或“结合部位”是抗原上抗原结合肽(例如抗体)特异地结合的范围或区域。蛋白质表位可以含有直接参与结合的氨基酸残基(也称作表位的优势免疫成分)和其他氨基酸残基，其不直接参与结合，例如由特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基是在特异性抗原结合肽的“足迹”内)。根据本发明，在本文术语表位包括KIR的任意特殊区域中两种类型的氨基酸结合部位，该部位特异地结合抗KIR抗体，或另外的KIR特异性物质，除非另作说明(例如，在本发明的一些上下文中涉及直接结合特殊氨基酸残基的抗体)。KIRs可以含有许多不同的表位，其可以包括，不限于，(I)线型肽抗原决定簇，(2)在成熟KIR构象中，由一个或多个位置互相接近非毗连氨基酸组成的构象抗原决定簇；和(3)翻译后抗原决定簇，其存于共价连接到KIR的在全部或部分分子结构中，例如碳水化合物基团。
[0067]短语第一抗体与第二抗体结合“实质上”或“至少部分地”相同表位，意思是第一抗体的表位结合部位含有构成第二抗体表位结合部位的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多抗原上的氨基酸残基。同样，如上所述，第一抗体与第二抗体结合实质上或部分相同的表位，意思是在结合抗原时第一和第二抗体竞争。因而，术语与单克隆抗体1-7F9—样“结合实质上相同的表位或决定簇”，意思是抗体与1-7F9“竞争”。通常，与目标单克隆抗体结合“实质上相同表位或决定簇”的抗体(例如DF200、NKVSFl、1-7F9)，意思是抗体与所述目标抗体“竞争”结合一个或多个KIR分子，优选地选自由KIR2DL1和KIR2DL2/3组成组的KIR分子。在另一个例子中，与目标抗体结合KIR2DL1分子上的实质上相同表位或决定簇的抗体与目标抗体“竞争”结合KIR2DL1。与目标抗体结合KIR2DL2/3分子上的实质上相同表位或决定簇的抗体与目标抗体“竞争”结合KIR2DL2/3。
[0068]短语与目标抗体“结合基本上相同的表位或决定簇”，意思是抗体与所述目标抗体“竞争”与所述目标抗体特异地结合的至少一个，或任意和所有KIR分子。短语与单克隆抗体1-7F9 “结合基本上相同的表位或决定簇”，意思是抗体与1-7F9 “竞争”与1-7F9特异地结合的至少一个，优选地任意和所有KIR分子。例如，与单克隆抗体1-7F9或NKVSFl结合基本上相同的表位或决定簇的抗体能分别地与所述1-7F9或NKVSFl “竞争”结合KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1 和 KIR2DS2。
[0069]抗KIR抗体“阻断” KIR分子和HLA分子结合的能力意思是，在使用可溶性或细胞表面结合的KIR和HLA分子的试验中，抗体能以剂量依赖的方式可检测地降低KIR分子与HLA分子的结合，其中在缺乏抗体时，KIR分子可检测地结合HLA分子。测定抗KIR抗体是否能够进行这种阻断的代表性的试验在实施例8中提供。
[0070]抗KIR抗体“降低KIR抑制活性”、“促进NK细胞活性”、“促进NK细胞细胞毒性”、“促进NK细胞”、“加强NK细胞活性”、“加强NK细胞细胞毒性”或“加强NK细胞”的能力意思是当与抗体接触时，表达KIR的NK细胞能够裂解靶细胞，靶细胞在其表面表达为所述KIR配体的特殊MHC或HLA I类。例如，术语“NK细胞毒性增强”意思为NK细胞毒性的任何实质性增强，或至少5%、10%,20%,30%或更大的增强，例如，当与对照比较时，NK细胞毒性至少增强大约50% (例如，至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%,或至少大约95%)。这包括，例如，当与对照比较时大约55-100%、大约65_100%、大约75-100%、大约80-100%或大约90-100%NK细胞细胞毒性的增强。同样包括细胞毒性超过大约100%、超过大约500%、超过大约1000%、超过大约2000%或更高的增加。这可以例如在试验，例如标准细胞毒性试验中测量，其中在存在NK增强剂(例如抗KIR mAb)比缺乏该增强剂(也就是对照)时，NK细胞裂解靶细胞更高的数量，达到更高的百分比。
`[0071]如在本文使用，术语“中和KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制作用”或“中和KIR的抑制活性”意思是当用经典的细胞毒性的铬释放试验测量时，增加特异性裂解至超过大约20%，优选地至少大约30%，至少大约40%，至少大约50%，至少大约100%或更多的以相同的效应物:靶细胞比率，用不能被它们的KIR阻断的NK细胞或NK细胞系获得的特异性裂解。“中和KIR介导的抑制作用”同样意思为在铬释放试验，或其他细胞毒性试验中，使用表达一种或几种抑制性KIRs的NK细胞克隆或转染子，和表达被NK细胞上的一种KIRs所识别的至少一个HLA I类等位基因的靶细胞，用抗体获得的特异性裂解超过大约100%、优选地至少大约101%、至少大约150%、至少大约200%或更多(例如大约101-150%、大约120-150%、大约120-200%、大约150-200%或大约200-1000%)，或更多的用相同浓度的NKVSFl (可从Serotec商业上获得)，使用相同的NK细胞和靶细胞，以相同效应物:靶细胞比率获得的特异性裂解。
[0072]如在本文使用，术语“人类抗体”打算包括具有等于、基本上等于，或来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。这类人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如在本文使用，术语“人类抗体”，不打算包括其中来源于另一哺乳动物物种种系，例如小鼠的CDR序列已经移植到人框架序列中的抗体。
[0073]在本发明的上下文中，除非另作说明，“治疗”指的是预防、减轻、管理、治愈或减少疾病或障碍的一种或多种症状或临床相关表现，除非同上下文相矛盾。例如其中没有鉴定疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”是预防性治疗，而其中已经鉴定疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防性治疗。尽管如此，应该理解本发明不同的治疗和预防方法和使用方面在许多方面彼此不同(例如输送到受试者的化合物剂量、应用时机、应用动力等)而且可以各自认为是本发明独特的方面。
[0074]在本发明的上下文中，“癌症”指的是任何肿瘤疾患，包括，但不限于这类细胞疾患象肉瘤、癌、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤，其可以包括乳腺、头颈部、卵巢、膀胱、肺、咽、喉、食管、胃、小肠、肝、胰腺、结肠、女性生殖道、男性生殖道、前列腺、肾和中枢神经系统中的癌症。
[0075]如在本文使用的术语“生物样品”包括但不限于来源于人类或非人类哺乳动物的生物流体(例如血清、淋巴和血液)，细胞样品或组织样品(例如骨髓或肿瘤组织)。
[0076]在两个氨基酸序列的上下文中，术语“实质上相同”意思是该序列，当最佳地比对时，例如通过使用默认间隙重量(gap weights)的GAP或BESTFIT程序，共有至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约98 %或至少大约99 %的序列同一性。在一个【具体实施方式】中，位置不相同的残基，因保守氨基酸取代而不同(在本文在别处进一步描述)。序列同一性典型地使用序列分析软件进行测量。蛋白质分析软件，使用分配给不同的取代、缺失和其他修饰，包括保守性氨基酸取代的相似性测量，匹配相似序列。例如可公开取得的GCG软件包含序列例如"Gap"和"BestFit〃，其能以默认的参数使用以确定密切相关的多肽，例如来自不同生物的物种的同源性多肽之间，或野生型蛋白质和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，例如GCG6.1版。多肽序列也可以使用FASTA，应用默认或推荐的参数进行比较。GCG6.1版，FASTA(例如FASTA2和FASTA3)中的程序提供了查询和检索序列之间最佳重叠的区域的比对和序列同一性百分比(Pearson, Methods Enzymo1.1990 ； 183:63-98 ；Pearson, MethodsMol.Biol.2000 ；132:185-219)。当将序列与包含大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是计算机程序BLAST，特别是blastp，使用默认参数。见，例如，Altschul 等，J.Mol.Biol.1 990 ；215:403-410 ;Altschul 等，Nucleic Acids Res.1997 ；25:3389-402(1997);在本文通过参考将上述每一篇文献并入本申请。在两个实质上相同的氨基酸序列中，“对应的”氨基酸位置是通过在本文提及的任意蛋白质分析软件，使用默认参数比对的那些。
[0077]如在本文使用的“1-7F9样”或“1-4F1样”抗体意思是(I)与分别含有1-7F9或1-4F1的VH和VL序列的抗体实质上结合相同表位的抗体，例如例如分别地为单克隆抗体1-7F9或1-4F1，和/或(2)含有分别与1-7F9或1-4F1的VH和VL序列相同或实质上相同的VH和VL序列的抗体。
[0078]“保守性”氨基酸取代是其中氨基酸残基被有具有相似化学特性(例如，带电或疏水性)的侧链(“R-基团”)的另外氨基酸残基取代的取代。通常，保守性氨基酸取代将不实质上改变蛋白质的功能特性。在通过保守性取代而导致氨基酸序列相互不同的情况下，序列同一性百分比可以因为取代的保守特性而向上调节校正。产生这种调整的方法对本领域的技术人员是众所周知的。见，例如，Pearson, Methods Mol.Biol.1994 ；243:307-31。有相似化学特性的侧链的氨基酸基团的例子包括I)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸；3)包含酰胺的侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链:半胱氨酸和蛋氨酸。代表性的保守氨基酸取代基团包括:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0079]发明详述
[0080]本发明基于结合抑制性KIRs的新交叉反应性和中和抗体的产生，该抗体允许在人群中的大多数或所有个体中NK细胞的有效地活化。
[0081]在本文所描述的是，例如结合KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的全部并通过阻断在这些KIRs和HLA-C之间的相互作用，加强NK细胞裂解活性的抗体。在本文将这类抗体称为“交叉反应和中和抗KIR mAbs”。
[0082]在特别方面，本发明涉及新的交叉反应性、中和性或交叉反应性和中和性二者、完全的人类抗KIR抗体，以及含有这种抗体的组合物和使用这种抗体或组合物的方法。这些抗体包括在申请于2004年7月I日的PCT/DK2004/000470中描述的人类抗体1-7F9和1-4F1，在本文通过参考将其全部并入本申请。
[0083]在本文描述的抗体、组合物和方法可以，除了其他方面之外，克服当前与KIR的治疗性调节和治疗性NK细胞活化有关的局限性，并提供附加的有利特征和益处。例如抗体能够与多种抑制性KIRs交叉反应并降低或中和他们的抑制信号，通过表达这种抑制性KIR受体的NK细胞，导致NK细胞细胞毒性的增强。与多种KIR基因产物交叉反应的能力可允许有效地使用本发明的抗体，在大多数或所有人类受试者中增加NK细胞活性，而没有预先测定受试者的KIR或HLA类型的 负担或花费。在【具体实施方式】中，抗体不结合KIR2DS4，因此避免了与活化KIR2DS4受体的中和有关的刺激性潜能的降低。另外地或可选择地，抗体不结合 KIR2DS3。
[0084]关于本发明的抗体，从这种抗体中，不同的抗体片段和衍生物同样可以产生并用于在本文描述的相同或相似的目的，并且关于抗体所述的本发明的方面同等地应用于抗体片段和衍生物，除非另作说明或明显地与上下文相矛盾。换句话说，除非另外指出，在本文描述的本发明关于抗体的特征应该，也含蓄地被理解为描述关于抗体片段或衍生物的相似特征，其中抗体片段或衍生物就特异性来说有相似功能性。然而，应该认识到“全长”抗体和抗体“片段”，由于它们的生物学和物理化学特性可能明显不同，能被表征为本发明的区别性方面。
[0085]本发明的一些抗体能表征为“人类”，其典型地与对于被施用该抗体的人类受试者对该抗体的免疫反应的低危险有关。在代表性的方面，描述了在实际上所有人中促进人类NK细胞的活化的分离的抗体。在代表性的【具体实施方式】中，抗体为人类抗体1-7F9或人1-7F9样抗体。
[0086]抗体、其片段或衍生物能与NK细胞表面的至少两种抑制性KIR受体交叉反应，减少或中和NK细胞的抑制性信号，并加强NK细胞的活性。例如抗体、抗体片段或衍生物可以结合人KIR2DL受体的共同决定簇，所以抗体、抗体片段或衍生物结合至少KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3受体。为了本发明的目的，术语“KIR2DL2/3”指的是KIR2DL2和KIR2DL3受体中任一种和二者。[0087]如在本文描述，抗KIR mAbsl-7F9和1-4F1相对于先前生产的抗KIR抗体有几个优势。例如1-7F9和1-4F1是完全人类的，因而一旦给受试者施用，减少或最小化任何针对抗体的免疫反应。此外，如下面所述，1-7F9和1-4F1 二者对于治疗性抗KIR抗体具有合适的同种型(分别为IgG4和IgG2)。在诱导表达KIR2DL1、_2和/或-3的NK细胞杀伤时，1-7F9比鼠mAbs EB6、GL183、DF200和NKVSFl (Pan2D)还更加有效得多。例如，如图5和6所示，1-7F9比EB6、DF200或NKVSFl (Pan2D)诱导更高的由表达HLA_Cw4的靶细胞的表达KIR2DL1的NK细胞产生的特异性裂解水平。1-7F9与以前已知的抗KIR mAbs比较还具有更高的亲和力。例如，1-7F9结合KIR2DL1和KIR2DL3，其解离常数(Kd，s)分别为0，43nM和0.025nM，表示对两种抗原的亲和力比，例如DF200更高(见实施例3和8)。与鼠抗体NKVSFl (Pan2D)、A210和A208g相反，1-7F9和1-4F1中没有一个结合KIR2DS4，使其更好地适于治疗目的。如同 NKVSFl (Pan2D)和 DF200，1-7F9 和 1-4F1 也结合 KIR2DS1 和 KIR2DS2，但认为KIR2DS1和KIR2DS2在抗白血病功效中是不重要的。因此根据本发明的特殊抗体具有与1-7F9和/或1-4F1相同或相似的抗原特异性。例如与1-7F9含有相同或相似的VH和VL区的抗体可以具有与1-7F9相同或相似的抗原结合和/或NK刺激性特性；并且与1-4F1含有相同或相似VH和VL区的抗体可以具有与1-4F1相同或相似的抗原结合特性。
[0088]如图14所示，1-7F9的VL和VH区的氨基酸序列已经确定:
[0089]1-7F9VL 区(SEQ ID NO: 15):
[0090]EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT
[0091]1-7F9VH 区(SEQ ID NO: 17):
[0092]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS
[0093]1-4F1VL和VH区的氨基酸序列分别以SEQ ID NOS:39和41提供，并且编码1-4F1VL和VH区的核苷酸序列分别以SEQ ID NOS:40和42提供。在一个【具体实施方式】中，SEQ ID NO:39 的残基 3、4、9、24、32、41、47、50、55、71 和 74 分别为 Q、L、S、R、A、G、L、D、E、F和A。在另一个【具体实施方式】中，SEQ ID NO:39的残基3、4、9、24、32、41、47、50、55、71和74 分别为 R、M、F、W、Y、A、F、Y、Q々PT。
[0094]如图15所示，1-7F9⑶Rs的氨基酸序列已经鉴定如下:轻链⑶Rl氨基酸序列对应于SEQ ID NO: 15的残基24-34 ;轻链CDR2氨基酸序列对应于SEQ ID NO: 15的残基50-56 ;轻链⑶R3氨基酸序列对应于SEQ ID NO: 15的残基89-97 ;重链⑶Rl氨基酸序列对应于SEQ ID NO: 17的残基31-35 ;重链CDR2氨基酸序列对应于SEQ ID NO: 17的残基50-65 ;重链CDR3氨基酸序列对应于SEQ ID NO:17的残基99-112。1_4F1CDRs的氨基酸序列已经鉴定如下:轻链⑶Rl氨基酸序列对应于SEQ ID NO:39的残基24-34 ;轻链⑶R2氨基酸序列对应于SEQ ID NO:39的残基50-56 ;轻链CDR3氨基酸序列对应于SEQ ID NO:39的残基89-97 ;重链CDRl氨基酸序列对应于SEQ ID NO:41的残基31-35 ;重链CDR2氨基酸序列对应于SEQ ID NO:41的残基50-66 ;重链CDR3氨基酸序列对应于SEQ ID NO:41的残基99-113。
[0095]完整的1-7F9轻和重链氨基酸序列分别以SEQ ID NOS:36和37提供。
[0096]因此，基于该信息，另外的抗体,例如不同的人类抗体亚类、抗体片段、抗体衍生物和其它结合KIR的肽，可以通过例如重组技术容易地进行生产。例如，在一方面，本发明提供了具有分别基本上由SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO:17组成的VL和VH序列的抗体，和/或具有分别基本上由SEQ ID N0:39和SEQ ID NO:41组成的VL和VH序列的抗体。在另一方面，本发明提供了含有基本上由上述描述的1-7F9或1-4F1VH CDR1-3和VL CDR1-3组成的CDR区的抗体。在另一方面，本发明提供了含有如下CDR区的抗体:轻链CDRl氨基酸序列对应于SEQ ID NO:15的大约残基24-34 ;轻链CDR2氨基酸序列对应于SEQ ID NO:15的大约残基50-56 ;轻链CDR3氨基酸序列对应于SEQ ID NO:15的大约残基89-97 ;重链CDRl氨基酸序列对应于SEQ ID NO:17的大约残基31-35 ;重链⑶R2氨基酸序列对应于SEQ IDNO: 17的大约残基50-65和重链CDR3氨基酸序列对应于SEQ ID NO:17的大约残基99-112。在另一方面，本发明提供了含有如下CDR区的抗体:轻链CDRl氨基酸序列对应于SEQ IDNO:39的大约残基24-34 ;轻链CDR2氨基酸序列对应于SEQ ID NO:39的大约残基50-56 ；轻链⑶R3氨基酸序列对应于SEQ IDNO:39的大约残基89-97 ;重链⑶Rl氨基酸序列对应于SEQ ID NO:41的大约残基31-35 ;重链CDR2氨基酸序列对应于SEQ ID NO:41的大约残基50-66和重链⑶R3氨基酸序列对应于SEQ ID NO:41的大约残基99-113。在另一方面，本发明提供了含有基本上由SEQ ID NO: 15的残基24-34组成的轻链⑶Rl氨基酸序列的抗体；含有由SEQ ID NO:15的残基50-56组成的轻链⑶R2氨基酸序列基本上；含有基本上由SEQ ID NO: 15的残基89-97组成的轻链CDR3氨基酸序列；含有基本上由SEQ ID NO:17的残基31-35组成的重链⑶Rl氨基酸序列；含有基本上由SEQ ID NO:17的残基50-65组成的重链⑶R2氨基酸序列和重链⑶R3氨基酸序列基本上由SEQ ID NO:17的残基99-112组成。在另一方面，本发明提供了含有如下⑶R区的抗体:基本上由SEQ ID NO:39的残基24-34组成的轻链CDRl氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:39的残基50-56组成的轻链CDR2氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:39的残基89-97组成的轻链⑶R3氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:41的残基31-35组成的重链CDRl氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:41的残基50-66组成的重链⑶R2氨基酸序列；和基本上由SEQ ID NO:41的残基99-113组成的重链⑶R3氨基酸序列。
[0097]本发明也包含抗KIR抗体、抗体片段或抗体衍生物或结合KIR的多肽，其含有至少一个与1-7F9或1-4F1VH或VL序列，或与其中的⑶R-区实质上相同的变异的氨基酸序列。变异的氨基酸序列可以含有或基`本上由与1-7F9或1-4F1⑶R，VH或VL区至少大约百分之 50、80、90、95、98 或 99 (例如大约 50_99%、大约 65_99%、大约 75-99% 或大约 85-99%)相同的氨基酸序列组成。变异的氨基酸序列也可以或可选择地含有1、2或3个CDRs，其含有或由与1-7F9或1-4F1⑶Rs至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的氨基酸序列组成。因而，在一方面，本发明提供了人类抗体，该抗体含有与SEQ ID N0:15或SEQ IDNO:39的残基24-34至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的轻链⑶Rl氨基酸序列；与SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO:39的残基50-56至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的轻链CDR2氨基酸序列；与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:39的残基89-97至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的轻链⑶R3氨基酸序列；与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:41的残基31-35至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的重链CDRl氨基酸序列；与SEQ ID NO:17的残基50-65或SEQ ID NO:41的残基50到66至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的重链⑶R2氨基酸序列；与SEQ ID NO:17的残基99-112或SEQ ID NO:41的残基99到113至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%相同的重链⑶R3氨基酸序列。1-7F9-或1-4F1-衍生的结合KIR的氨基酸序列的基本特性(其保留在这种变异的氨基酸序列中)期望地包括1-7F9或1-4F1序列对一个或多个KIRs的特异性和/或亲合力，并且还可以或可选择性地包括1-7F9在阻断KIR/HLA-C相互作用并加强NK细胞的裂解活性中的能力。
[0098]在另一方面，本发明提供了抗KIR抗体、抗体片段、或抗体衍生物、或结合KIR的多肽，其包含结合KIR的氨基酸序列，该氨基酸序列通过一个或多个的残基插入、缺失和/或取代，在一个或多个氨基酸残基(例如至少2、3、5，至少大约10、至少大约15、至少大约20、至少大约25、至少大约30、至少大约35、至少大约40、至少大约50或更多个的氨基酸残基)与1-7F9或1-4F1结合KIR的序列不同。在一个【具体实施方式】中，这种变异的结合KIR的序列给予了变异序列更大的亲和力；更大或不同的特异性；更小的免疫原性(根据对该序列的宿主反应)；在体内更大的稳定性；和/或相对于含有天然1-7F9或1-4F1序列的基本相同氨基酸序列的其它有益特性。在本文别处进一步描述了适当的序列变异。抗KIR抗体、抗体片段、或抗体衍生物、或结合KIR的多肽的结合KIR的部分也可以含有任意适当数量的非氨基酸成分或取代基，例如非氨基酸有机部分，其促进KIR结合和/或提供其它有利的物理化学或免疫学特性。
[0099]本发明的一些抗体还可以或选择性地通过其对一个或多个KIRs的结合亲和力表征。例如如在实施例3和8中所示，根据二价结合，DF200对KIR2DL1的Kd为大约IlnM ;和对 KIR2DL3 的 Kd 为大约 2.0nM,和 1-7F9 对 KIR2DL1 的 Kd 为大约 0.43nM,对 KIR2DL3 的 Kd为大约0.025nM。因此，在一方面，本发明提供了在与KIR2DL1 二价结合中，Kd不大于大约20nM、不大于大约llnM、不大于大约5nM、不大于大约InM、不大于大约0.5nM或不大于大约0.43nM的人类或非人类(例如鼠、嵌合的或人源化的)抗体。另外地或可选择地，本发明的人类或非人类(例如鼠、嵌合 的或人源化的)抗体对KIR2DL3的Kd可能不大于大约20nM、不大于大约2nM、不大于大约InM、不大于大约0.1nM、或不大于大约0.05nM或不大于大约0.025nM。在特殊方面，该抗体对KIR2DL1和KIR2DL3的二价结合的Kd值与1-7F9大约相同。如在实施例13所示，根据单价结合，1-7F9和1-4F1对KIR2DL3的Kd值分别为大约3.5和7nM。因此，在一方面，本发明提供了人类或非人类(例如鼠、嵌合的或人源化的)抗体，其单价结合KIR2DL3的Kd不大于大约20nM、不大于大约ΙΟηΜ、不大于大约7nM或不大于大约 3.5nM。
[0100]在适当条件(例如，关于温度、pH等，其将典型地反应人类正常或NK细胞相关疾病状态下，并且在含有所述序列或组合的合适的蛋白质的上下文中的生理状态)下，抗KIR抗体、抗体片段、或抗体衍生物、或结合KIR的多肽选择地和/或特异地(典型地特异地)结合至少一种KIR，并且更特殊地结合至少一种KIR的抗原决定簇区或表位。例如，在一方面，本发明涉及可以用(除了其它事情之外)与1-7F9U-4F1或1-7F9-或1-4F1样抗体竞争的能力表征的抗体，和涉及该抗体的不同方法。本发明的其它抗体(和/或在实践在本文描述创造性方法中有用的抗体)还可以或可选择地在具有与抗体DF200、抗体NKVSF1、抗体EB6和抗体GL183中的一个或多个竞争的能力方面进行表征。
[0101]通过特异地抑制MHC和/或HLA分子结合至少两种抑制性KIR受体并促进NK细胞活性，本发明的交叉反应性和中和性抗KIR抗体、抗体片段或衍生物降低或中和KIR的抑制活性，这意思是指这类抗体、片段或衍生物允许在其表面表达抑制性KIR受体的NK细胞能裂解细胞，该细胞表达与所述特殊的抑制性KIR受体相应的HLA配体(例如特殊的HLA抗原)。在一方面，本发明提供了特异性抑制HLA-C分子与KIR2DL1和KIR2DL2/3受体结合的抗体。在另一方面，本发明提供了抑制KIR2DL1和/或KIR2DL2/3结合HLA-C的抗体。还有另一方面，本发明提供了在体内和/或体外促进NK细胞活性的抗体。
[0102]KIR2DL1或KID2DL2/3的至少一个存在于至少90 %或更多的人口中，并且本发明更优选的抗体能加强表达这些KIR任一或二者的NK细胞活性。因此，本发明的组合物可以在大多数的人类个体中，典型地在大约90%或更多的人类个体中，用于有效地活化或加强NK细胞。因此，根据本发明的单一抗体组合物可以用于治疗大多数人类受试者，并且很少需要确定KIR-或HLA-等位基因组或使用两个或更多个抗KIR mAbs的混合物。
[0103]在一方面，抗体特异地结合KIR2DL1和KIR2DL2/3两个人类受体，并且逆转由这些KIRs介导的NK细胞细胞毒性抑制。抗体同样可以为人类而且与单克隆抗体1-7F9和/或1-4F1竞争。术语“竞争”当指的是特殊的成对抗体(例如选自DF200、NKVSFl (Pan2D)、1-7F9、EB6和GL183的一个或更多抗体)时，意思是在结合试验中，使用重组KIR分子或细胞表面表达的KIR分子，第一抗体可检测地与第二抗体(或其它分子)竞争。例如，在一方面，不管那个抗体用作第一抗体，当对某抗体对的抑制百分比超过大约20%、超过大约30%、超过大约40%、超过大约50%时，该抗体竞争。可选择地，如果对某抗体对的抑制作用百分比平均为至少大约29%、至少大约30%、至少大约40%或至少大约50%，该抗体竞争。第一抗体对第二抗体结合KIR2D蛋白质的抑制百分比可以按照100*(1-(检测到的结合第二抗体)/(检测到的第一抗体的结合))计算。相同的应用于抗体片段和抗体衍生物。除非另有说明，与1-7F9、1-4F1或1-7F9-或1-4F1样抗体“竞争”的抗体可以与1_7F9、1_4F1或1-7F9-或1-4F1样抗体竞争结合人类KIR2DL1、人类KIR2DL2/3或人类KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者。例如，抗体DF200与1-7F9和1-4F1竞争结合到KIR2DL3。
[0104]任选地，与1-7F9或1-4F1竞争的抗体分别地不是1-7F9或1-4F1自身(也就是本发明提供了不是1-7F9和1-4F1的抗体，其特征为，尤其是在结合这些KIRs中的一个或两个中与1-7F9和/或1-4F1竞 争的能力)。
[0105]在另一方面，该抗体结合KIR2DL1和KIR2DL2/3两个人类受体，降低或中和或逆转这些KIRs介导的NK细胞细胞毒性的抑制，并且与1-7F9竞争结合KIR2DL1人类受体，KIR2DL2/3人类受体，或KIR2DL1和KIR2DL2/3两个人类受体。任选地，所述抗体为嵌合的、人类的或人源化抗体。
[0106]在另一方面，抗体结合KIR2DL1和KIR2DL2/3两个人类受体，降低或中和或逆转这些KIRs介导的NK细胞细胞毒性的抑制，并且与EB6竞争结合KIR2DL1人类受体，或与GL183和/或DF200竞争结合KIR2DL2/3人类受体，或既与EB6竞争结合KIR2DL1人类受体而且又与GL183和/或DF200竞争结合KIR2DL2/3人类受体。在一个【具体实施方式】中，抗体不是NKVSFl (Pan2D)，不是A210，不是A803g和/或不是DF200。抗体可以是例如鼠的、嵌合的、人类的或人源化抗体。
[0107]在另一方面，抗体含有至少实质上与1-7F9或1-4F1的VH和/或VL区相同的VH，VL，或VH和VL两个区。抗体可以具有任意亚类，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在特殊方面，抗体为人类IgG4抗体。在另外特殊方面，抗体为人类IgG2抗体。抗体可以为嵌合的、人类的或人源化的抗体。
[0108]在另一方面，抗体为人类的，与1-7F9或1-4F1竞争，并且如单克隆抗体1-7F9或1-4F1，对至少部分相同或相同KIR分子上的表位或“表位部位”识别、结合或具有免疫特异性。优选地，所述KIR分子为人类KIR2DL1或KIR2DL2/3受体。
[0109]在另一方面，抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3两个人类受体中的共同决定簇，并且降低、中和或逆转这些KIRs介导的NK细胞细胞毒性的抑制作用。如单克隆抗体1-7F9，抗体可更加特异地结合至少部分相同、实质上相同，或相同的KIR上的表位。
[0110]在特殊方面，抗体为显示一个或更多上述特征的单克隆抗体。
[0111]在另一方面，在本文描述的抗体的功能性片段和衍生物可以进行制备，其有实质相似的抗原结合、特异性和/或活性，包括不限于Fab片段、Fab’ 2片段、免疫粘附素、双抗体、camelized 抗体、Janusins、小体、CDRs 和 ScFv 片段。
[0112]除非另有说明，抗体或其二价片段或衍生物是单特异性的，也就是抗体，片段，或衍生物的两个“臂”结合相同抗原。
[0113]在还有另外的方面，可以制备含有本发明抗体、缀合或共价结合毒素、放射性核素、可检测到的部分(例如氟石)或固体载体的抗体衍生物。
[0114]本发明也包含含有上述公开的抗体，其片段，或其任一衍生物的药物组合物。因此，本发明也涉及在本文公开的抗体在生产药物方法中的用途。在优选的【具体实施方式】中，药物或药物组合物用来治疗癌症或其它增殖性障碍、感染或用于移植。
[0115]在一方面，本发 明涉及含有抗体的组合物(例如为药物施用配制的组合物，制备这种组合物的试剂盒，分析试剂盒或介质，纯化介质等)，其中所述抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物，并能中和KIR介导的NK细胞的抑制细胞毒性，该NK细胞表达至少所述两种不同人类抑制性KIR受体中的一种，其中抗体合并入脂质体中。脂质体也可以含有附加物质，例如例如，传输基因用于基因治疗的核酸分子；传输反义RNA，RNAi,或siRNA来抑制NK细胞中基因的核酸分子；或用来NK细胞靶向杀伤的毒素或药物。
[0116]在本文也描述了在体外、离体或在体内调节人类NK细胞活性的方法，它包括用有效量的本发明抗体、这种抗体的片段、其任一的衍生物，或包含其任意至少一种的药物组合物接触人类NK细胞。优选的方法包括施用有效量的本发明药物组合物并指向增加人类NK细胞的细胞毒活性，最优选离体或在体内，在患有癌症、感染性疾病或免疫疾病的受试者中。例如，施用可以通过给有癌症或感染性疾病(例如病毒病)的患者静脉内输注在适当缓冲剂中的抗体来实现。
[0117]本发明也提供了组合物，该组合物含有结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的抗体，其中抗体能中和在表达该两种不同的人类抑制性KIR受体中的至少一种的NK细胞中KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制作用，该抗体以可以以有效可检测地加强患者或含有NK细胞的生物样品中的NK细胞细胞毒性的量存在；和药学上可接受的载体或赋形剂。优选地，该抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。含有本发明抗体的组合物可以任选地进一步含有第二种治疗药(诱导、促进和/或增强宿主中的疗效的药剂，该宿主与为之而施用抗体的病症或障碍相关-例如与癌症、移植、感染性疾病、病毒感染等相关的病症)。在一方面，可以与本发明的抗体以这种联合组合物共同施用的第二治疗药可以选自，例如免疫调节剂、激素药剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、对非KIR抗原特异的第二抗体，任选地结合并抑制并中和抑制性KIR，或减少来自抑制性KIR的信号的第二抗体，抗感染剂、靶向剂或辅助化合物。有利的免疫调节剂可以选自IL-1a、IL_li3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF- β、GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF- a、TNF- β、LAF、TCGF, BCGF, TRF、BAF、BDG、ΜΡ、LIF、OSM、TMF、PDGF, IFN-a、IFN-β或IFN-Y。化学治疗剂的例子包括烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、阿霉素、放线菌素D、丝裂霉素、洋红霉素、道诺霉素、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春烯碱、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、三胺硫磷、甲氨蝶呤、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、顺钼(CDDP)、氨喋呤、考布他汀、其它长春花属生物碱类(alkyloids)和其衍生物或前药。激素药剂的例子包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫昔芬、托瑞米芬、氟利坦、尼鲁米特、环丙孕酮酯比卡鲁胺阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、甲羟(medroxy)法倔唑、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH激动剂、其它抗雌激素类、其它抗雄激素、其它芳香酶抑制剂和其它结合孕激素类。优选地，结合和抑制抑制性KIR受体的第二抗体是结合抑制性KIR受体的表位的抗体或其衍生物或片段，该表位不同于与存在于至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物上的共同抗原决定簇结合的抗体结合的表位。在另一方面，第二抗体可以指向与疾病状态相关的靶标，该疾病状态通过施用本发明的抗体至少可部分地治疗(例如与癌症相关的抗原，病毒感染相关抗原等)。
[0118]本发明进一步提供了在需要其的患者中可检测地加强NK细胞活性的方法，它包括给患者施用根据本发明的组合物的步骤。需要NK细胞活性增强的患者可以为诊断为患有疾病或障碍的任何患者，在该疾病或障碍中这种增强可以促进、增强和/或诱导疗效(或促进、增强和/或诱导这样一种效果，至少在相当比例的患有所述疾病或障碍和与所述患者实质上相似特征的患者中一如可以通过例如临床试验确定)。需要这种治疗的患者可以患有，例如癌症、另外的增殖性障碍、感染性疾病或免疫障碍。优选地，该方法包括给患者施用适当的附加治疗药的附加步骤，该附加的治疗药选自免疫调节剂、激素药剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、对不同于KIR的抗原特异的第二抗体，任选地结合并抑制并中和抑制性KIR受体，或减少来自抑制性KIR的信号的第二抗体、抗感染剂、靶向剂或辅助化合物，其中所述附加治疗药作为与所述抗体一起的单一剂量形式或作为分离的剂量形式给所述患者施用。抗体(或抗体片 段/衍生物)的剂量和附加治疗药的剂量共同地足够可检测地诱导、促进和/或增强患者的治疗反应，其包含NK细胞活性的增强。当分别地施用时，抗体、片段或衍生物和附加治疗药是在对患者引起可检测到的联合治疗益处的情况下合乎需要地施用。
[0119]本发明进一步包括能在非人类灵长类，优选猴中特异地结合NK细胞和/或KIR受体的抗体。也包括用来评价为候选药物的本发明抗体的毒性、剂量和/或活性或功效的方法。在一方面，本发明包括通过对具有NK细胞的非人类灵长类动物接受者施用本发明的抗体，并评价该药剂对动物或优选地对靶组织的任何有毒的或有害的或不良效果，来确定对动物或靶组织有毒的抗体剂量的方法。在另一方面，本发明是通过对具有NK细胞的非人类灵长类动物接受者施用本发明的抗体，并评价该药剂对动物或优选地对靶组织任何有毒的或有害的或不良效果，来鉴别对动物或靶组织有毒的抗体的方法。在另一方面，本发明是用来鉴别有效治疗感染、疾病或肿瘤的抗体的方法，其是通过给非人类灵长类感染、疾病或癌症模型施用本发明的抗体，并鉴别改善感染、疾病或癌症，或其症状的抗体进行的。在一个实施方式中，本发明所述抗体是(a)与人类NK细胞表面上至少两种抑制性人类KIR受体交叉反应的抗体，和(b)与非人类灵长类的NK细胞或KIR受体交叉反应的抗体。
[0120]本发明进一步包括在生物样品或活生物中，检测在其细胞表面上具有抑制性KIR的NK细胞存在的方法，所述方法包括如下步骤:
[0121]a)用本发明的抗体接触所述生物样品或活体，其中所述抗体缀合或共价结合可检测的部分；并且
[0122]b)在所述生物样品或活生物中检测所述抗体的存在；
[0123]本发明也提供了从样品中纯化在其细胞表面上具有抑制性KIR的NK细胞的方法，它包括如下步骤:
[0124]a)在允许所述在其细胞表面上具有抑制性KIR的NK细胞结合所述抗体的条件下，用本发明的抗体接触所述样品，其中所述抗体缀合或共价结合到固体载体(例如，珠，基质等)；并且
[0125]b)从所述缀合或共价结合到固体载体的所述抗体中，洗脱所述结合的NK细胞。
[0126]已发现，抗体NKVSFl (Pan2D)也结合来自猕猴的NK细胞，见图10。
[0127]因此本发明提供抗体，以及其片段和衍生物，其中所述抗体、片段或衍生物与人类NK细胞表面上的至少两种抑制性人类KIR受体交叉反应，并且此外它还结合来自猕猴的NK细胞。在这方面的一个实施方式中，抗体不是抗体NKVSF1、不是A210和/或不是A802g。本发明也提供了测试抗体、以及其片段和衍生物毒性的方法，其中所述抗体、片段或衍生物与在人类NK细胞表面上的至少两种抑制性人类KIR受体交叉反应，其中该方法包含检测猕猴中的抗体。
[0128]在进一步方面，本发明`提供了抗体、抗体片段或其任一的衍生物，其包含抗体1-7F9或1-4F1的轻链可变区或一个或更多的轻链可变区⑶Rs。还有另一方面，本发明提供了抗体、抗体片段或其任一的衍生物，其包含与1-7F9或1-4F1的全部或基本全部轻链可变区序列高度相似的序列。
[0129]在进一步方面，本发明提供了抗体、抗体片段或其任一的衍生物，其包含抗体1-7F9或1-4F1的重链可变区或一个或更多的重链可变区⑶Rs。还有另一方面，本发明提供了抗体、抗体片段或其任一的衍生物，其包含与1-7F9或1-4F1的全部或基本全部重链可变区序列高度相似的序列。
[0130]抗体
[0131]本发明提供了新的抗体和其片段或衍生物，其结合在人类抑制性KIR受体中保受的的共同决定簇，优选地包括存在于至少两种不同的KIR2DL基因产物上，但是不在KIR2DS4上的决定簇，并且其引起表达至少那些KIR受体之一的NK细胞的增强。本发明首次公开了，可以生产这种交叉反应和中和抗体，并有效地用于NK细胞活性的调节，其代表意想不到的结果并打开了一条通往新的和有效的基于NK的治疗，特别是在人类受试者中的治疗的大道。
[0132]在本发明的上下文中，“共同决定簇”表示由人类抑制性KIR受体的多种基因产物共享的决定簇或表位。优选地，共同决定簇由KIR2DL受体群的至少两个成员共享。更优选地，决定簇由至少KIR2DL1和KIR2DL2/3共享。本发明的某些抗体，可以除了识别KIR2DL类型的多种基因产物之外，也识别存在于其他抑制性KIRs上的决定簇，例如KIR3DL受体群的基因产物；例如KIR3DL1和/或KIR3DL2。决定簇或表位可以代表由所述成员共享的肽片段或构象表位。在更为具体的实施方式中，本发明的抗体特异地结合单克隆抗体DF200识别的实质上相同的表位。该决定簇存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者上。在另一个优选的【具体实施方式】中，本发明抗体特异地结合由人类mAbl-7F9识别的实质上相同表位，或人类mAbl-4Fl识别的表位，所述表位存在于KIR2DL1、-2和-3上，但不在KIR2DS4上。
[0133]除非另作说明或明显地与上下文相矛盾，如在本文所使用，术语“抗体，”指的是多克隆和单克隆抗体，以及所述多克隆和单克隆抗体的片段和衍生物。根据重链恒定区的类型，全长抗体典型地分配到五个主要类型之一:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的几个进一步分为亚类或同种型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为“ α、” “ δ、” “ ε、” “ Y ”和“ μ ”。不同类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型已经众所周知。IgG和/或IgM为本发明中使用的优选种类抗体，因为它们是生理状态下最普通的抗体，并且因为它们最易于在实验室环境中制备。典型地，本发明上下文中的“抗体”指的是单克隆抗体，更优选“人类”单克隆抗体。
[0134]为了治疗目的，本发明的一个【具体实施方式】提供了阻断抑制性KIR和其在体内对应的HLA配体相互作用的方法，其包括内源性NK细胞的活化。在这种环境中，避免耗尽NK细胞可能是有利的，因为如果耗尽，NK细胞不能发挥其治疗的有益效果。因此，抗体同种型例如IgG4和IgG2，其显示对Fe-受体的很少结合，并且不活化补体系统，为典型的优选。1-7F9的同种型为IgG4。也通常认为IgG2抗体是非耗尽的，并可能也是比IgG4抗体更稳定的分子，因此具有更长的体内半衰期。1-4F1是IgG2同种型。
[0135]抗体生产
[0136]本发明的抗体可以通过本领域已知的多种技术进行生产。典型地通过用包含抑制性KIR多肽，优选KIR2DL多肽，更优选人类KIR2DL多肽的免疫原免疫非人类动物，优选小鼠进行生产。抑制性KIR多肽可以含有人类抑制性KIR多肽的全长序列，或其片段或衍生物，典型地为免疫原性片段，也就是含有暴露在表达抑制性KIR受体的细胞表面上的表位的多肽部分。这种片段典型地包含成熟多肽序列的至少大约7个连续氨基酸，甚至更优选地它的至少大约10连续的氨基酸。典型地，片段基本上来源于受体的胞外域。甚至更优选的是人类KIR2DL多肽，其包括至少一个，更优选地两个全长KIRDL多肽的细胞外免疫球蛋白域，并且能模仿存在于KIR2DL受体内至少一个构象表位。在其他【具体实施方式】，所述多肽含有KIR2DL1多肽的1-224位氨基酸的细胞外免疫球蛋白域的至少大约8个连续氨基酸(根据Wagtmann等，Immunityl995 ；2:439-449的氨基酸编号，其在本文通过参考以其全部并入本申请，或根据在万维网(www)地址 ncb1.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082, htm发现的PROW互联网站点)。
[0137]在一个【具体实施方式】中，免疫原含有脂膜中，典型地在细胞表面上的野生型人类KIR2DL多肽。在特殊的【具体实施方式】中，免疫原含有完整的NK细胞，特别是完整的人类NK细胞。在另一个【具体实施方式】中，细胞经过裂解和以其它方式被处理，以致不是完整的。在给非人类哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、狗、绵羊、豚鼠、大鼠、仓鼠等施用前，免疫原可以，例如悬浮或溶解于缓冲液中，该缓冲液任选地含有佐剂，例如完全弗氏佐剂。
[0138]用抗原免疫非人类哺乳动物的步骤可以以本领域众所周知的任何刺激小鼠中抗体的产生的方式进行(见，例如 E.Harlow 和 D.Lane, Antibodies:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY(1988))。然后免疫原悬浮或溶解于缓冲液，任选地有佐剂，例如完全弗氏佐剂。确定免疫原数量、缓冲液类型和佐剂数量的方法对本领域技术人员是众所周知的，并且不以任何方式对本发明进行限制。这些参数对不同的免疫原可以是不同的，但可容易地阐明。
[0139]相似地，与足够刺激抗体产生的免疫部位和频率的选择相关的原理，在本领域也是众所周知的。在有代表性的免疫方案中，在第一天和大约一周后再次用抗原腹膜内注射非人类动物。然后在大约20天，任选地与不完全弗氏佐剂一起，恢复注射抗原。该恢复注射静脉内进行而且可以重复几个连续日。然后在第40天，静脉内或腹膜内，典型地不用佐剂，加强注射。该方案导致大约40天后产生抗原特异的产生抗体的B细胞。也可以应用其他的方案，只要他们导致表达抗体的B细胞的产生，该抗体针对在免疫中使用的抗原。
[0140]对于多克隆抗体制备，从免疫的非人类动物中获得血清，并且将其中存在的抗体通过众所周知的技术进行分离。血清可以使用上面陈述的连接到固体载体的任意免疫原进行亲和纯化，以便获得与抑制性KIR受体反应的抗体。
[0141]在可替代的【具体实施方式】中，从未免疫的非人类哺乳动物中分离淋巴细胞，在细胞培养物中在体外生长，并然后暴露于免疫原。然后收获淋巴细胞并进行下面描述的融合步骤。
[0142]对于单克隆抗体，下一个步骤是从免疫的非人类哺乳动物中分离脾细胞，并且随后为了形成产生抗体的杂交瘤，这些脾细胞与免疫的细胞融合。从非人类哺乳动物中分离脾细胞在本领域是众所周知的，并且典型地包括从麻醉的非人类哺乳动物中取出脾，将它切为小块并从脾被膜挤出脾细胞并通过尼龙筛网的细胞过滤器进入适当的缓冲液中以产生单细胞悬液。洗涤细胞，离心并在裂解任何红细胞的缓冲液中重悬。该溶液再一次离心而且在颗粒沉淀中保留的淋巴细胞最终在新鲜缓冲液中重悬。
[0143]一旦得以分离并存在于单细胞悬液中，淋巴细胞可以与无限增殖细胞系融合。这典型的是小鼠骨髓瘤细胞系，虽然本领域已知许多其它对产生杂交瘤有用的无限增殖细胞系。优选的鼠骨髓瘤细胞系包括，但不限于来源于M0PC-21和MPC-1l小鼠肿瘤的那些(从 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.美国可以得到)或X63Ag8653和SP_2细胞系(可从美国典型培养物保藏中心，Rockville, Mary美国获得)。细胞融合是使用聚乙二醇或类似物实现的。然后将得到的杂交瘤生长于包含一种或更多抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的选择性培养基中。例如如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤，氨基喋呤，和胸腺嘧啶(HAT培养基)，该物质预防缺乏HGPRT的细胞的生长。
[0144]杂交瘤典型地在巨噬细胞饲养层上生长。巨噬细胞优选地来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物同窝仔，并且典型地在平板接种杂交瘤之前数天用不完全弗氏佐剂处理。融合方法在 Goding, “Monoclonal Antibodies:Principles andPractice, ”pp.59-103 (Academic Press, 1986)中进行了描述， 在本文公开内容通过参考合并入本申请。
[0145]为了克隆形成和抗体产生，允许细胞在选择培养基中生长足够的时间。这通常在大约7到大约14天之间。然后分析杂交瘤克隆的与多种抑制性KIR基因产物交叉反应的抗体的产生。虽然可以使用多种其它类型的测定，包括免疫沉淀法和放射免疫测定法或FACS、Biacore、闪烁亲近测定法(SPA)或本领域众所周知的其它类型的测定，该测定典型地为比色性ELISA类测定。检查含有具有期望特异性的抗体的孔以确定是否存在一个或更多区别性的杂交瘤细胞克隆。如果超过一个克隆存在，细胞可以进行再克隆并生长以保证只有单个细胞产生生产期望抗体的克隆。具有单一明显克隆的阳性孔典型地再克隆并再分析以确保只有一种单克隆抗体被检测到并产生。[0146]在优选的【具体实施方式】中，根据本发明可应用的方法用于产生抗体的非人类动物是哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)、牛、猪、马、兔、山羊、绵羊等。另外，非人类哺乳动物可以通过基因修饰或基因工程产生“人类”抗体，例如Xenomouse?(Abgenix)或HuMAb-Mouse? (Medarex),如下所描述。
[0147]抗体也可以转基因地通过对目标免疫球蛋白重链和轻链序列来说为转基因的脊索动物(例如哺乳动物或禽)或植物的传代产生，并从中产生可回收形式的抗体(见，例如 Ma 等，Nature Rev.Genetics4:794-805 (2003) ；Nolke 等，Expert Opin BiolTher.20030ct ;3 (7):1153-62 ;Schillberg 等，Cell Mol Life Sc1.2003Mar ；60(3):433-45 ；Tekoah 等，Arch Biochem Biophys.2004Junl5 ；426 (2):266-78 ；Fischer 等，Eur.J.0f Biochem.,262(3):810(1999);和关于在植物中产生抗体和抗体样蛋白质的美国专利申请20030084482)。关于在哺乳动物中的转基因生产，可以在山羊、奶牛或其它哺乳动物中生产抗体和其他蛋白质，并且从山羊、奶牛或其他哺乳动物中回收。见，例如，美国专利5，827，690，5，756，687，5，750，172，和5，741，957。抗体也可以在禽蛋中生产并从其中回收。见，例如，Tini 等，Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol.2002Mar ； 131 (3):569-74 和美国专利 4，550，019。
[0148]抗体也可以通过免疫球蛋白的组合文库的选择进行生产，如例如在Ward等，Nature, 341 (1989) p.544 中所公开。
[0149]根据另外的【具体实施方式】，本发明提供了来源于非人类宿主B细胞的杂交瘤，其中所述B细胞产生结合存在于至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物上的决定簇的抗体，并且所述抗体能中和所述受体的抑制活性。更为优选地，本发明这方面的杂交瘤不是产生单克隆抗体NKVSF1、不是A210和/或不是A802g的杂交瘤。根据本发明这方面的杂交瘤，可以如上所述，通过来自免疫的非人类哺乳动物的脾细胞与无限增殖细胞系融合产生。如在本文在别处所描述，可以对该融合产生的杂交瘤进行筛选这种交叉反应抗体的存在。优选地，杂交瘤产生识别存在于至少两种不同的KIR2DL基因产物上的决定簇的抗体，并引起表达至少那些KIR受体之一的NK细胞的增强。甚至更加优选地，杂交瘤产生与1-7F9结合实质上相同表位或决定簇而且加强NK细胞活性的抗体，或与1-4F1结合实质上相同表位的抗体。最优选地，杂交瘤是产生单克隆抗体1-7F9的杂交瘤1-7F9，或产生单克隆抗体1-4F1的杂交瘤1-4F1。
[0150]证实产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基，例如DMEM或RPM1-1640中大量生长。可选择地，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水瘤生长。
[0151]在足够生长以产生期望的单克隆抗体之后，包含单克隆抗体的生长培养基(或腹水)可以与细胞分离，并且纯化单克隆抗体。纯化典型地通过使用蛋白A或蛋白G-Sepharose,或连接固体载体例如琼脂糖或Sepharose珠的抗小鼠免疫球蛋白的色谱法(全部描述，例如在 the Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences,publication N0.18-1037-46，AC版中，公开的内容通过参考将它并入本申请)，或通过其它已知技术例如电泳或透析完成。结合的抗体典型地通过使用低PH缓冲液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸盐缓冲液)，用包含抗体部分的立即中和从蛋白质A/蛋白质G柱洗脱。这些部分可以根据需要进行混合、透析和浓缩。
[0152]人类抗体
[0153]在一方面，本发明提供了人类抗KIR抗体。〃人类〃抗体与〃人源化的〃抗体是有区别的(其分别描述如下)。这种"人类"抗体可以包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外由随机或位点特异的诱变或通过在体内体细胞突变引入的突变)，例如在⑶Rs内，例如⑶R3内。然而，如在本文所使用，术语〃人类抗体"，不打算包括人源化的抗体或人类/小鼠嵌合抗体，其中来源于另外的哺乳动物物种，例如小鼠的种系的⑶R序列已经移植到人类框架序列上。
[0154]含有人免疫球蛋白基因的转基因动物能够而且已经开发，免疫后，在没有小鼠免疫球蛋白产生的情况下，产生全套人类抗体。可以应用这种人类免疫球蛋白转基因小鼠产生人类抗体。这种人类抗体可以在含有人类免疫球蛋白基因座和天然的免疫球蛋白基因缺失的人类免疫球蛋白转基因动物(例如小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛、马等)中，例如在Xeno Mouse?(Abgenix - Fremont, CA, USA)中产生(见，例如 Green 等 Nature Genetics7:13-21 (1994) ;Mendez 等Nature Geneticsl5:146-156 (1997) ;Green和 Jakobovits J.Exp.Med.188:483-495(1998);欧洲专利 N0.EP 0 463 151 BI ;国际专利申请 Nos.TO94/02602、W096/34096、W098/24893、W099/45031、W099/53049 和 W000/037504 和美国专利 5，916，771、5，939，598,5, 985，615,5, 998，209,5, 994，619,6, 075，181,6, 091，001,6, 114，598 和6，130，364)或在含有人类免疫球蛋白编码基因的微卫星基因座的转基因动物，例如HuMab-Mouse?(Medarex-Princeton，NJ, USA)中产生(见，例如 EP0546073，EP0546073 ；美国专利 Nos.5，545，807、5，545，806、5，625，825、5，625，126、5，633，425、5，661，016、5，770，429、5，789，650、5，814，318、5，591，669、5，612，205、5，721，367、5，789，215、5，643，763 和国际专利申请 N os.W092/03918、W092/22645、W092/22647、W092/22670、W093/12227、W094/00569、W094/25585、W096/14436、W097/13852 和 W098/24884)。如在本文所述，根据熟知技术，可以使用来自这种转基因小鼠的脾细胞以产生分泌人类单克隆抗体的杂交瘤。相似的技术和原理在，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90:2551-255 (1993) ; Jakobovits 等，Nature, 362:255-258 (1993);和 Bruggemann 等，Year inImmun0.，7:33(1993))中进行了描述。
[0155]进一步，人类抗体或来自其它物种的抗体可以通过展示类技术，包括不限于，噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它相关技术，使用本领域众所周知的方法产生，并且得到的分子可以进行附加的成熟方法，例如亲和力成熟，因为这种技术也是众所周知的(见，例如(Hoogenboom 等.，J.Mol.Biol.227:381 (1991)(卩遼菌体展示)；Vaughan,等，Nature Biotechl4:309 (1996)(卩遼菌体展不)；Hanes 和 Plucthau PNAS USA94:4937-4942(1997)(核糖体展示)；Parmley 和 Smith Gene73:305-318(1988)(噬菌体展示)；Marks 等，J.Mol.Biol.，222:581 (1991)，Scott TIBS17:241-245 (1992) ；Cwirla 等PNAS USA87:6378-6382(1990) ；Russel 等 Nucl.Acids Research21:1081-1085(1993)；Hoganboom 等 Immunol.Reviewsl30:43-68 (1992) ；Chiswell 和 McCafferty TIBTECH10:80-84(1992)，和美国专利5，733，743)。如果利用展示技术生产不是人类的抗体，这种抗体可以被人源化，例如如在本文在别处所描述。
[0156]因此，如在本文所述，抗KIR mAbs对治疗癌症和病毒感染和其它疾病和障碍是有前途的物质。抗KIR mAbs可以通过不同的方法,例如鼠mAbs的人源化或通过来自人类免疫球蛋白转基因小鼠(XenoMouse或HuMab小鼠)的脾细胞融合，通过噬菌体展示或通过人类产生Ab的B细胞的无限增殖化，或通过其它方法产生。在任一情况下，在需要它时，抗体可以通过细胞系产生并以适于配制、包装和注入患者的数量进行纯化。
[0157]重组产生
[0158]抗KIR抗体也可以通过在单细胞生物，例如酵母中；或在细菌细胞培养物(例如在大肠村菌(E.coli)中);或在真核细胞培养物中(例如在哺乳动物细胞培养物中)，使用标准技术重组表达进行制备。
[0159]因而，根据备择的【具体实施方式】，编码交叉反应和中和性抗KIR抗体重链和轻链的DNA(所述抗体结合存在于至少两种不同的人类抑制性KIRs上的决定簇)从本发明的杂交瘤中分离并为了转染到适当的宿主中，放于适当的表达载体中。然后该宿主用于抗体，或其变体的重组生产，例如所述单克隆抗体的人源化形式、抗体的活性片段或含有抗体的抗原识别部分的嵌合抗体。优选地，用于该【具体实施方式】中的DNA编码识别存在于至少两种不同的KIR2DL基因产物上，但不在KIR2DS3或-4上的决定簇的抗体，并且该抗体引起表达那些KIR2DL受体中的至少一种NK细胞的增强。甚至更为优选地，DNA编码与1-7F9的抗体结合实质上相同表位或决定簇，并且加强NK细胞活性的抗体。最优选地，DNA编码单克隆抗体1-7F9。
[0160]编码本发明单克隆抗体的DNA使用常规步骤，容易地分离和测序(例如通过使用能特异地结合编码鼠或人类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离，DNA可以放入表达载体中，然后将表达载体`转染入不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。在细菌中重组表达编码抗体片段的DNA在本领域是众所周知的(见，例如 Skerra 等，Curr.0pinion in Tmmunol.,5, pp.256(1993);和 Pluckthun, Tmmunol.Revs.130,pp.151 (1992))。
[0161]另外，由已知可变重链(VH)区和可变轻链区(VL)和人类恒定区重组生产抗体已经通过下面文献进行了描述，例如Ruker等(Annals of the New York Academy ofSciences.1991 ；646:212-219)，他报告了人类单克隆抗HIV-1抗体在CHO细胞中的表达；Bianchi 等(Biotechnology 和 Bioengineering.2003 ；84:439-444)，他描述了使用反式互补表达载体的全长抗体的高水平表达；No Soo Kim等(Biotechnol.Prog.2001 ;17:69-75)，他描述了在二氢叶酸还原酶介导基因扩增中，在CHO细胞的人源化的抗体表达中克隆变异存在的关键决定簇；King等(Biochemical Journal.1992 ；281:317-323)，他报告了小鼠-人类嵌合的抗体和嵌合的Fab’片段的表达，纯化和特征；W02003064606描述了分离的人类单克隆抗体，该抗体含有人重链和轻链可变区，两者含有FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、CDR3和FR4序列；和W02003040170描述了嵌合的或人类单克隆抗体和抗原结合部分，其特异地结合并活化人类⑶40。[0162]编码人类IgG恒定区的全部cDNA序列可以在下面GenBank条目中发现,其每一项在本文通过参考将其并入本申请中，获取在2005年I月6日登入。
[0163]人类IgGl恒定重链区=GenBank登记入册号# J00228
[0164]人类IgG2恒定重链区=GenBank登记入册号# J00230
[0165]人类IgG3恒定重链区=GenBank登记入册号#:X04646
[0166]人类IgG4恒定重链区:GenBank登记入册号#:K01316
[0167]人类K轻链恒定区=GenBank登记入册号# J00241。
[0168]在代表性【具体实施方式】中，为生产从1-7F9或1-4F1VH和VL序列产生的重组mAb，可以应用下列方案。步骤1-3描述了从杂交瘤或其他产生1-7F9或1-4F1的细胞中检索VH和VL区。然而，用于步骤4中的编码1-7F9或1-4F1VH和VL序列(或其突变体或衍生物)的cDNA，也可以使用建立好的合成DNA片段的技术，从图14或15中提供的序列信息进行制备。备择地，为了表达全长抗体，1-7F9或1-4F1，或其突变体或衍生物的VH和VL片段可以克隆入包含期望的免疫球蛋白亚类恒定区的科学文献中描述的许多表达载体的任一和/或商业上可获得的表达载体。另外地，为了表达抗体片段(例如Fab片段)，1-7F9或1-4F1，或其突变体或衍生物的VH和VL片段可以克隆入编码截短的恒定区的载体。商业上可获得载体的一个例子是PASK84，可以从ATCC(美国典型培养物保藏中心，目录号87094)得到。
[0169](I)从杂交瘤细胞中分离总RNA
[0170]使用Qiagen的RNea sy小试剂盒,根据厂商说明书，分泌针对人类KIR抗体的4xl06杂交瘤细胞(例如1-7F9或1-4F1)用于分离总RNA，并简要略述如下:细胞通过1000rpm离心5分钟而成粒状并通过添加包含10 μ I/ml β -巯基乙醇的350 μ I RLT缓冲液破裂。将裂解物转移到来自Qiagen的QIA shredder柱并以最大速度离心2分钟。流通物与等量的70%乙醇混合。每个Rneasy旋转柱(Qiagen)适用至多700 μ I样品并以14000rpm离心，并丢弃流通物。每一柱适用700 μ IRffl缓冲液，以HOOOrpm离心15秒洗涤柱。用500 μ IRPE缓冲液洗涤柱两次并以HOOOrpm离心15秒。为了干燥柱，以HOOOrpm另外离心2分钟。柱转移到新的收集管，并且用50 μ I无核酸酶的水洗脱RNA并以HOOOrpm离心I分钟。通过0D=260nm的吸光度测量RNA浓度。RNA储存于_80°C，直到需要时为止。
[0171](2)cDNA 合成:
[0172]使用Clontech的SMART RACE cDNA扩增试剂盒，使用Iyg RNA合成第一链cDNA。为了制备5’ -RACE-Ready cDNA，制备包含如上所述分离的RNA、反向引物5’ -⑶S引物背和SMART II A寡核苷酸的反应混合物，和该混合物在72°C孵育大约2分钟，并且随后在冰上冷却大约2分钟，然后加Ix第一链缓冲液、DTT(20mM) ^dNTP(IOmM)和PowerScript反转录酶。反应混合物在42°C孵育1.5小时，并且加三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)-EDT缓冲液并在72°C孵育7分钟。在这点上，样品可以储存在_20°C。
[0173](3)人类可变轻链(VL)区和人类可变重链(VH)区的克隆和PCR扩增:
[0174]为了从上面制备的cDNA中分离扩增VL和VH 二者的可变区，建立了包含IxAdvantage HF2PCR 缓冲液、dNTP(IOmM)和 IxAdvantage HF2 多聚酶混合物的 PCR(多聚酶链反应)反应混合物。
[0175]为了扩增VL，使用了下列引物:
[0176]UPM (通用引物混合物):[0177]5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，(SEQ ID NO:26)
[0178]5，-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO:27)
[0179]VK RACE2:
[0180]5，-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3’ (SEQ ID NO:28)
[0181]为了扩增VH，使用了下列引物:
[0182]UPM (通用引物混合物):
[0183]5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，(SEQ ID NO:29)
[0184]5’-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO:30)
[0185]AB90RACE:
[0186]5，-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3’ (SEQ ID NO:31)
[0187]进行三轮PCR。第一轮:PCR进行5循环的94°C 5秒和72°C 3分钟。第二轮:PCR进行5循环的94°C 5秒，70°C 10秒和72°C I分钟。第三轮:PCR进行28循环的94°C 5秒，68 0C 10秒和72 0C I分钟。
[0188]通过1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析而且使用Qiagen的QIAEXl I琼脂糖凝胶提取试剂盒，从凝胶中纯化DNA。
[0189]使用Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒将纯化的PCR产物引入PCR4-T0P0载体并用来转化T0P10感受态细胞。
`[0190]通过集落PCR，使用Taq多聚酶、IxTaq多聚酶缓冲液、dNTP (IOmM)和下列引物和PCR程序，对适当数量的菌落进行分析:
[0191]M13 正向引物:5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3’ (SEQ ID NO:32)
[0192]M13 反向引物:5’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’ (SEQ ID NO:33)
[0193]PCR 程序:
[0194]进行25循环的94V 30秒、55 °C 30秒和72 °C I分钟。
[0195]对来自分别含有VL和VH插入片段的克隆的质粒DNA，进行提取并使用上面列出的M13正向引物和M13反向引物进行测序。就人类抗KIR mAbl_7F9来说，编码重链和轻链可变区的序列如图15所示。
[0196](4)抗体基因亚克隆进入哺乳动物表达载体
[0197]基于对编码mAb的重链和轻链可变区的cDNAs的序列数据，分别设计引物来扩增可变轻(VL)链和可变重(VH)链基因。通过PCR对可变区进行设计(format)以包括Kozak序列、前导序列和独特的限制酶位点。对于VL，这是通过设计5’ PCR引物，以引入HindIII位点、Kozak序列而且与可变轻链区的前导序列的5’端同源来实现的。3’引物与可变区的3’端是同源的，并且在可变区的3’边界引入BsiWI位点。VH区以相似的方式产生，除了将NotI和NheI位点分别引入5’和3，端，代替HindIII和BsiffI之外。
[0198]使用标准技术，将扩增的基因产物各自克隆进入一个包含轻链和重链恒定区的真核表达载体。用HindIII和BsiWI消化VL DNA片段，并连接入真核表达载体，该载体包含编码氨苄青霉素抗性的内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点(PUC);得到的质粒命名为VLCL0用NotI和NheI消化VH DNA片段，并引入由如上所述引入VL片段产生的VLCL载体。得到的质粒包含编码相同质粒上抗体的重链和轻链二者的功能性表达盒。连接的质粒用以转化大肠杆菌。质粒DNA从这些氨苄青霉素抗性细菌群落中制备并用来转染到中国仓鼠卵巢细胞，或其他哺乳动物细胞系中。通过例如在“Molecular Cloning” Sambrook等中所述标准方法，完成转染和细胞培养。结果为稳定地表达并分泌目标抗体分子，例如1-7F9或1-4F1人类抗KIR mAb或含有1-7F9或1-4F1的VH和VL区的mAb,或另外人类抗KIRmAb的转染的细胞系。
[0199]抗体的变体可以容易地产生。例如，与1-7F9或1-4F1具有精确相同特异性，但与IgG4或IgG2相比分别地为不同的同种型的抗体，可以通过亚克隆编码1-7F9或1-4F1的VL和VH的cDNA进入包含编码K轻链恒定区和选自IgGl或IgG2或IgG3或IgG4重链恒定区的重链恒定区cDNA的质粒获得。因而，如所产生的抗体能具有任意的同种型而且然后该抗体可以使用本领域常规技术进行同种型转换。这种技术包括使用直接重组技术(见，例如美国专利4，816，397)，细胞-细胞融合技术(见例如美国专利5，916，771)，和本领域已知的其他适合的技术。因此，通过同种型转换为，例如用于包括治疗用途的不同用途的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体,本发明提供的抗体效应物功能相对于亲本抗体的同种型可以“变化”。
[0200]因而，在进一步方面，本发明提供了杂交瘤，其含有:(a)来自哺乳动物宿主(典型地非人类哺乳动物宿主)的B细胞，该宿主已经用抗原进行了免疫，其中抗原含有存在于抑制性KIR多肽上的表位，其融合至(b)无限增殖化细胞(例如骨髓瘤细胞)，其中所述杂交瘤产生结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体的单克隆抗体，并在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体的NK细胞的群体中，能至少实质上中和KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制作用。在一个【具体实施方式】中，哺乳动物宿主是能产生人类抗体的转基因动物。任选地，所述杂交瘤不产生单克隆抗体NKVSFl、不产生A210和/或不产生A802g。在不同的【具体实施方式】中，抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者上的KIR2DL1和KIR2DL2/3受体或共同决定簇。杂交瘤可以产生抗体，该抗体抑制在80位有赖氨酸残基的HLA-C等位基因分子与人类KIR2DL1受体结合，抑制在80位有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人类KIR2DL2/3受体结合。例如，在杂交瘤可以产生与单克隆抗体1-7F9或1-4F1结合实质上相同的在任一 KIR2DL1或KIR2DL2/3或KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者上的表位。
[0201]本发明也提供了产 生与多个KIR2DL基因产物交叉反应而且降低或中和这种KIRs抑制活性的抗体的方法，所述方法含有如下步骤:
[0202](a)用含有KIR2DL多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；
[0203](b)从所述免疫的哺乳动物中制备抗体，其中所述抗体结合所述的KIR2DL多肽，
[0204](c)选择(b)的与至少两种不同的KIR2DL基因产物交叉反应的抗体，和
[0205](d)选择(C)的加强NK细胞的抗体。在一个【具体实施方式】中，所述非人类哺乳动物被设计以表达人类抗体所有组成成分的转基因动物(例如非人类含有人类免疫球蛋白基因座和天然的免疫球蛋白基因缺失的哺乳动物，例如Xeno mouse?(Abgenix - Fremont,CA，USA)或含有人类免疫球蛋白编码基因的微卫星基因座的非人类哺乳动物，例如HuMabmouse? (Medarex - Princeton, NJ, USA))。任选地,可以用获得抗KIR mAbs的备择的方法代替步骤a和b，包括不限于，使用噬菌体展示或人类B细胞的病毒转导，或本领域已知的其它方法。任选地，该方法进一步含有选择在灵长类，优选结合猕猴中KIR的抗体，NK细胞或KIR多肽。任选地，本发明进一步含有评价抗KIR抗体的方法，其中根据上面方法产生的抗体给灵长类，优选猕猴施用，优选地其中观察猴抗体毒性指示的存在或缺乏。[0206]本发明也提供了生产结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的抗体的方法，其中该抗体通过表达至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞的群体，能中和KIR介导的细胞毒性的抑制(或加强NK细胞毒性)，该方法含有如下步骤:
[0207](a)用含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；
[0208](b)从免疫的动物中制备抗体，其中抗体结合KIR多肽，
[0209](c)选择(b)的与至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物交叉反应的抗体，和
[0210](d)选择(C)的抗体，该抗体能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性对表达至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞的群体的抑制作用，其中步骤(c)和(d)的顺序任意地颠倒，并且任选地重复任意数目的步骤一次或多次。在一个【具体实施方式】中，用于免疫的抑制性KIR多肽可以为一个或更多的KIR2DL多肽而且在步骤(c)中选择的抗体与至少KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反应。优选地，抗体识别存在于至少两种不同的KIR受体基因产物上的共同决定簇；最优选地，KIRs是KIR2DL1和KIR2DL2/3。在一个【具体实施方式】中，步骤(c)含有选择与至少一种KIR2DL和一种KIR3DL受体基因产物交叉反应的抗体。例如选择的抗体能与KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR3DL1和/或KIR3DL2反应。任选地，该方法进一步含有选择结合灵长类，优选猕猴，NK细胞或KIR多肽的抗体。任选地，本发明还包括评价抗体的方法，其中将根据上述方法生产的抗体给予灵长类，优选猕猴，优选地其中观察猴抗体毒性指示的存在或缺乏。
[0211]任选地，上面描述的方法中，在步骤c)或d)中选择的抗体不是NKVSFl，不是A210和/或不是A802g。优选地，在在上面方法中的步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。优选地在上面方法的步骤(c)中选择的抗体抑制一个或更多在80位有赖氨酸残基的HLA-C同种异型结合人类KIR2DL1受体，和一个或更多在80位有天冬酰胺残基的HLA-C同种异型结合人类KIR2DL2/3受体。优选地，在上面方法的步骤(d)中选择的抗体引起NK细胞毒性的增强，或KIR介导的抑制NK细胞毒性的中和作用。优选地，该抗体与单克隆抗体1-7F9结合实质上相同的KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的表位。任选地，该方法还或备择地含有如下附加步骤:制造选择的单克隆抗体的片段，制造选择的单克隆抗体的衍生物(例如通过与放射性核素、细胞毒性药剂、报道分子或类似物缀合)，或制造从中产生的抗体片段，或含有对应于这种单克隆抗体序列的序列抗体片段的衍生物。在另一方面，这种抗体的变体可以通过制备含有，通过上面描述的方法，通过使用已知的基因工程方法获得的抗体的变异的氨基酸序列(例如被修饰以便改变该抗体的结合特性，增加或减少该抗体的稳定性，增强抗体的纯化，增强抗体的检测，和/或改变抗体对于将被施用该抗体的宿主的免疫学特性的序列)。
[0212]本发明进一步提供了生产结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的抗体的方法，其中该抗体能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性对表达至少一种所述不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞的群体的抑制作用(或加强NK细胞毒性)，该方法含有如下步骤:
[0213](a)从文库或全部组成部分中，选择与至少两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物交叉反应的单克隆抗体或抗体片段，并且
[0214](b)选择能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性在表达至少两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞的群体中的抑制作用的(a)的抗体。优选地，该抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。任选地，在步骤(b)中选择的抗体不是NKVSFl。优选地，在步骤(b)中选择的抗体抑制在80位有赖氨酸残基的HLA-c等位分子结合人类KIR2DL1受体，和在80位有天冬酰胺残基的HLA-C等位分子结合人类KIR2DL2/3受体。优选地，在步骤(b)中选择的抗体引起NK细胞毒性的增强。优选地，该抗体与单克隆抗体1-7F9结合实质上相同的KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的表位。备择地，该抗体与单克隆抗体1-4F1结合实质上相同表位。任选地，该方法含有如下附加步骤:制造选择的单克隆抗体的片段，制造选择的单克隆抗体的衍生物，或制造选择的单克隆抗体片段的衍生物。
[0215]另外，本发明也提供了生产结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的抗体的方法，其中该抗体能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性在表达两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物中至少一种的NK细胞的群体中的抑制作用，该方法含有如下步骤:
[0216]a)在允许生产单克隆抗体的条件下培养本发明的杂交瘤；并且
[0217]b)从杂交瘤细胞中分离单克隆抗体。任选地该方法含有如下附加步骤:制造单克隆抗体的片段、制造单克隆抗体的衍生物或制造这种单克隆抗体片段的衍生物。优选地，该抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。
[0218]本发明也提供了一种生产结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的抗体，其中该抗体能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性在表达两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物中至少一种的NK细胞的群体中的抑制作用，该方法含有如下步骤:
[0219](a)从本发明的杂交瘤中分离编码单克隆抗体的核酸；
[0220](b)任选地修饰该核酸以便获得修饰的核酸，该修饰的核酸含有编码修饰的或衍生的抗体的序列，该修饰或衍 生的抗体含有对应于单克隆抗体的功能序列或与其实质上相似的(例如与这种序列为至少大约65%、至少大约75%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%(例如大约70-99%)相同)的氨基酸序列，其选自人源化抗体、嵌合的抗体、单链抗体、抗体的免疫活性片段或含有这种免疫活性片段的融合蛋白；
[0221](C)将核酸或修饰的核酸(或编码相同氨基酸序列的相关核酸)插入到表达载体中，其中当表达载体存在于在适当的条件下生长的宿主细胞中时，编码的抗体或抗体片段能进行表达；
[0222]d)用表达载体转染宿主细胞，其中宿主细胞不另外产生免疫球蛋白；
[0223]e)在引起抗体或抗体片段表达的条件下，培养转染的宿主细胞；而且
[0224]f)分离由转染的宿主细胞的产生的抗体或抗体片段。优选地该抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。
[0225]抗体筛选和选择
[0226]本发明特别的抗体能够降低或中和KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制作用；特别是由KIR2DL受体介导的抑制作用而且更特别地是至少KIR2DL1-和KIR2DL2/3- 二者介导的抑制作用。因而，这些抗体是“中和”、“阻断”或“抑制性”抗体，在这个意义上，当这些与MHC I类分子相互作用时，他们至少部分或可检测地降低、中和和/或阻断由KIR受体介导的抑制性信号通路。更重要地，关于几种类型的抑制性KIR受体，优选几种KIR2DL受体基因产物，并且更优选地至少KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者，展示了该中和作用活性，以便这些抗体可以高功效地用于大多数或全部人类受试者中。KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制作用的中和，如在本文所述，可以通过不同的分析或试验，例如标准的体外细胞毒性分析进行评估。
[0227]一旦鉴别与多种抑制剂KIR受体交叉反应的抗体，就可以测定其在完整的NK细胞中降低或中和那些KIR受体的抑制作用的能力。在特定变体中，中和活性可以通过所述抗体通过表达HLA-C的靶标的KIR2DL表达性NK细胞重建裂解的能力来阐明。在另一个特定【具体实施方式】中，抗体的中和活性是通过该抗体阻断或降低HLA-C分子结合KIR2DL1和KIR2DL3(或密切相关的KIR2DL2)受体的能力定义的，进一步优选地的是用该抗体改变KIR2DL2/3结合选自Cwl、Cw3、Cw7和Cw8的HLA-C分子(或在80位有天冬酰胺残基的另外的HLA-C分子)和/或KIR2DL1结合选自Cw2、Cw4、Cw5和Cw6的HLA-C分子(或在80位有赖氨酸残基的另外的HLA-C分子)的能力来定义它。
[0228]在另外的变体中，如在本文提供的实施例中过公开的，本发明抗体的中和活性可以在基于细胞的细胞毒性试验中进行评估。
[0229]在另外的变体中，本发明的抗体的中和活性可以在释放细胞因子的试验中进行评估，其中NK细胞用检测抗体和表达NK群体的KIR分子识别的一种HLA-C等位基因的靶细胞系孵育，以刺激NK细胞因子产生(例如IFN- Y和/或GM-CSF产生)。在代表性的方案中，在培养基中大约4天后，从PBMC产生IFN- Y通过细胞表面和胞质内染色，和由流式细胞仪的分析进行评估。简要地，布雷菲德菌素A (Sigma Aldrich)可以以大约5 μ g/ml的终浓度添加用于培养最少大约4小时。然后,细胞可以在透化(IntraPrep? ;Beckman Coulter)之前与抗CD3和抗CD56mAb孵育，并且用PE-抗IFN- Y或PE-1gGl (Pharmingen)染色。可以使用ELISA进行测量上清中从多克隆活化的NK细胞中产生GM-CSF和IFN(GM_CSF =DuoSetElisa, R&D Systems, Minneapolis, MN ；IFN- y:OptElA set, Pharmingen)。
[0230]本发明的抗体可以部分地(也就是降低)或完全地中和KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制作用。例如本发明优选的抗体能够诱导或增加HLA-匹配的，或HLA-兼容的，或自体靶细胞群，也就是在所述抗体缺乏时，NK细胞不能有效地裂解的细胞群的裂解。因此，本发明的抗体也可以定义为在体内和/或体外促进NK细胞活性。
`[0231]在特定的【具体实施方式】中，所述抗体与单克隆抗体DF200(由杂交瘤DF200产生)，1-7F9,或1-4F1，结合实质上相同的表位。这种抗体在本文分别被称为“DF200样抗体”、“1-7F9-样抗体”和“1-4F1-样抗体”。在进一步优选的【具体实施方式】中，抗体是单克隆抗体。更优选的本发明的“DF200样抗体”是除单克隆抗体NKVSFl以外的抗体。最优选的是单克隆抗体1-7F9或1-4F1，和含有1-7F9或1-4F1的VH和/或VL区的抗体。
[0232]与在本文描述的单克隆抗体结合实质上或基本上相同表位的一种或更多抗体的鉴定可以使用其中能评估抗体竞争的多种免疫学筛选试验中的任一种容易地进行测定。许多的这类试验被常规地进行而且为本领域众所周知(见，例如美国专利N0.5，660，827，1997，08.26授权，其特别通过引用将其并入本申请)。将要理解，为鉴别与本文描述的单克隆抗体结合相同或实质上相同表位的抗体，并不是任何时候都必需实际测定在本文描述的抗体结合的表位。
[0233]例如，当将要检查的测试抗体从不同来源动物获得，或甚至具有不同的免疫球蛋白同种型，可以应用简单竞争试验，其中对照抗体(例如DF200)与测试抗体混合，然后应用到含有KIR2DL1和/或KIR2DL2/3任一或二者的样品，已知它们中的每一个与DF200结合。基于ELISAs、放射免疫测定法、免疫印迹和应用BIACORE分析(如所描述，例如在本文实施例部分中)的方案，适于在这种简单竞争研究中使用。
[0234]在一些【具体实施方式】中，在应用于KIR抗原样品以前，将对照抗体(例如，1-7F9或1-4F1)与数量变化的测试抗体(例如以大约1:1、1:2、1:10或大约1:100比率)预先混合一段时间。在其他的【具体实施方式】中，在暴露于KIR抗原样品期间，对照和数量变化的测试抗体可以简单地分别进行添加并混合。只要能将结合抗体与游离抗体区分(例如通过使用分离或洗涤技术以除去未结合抗体)并区分对照抗体与测试抗体(例如通过使用物种特异性或同种型特异的二抗或通过用可检测到的标记特异地标记对照抗体)，将能确定测试抗体是否降低对照抗体结合不同的KIR2DL抗原，提示测试抗体与1-7F9识别实质上相同表位。(标记的)对照抗体的结合在存在完全不相关的抗体(其不结合KIR)时能用作对照高值。对照低值能通过用相同但未标记对照抗体孵育标记对照抗体获得，而竞争将发生并降低标记抗体的结合。在测试分析中，存在测试抗体时标记抗体反应性显著降低表现了识别实质上相同表位的测试抗体，也就是与标记的对照抗体竞争的抗体。例如，以大约1:1或1:10和大约1:100之间任何比率的1-7F9:测试抗体或1-4F1:测试抗体，降低1-7F9或1-4F1与KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原二者结合至少大约50%，例如至少大约60%，或更优选地至少大约70%(例如大约65-100%)的任何测试抗体，被认为是分别与1-7F9或1-4F1结合实质上相同表位或决定簇的抗体。优选地，这种测试抗体将降低1-7F9结合至少一个其它的，优选地每一个KIR2DL抗原，优选地至少大约50%、至少大约60%、至少大约80%或至少大约90%(例如大约95%)的在缺乏测试抗体时观察到的1-7F9或1-4F1的结合。当然，这种方法可适合于鉴别和/或评价与其它抗体和/或KIR抗原竞争的抗体。
[0235]竞争能同样或备择地通过，例如流式细胞试验进行评估。在这种试验中，具有给定的KIR的细胞可以首先与对照抗体(例如，1-7F9或1-4F1)孵育，并且然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体孵育。如果与饱和量的对照抗体预孵化获得的结合为通过测试抗体不与对照抗体进行预孵化获得的结合(如依靠荧光测量)的大约80%，优选地大约50%、大约40%或更低(例如大约30%)，表示该抗体与对照抗体竞争。备择地，如果在用饱和量的测试抗体预孵化的细胞上，用标记对照抗体(通过荧光燃料或生物素)获得的结合为未用测试抗体预孵化获得的结合的大约 80%，优选地大约50%、大约40%，或更低(例如大约30%)，表示抗体与对照抗体竞争。
[0236]其中以饱和浓度预吸附和应用测试抗体到其上固定有KIR2DL1或KIR2DL2/3任一或二者的表面的简单竞争分析，同样可以方便地利用。简单竞争分析中的表面优选地为BIACORE芯片(或其它适于表面胞质基因组共振分析的介质)。测量对照抗体(例如1-7F9或1-4F1)与KIR-包被的表面的这种结合。该对照抗体单独与包含KIR表面的结合与存在测试抗体时对照抗体的结合比较。存在测试抗体时由对照抗体与包含KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的结合显著降低，表明测试抗体与对照抗体识别实质上相同表位，这样测试抗体与对照抗体“竞争”。任何降低对照抗体(例如1-7F9或1-4F1)与KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原二者的结合至少大约20%或更多、至少大约40%、至少大约50%、至少大约70%或更多的测试抗体，可以认为是与对照抗体(例如1-7F9或1-4F1)结合实质上相同表位或决定簇的抗体。优选地，这种测试抗体将降低对照抗体(例如1-7F9或1-4F1)与每一种KIR2DL抗原的结合至少大约50%(例如至少大约60%，至少大约70%或更多)。将要理解，对照抗体和测试抗体的顺序可以颠倒进行；也就是对照抗体可以首先结合表面而且然后在其后的竞争试验中测试抗体与表面接触。优选地，对KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原具有更高亲和力的抗体首先结合包含KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，因为预期对于二抗(假设抗体是竞争性的)所观察到的结合将会更大幅度地减少。在本文的实施例中，和在例如Saunal和Regenmortel, (1995) J.1mmunol.Methodsl83:33-41 中提供了这种试验的进一步的例子，其公开内容在本文通过参考并入本申请。
[0237]尽管为例证的目的，在1-7F9或1-4F1的上下文中进行了描述，但将要理解上面描述的筛选试验也可以用于鉴别与NKVSF1、DF200、EB6、GL183和根据本发明其它抗体、抗体片段和抗体衍生物中一种或多种竞争的抗体。
[0238]在脊椎动物或细胞中免疫并产生抗体后，可以进行特别的选择步骤以分离所要求保护的抗体。在这点上，在特定的【具体实施方式】中，本发明也涉及产生这种抗体的方法，它包括如下步骤:
[0239](a)用含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；
[0240](b)从所述免疫的动物中制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽，
[0241](c)选择与至少两种不同的抑制性KIR基因产物交叉反应的(b)的抗体，和
[0242](d)选择能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性对表达所述两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物中至少一种的NK细胞的群体的抑制作用的(c)的抗体。
[0243]在某些【具体实施方式】中，在上面的步骤(C)和(d)之间，进行附加步骤，以选择不与KIR2DS4反应的抗KIR mA bs。
[0244]与至少两种不同的抑制性KIR基因产物交叉反应的抗体选择可以通过筛选针对两种或更多种不同的抑制性KIR抗原的抗体完成。在更优选的【具体实施方式】中，在步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。因而，如在本文所使用，术语“从所述免疫的动物中制备抗体”，包括从免疫的动物中获得B细胞并使用那些B细胞以产生表达抗体的杂交瘤，以及直接从免疫动物的血清中获得抗体。在另一个优选【具体实施方式】中，在步骤(c)中选择的抗体是与至少KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反应的那些。
[0245]还有在另一个【具体实施方式】中，当在对表达同源HLA I类分子的靶细胞的标准铬释放试验中所测量时，与在缺乏抗KIR mAb时特异性裂解比较，在步骤(d)中选择的抗体引起由显示至少一个被抗体识别的KIR的NK细胞介导的至少大约10%更多的特异性裂解，并且优选地至少大约40%更多的特异性裂解，至少大约50%更高的特异性裂解或更优选地至少增加大约70%特异性裂解(例如大约增加60-100%特异性裂解)。备择地，在步骤(d)中选择的抗体当用于铬释放试验时，该试验应用表达一种或几种抑制性KIRs的NK细胞克隆和表达至少一个HLA等位基因(它被NK克隆上的KIRs之一识别)的靶细胞，用该抗体获得的细胞毒性水平应为以相同的效应物:祀细胞比率，用相同浓度的DF200或用阻断抗MHCI类抗体获得的特异细胞毒性的至少大约20%，优选地至少大约30%或更多。
[0246]上面刚刚描述的方法的步骤(C)和(d)的顺序可以改变。任选地，该方法同样或备择地可以进一步含有制造单克隆抗体片段或单克隆抗体的衍生物或例如在本文别处所描述的这样的片段的附加步骤。
[0247]在另一个变体中，本发明提供了获得抗体的方法，它包括如下步骤:
[0248](a)从文库或全部组成部分中，选择与至少两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物交叉反应的单克隆抗体、单克隆抗体片段或其任一的衍生物，并且
[0249](b)选择能中和KIR介导的NK细胞细胞毒性对表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞群体的抑制作用的(a)的抗体。
[0250]所有组成成分可能是任何(重组的)抗体或其片段的所有组成成分，任选地通过任何适当结构(例如噬菌体、细菌、合成复合体等)进行显示。抑制性抗体的选择可以如上面所公开的进行，并在实施例中进一步阐明。
[0251 ] KIR2DL1、_2和_3 (KIR2DL1-3)的胞外域的计算机模拟，基于其公布的晶体结构(Maenaka 等 Structure with Folding and designl999 ；7:391-398 ；Fan 等，Natureimmunology2001 ；2:452-460 ；Boyington 等 Nature, 2000 ；405:537-543)，揭示在这些 KIR和抗KIR2DL交叉反应性鼠单克隆抗体DF200和NKVSFl之间的相互作用中涉及一些区或KIR2DLU-2和-3。因而，在一个【具体实施方式】中，本发明提供了在由氨基酸残基(105、106、
107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、
158、159、160、161、162、163、181和192)限定的区域中唯一地结合KIR2DL1的抗体。在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和KIR2DL2/3而不与由残基(105、106、107、
108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、
159、160、161、162、163、181和192)限定的区域外面的氨基酸残基相互作用的抗体。
[0252]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和不结合其中R131(也就是在KIR2DL1突变体131位的精氨酸残基)是丙氨酸残基(也就是被丙氨酸残基取代)的KIR2DL1突变体的抗体。
[0253]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和不结合其中R157是丙氨酸的KIR2DL1突变体的抗体。
[0254]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和不结合其中R158是丙氨酸的KIR2DL1突变体的抗体。
[0255]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1残基131，157，和158的抗体。
[0256]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DS3 (R131W)，但不结合野生型KIR2DS3的抗体。
[0257]在特殊的【具体实施方式】中，所述抗体只在由氨基酸残基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87和Y88 (其中字母指的是氨基酸的单一字母代码，并且数字为KIR2DL1(SEQ ID NO:23)的残基位置，使用在Wagtmann等，Immunityl995 ;2:439-449中描述的编号系统)限定的区域中结合KIR2DL1。这些残基已被鉴定为1-7F9KIR2DL1表位(见实施例11)。
[0258]在另一个【具体实施方式】中，抗体结合KIR2DL1序列中由SEQ ID NO:23的L38到Y88片段组成的抗原表位。在还有一个【具体实施方式】中，抗体结合KIR2DL1序列中含有SEQID NO:23的L38到Y88片段的抗原表位。
[0259]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和KIR2DL2/3而不与残基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 限定区域外的
氨基酸残基相互作用的抗体。
[0260]在另一个【具体实施方式】中，抗体在含有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多的氨基酸残基 L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87和Y88的区域中结合KIR2DL1。在特殊的【具体实施方式】中，KIR2DL1对抗体的表位含有氨基酸残基M44和F45 (见实施例9和11)。
[0261]在另一个【具体实施方式】中，抗体在含有至少1、2、4、6、8、10或12或全部氨基酸残基 L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 的区域中结合KIR2DL1。在特殊的【具体实施方式】中，该区域含有氨基酸残基M44和F45和任选地至少1、2、4、6、8、10 或全部的 L38、R41、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 (见实施例9和11)。在另一个特殊的【具体实施方式】中，该区域含有至少氨基酸残基M44、F45和D72，其在1-7F9表位和HLA-C结合部位重叠的KIR2DL1区域。
[0262]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1、KIR2DL2/3和KIR2DS4的抗体。
[0263]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者但不结合KIR2DS4的抗体。
[0264]在另一个【具体实施方式】中，本发明提供了结合KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者但不结合KIR2DS3或KIR2DS4的抗体。
[0265]确定在上面限定的表位区之一内的抗体、抗体片段或抗体衍生物是否结合，可以以本领域技术人员已知的方法进行。见，例如实施例9和11。在这种绘图/表征方法的另一个实施例中，对于抗KIR抗 体的表位区可以通过表位〃足迹法〃，使用KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白质中暴露的胺/羧基的化学修饰进行确定。这种足迹法技术的一个特定的例子是使用HXMS (通过质谱法检测到的氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白质酰胺质子的氢/氘交换，结合，并且反向(back)交换，其中参与蛋白质结合的主链酰胺基团被保护不进行反向交换而且因此将仍然是氘化的。有关的区域可以在这点上通过消化性蛋白酶解，快速微孔高效液相色谱法分离，和/或电喷射离子化质谱法进行鉴定。见，例如Ehring H,AnalyticalBiochemistry, Vol.267 (2) pp.252-259(1999)和 / 或 Engen, J.R.和 Smith, D.L.(2001)Anal.Chem.73，256A-265A。另一个适当的表位鉴定技术例子是核磁共振表位作图(NMR)，其中典型地比较游离抗原和与抗原结合肽，例如抗体复合的抗原的二维NMR光谱(spectres)中信号的位置。抗原典型地用15N选择性地同位素标记，所以只有对应于抗原的信号可以在NMR-谱中看到和看不到来自抗原结合肽的信号。起源于参与与抗原结合肽的相互作用的氨基酸的抗原信号，与游离抗原的光谱比较，典型地将移动在复合体中的光谱的位置，并且可以那样确认参与结合的氨基酸。见，例如Ernst Schering Res Found Workshop.2004 ；(44):149-67 ;Huang 等，Journal of Molecular Biology, Vol.281(l)pp.61-67(1998);和Saito 和 Patterson, Methods.1996Jun ；9 (3):516_24。
[0266]表位作图/表征也可以使用质谱学方法进行。见，例如Downward, J MassSpectrom.2000Apr ；35 (4):493-503 和 Kiselar 和 Downard, Anal Chem.1999Mayl ；71 (9):1792-801 ο
[0267]蛋白酶消化技术也可以用于表位作图和鉴定的范围中。抗原决定簇有关的区/序列可以通过蛋白酶消化进行确定，例如通过以与KIR2DL1或KIR2DL2/3的比率大约1:50使用胰蛋白酶，在37°C和pH7-8进行(ο/η)消化，继之以质谱法(MS)分析进行肽鉴定。由抗KIR抗体保护免于胰蛋白酶切割的肽随后进行鉴定，该鉴定是通过比较受到胰蛋白酶消化的样品和用抗体进行孵育然后受到消化例如胰蛋白酶(由此显色抗体的足迹)的样品进行的。其它的酶象胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，同样或备择地可以用于相似的表位表征方法。而且，酶的消化能提供快速的分析潜在的抗原决定簇序列是否在结合KIR多肽的上下文中KIR2DL1的区域内。如果多肽不是表面暴露的，根据免疫原性/抗原性最有可能不相关。关于相似技术的讨论，见例如 Manca, Ann 1st Super Sanita.1991 ；27 (I):15_9。
[0268]定点诱变是对阐明结合表位有用的另一种技术。例如在“丙氨酸-扫描”中，在蛋白质区段内的每一残基用丙氨酸残基取代，并且对结合亲和力的结果进行了测量。如果突变导致结合亲和力显著地降低(resuction)，它最有可能参与结合。对结构表位特异的单克隆抗体(也就是不结合未折叠蛋白质的抗体)可以用于证实，丙氨酸-置换不影响蛋白质的全部折叠。见，例如 Clackson 和 Wells, Sciencel995 ；267:383 - 386 ;和 Wells, ProcNatl Acad Sci USA1996 ；93:1 -6。
[0269]电子显微镜术也可以用于表位“足迹法”。例如Wang等，Naturel992 ；355 =275-278使用了冷冻电镜术、三维图像重构和X-射线晶体学的协调应用以确定天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上Fab-片段的物理足迹。
[0270]对表位评价的其它形式的“无标记”试验包括表面胞质基因组共振(SPR，BIA⑶RE)和反射计干涉光谱学(RifS)。见，例如Fagerstam等，Journal OfMolecular Recognitionl990 ；3:208-14 ；Nice 等，J.Chromatogr.1993 ；646: 159 - 168 ；Leipert 等，Angew.Chem.1nt.Ed.1998 ；37:3308 - 3311 ； Kroger 等，Biosensors 和Bioelectronics2002；17:937_944。
[0271]抗体片段和衍生物
[0272]本发明的抗体片段和衍生物(如在本申请中使用，其包含于术语“抗体”和“抗体类”中，除非另作说明或明显地与上下文相矛盾)，优选地1-7F9-或1-4F1-样抗体，可以通过本领域已知的技术产生。“免疫反应性片段”含有完整抗体的一部分，通常包含抗原结合部位或可变区。抗体片段的例子包括〃 K体〃(见,例如Ill等，Protein EnglO:949-57(1997))和 〃janusins〃(在本文别处进一步描述)。Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab)2、F(ab’)2、dAb(Ward 等，(1989) Nature341:544-546);基本上由 VH 域组成)、Fd (基本上由VH和CHl域组成)和Fv (基本上由VL和VH域组成)片段；双抗体；κ体和janusins。例如抗体片段包括具有由毗连氨基酸残基的不间断序列组成一级结构的多肽(在本文称为〃单链抗体片段"或"单链多肽")，包括不限于⑴单链Fv (scFv)分子⑵只包含一个轻链可变域的单链多肽，或其包含轻链可变域三个CDRs的片段，没有相关重链部分和(3)只包含一个重链可变区的单链多肽，或其包含重链可变区三个CDRs的片段，没有相关的轻链部分；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，Fab或F(ab’)2片段可以根据常规技术，通过分离抗体的蛋白酶消化产生。
[0273]将要理解，免疫反应性片段可以使用已知方法进行修饰，例如减缓体内清除率并获得更合意的药物动力学特征。例如该片段可以用聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯化多元醇进行修饰。偶联和位点特异的缀合PEG到Fab’片段的方法在,例如Leong等，Cytokinel6(3):106-119(2001)和Delgado 等，Br.J.Cancer73 (2):175-182(1996)中进行了描述，其公开内容在本文通过参考并入本申请。
[0274]在特殊的方面，如图14所阐明，本发明提供了含有1-7F9或1-4F1的轻链和/或重链可变区序列的抗体、抗体片段和抗体衍生物。在另一方面，如图15所阐明或上面所描述，本发明提供了含有一个或更多1-7F9或1-4F1的轻链和/或重链可变区⑶Rs的抗体、其抗体片段和衍生物。这种序列的功能性变体/类似物可以使用标准技术，通过制造适当的取代、添加和/或缺失，在这些公开的氨基酸序列中产生，该标准技术可辅助以序列比较。从7F9/KIR2DL1复合体和KIR2DL1/MHC I类复合体的晶体结构的重叠(Fan等，Nat.1mmunol.2001 ；2:452-460)，PDB-代码1頂9，可以得出结论1-7F9的scFv衍生物将能阻断MHC I类结合KIR2DL1。同样单独的1-7F9的单L-链或1-7F9的单VL域，当结合KIR2DL1时，将阻断MHC I类结合。
[0275]这种序列的功能性变体/类似物可以通过在这些公开的氨基酸序列中，通过使用标准技术进行适当的取代、添加和/或缺失产生，该标准技术可辅助以比较序列。在另一方面，其中存在于这些抗体之一的序列中的残基的位置，但不是另一个，可能适于缺失、取代和/或插入。
[0276]备择地，编码本发明抗体，例如1-7F9-或1-4F1样抗体的DNA，可以进行修饰以使编码本发明的片段。然后，将修饰的DNA插入表达载体并用以转化或转染适当的细胞，然后其表达期望的片段，如在本文别处所描述。
[0277]在备择的【具体实施方式】中，产生本发明的鼠抗体，例如DF200样抗体的杂交瘤的DNA，可以在插入表达载体之前进行修饰，例如通过用人类重链和轻链恒定区的编码序列代替同源的非人类序列(如通过例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81,PP- 6851(1984)描述)。在另一个【具体实施方式】中，编码本发明抗体的可变区可以通过重组DNA工程结合至免疫球蛋白编码序列对非免疫球蛋白多肽的全部或部分的编码序列。以那种方式，制备了 "嵌合的"或"杂交"抗体，其具有原始抗体的结合特异性。典型地，用这种非免疫球蛋白多肽取代本 发明抗体的恒定区。
[0278]因而，根据另一个【具体实施方式】，本发明的抗体、优选地DF-200样抗体是人源化的。根据本发明，"人源化的"形式的抗体是特异性嵌合的免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含来源于鼠免疫球蛋白的最小序列。对大部分来说，人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自该接受体互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)CDR的残基取代，同时保持了原始抗体期望的特异性、亲和力和能力。在一些例子中，人类免疫球蛋白的Fv框架残基可以被对应的非人类残基代替。此外，人源化抗体能含有没有在接受体抗体或在输入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将实质上含有全部至少一个，并且典型地两个可变域，其中全部或实质上全部的CDR区对应于原始抗体的那些和全部或实质上全部的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地也将含有至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地为人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。更详细的资料见Jones等,Nature, 321,pp.522 (1986) ；Reichmann等，Nature,332,pp.323 (1988);和 Presta,Curr.0p.Struct.Biol.，2, pp.593 (1992)。
[0279]人源化本发明的抗体的方法为本领域众所周知。通常地，根据本发明的人源化抗体具有从原始抗体引入其中的一个或更多的氨基酸残基。这些鼠或其它非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变域。人源化可以基本上按Winter和合作者(Jones 等，Nature, 321, pp.522 (1986) ;Riechmann 等，Nature, 332, pp.323 (1988)；Verhoeyen等，Science, 239, pp.1534 (1988))的方法进行。因此，这种“人源化”抗体为嵌合抗体(Cabilly等,美国专利N0.4，816，567),其中实质上小于完整的人类可变域已经被来自原始鼠抗体的相应序列取代。实际上，根据本发明的人源化抗体典型地为其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自原始鼠抗体中类似部位的残基取代的人类抗体。
[0280]用于制造人源化抗体的人类可变结构域(轻链和重链二者)的选择对降低抗原性是非常重要的。根据所谓的〃最适〃方法，针对已知人类可变域序列的全部文库筛选本发明抗体的可变域序列。然后采用最接近于小鼠序列的人类序列作为人源化抗体的人类框架(FR) (Sims 等，J.1mmunol., 151, pp.2296(1993) ；Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.，196，PP.901(1987))。另一个方法使用了来自轻链或重链特殊亚群的全部人类抗体共有序列的特殊框架。相同框架可以用于几种不同的人源化的抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，89, pp.4285 (1992) ；Presta 等，J.1mmunol.，51, pp.1993))。
[0281]进一步重要的是，在保留有对多种抑制性KIR受:体的闻未和力和其他有利的生物学特性的情况下人源化抗体。为了达到该目的，根据优选的方法，人源化抗体是通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和不同的概念性人源化产物的过程进行制备的。三维免疫球蛋白模型一般可以得到而且对那些本领域技术人员是熟悉的。可以得到计算机程序，其阐明并显示选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，也就是分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。这样，FR残基可以从共同序列和输入序列中选择并组合以便获得期望的抗体特征，例如对靶抗原亲和力的增加。通常，CDR残基直接地而且最实质上参与影响抗原结合。
[0282]如上所述，制造人类单克隆抗 体的方法是使用XenoMoUSe? (Abgenix,Fremont, CA)，作为用来免疫的小鼠。根据本发明，XenoMouse是其免疫球蛋白基因被功能性人类免疫球蛋白基因代替 的鼠宿主。因而，由该小鼠或在由该小鼠的B细胞制造的杂交瘤中产生的抗体已经是人源化的。XenoMouse在美国专利N0.6, 162, 963中进行了描述,在本文通过参考将其全部并入本申请。类似的方法可以使用HuMAb-Mouse?(Medarex)完成。
[0283]人类抗体也可以根据不同的其它技术产生，例如对于免疫，通过使用其它的转基因动物，其已经设计以表达人类抗体所有组成成分(Jakobovitz等，Nature362 (1993) 255),或通过使用噬菌体展示方法，选择抗体全部组成部分。如在本申请中所公开，这种技术对技术人员来说是已知的而且可以从单克隆抗体开始来实现。
[0284]本发明的抗体，优选地1-7F9-或1-4F1样抗体，也可以衍生为〃嵌合的〃抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与原始抗体中的相应序列相同或同源，而这(些)链的剩余部分与来源于另外物种或属于另外抗体类或亚类的抗体以及这类抗体的片段中相应序列相同或同源，只要它们显示期望的生物学活性(Cabilly等，supra ;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81, pp.6851 (1984))。
[0285]本发明范围内的其它衍生物包括功能化的抗体，也就是与毒素，例如蓖麻毒素、白喉毒素、相思豆毒素和假单胞菌外毒素，或治疗性放射性核素，例如，例如9°Y或131I;与可检测到的部分，例如荧光部分，诊断性放射性同位素或显影剂；或与固体载体，例如琼脂糖珠或类似物缀合或共价结合的抗体。这些其它的药剂缀合或共价结合至抗体的方法在本领域众所周知。[0286]与毒素的缀合对显示其细胞表面交叉反应性KIR受体之一的NK细胞的靶向杀伤是有用的。一旦本发明的抗体结合这种细胞的细胞表面，其被内在化而且毒素在细胞内释放，选择性地杀伤所述细胞。这种使用是本发明备择的【具体实施方式】。
[0287]当本发明的抗体用于诊断目的时，与可检测到的部分缀合是有用的。这种目的包括，但不限于分析生物样品中其细胞表面上具有交叉性反应KIR的NK细胞存在，和检测在活的生物中具有交叉性反应KIR的NK细胞存在。这种分析和检测方法也是本发明备择的【具体实施方式】。
[0288]本发明的抗体缀合到固体载体，作为在其细胞表面上具有交叉反应性KIR的NK细胞的亲和纯化工具是有用的，NK细胞来自来源，例如生物学流体。该纯化方法是本发明的另一个备择【具体实施方式】，得到的纯化的NK细胞群体也是本发明的另一个备择【具体实施方式】。
[0289]药物组合物和应用
[0290]本发明也提供了含有人类或人源化抗体，或其片段和衍生物的药物组合物，其中所述抗体、片段或衍生物在患者中或在含有NK细胞的生物样品中，在任何适当的媒介中以有效可检测地加强NK细胞细胞毒性的量，与NK细胞表面的至少两种抑制性KIR受体交叉反应，降低或中和它们的抑制性信号并加强那些细胞的活性。用于根据本发明的用途，含有人类或人源化的抗KIR mAb,任选地和另一种活性剂的药物组合物，按照常规技术例如在 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 编，MackPublishing C0., Easton, PA, 1995中公开的那些,可以与药学上可接受的载体或稀释剂以及任意其它已知佐剂和赋形剂配制。组合物可以以常规形式，例如胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液或悬液、或以冻干粉末出现。
[0291]因此，本发明的一个目标是提供含有人类或人源化抗体，或其片段或衍生物的药物制剂，其存在浓度从lmg/ml到500mg/ml，并且其中所述制剂pH从2.0到10.0。该制剂可以进一步含有缓冲液系统、防腐剂(类)、张力剂(类)、螯合剂(类)、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个【具体实施方式】中，药物制剂是含水制剂，也就是含有水的制剂。这种制剂典型地是溶液或悬液。在本发明进一步的【具体实施方式】中，药物制剂为水溶液。如在本文所使用，术语“含水剂型”为含有至少50%w/w水的制剂。同样地，术语“水溶液”为含有至少50%w/w水的溶液，并且术语“含水悬液”为含有至少50%w/w水的悬液。
[0292]在另一个【具体实施方式】中，药物制剂为冷冻干燥的制剂，在使用之前，医生或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。
[0293]在另一个【具体实施方式】中，药物制剂为即时可用而不需要任何预先溶解的干燥制剂(例如冷冻干燥或喷雾干燥)。
[0294]在进一步方面，本发明涉及含有如在本文所述抗体水溶液和缓冲液的药物制剂，其中所述抗体以lmg/ml或更高浓度存在，并且其中所述制剂pH从大约2.0到大约10.0。
[0295]在另一个【具体实施方式】中，该制剂的pH选自由2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6、
2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、
4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、
6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、
8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9 和 10.0 组成的列表。
[0296]在进一步的【具体实施方式】中，缓冲剂选自由醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、双甘氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物组成的组。这些具体缓冲剂的每一种构成本发明备择的【具体实施方式】。
[0297]在进一步【具体实施方式】中，制剂也含有药学上可接受的防腐剂。在另一个【具体实施方式】中，防腐剂选自由苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、甲基对-羟基苯甲酸酯、丙基对-羟基苯甲酸酯、2_苯氧乙醇、丁基对-羟基苯甲酸酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳汞、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苯索氯铵、氯苯甘醚(3对氯苯氧基丙-1，2-二醇)或其混合物组成的组。在一个【具体实施方式】中，防腐剂以浓度从0.lmg/ml到20mg/ml存在。在另一个【具体实施方式】中，防腐剂以浓度从0.lmg/ml到5mg/ml存在。在还有另一个【具体实施方式】中，防腐剂以浓度从5mg/ml到10mg/ml存在。在另一个【具体实施方式】，防腐剂以浓度从10mg/ml到20mg/ml存在。所列出的具体防腐剂的每一种构成本发明备择的【具体实施方式】。尽管防腐剂在药物组合物中的用途对技术人员是众所周知的；但为了便利，参考Remington:The Science andPractice of Pharmacy,% 19 版，1995。
[0298]在进一步的【具体实施方式】中，制剂也含有等渗剂。在一个【具体实施方式】中，等渗剂选自由盐(例如氯化钠)、糖、糖醇、氨基糖、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如甘油(甘油)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)和聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物组成的群。可以使用任何适当的糖，包括但不限于单_，双-或多糖和水溶性葡聚糖，例如例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖 、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个【具体实施方式】中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为有至少一个羟基基团的C4-C8碳氢化合物而且包括，例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿糖醇。在一个【具体实施方式】中，糖醇添加剂为甘露醇。上面提到的糖或糖醇可以单独或结合使用。对使用的数量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中是可溶的而且不会不利地影响使用本发明的方法获得的稳定效应。在一个【具体实施方式】中，糖或糖醇浓度在大约lmg/ml和大约150mg/ml之间。在另一个【具体实施方式】中，等渗剂以浓度从lmg/ml到50mg/ml存在。在另一个【具体实施方式】中，等渗剂以浓度从lmg/ml到7mg/ml存在。在另一个【具体实施方式】中，等渗剂以浓度从8mg/ml到24mg/ml存在。在另一个【具体实施方式】中，等渗剂以浓度从25mg/ml到50mg/ml存在。上面列出的每一特定等渗剂构成本发明备择的【具体实施方式】。尽管药物组合物中等渗剂的使用对技术人员是众所周知的；但为了便利，参考 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19版，1995。
[0299]在进一步【具体实施方式】中，制剂也含有螯合剂。在一个【具体实施方式】中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)，柠檬酸，和天冬氨酸，及其混合物的盐类。在另一个【具体实施方式】中，螯合剂以浓度从0.lmg/ml到5mg/ml存在。在另一个【具体实施方式】中，螯合剂以浓度从0.lmg/ml到2mg/ml存在。在本发明的进一步【具体实施方式】中，螯合剂以浓度从2mg/ml到5mg/ml存在。这些特定螯合剂的每一个构成本发明备择的【具体实施方式】。药物组合物中螯合剂的用途对技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington:The Science andPractice of Pharmacy,% 19 版，1995。
[0300]在进一步【具体实施方式】中，制剂也含有稳定剂。尽管药物组合物中稳定剂的用途对技术人员是众所周知的；但为了方便，参考Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第 19 版，1995。
[0301]本发明的组合物可以，例如为稳定的液体药物组合物，其治疗性活性组分包括可能在液体药物制剂中在储存期间显示聚集体形成的多肽。"聚集形成"意思是在引起寡聚体形成的多肽分子之间物理相互作用，其可以保留可溶性，或从溶液中沉淀的大的可见聚集体。"在储存期间"意思是一旦制备液体药物组合物或制剂，不立即给受试者施用。反而，在制备后，将其包装或以液体形式，以冷冻态或以干燥形式储存，用于后来重建为液体形式或适于给受试者施用的其它形式。"干燥形式"意思是液体药物组合物或制剂通过冷冻干燥(也就是冻干；见,例如Williams和Polli (1984) J.Parenteral Sc1.Technol.38:48-59),喷雾干燥(见 Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed ；Longman Scientific 和 Technical, Essez, U.K.), pp.491-676 ；Broadhead 等(1992)DrugDevel.1nd.Pharm.18:1169-1206 ；和 Mumenthaler 等(1994)Pharm.Res.11:12-20)，或风干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology25:459-470 ；和 Roser (1991) Biopharm.4:47-53)进行干燥。在液体药物组合物储存期间多肽的聚集形成能不利地影响导致药物组合物治疗性功能丧失的多肽的生物学活性。此外，当使用输注系统施用包含多肽的药物组合物时，聚集形成可以引起其它的问题例如阻塞管、膜或泵。
[0302]本发明的药物组合物也可以含有足够减少在组合物储存期间多肽引起的聚集形成的量的氨基酸碱。"氨基酸碱"意思是氨基酸或氨基酸组合，其中任意所给的氨基酸以其游离碱形式或以其盐形式存 在。当使用氨基酸的组合时，全部的氨基酸可以它们的游离碱形式存在，全部可以它们的盐形式，或一些可以它们游离碱形式而其它以它们的盐形式存在。在一个【具体实施方式】中，在制备本发明组合物中使用的氨基酸是带有电荷侧链的那些，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如蛋氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和其混合物)的任何立体异构体(也就是L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合，可以在本发明的药物组合物中存在，只要该特定氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。在一个【具体实施方式】中，使用了 L-立体异构体。本发明的组合物也可以与这些氨基酸的类似物配制。"氨基酸类似物"意思是引起降低在本发明的液体药物组合物储存期间由多肽引起的聚集形成期望效果的自然存在的氨基酸衍生物。适当的精氨酸类似物包括，例如氨基胍，鸟氨酸和N- —乙基L-精氨酸，适当的蛋氨酸类似物包括乙硫氨酸和buthionine而且适当的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。当用其它的氨基酸时，将氨基酸类似物以它们的游离碱形式或盐形式合并入组合物中。在本发明进一步【具体实施方式】中，氨基酸或氨基酸类似物以足够预防或延迟蛋白质聚集的浓度使用。
[0303]在进一步【具体实施方式】中，当用作治疗药的多肽是含有至少一个对这种氧化敏感的蛋氨酸残基的多肽时，可以添加蛋氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸类似物)以抑制蛋氨酸残基氧化为蛋氨酸亚砜。"抑制"意思是随时间蛋氨酸氧化的种类的最小的积聚。抑制蛋氨酸氧化导致多肽以其适当的分子形式更大的保留。可以使用蛋氨酸(L或D)的任何立体异构体或其组合。要添加的量应为足够抑制蛋氨酸残基氧化的量，这样蛋氨酸亚砜的量对管理机构来说是可以接受的。典型地，这意味着组合物包含不大于大约10%到大约30%的蛋氨酸亚砜。通常地，这可以通过添加蛋氨酸(这样添加的蛋氨酸与蛋氨酸残基的比率范围从大约I:1到大约1000:1，例如10:1到大约100:1)来获得。
[0304]在进一步【具体实施方式】中，制剂也含有选自高分子量聚合物或低分子化合物组的稳定剂。在一个【具体实施方式】中，稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL, HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如一硫代甘油、巯基乙酸和2-甲硫基乙醇，和不同的盐类(例如氯化钠)。这些特定稳定剂的每一个构成本发明备择的【具体实施方式】。
[0305]药物组合物也可以含有进一步增强其中治疗活性多肽的稳定性的附加的稳定剂。为本发明所特有兴趣的稳定剂包括，但不限于，保护多肽免于蛋氨酸氧化的蛋氨酸和EDTA，和保护多肽免于与冻融或机械剪切有关的聚集的非离子表面活性剂。
[0306]在进一步【具体实施方式】中，制剂也含有表面活性剂。在一个【具体实施方式】中，表面活性剂选自去污剂、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙酰单酸甘油乙酯、脂肪酸脱水山梨醇酯、聚氧化丙稀-聚氧化乙烯嵌段共聚物(例如泊咯沙姆例如Pluronic? F68、泊咯沙姆188和407、TritonX-100)、聚氧化乙烯脂肪酸脱水山梨醇酯、聚氧化乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温，例如吐温-20、吐温-40、吐温-80和Bri j-35)、单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧化乙烯衍生物、醇类、甘油、凝集素类和磷脂类(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂类衍生物(例如棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂类(例如乙醇胺的棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和1-酰基-sn-丙三醇-3-磷酸酯、胆碱、丝氨酸或苏氨酸)和溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱类的 烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蘧酰衍生物和极性头基团的修饰形式，其为胆碱类、乙醇胺类、磷脂酸、丝氨酸类、苏氨酸类、甘油、肌醇和正电荷的DODAC、D0TMA、DCP、BISH0P、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸和丙三醇磷脂类(例如脑磷脂类)、甘油糖脂类(例如吡喃半乳糖苷)、神经鞘糖脂类(例如神经酰胺类、神经节苷脂类)、十二烷基磷酸胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂、梭链孢酸衍生物(例如牛磺二氢梭链孢酸钠等)、C6-C12的长链脂肪酸和其盐类(例如油酸和辛酸)、酰基肉碱类和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N°-酰化衍生物、或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、含有赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸任何组合的二肽类的N°-酰化衍生物、含有中性氨基酸和两个带电氨基酸任何组合的三肽的N°-酰化衍生物、DSS(琥珀辛酯钠、CAS登记号[577-11-7])、琥珀辛酯钙、CAS登记号[128-49-4])、琥珀辛酯钾、CAS登记号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸类和其盐类与甘氨酸或牛磺酸缀合物、乌素脱氧胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、N-十六烷基-N，N- 二甲基-3-氨溶-1-丙磺酸盐、阴离子(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂、两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N- 二甲氨溶-1-丙磺酸盐类、3-胆酰氨基-1-丙基二甲氨溶-1-丙磺酸盐、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如十六烷基-三甲溴化铵、十六烷基氯化吡啶银)、非离子表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、乙二胺衍生物类(poloxamines)(例如Tetronic’ s)、其为来源于连续添加环氧丙烷和环氧乙烧到乙二胺的四功能嵌段共聚物，或表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物或其混合物的组。这些特定表面活性剂的每一个构成本发明备择的【具体实施方式】。
[0307]虽然药物组合物中表面活性剂的用途对技术人员是众所周知的；但是为了方便，参考 Remington:The Science 和 Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。
[0308]在进一步【具体实施方式】中，虽然也可以使用其它的商业上可获得和适当的蛋白酶抑制剂，该制剂也含有蛋白酶抑制剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)和苄脒HC1。为了抑制自催化，蛋白酶抑制剂的用途在含有蛋白酶的酶原的药物组合物中特别有用。
[0309]其它的成分也可以在本发明的药物制剂中存在。这种附加成分可以包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力改进剂、螯合剂、金属离子、含油赋形剂、蛋白质(例如人类血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这种附加成分优选地不会不利地影响本发明药物制剂的总稳定度。
[0310]包含根据本发明抗体的药物组合物可以给需要这种治疗的患者，在几个部位施用，例如在局部部位，例如皮肤和粘膜部位，在绕过吸收的部位，例如在动脉、在静脉、在心脏中施用和在包括吸收的部位，例如在皮肤中、在皮下、在肌肉中和腹部中施用。
[0311]根据本发明药物组合物的施用可以通过几个途径给需要这种治疗的患者施用，例如舌、舌下、颊、口中、口服、胃和肠中、鼻、肺，例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼睛、例如通过结膜、输尿管和胃肠外。
[0312]本发明的组合物可以多种剂量形式施用，例如溶液、悬液、乳剂、微乳剂、多重乳剂、泡沫、油膏剂、膏剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、清洗剂、胶囊剂、例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊、栓剂、直肠用胶囊、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气雾剂、吸人剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用清洗剂、阴道栓 剂、阴道环、阴道软膏剂、注射液、原地转化溶液、例如原地胶凝、原地凝固(Se11 ing )、原地沉淀、原地结晶化、输注液和植入物。
[0313]为了进一步增强抗体稳定性，提高生物利用度，提高溶解度，减少不良作用，达到对本领域技术人员众所周知的择时治疗，和提高患者顺应性或其任何组合，本发明的组合物可以进一步例如通过共价，疏水和静电相互作用，混合在或连接到药物载体，药物传递系统和高级药物传递系统。载体，药物传递系统和高级药物传递系统的例子包括，但不限于聚合体，例如纤维素和衍生物、多糖，例如右旋糖苷和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚羟基乙酸和其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白质，例如白蛋白、凝胶，例如热胶凝(thermogelling)系统,例如对那些本领域技术人员众所周知的嵌段共聚物系统、胶束、脂质体、微球体、纳米颗粒、液晶和其分散体、L2相和其分散体，其对那些脂质-水系统中相行为领域技术人员众所周知，聚合胶束、多重乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精和其衍生物和树状聚合物(dendrimers)。
[0314]本发明的组合物在固体、半固体、粉剂和溶液制剂中是有用的，用于使用例如定量吸入器、干粉吸入器和雾化器(所有的装置对那些本领域技术人员是众所周知的)肺给予抗体。
[0315]本发明的组合物在控制的、持续的、延长的、延迟和缓慢释放药物传递系统的制剂中特别有用。更特别地，但不限于，组合物在本领域技术人员众所周知的胃肠外控制释放和持续释放系统(两系统导致施用次数的多倍减少)制剂中是有用的。甚至更优选地，是皮下施用的控制释放和持续释放系统。不限制本发明的范围，有用的控制释放系统和组合物的例子是水凝胶、油质凝胶、液晶、聚合胶束、微球体、纳米粒子。
[0316]产生对本发明的组合物有用的控制释放系统的方法包括，但不限于，结晶、浓缩、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀化、包囊、喷雾干燥、微囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以产生微球体、挤压和超临界流体过程。通常参考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise, D.L.编，Marcel Dekker, New York,2000)和 Drug and thePharmaceutical Sciences vol.99:Protein Formulation and Delivery(MacNally,E.J.编，Marcel Dekker，New York, 2000)。
[0317]胃肠外施用可以使用注射器，任选地笔样注射器通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行。备择地，胃肠外施用可以使用输注泵进行。进一步选择是可以是用于以鼻或肺喷雾形式施用抗体溶液或悬液的组合物。作为另外的选择，包含本发明抗体的药物组合物也可以适合于经皮施用，例如通过无针注射或来自贴片，任选地离子电渗贴片，或经粘膜，例如颊施用。
[0318]抗体可以通过肺途径，使用适于肺部药物输送的任意已知类型的装置，在介质中以溶液、悬液或干粉形式进行施用。
[0319]这些的例子含有，但不限于，用于肺部药物输送的产生气雾剂的三个通常类型，并且可以包括喷射器或超声波雾化器，定量吸入器，或干粉吸入器(Cf.Yu J，ChienYff.Pulmonary drug delivery:Physiologic and mechanistic aspects.Crit Rev TherDrug Carr Sysl4(4)(1997)395-453)。
[0320]基于标准化的测试方法学，将粒子的空气动力直径(da)定义为单位密度的参考标准球形粒子的几何等价直径(lg/cm3)。在最简单的情况，对于球形粒子，da与参考直径(d)相关，参考直径为密度比率 的平方根的函数，如下式所描述:
[0321]
【权利要求】
1.一种分离的人类抗体，其与KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一个结合，但是不结合 KIR2DS4。
2.权利要求1的分离的人类抗体，其进一步不与KIR2DS3结合。
3.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体阻断KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一个与I类HLA-C分子结合。
4.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体阻断HLA-Cw4分子与KIR2DL1的结合，以及HLA-Cw3分子与KIR2DL2或KIR2DL3中的至少一个结合。
5.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体加强NK细胞对表达I类HLA-C分子的人类靶细胞的裂解活性。
6.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体在与KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一个结合中，与含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争。
7.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体在与KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一个结合中，与含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争。
8.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体含有包含SEQID N0:15的氨基酸序列的轻链可变区。
9.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体包含: (a)对应于SEQID NO:17的残基31-35的重链CDRl氨基酸序列； (b)对应于SEQID NO:17的残基50-65的重链CDR2氨基酸序列；和 (c)对应于SEQID NO:17的残基99-112的重链CDR3氨基酸序列。
10.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体含有包含SEQID NO:17的氨基酸序列的重链可变区。
11.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体对KIR2DL1的解离常数(Kd)不大于大约0.45nM。
12.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体对KIR2DL3的Kd不大于大约0.025nM.
13.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体与实质上含有氨基酸残基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 的 KIR2DL1 表位结合。
14.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体阻断HLA-Cw4分子与KIR2DL1的胞外部分(SEQ ID NO:23)的残基M44、F45和D72的结合。
15.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体为单克隆抗体。
16.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体为IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
17.前述权利要求任意一项的分离的人类抗体，该抗体为IgG4抗体。
18.编码前述权利要求任意一项的人类抗体的核酸。
19.含有权利要求18的核酸的载体。
20.含有权利要求19的载体的细胞。
21.—种产生人类抗KIR抗体的方法，它包括在适于表达抗KIR抗体的条件下培养权利要求20的细胞。
22.—种药物组合物，它含有可检测地加强患者中NK细胞细胞毒性有效量的权利要求1-17任意一项的人类抗体，或通过权利要求21的方法产生的人类抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
23.权利要求22的药物组合物，它含有吐温80、蔗糖，或吐温80和蔗糖二者。
24.一种加强有其需要的受试者中NK细胞活性的方法，该方法包括给予该受试者有效量的权利要求22到23任意一项的组合物。
25.权利要求24的方法，其中受试者为患有癌症的患者。
26.权利要求25的方法，其中患者患有选自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤的癌症。
27.权利要求25的方法，其中患者患有选自结肠直肠癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤的癌症。
28.权利要求24的方法，其中受试者为患有感染性疾病的患者。
29.权利要求24到28任意一项的方法，它还包括给予选自免疫调节剂、激素药剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、结合抑制性KIR的第二抗体、抗感染剂、导向剂和辅助化合物的治疗剂。
【文档编号】C12N15/13GK103509111SQ201310415588
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2005年7月1日 优先权日:2004年7月1日
【发明者】A·莫雷塔, M·德拉齐萨, P·安德烈, L·戈捷, F·罗马格涅, P·A·N·R·瓦格特曼, I·斯文德森, S·扎恩, A·斯温森, M·斯奥夫森, S·贝格佩德凯尔, K·谢尔高, P·施佩, W·迈克尔 申请人:诺和诺德公司, 伊纳特医药公司, 热纳亚大学