菇娘在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了菇娘的新用途——菇娘在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。本发明还提供了菇娘果汁、果肉种子提取物、宿萼提取物的制备方法。研究表明，菇娘果汁、果肉种子提取物、宿萼提取物能够激活Nrf2信号通路，促进抗氧化和II相解毒酶的表达，增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力，并能够抑制致癌物砷引起的细胞毒性，减弱活性氧H2O2诱导的神经细胞毒性。因此，可将其制备成相应的口服制剂和注射剂，并用于肿瘤、神经退行性疾病预防。
【专利说明】菇娘在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及菇娘的新用途，尤其涉及菇娘在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。
【背景技术】
[0002]随着社会的发展，人类生活水平和医疗环境的改善，人类寿命得到了显著的延长，但同时，恶性肿瘤、神经退行性疾病的发病率也在提高，严重威胁人类健康，给国家和社会带来沉重的负担。在尚无有效药物实现对上述疾病有效治疗的前提下，研发具有预防作用的药物和保健品，防止疾病的早期形成和发生成为有效的应对策略。
[0003]核转录因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid2-related factor2)是调节细胞氧化还原平衡的重要转录因子，通过与抗氧化酶和II相解毒酶启动子区域抗氧化反应原件(ARE)结合调控细胞氧化还原平衡，其目标基因包括编码GST、UGT、y GCS, NQOl的II相解毒酶，及GCUHO-1等内源性抗氧化蛋白。当机体暴露于亲电性异物、化学致癌物、内源性氧化剂等对机体有损伤作用的物质下，Nrf2便会被激活并通过上调抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保护机体免受毒物的损伤(Lau et al.，Pharmacol.Res.，2008，58，262-270)。因此，通过激活Nrf2信号通路，增强机体自身清除毒物的能力，能够预防多种疾病的发生，例如肿瘤和神经退行性疾病。
[0004]在氧化应激状态下，面对内源性和外源性毒物对机体的侵害,利用外源性Nrf2激动剂上调机体Nrf2水平，能够增强机体自身防御能力，对于预防肿瘤、神经退行性疾病的发生具有重要意义(Magesh etal.,Med.Res.Rev.，2012，32，4，687-726)。激活 Nrf2 信号通路，能够上调II相解毒酶水平，清除致癌物或降低其毒性，抑制致癌物诱导的DNA损伤、基因突变，从而预防肿瘤的发生。通过上调Nrf2表达，能够增加细胞内谷胱甘肽水平，增强抗氧化酶活性，清除细胞内活性氧，抑制细胞脂质过氧化，降低阿尔茨海默氏症和帕金森氏病等神经退行性疾病的发病率。因此，具有Nrf2激动作用的单体化合物、植物提取物等能够有效预防肿瘤和神经退行性疾病发生。
[0005]菇娘为茄科酸浆属(Physalis)植物，广泛的分布于我国东北、华北、长江中下游地区。市场销售的燕娘果通常为酸浆 (Physalis alkekengil var.francheti (Mast.)Makino)、毛酸衆(Physialis pubescensL.)、小果酸浆(Physialis peruviana)的外被宿萼的果实。其果实和宿萼中含有大量的油酸，亚油酸等不饱和脂肪酸，丰富的无机元素(以钾、磷、钠、镁和钙的含量较高)、18种氨基酸和丰富的维生素(安徽农业科学，2012，40，16113-16114)。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，本发明提供了菇娘的新用途——在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。另外，本发明还提供了菇娘提取物——菇娘果汁、果肉种子提取物、宿萼提取物的制备方法。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明的发明人通过研究发现，菇娘果汁、果肉种子提取物、宿萼提取物能够激活Nrf2信号通路，并能保护细胞抵抗砷和双氧水产生的细胞毒性，因此，可以以菇娘为原料制备预防肿瘤、神经退行性疾病的保健品，也可以制备治疗肿瘤、神经退行性疾病的药物(经查阅文献，迄今为止未见有菇娘激活Nrf2信号通路的报道，亦未见菇娘用于肿瘤、神经退行性疾病预防的报道)。
[0009]具体应用时，可以以菇娘果汁、果肉种子提取物、宿萼提取物等菇娘提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂(包括软胶囊)、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂等剂型，优选颗粒剂、胶囊剂、片剂；或者将提菇娘取物进一步纯化制成注射制剂。也可以将菇娘提取物与其它对肿瘤、神经退行性疾病有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂(包括软胶囊)、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂、注射剂等剂型。
[0010]所述菇娘果汁，是通过以下方法制备得到的:将菇娘果实与宿萼分开，取果榨汁，过滤，滤液即为菇娘果汁，可以根据需求再加入适量水，以配制成不同浓度的果汁。
[0011]所述菇娘果肉种子提取物，是通过以下方法制备得到的:
[0012]将菇娘果实与宿萼分开，取果榨汁，过滤得果汁、果肉和种子；取果肉和种子，用0?95%乙醇(指体积份数，当取到“0”时即为纯水)回流提取I?8次，每次溶剂用量为药材重量(果肉和种子)的I?20倍，每次提取时间为0.5?10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇(如减压回收)，浓缩得浸膏；向浸膏中加入浸膏重量I?20倍的水混悬后，用混悬液体积I?20倍的二氯甲烷萃取，分离水相和二氯甲烷相，对二氯甲烷相进行浓缩、干燥，SP得果肉种子提取物。
[0013]所述菇娘宿萼提取物，是通过以下方法制备得到的:
[0014]将菇娘果实与宿萼分开，取宿萼，用0?95%乙醇(指体积份数，当取到“0”时即为纯水)回流提取I?8次，每次溶剂用量为宿萼重量的I?20倍，每次提取时间为0.5?10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇(如减压回收)，浓缩、干燥，即得菇娘宿萼提取物。
[0015]所述菇娘果汁、菇娘果肉种子提取物、菇娘宿萼提取物，均可以用于制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品。
[0016]本发明的发明人完成了菇娘果汁、果肉和种子提取物、宿萼提取物对Nrf2信号激活作用的研究。结果表明，上述三种菇娘提取物能够在蛋白水平激活Nrf2，增加Nrf2及其下游基因NQOl和GCS的表达，通过增加细胞内谷胱甘肽的水平增强细胞还原能力。发明人还发现它们能够抑制致癌物砷诱导的细胞毒性，表现出抑制细胞癌变的能力；能够降低H2O2诱导神经细胞毒性，表现出预防神经退行性疾病的潜力。下面以菇娘果汁为例，介绍其对Nrf2信号通路的作用:
[0017]采用能够稳定表达含ARE依赖的荧光素酶质粒的MDA-MB-231-Luc细胞系，比较了菇娘果汁与其他水果(草莓、樱桃、西红柿)对Nrf2的作用，结果表明菇娘果汁具有激活Nrf2信号通路的作用，其活性强于其他水果(图1)。采用ARE依赖的荧光素酶报告筛选试验作为活性指导，按照图2所示提取流程，活性追踪了具有Nrf2激动作用的菇娘果实和宿萼部位，结果表明菇娘果果汁、果肉种子提取物二氯甲烷部位、宿萼提取物均具有激活Nrf2信号通路的作用(图3)。
[0018]选择人乳腺癌MDA-MB-231细胞作为检测细胞，评价菇娘果汁对Nrf2信号通路的作用。蛋白质印迹分析结果表明，菇娘果汁能够上调Nrf2蛋白的表达，并能促进下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQOl和YGCS的表达(图4)。
[0019]选择人正常肺上皮HBE细胞，检测了菇娘果汁对细胞内谷胱甘肽水平的影响。结果显示，菇娘果汁能增加细胞内谷胱甘肽水平(图5)，增强细胞内还原能力和清除活性氧能力。
[0020]选择致癌物砷诱导的细胞毒性模型，评价菇娘果汁对人正常肺上皮HBE细胞的保护作用。经菇娘果汁处理后，细胞生存率显著高于未加药处理组，证明菇娘果汁能够抑制三价砷诱导的细胞毒性(图6)，表明菇娘果汁可用于肿瘤的预防。同时发现，果肉种子提取物和宿萼提取物具有与菇娘果汁相同的预防肿瘤形成的能力。
[0021]选择活性氧H2O2诱导的细胞毒性模型，评价菇娘果汁对神经细胞PC12的保护作用。结果表明菇娘果汁能够抑制H2O2产生的毒性，提高细胞生存率(图7)。神经退行性疾病的发生多与活性氧产生的毒性密切相关，该结果证明菇娘果汁可用于神经退行性疾病的预防。果肉种子提取物和宿萼提取物具有与菇娘果汁相同的预防神经退行性疾病的能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1:ARE依赖的荧光素酶报告试验表明菇娘果汁能够激活Nrf2信号通路，图中的1:500、1:100、1:50表示的含义为果汁的稀释倍数。
[0023]图2:菇娘果实和宿萼分部提取流程图。
[0024]图3 =ARE依赖的荧光素报告试验测定菇娘各部分激活Nrf2信号通路的作用。
[0025]图4:蛋白质印迹分析表明菇娘果汁能够在蛋白水平激活Nrf2其下游基因，图中的1:500、1:100、1:50表示的含义为果汁的稀释倍数。
[0026]图5:菇娘果汁能够增加细胞内谷胱甘肽水平，图中的1:500、1:100、1:50表示的含义为果汁的稀释倍数。
[0027]图6:菇娘果汁能够降低砷诱导的细胞毒性(*p〈0.05)。
[0028]图7:菇娘果汁能够降低H2O2诱导的细胞毒性(*p〈0.05)。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述实施例仅为说明之目的，并非用于限制本发明。
[0030]实施例1:菇娘果汁对Nrf2信号通路的激活作用
[0031]方法:(1)菇娘果汁的制备
[0032]菇娘果200g，将果实与宿萼分开，取果榨汁，过滤，得滤液130mL，即为菇娘果汁。草莓、樱桃、西红柿采用相同方法制备果汁，用于活性评价。
[0033](2)人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系的培养
[0034]人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用含10%胎牛血清(FBS)、2mMHEPES和6ng/mL胰岛素的MEM培养基，置于37°C，5%C02培养箱中培养。
[0035](3) ARE依赖 的荧光素酶报告试验[0036]将MDA-MB-231-Luc细胞接种于96孔板上，24小时后加入不同浓度的待测化合物，处理16小时，采用细胞裂解液[0.1M磷酸钾和ImM 二硫苏糖醇]裂解细胞，用检测液(25mM双甘氨肽，15mM硫酸镁，500 u MATP, 250 u M荧光素和250 y M辅酶A)，测定荧光强度。
[0037]结果:如图1所示，菇娘果汁能够显著增强ARE依赖的荧光素酶活性，1:50浓度处理细胞组，其强度是空白对照组的4倍，是阳性对照药物萝卜硫素(2.5 PM)的1.5倍。在测定浓度下(I: 50-1:500)，草莓、樱桃、西红柿果汁未表现出明显的Nrf2激活作用。上述结果表明，与草莓、樱桃、西红柿果汁相比，菇娘果汁能够更好的诱导Nrf2信号通路，对机体具有更好的保护作用。
[0038]实施例2:不同菇·娘部位的制备及其对Nrf2信号通路的作用
[0039]方法:(1)不同菇娘部位的制备(分部提取流程图如图2所示)
[0040]菇娘果200g，将果实与宿萼分开，取果实榨汁，过滤，得130mL滤液(菇娘果汁)和50g滤渣(果肉和种子)；果肉和种子50g，以其重量10倍的75%乙醇回流提取2次，每次I小时，合并提取液，过滤，浓缩至浸膏，加水IOOmL混悬，并以二氯甲烷萃取(2 X IOOmL),蒸干二氯甲烷相得果肉种子提取物1.1g ;宿萼6g，以其重量10倍的75%乙醇回流提取2次，每次I小时，合并提取液，过滤，浓缩至宿萼提取物1.2g。
[0041](2) ARE依赖的荧光素酶报告试验
[0042]方法如实施例1所示。
[0043]结果:如图3所示，按照上述方法制备的果肉种子提取物和宿萼提取物能够增强ARE依赖的荧光素酶活性，表明这两种提取物具有激活Nrf2信号通路的作用。
[0044]实施例3:菇娘果汁能够上调Nrf2及以下游基因蛋白水平的表达
[0045]方法:蛋白质印迹分析(Western blot)检测细胞中蛋白水平的变化
[0046]将MDA-MB-231细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70%?80%后，力口入不同浓度的菇娘果汁(菇娘果汁为实施例1制备)处理16h，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液(50 V- g/ml抑肽酶，0.5mM苯甲基磺酰氟，ImM正I凡酸钠，IOmM氟化钠，IOmMP -磷酸甘油)，收集蛋白并采用Bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白(100 y g)上样，SDS-PAGE分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经TBS配制5%的脱脂奶粉溶液室温封闭Ih后，分别与各待测蛋白抗体4°C孵育过夜。经TBS洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育Ih后，用增强型ECL化学发光进行蛋白分析。
[0047]结果:如图4所示，细胞经菇娘果汁处理16h后，Nrf2及其下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQOl和Y GCS蛋白水平呈现剂量依赖性增加，证实菇娘果汁能够在蛋白水平上计划Nrf2信号通路。
[0048]实施例4:菇娘果汁增加细胞内谷胱甘肽水平
[0049]方法:(I)人正常肺上皮细胞HBE细胞的培养
[0050]人正常肺上皮细胞HBE购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用MEM培养基，并向其中加入10%胎牛血清(FBS)，5%谷氨酰胺，置于37°C，5%C02培养箱中培养。
[0051](2)细胞内谷胱甘肽含量的测定
[0052]将HBE细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70%?80%后，加入不同浓度的菇娘果汁(菇娘果汁为实施例1制备)处理24小时，PBS洗涤2次，加入0.5mL50mM磷酸钠和ImMEDTA缓冲液收细胞，超声lmin，IOOOOg离心15分钟，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，412nm测定吸光度并计算谷胱甘肽含量。
[0053]结果:如图5所示，菇娘果汁能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力。
[0054]实施例5:菇娘果汁能够抑制三价砷对人肺支气管上皮HBE细胞的毒性
[0055]方法:MTT法测定化合物对砷诱导的细胞毒性的保护作用
[0056]将HBE细胞接种于96孔板上，加入不同浓度待测化合物处理16小时，然后加入不同浓度的砷和待测浓度果汁(菇娘果汁为实施例1制备)处理24小时，加入MTT3小时后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。
[0057]结果:如图6所示，采用1:100浓度菇娘果汁预处理细胞16小时，然后加入20 iiM、40 u M的砷和1:100浓度菇娘果汁处理细胞24小时，结果表明菇娘果汁对HBE细胞具有保护作用，能够抑制砷诱导的细胞毒性。果汁处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，菇娘果汁能够抑制致癌物砷诱导的毒性，能够用于肿瘤的预防和治疗。
[0058]实施例6:菇娘果汁能够抑制H2O2对神经细胞株PC12的毒性
[0059]方法:(I)神经细胞PCl2的培养
[0060]神经细胞株PC12购自美国模式培养物集存库(ATCC，)采用含15%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，置于37°C，5%C02培养箱中培养。
[0061](2) MTT法测定化合物对H2O2诱导的细胞毒性的保护作用
[0062]将PC12细胞接种于96孔板上，加入不同浓度待测菇娘果汁(菇娘果汁为实施例1制备)处理16小时，然后加入不同浓度的砷和待测菇娘果汁处理24小时，加入MTT3小时后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。
[0063]结果:图7所示，采用1:100浓度菇娘果汁预处理细胞16小时，然后加入100 U M、200 ii M的H2O2和1:100浓度菇娘果汁处理细胞24小时，结果表明菇娘果汁对PC12细胞具有保护作用，能够抑制H2O2诱导的细胞毒性。菇娘果汁处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，菇娘果汁能够抑制活性氧H2O2产生的神经细胞毒性，能够用于神经退行性疾病的预防和治疗。
[0064]实施例7:菇娘果肉种子提取物的制备
[0065]菇娘果5kg，果实与宿萼分开，将果实榨汁，过滤，得1.25kg滤渣(果肉和种子)，以其重量10倍的75%乙醇回流提取2次，每次I小时，合并提取液，过滤，浓缩至浸膏，加水IOOOmL混悬，并以二氯甲烷萃取(2\10001 )，蒸干二氯甲烷相得果肉种子提取物25g，收率为0.5%。
[0066]实施例8:菇娘宿萼提取物的制备
[0067]菇娘果5kg，将果实与宿萼分开，得宿萼150g，以其重量10倍的75%乙醇回流提取2次，每次I小时，合并提取液，过滤，浓缩至浸膏，即得宿萼提取物30g，收率0.6%。
[0068]实施例9:片剂的制备
[0069]菇娘宿萼提取物(实施例8制备)20g，加入玉米淀粉30g，糊精15g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加适量滑石粉，压片，即得。
[0070]实施例10:胶囊剂的制备
[0071]菇娘宿萼提取物(实施例8制备)20g，加入淀粉20g、糊精15g，微晶纤维素8g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，装胶囊，即得。
【权利要求】
1.菇娘在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:具体应用时，以菇娘提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂或酊剂；或者将提菇娘取物纯化制成注射制剂；或者:将菇娘提取物与其它对肿瘤、神经退行性疾病有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂或注射剂；所述菇娘提取物选自菇娘果汁、果肉种子提取物、宿萼提取物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述菇娘为酸浆(Physalisalkekengil var.franchet1、毛酸衆(Physialis pubescens L.)、小果酸衆(Physialisperuviana)的外被宿萼的果实。
4.一种菇娘果汁，其特征在于:是通过以下方法制备得到的:将菇娘果实与宿萼分开，取果榨汁，过滤，滤液即为菇娘果汁。
5.权利要求4所述的菇娘果汁在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。
6.一种菇娘果肉种子提取物，其特征在于:是通过以下方法制备得到的:将菇娘果实与宿萼分开，取果榨汁，过滤得果汁、果肉和种子；取果肉和种子，用O?95%乙醇回流提取I?8次，每次溶剂用量为药材重量的I?20倍，每次提取时间为0.5?10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩得浸膏；向浸膏中加入浸膏重量I?20倍的水混悬后，用混悬液体积I?20倍的二氯甲烷萃取，分离水相和二氯甲烷相，对二氯甲烷相进行浓缩、干燥，SP得果肉种子提取物。
7.权利要求6所述的菇娘果肉种子 提取物在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。
8.一种菇娘宿萼提取物，其特征在于:是通过以下方法制备得到的:将菇娘果实与宿萼分开，取宿萼，用0?95%乙醇回流提取I?8次，每次溶剂用量为宿萼重量的I?20倍，每次提取时间为0.5?10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩、干燥，即得菇娘宿萼提取物。
9.权利要求8所述的菇娘宿萼提取物在制备治疗或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。
10.根据权利要求5或7或9所述的应用，其特征在于:具体应用时，以菇娘果汁、果肉种子提取物或/和宿萼提取物为原料，添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂或酊剂；或者将菇娘果汁、果肉种子提取物或/和宿萼提取物纯化制成注射制剂；或者:将菇娘果汁、果肉种子提取物或/和宿萼提取物与其它对肿瘤、神经退行性疾病有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的辅料，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂或注射剂。
【文档编号】A23L2/02GK103432283SQ201310415523
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】沈涛, 张唐娜, 任冬梅 申请人:山东大学