用于检测男性生育力的引物、探针及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测男性生育力的引物、探针及其试剂盒，所述引物由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No:1，反向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No:2所示。所述探针包括四种探针，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?No:3、SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:5、SEQ?ID?No:6所示，所述四种探针的5'端标记有四种不同的报告荧光基团，3'端标记有淬灭荧光基团。所述试剂盒包括所述引物和所述探针。本发明实现了β防御素126基因双位点缺失的同时筛查，利用本发明进行检测能更真实地反映男性体内β防御素126的表达特征，可应用于男性不育诊断领域中。
【专利说明】用于检测男性生育力的引物、探针及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测男性生育力的的引物、探针及其试剂盒，具体地，涉及一种通过同时检测β防御素126基因双位点突变以诊断男性生育力的引物、探针及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]世界上大约10%至15%的夫妇患有不孕不育症，无精子或者精子密度、活力和形态畸形等只能解释其中部分案例。最新研究发现，精子包膜缺陷是导致男性不育的新原因；而精子包膜缺陷是β防御素126基因突变造成的。防御素在动植物界中广泛存在，根据其所含三对二硫键连接方式的不同，分为α，β和Θ防御素。β防御素是一类具有广谱抗菌性质的带阳离子的小分子多肽。在哺乳动物中，大部分β防御素基因主要在雄性生殖道中表达，是一类富含精氨酸的阳离子多肽，具有广谱的抗微生物活性。附睾β防御素家族蛋白不仅在宿主生殖道防御方面起作用，而且在雄性生育中亦发挥重要作用，β防御素126表达异常或缺失表达会导致人精子穿过透明质酸的能力降低，进而使男性的自然生育能力降低。
[0003]β防御素126存在多个移码突变位点，其中一个位点(rsl 1468374，chr20:126314-126315，如图1和图3所示)的移码突变已被证明与男性生育力降低相关，但我们发现该位点并不能真实全面地反映体内β防御素126 (DEFB126)的表达异常情况。
[0004]通过PCR扩增产物测序、实时荧光定量PCR等技术方法，我们发现DEFB126还存在另一个位点的移码突变(rsll467497，chr20:126160-126163，如图1和图2所示)，该位点移码突变与男性不育亦呈现高度相关性。统计结果表明rsl 1467497和rsl 1468374也高度相关。
[0005]研究发现，联合检测2个SNP位点能更有效检测不明原因的男性不育问题，建立在此基础上的分子检测，能及时提醒医疗机构及时调整治疗方案、减轻病患的经济负担；在建立人类精子库时有利于发现潜在不合格的标本；对准备进行IVF实验的患者而言可以做出前瞻性的风险评估；而对该基因的了解亦会帮助了解后代发生不孕不育的风险，从而对子代遗传有指导意义。
[0006]在现有技术中检测β防御素126基因突变时，只是针对一个位点的缺失，而且检测试剂和方法只适用于常规PCR，目前国内外还没有通过荧光探针对β防御素126基因rsll467497和rsll468374两个突变位点同时进行检测以诊断男性生育力的文献报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种通过同时检测β防御素126基因双位点突变以诊断男性生育力的引物、探针及其试剂盒，本发明实现了 β防御素126基因双位点缺失的同时筛查，利用本发明进行检测能更真实地反映男性体内β防御素126的表达特征，进而实现男性生育力的诊断。[0008]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0009]—种检测男性生育力的引物，由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No: 1，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0010]一种与所述引物配合使用的探针，所述探针包括四种探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID No:3,SEQ ID No:4,SEQ ID No:5,SEQ ID No:6 所示，所述四种探针的 5’ 端标记有四种不同的报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
[0011]优选的，所述四种探针的报告荧光基团分别为TAMRA、ROX、FAM、VIC。
[0012]优选的，SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示探针的淬灭荧光基团为BHQ2 ;SEQ IDNo:5和SEQ ID No:6所示探针的淬灭荧光基团为BHQl。
[0013]一种检测男性生育力的试剂盒，含有所述正向引物和反向引物。优选的，所述试剂盒还包括所述的探针。更优选的，所述试剂盒还包括以下试剂:2XMaster Mix。最优选的，所述试剂盒还包括以下试剂:裂解吸附液、洗涤液、洗脱液和氧化硅磁珠悬浮液，所述裂解吸附液含有 3.6mol/L GuHCl 和 10mmol/L Tris-HCl ;所述洗涤液含有 800mmol/L LiCl 和IOOmmoI/L NaCl ;所述洗脱液含有 10mmol/L Tris-HCl。
[0014]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0015]rsll467497位点与男性不育高度相关，是β防御素126基因缺失常见形式之一，rsl 1467497与rsl 1468374在各分组人群中高度相关，二者单独或共同作用导致精子包膜缺失，进而导致男性不孕不育；利用本发明提供的试剂盒能够通过探针法荧光定量PCR实现rsll467497和rsll468374双缺失位点的筛查，能更真实地反映男性体内β防御素126的表达特征。通过利用本发明进行分子检测，对疾患而言能及时提醒医疗机构调整治疗方案，减轻病患的经济负担；对建立人类精子库也能发现潜在不合格的标本；对准备进行IVF实验的患者而言可以做出前瞻性的风险评估；而对β防御素126基因的了解亦会帮助了解后代发生不孕不育的风险，从而对子代遗传有指导意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0017]图1为β防御素126基因的结构示意图。
[0018]图2为β防御素126基因rsll467497位点(chr20:126160-126163)的突变位置
示意图。
[0019]图3为β防御素126基因rsll468374位点(chr20:126314-126315)的突变位置示意图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0021]实施例1、β防御素126DNA模板的制备[0022]在制备β防御素126模板DNA分子时，采用以下步骤完成:
[0023]步骤(I)在2313个标本数中，各取100μ L抗凝血、750μ L裂解吸附液(3.6mol/LGuHCl, IOmmoI/L Tris-HCl)和适量(2_5 μ L)氧化硅磁珠悬浮液到1.5mL离心管中，漩涡振荡混匀后室温静置5分钟；
[0024]步骤(2)置磁力架上分离固液相，弃废液；
[0025]步骤(3)加入900 μ L 洗涤液(800mmol/L LiCl，IOOmmoI/L NaCl)，漩涡振荡混匀后置磁力架上分离固液相，弃废液；
[0026]步骤(4)加入900μ L70%乙醇洗涤，漩涡振荡混匀后置磁力架上分离固液相，弃废液；
[0027]步骤(5)重复步骤(4)；
[0028]步骤(6)加入20 μ L洗脱液(10mmol/L Tris-HCl)，65°C放置5分钟后置磁力架上分离固液相；
[0029]步骤(7)吸取液相到新的离心管中待用。
[0030]实施例2、探针法荧光定量PCR检测不同β防御素126基因型
[0031]将实施例1获得的DNA模板分子分别进行探针法荧光定量PCR扩增。探针法荧光定量PCR扩增的引物和探针序列如下表1所示(其中，2W代表rsll468374位点的野生型，2D代表rsl 1468374位点的突变型；4W代表rsl 1467497位点的野生型，4D代表rsl 1467497位点的突变型)，PCR反应体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示，不同荧光探针与基因型的对应关系如表4所不。
[0032]根据每个样本的扩增曲线可确定其基因型,在2313各检测标本中，根据4种荧光曲线的变化趋势，分别有 4 ffff-2ffff，4WW-2DD, 4WW-2WD, 4WD-2WW, 4WD-2DD，4WD-2WD，4DD-2WW,4DD-2DD,4DD-2WD 累计 9 种情形。
[0033]β防御素126不同基因型的荧光定量PCR检测结果如表5所示，已检测样本的统计结果如表6所示，rsll468374位点在不同中国人群中分布如表7所示，rsll467497位点在不同中国人群中的分布如表8所示，rsll468374位点和rsll467497位点相关性研究如表9所示。
[0034]在β防御素126的不同基因型中，4W-2W表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Νο:7所示；4W-2D表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；4D_2D表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示；4D-2W表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 10所示。
[0035]表1
[0036]
【权利要求】
1.一种检测男性生育力的引物，其特征在于:由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No: 1，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于:所述探针包括四种探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID No: 3, SEQ ID No:4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No:6所示，所述四种探针的5’端标记有四种不同的报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于:所述四种探针的报告荧光基团分别为TAMRA、丽、FAM、VIC。
4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于:SEQID No:3和SEQ ID No:4所示探针的淬灭荧光基团为BHQ2 ；SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示探针的淬灭荧光基团为BHQl。
5.一种检测男性生育力的试剂盒，其特征在于:含有权利要求1所述正向引物和反向引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:还包括权利要求2、3或4所述的探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:还包括以下试剂:2XMasterMix。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:还包括以下试剂:裂解吸附液、洗涤液、洗脱液和氧化硅磁珠悬浮液，所述裂解吸附液含有3.6mol/L GuHCl和lOmmol/LTris-HCl ;所述洗涤液含 有800mmol/L LiCl和100mmol/L NaCl ;所述洗脱液含有IOmmol/L Tris-HCl0
【文档编号】C12Q1/68GK103468807SQ201310415474
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】施长根, 施惠娟, 王荣芳, 段世伟, 吴峻, 袁瑶, 吴斌 申请人:上海惠宝生物科技有限公司