专利名称：快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-Ⅰ型抗体的垂直流免疫印迹法的制作方法
技术领域：
本发明提供一种免疫化学和生物化学分析方法一垂直流免疫印迹法，特别适用 于婴儿、采血困难和不愿采血者快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体的垂 直流免疫印迹法。
背景技术：
自上世纪80年代被发现以来，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染尚未找到有效的预防 和根治手段，早诊断、早隔离还是目前防止其进一步传播扩散的主要办法。用于检测HIV感 染的方法包括核酸检测、抗体检测和病毒载量检测等，其中抗体检测因其简单、快速，被世 界卫生组织和卫生部规定作为临床检测的主要方法。临床检测HIV抗体，免疫印迹法(WB) 是重要的方法，主要用于确认初筛结果为HIV阳性的血清样本。目前国内未见人类免疫缺 陷病毒-I型抗体尿液检测确认方法。 与血液检查相比，尿液检查有多种优点尿液为非创伤性获得的样品，适用于婴 儿、采血困难和不愿采血者；尿液中HIV病毒滴度相当低，目前尚未见经尿液感染HIV的相 关报道，消除了采集样本过程中感染的风险；尿液抗体含量稳定，常温可存放55天，2 8°C 可储存1年，储存和运输条件要求比血液低等。但研究表明尿液中HIV-1抗体的浓度较低， 特别是血清中浓度较高的p24抗体浓度低，因此需要提高尿液检测技术。
用传统免疫印迹法检测尿液样本HIV-1抗体，被检抗体在反应缓冲液中自由水平 扩散，结合时间长、效率低，且灵敏度远低于血液检测，不能作为常规检测手段。本垂直流免 疫印迹法可快速检测尿液人类免疫缺陷病毒-I型抗体，且简便实用、敏感特异。
发明内容
本发明的目的是针对性地研制出一种易于基层普及使用的简便、敏感、特异的快 速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体的垂直流免疫印迹法。采用垂流检测方法，利用 真空压力作用，使尿液样本在控制的时间内垂直通过硝酸纤维素膜，同时反应液中的抗体 也定向转移到膜上与抗原结合，通过设定检测流程和条件参数，从而提高抗体与抗原结合 的速率，縮短反应时间，实现快速检测尿液中HIV-1抗体的目的。 本快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体的垂直流免疫印迹法，是通过采 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和电转，并与真空抽滤系统结合构成 垂直流免疫印迹法检测方法，使尿液样本在可控的时间内垂直通过硝酸纤维素膜，从而增 加抗原抗体的结合，提高检测灵敏度，以快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1) 的抗体来确认HIV-1感染与否。 本发明在传统免疫印迹法的基础上，采用将包被有HIV-1抗原的硝酸纤维素膜粘 合于自制反应槽底的方法，通过与真空抽滤系统和支架搭建成垂直流检测装置，利用外力 作用使尿液样本在一定时间内垂直通过硝酸纤维素膜，加快了抗体与试剂条的反应速率的同时，确保抗体和抗原充分反应，提高检测特异性。 本垂直流免疫印迹法，是通过十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转，将 HIV-1抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后将膜粘合于自制反应槽的底部，并与真空抽滤系 统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法，使尿液样本在可控的时间内垂直通过硝酸纤维素 膜，用来加速抗原抗体反应，增加抗原抗体的结合，提高检测灵敏度和特异性，从而通过快 速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体，以确认HIV-1感染与否。
相应的，本发明提供了一种垂直流免疫印迹法快速检测尿液中HIV-1抗体的检测 装置，由包被有HIV-1抗原的硝酸纤维素膜、自制反应槽、真空抽虑系统和支架共同组建而 成。 使用本垂直流免疫印迹法，可以简便、灵敏、特异的检测尿液中HIV-1抗体，用于
实验室的诊断确认、药物治疗效果评价、流行病学调查等，适宜基层普及使用，具有较大的
推广应用价值。 具体步骤如下 —、材料准备 1、试剂 (1)裂解液lM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.8)、7% (W/V)十二烷基硫酸钠；
(2)电泳液甘氨酸10克、三羟甲基氨基甲烷6克、十二烷基硫酸钠2克于1升蒸 馏水(PH8. 7); (3)电转液氯化钠13克、乙二胺四乙酸二钠2克、三羟甲基氨基甲烷9. 5克溶于 1升蒸馏水OW. 5); (4)封闭液5%牛血清白蛋白； (5)粘合剂a -氰基丙烯酸乙酯瞬间粘合剂； (6) 10倍漂洗液氯化钠80克、磷酸氢二钠28. 8克、磷酸二氢钾2. 4克溶于1升 蒸馏水(IW. 0); (7)结合物碱性磷酸酶标记兔抗人免疫球蛋白(IgG)，按1 : 5000稀释；
(8)底物1. 2克5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、2. 3克氯化硝基四氮唑蓝溶于1 升蒸馏水。 2、载体硝酸纤维素膜(NC膜)。
3、抗原HIV-1抗原蛋白。
二、检测方法
1 、制备HIV-1抗原NC膜 将灭活HIV-1抗原按1 : 2加入裂解液，充分混合，置于56t:水浴中裂解30分 钟。裂解后的抗原用4%浓縮胶、12%分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 在150伏电泳60分钟后取出蛋白胶，与硝酸纤维素膜和滤纸组成"三明治"，在90伏电转55 分钟后取出硝酸纤维素膜，于封闭液中封闭1小时，然后37t:烘干备用。
2、制备垂直流检测装置 将包被HIV-1抗原的硝酸纤维素膜(6cmX8cm)粘合到特制的反应槽上，粘合剂涂 抹均匀，不留缝隙以免渗漏。待粘合剂彻底干燥后，将反应槽置于盒状支架上，并将支架上 的塑料管与真空抽滤器相连。注意整个装置的密封性。
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3、检测流程及条件参数 上述制备的反应槽，每槽加入1毫升尿液样本，置于摇床旋摇5分钟。连接垂直流 反应检测装置，打开真空抽滤器，由小到大调节压差为"0. 5个"工业大气压，控制抗原_抗 体反应时间(约为15分钟)。抽滤完毕，加入漂洗液，置于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。 然后加入碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG，置于摇床旋摇30分钟。反应完毕，加入漂洗液，置 于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。再加入底物，置于振荡器上旋摇10分钟后弃去，观察反 应结果。 4、检测结果显示及判断(见图1、图2) 采集12例HIV-1抗体阳性志愿者的血液样本和尿液样本、10例阴性志愿者血液样 本和尿液样本，分别用垂直流免疫印迹法和传统免疫印迹法检测，通过观察HIV-1主要抗 原蛋白阳性反应条带，如ENV带(gp41、 gpl20/gp160)、 P0L带(p31) 、 GAG(p24)等，最后按 照世界卫生组织相关规定判断检测结果。图l为垂直流免疫印迹法检测尿液样本结果，左 侧为1-12号阳性志愿者的尿液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的尿液样本检测 结果。图2为传统免疫印迹法检测血液样本结果，每份血液样本与尿液样本来源对应，左侧 为1-12号阳性志愿者的血液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的血液样本检测结 果。 按世界卫生组织相关规定判断图1和图2所示的检测结果，垂直流免疫印迹法检 测尿液样本与传统免疫印迹法检测血液样本，对22位志愿者HIV感染情况的判断结果相 同(见表1)，表明垂直流免疫印迹法可简便、特异、敏感的快速检测尿液中人类免疫缺陷病 毒-I型抗体。 因此，本发明在传统免疫印迹法的基础上，采用垂直流技术，使尿液样本在可控的 时间内垂直通过硝酸纤维素膜，既加速了抗原抗体反应，縮短检测时间，又增加了抗原抗体 的结合度，从而提高检测灵敏性。通过本发明可快速检测尿液中的HIV-1抗体，确认HIV-1 感染状况。可用于实验室的检测确认、药物治疗效果评价、流行病学调查等，适宜基层普及 使用，具有较大的推广应用价值。
图1为垂直流免疫印迹法检测尿液样本结果，左侧为1-12号阳性志愿者的尿液样 本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的尿液样本检测结果。 图2为传统免疫印迹法检测血液样本结果，每份血液样本与尿液样本来源对应， 左侧为1-12号阳性志愿者的血液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的血液样本检 测结果。
具体实施例方式
以下非限制性实施例旨在更加详细地阐释本发明，而不以任何方式限制本发明的 范围。 实施例
—、材料准备
1、试剂
(1)裂解液lM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.8)、7% (W/V)十二烷基硫酸钠；
(2)电泳液甘氨酸10g、三羟甲基氨基甲烷6g、十二烷基硫酸钠2g溶于1升蒸馏 水(PH8. 7); (3)电转液氯化钠13g、乙二胺四乙酸二钠2g、三羟甲基氨基甲烷9. 5g溶于1升
蒸馏水(ra7.5); (4)封闭液5 %牛血清白蛋白； (5)粘合剂a -氰基丙烯酸乙酯瞬间粘合剂； (6) 10倍漂洗液氯化钠80g、磷酸氢二钠28. 8g、磷酸二氢钾2. 4g溶于1升蒸馏 水(IW. 0); (7)结合物碱性磷酸酶标记兔抗人IgG，按1 : 5000稀释； (8)底物1. 2g 5-溴-4-氯_3_吲哚基磷酸酯、2. 3g氯化硝基四氮唑蓝溶于1升 蒸馏水。 2、载体硝酸纤维素膜(NC膜)。
3、抗原HIV-1抗原蛋白。
二、检测方法
1 、制备HIV-1抗原NC膜 将灭活HIV-1抗原按1 : 2加入裂解液，充分混合，置于56t:水浴中裂解30分 钟。裂解后的抗原用4%浓縮胶、12%分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 在150伏电泳60分钟后取出蛋白胶，与硝酸纤维素膜和滤纸组成"三明治"，在90伏电转55 分钟后取出硝酸纤维素膜，于封闭液中封闭1小时，然后37t:烘干备用。
2、制备垂直流检测装置 将包被HIV-1抗原的硝酸纤维素膜(6cmX8cm)粘合到特制的反应槽上，粘合剂涂 抹均匀，不留缝隙以免渗漏。待粘合剂彻底干燥后，将反应槽置于盒状支架上，并将支架上 的塑料管与真空抽滤器相连。注意整个装置的密封性。
3、检测流程及条件参数 上述制备的反应槽，每槽加入1毫升尿液样本，置于摇床旋摇5分钟。连接垂直流 反应装置，打开真空抽滤器，由小到大调节压差为"0. 5个"工业大气压，控制抗原_抗体反 应时间(约为15分钟)。抽滤完毕，加入漂洗液，置于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。然 后加入碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG，置于摇床旋摇30分钟。反应完毕，加入漂洗液，置于 摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。再加入底物，置于振荡器上旋摇10分钟后弃去，观察反应 结果。 4、检测结果显示及判断(见附图1) 图1中左侧为12份阳性样本检测结果；右侧为10份阴性样本检测结果。按照世 界卫生组织相关规定判断检测结果。 按上述方法条件进行严格的检测确认，并与传统免疫印迹法检测血液样本的结果 相比较，其HIV-1主要抗原蛋白均显示阳性反应条带，，如ENV带(gp41、gpl20/gp160) 、POL 带(p31)、GAG(p24)等，实验结果表明本垂直流免疫印迹法检测尿液样本与传统免疫印迹 法检测血液样本的结果相符合。见表l。 表l主要抗原蛋白灵敏度比较结果(12份阳性及不确定样本)
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主要抗原蛋白_尿检垂直流法检出率 与血检符合率
p24， p31， gp41和gpl20/gpl60 33. 3%(4/12) 100%
ENV和GAG和POL带各一条 58. 3% (7/12) 100%
ENV和 GAG或 POL带各 一 条 100% (12/12) 100%
权利要求
一种快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体的垂直流免疫印迹法，其特征是通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转，将人类免疫缺陷病毒-I型抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后将膜粘合于自制反应槽的底部，并与真空抽滤系统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法，使尿液样本在较短时间内垂直通过硝酸纤维素膜，加速抗原抗体反应，增加抗原抗体的结合，提高检测灵敏度及特异性，从而快速检测尿液中的人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体，以确认HIV-1感染与否。
2. 根据权利要求1所述的垂直流免疫印迹法，其特征在于可以利用垂直流免疫印迹法 快速检测尿液中HIV-1抗体，用于实验室的检测确认、药物治疗效果评价、流行病学调查研 究等。
全文摘要
本发明提供一种免疫化学和生物化学分析方法，特别适用于婴儿、采血困难和不愿采血者快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体的垂直流免疫印迹法。本发明是通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转，将HIV-1抗原包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上，然后将膜粘合于自制反应槽的底部，并与真空抽滤系统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法。该方法使尿液样本在可控时间内垂直通过硝酸纤维素膜，加速抗原抗体反应，增加抗原抗体的结合度，从而提高检测灵敏度。通过本发明可快速检测尿液中的HIV-1抗体，确认HIV-1感染状况。可用于实验室诊断确认、药物治疗效果评价等，适宜基层普及使用，具有较大的推广应用价值。
文档编号G01N33/561GK101726594SQ20091015662
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者倪崖, 房国坚, 李坤, 李忠辉, 谭卓, 黄云坚 申请人:浙江省医学科学院