专利名称：儿茶精及其衍生物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及儿茶精[Catechin，Catechuic acid，Catechinicacid，Cyanidol，(-)Epicatechin，儿茶素，儿茶酸，(-)儿茶精]及其衍生物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用。
背景技术：
神经退行性疾病是指人体的神经元发生退行性变化而引起的一系列病症，多发生在中老年人，但最近有低龄化的趋势。该类疾病大大影响了人们的生活质量，例如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)和老年性痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)就是两种发病率较高的神经退行性疾病；其它神经退行性疾病包括有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、神经纤维瘤病、Huntington病、肌阵挛性癫痫、家族失明性白痴、脱髓鞘性疾病、脊髓损伤等。美国前总统克林顿在其卸任前的述职演说中将神经退行性疾病列为医学界面临的迫切任务之一。
证据表明，神经元死亡而导致神经元丢失是神经退行性疾病的主要病理特征。长期以来，人们对大脑中神经退行性疾病的“治本”还束手无策，一般只能采取一些“治标”的方法，使病人通过服用或静脉注射特定的化学药物来补充大脑神经元匮乏的物质。如针对PD病人脑内多巴胺不足，用其前体左旋多巴补充，或通过移植胎儿神经细胞以取代已消失的多巴胺神经细胞；又如，针对AD脑内乙酰胆碱不足，用胆碱酯酶抑制剂提高其浓度。但是，这些“治标”的方法，由于不能控制神经元丢失的病理特征，所以，无法控制疾病的发展；同时，由于神经退行性疾病的治疗要求药物在脑内有一定的血药浓度，而血脑屏障大大降低了该浓度，在脑内血药浓度可能未达到有效浓度，而在体内其他部位，该浓度却已产生了一定的毒副作用，因而，现有的药物的治疗效果差。
儿茶精(Catechin)是从茅莓(Rubus parvifollus L)全株植物中提取的化合物，其分子式为C15H14O6，分子量为290。茅莓是一味草药，因其具有散瘀、止痛、解毒、化痰、杀虫的功效，所以民间常用于治疗吐血、痢疾、疥疮、痔疮、瘰疬、跌打刀伤、产后淤滞腹痛等，可以增加冠脉流量，增加缺氧耐受力。另外，已发现儿茶精(Catechin)还在以下植物中可以分离提取蔷薇科植物山樱桃Prunus tomentosa Thunb.木材，鹅绒委陵菜Potentilla anserine L.叶；银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.叶；樟科植物红楠Machilus thunbergii Sieb.et Zucc.心材；胡颓子科植物沙枣Elaeagnus angustifolis L.茎皮、枝；楝科植物日本苦楝Meliaazedarach L.var.japonica Mak.韧皮；夹竹桃科植物罗布麻Apocynumvenetum L.叶；豆科植物儿茶Acacia catechu L.心材；棕榈科植物摈榔Areca catechu L.内胚乳；牻牛儿苗科植物草原老鹳草Geranium pretenseL.根茎；山茶科植物茶Camellia sinensis O.ktze.叶，山茶C.japonicaL.叶；蓼科植物Polygonum bistorta L.根茎；杜鹃花科植物越橘Vaccinium vitisidaea L.叶；七叶树科植物红七叶树Aesculus carneaWats；金丝桃科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.地上部分。
儿茶精(Catechin，Catechuic acid，Catechinicacid，Cyanidol，(-)Epicatechin，儿茶素，儿茶酸，(-)儿茶精)化学结构如下所示 其系统命名为2H-1-Benzopyran-3，5，7-triol，2-(3，4-dihydroxyphenyl)-3，4-dihydro-，(2R-trans)-；或5，7，3′，4′-tetrahydryxyflavanol(5，7，3′，4′-四羟基黄烷醇)。(-)表儿茶精系统命名为2H-1-Benzopyran-3，5，7-triol，2-(3，4-dihydroxyphenyl)-3，4-dihydro-，(2R-cis)-。
迄今为止，未有儿茶精(Catechin，Catechuic acid，Catechinicacid，Cyanidol，(-)Epicatechin，儿茶素，儿茶酸，(-)儿茶精)及其衍生物在神经科学领域应用的具有实质意义的报道。
发明内容本发明的目的就在于提供儿茶精及其衍生物作为防治神经退行性疾病的药物的应用，这种应用从“治本”的角度作用于神经退行性疾病的神经元死亡，从而达到防治神经退行性疾病的目的。
我们使用蔷薇科悬钩子属茅莓(Rubus parvifollus L)全株植物成功地使得患有帕金森病的患者的症状缓解，进一步研究，我们从茅莓中提取出儿茶精，用MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)和MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶离子)制备帕金森病动物模型，研究发现儿茶精可明显缓解帕金森病动物的症状。药理实验表明，其对黑质神经元死亡具有保护性干预作用，对体外培养的中脑腹侧多巴胺神经元有保护作用，挽救多巴胺神经元的丢失，抑制MPTP引起纹状体多巴胺浓度的降低，改善PD小鼠行为学异常，故其对帕金森病具有“治本”的作用。而且，进一步实验表明，该化合物可用于治疗一系列以“神经元死亡”为特征的神经退行性疾病，不仅对PD，而且对其他神经退行性疾病如AD、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、神经纤维瘤病、Huntington病、肌阵挛性癫痫、家族性失明性白痴、脱髓鞘性疾病、脊髓损伤等的预防、治疗也具有很高应用价值，同时，实验表明，其治疗指数高，安全性好。
儿茶精是黄烷醇类化合物，可以在以下各位发生取代。
式1其中R1，R2，R3，R4，R5＝H，卤素，SH，OH，NO2，-O-(CH2)nCH3，-O-CO-(CH2)nCH3，-O-CN-(CH2)nCH3，，-O-(一、二价金属盐离子)，-(CH2)nCH3，五碳、六碳、七碳单糖或双糖，n≤5。
经过初试，上述经取代的化合物均具有与儿茶精相同或相类似的药理作用。
本发明的儿茶精及其衍生物由于具有一定的脂溶性，能够经过胃肠道吸收，以及通过血脑屏障，因而可以采用口服剂型如制成片剂、颗粒剂、胶囊剂，也可以制成注射剂，还可以制成透皮吸收制剂如膜剂、乳剂、悬浮剂等，通过皮肤吸收进而经过血液循环通过血脑屏障进入靶点。
本发明的儿茶精及其衍生物可以与目前常用的制剂辅料，按照常规的制剂方法制成上述各种制剂。
本发明的儿茶精及其衍生物的使用剂量为口服剂量每天1～10mg/kg体重；注射剂量降低一半。
本发明的儿茶精及其衍生物可以与左旋多巴复方制成复方制剂，以减轻左旋多巴对黑质纹状体多巴胺能神经元的损害。
以下
具体实施例方式
是对本发明的进一步说明，决非是对本发明的任何限制。
具体实施方式实施例1 儿茶精的提取我们采用蔷薇科悬钩子属植物茅莓(Rubus parvifollus L)全株植物，利用其干燥粉末，用乙醇回流提取多次后，提取液回收乙醇。残渣用石油醚去除脂溶性成分后悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，萃取物溶于甲醇中拌硅胶过层析柱，用石油醚乙酸乙酯梯度洗脱，分得淡黄色针状结晶性成分。我们发现该成分易溶于甲醇、乙醇、碱性水溶液等溶剂；溶于乙酸乙酯、丙酮等溶剂；微溶于水；不溶于氯仿、石油醚、乙醚、二氯甲烷等溶剂。按上述提取方法，得率约1‰，该成分遇香蓝醛浓硫酸液变红色。经鉴定，该成分为儿茶精(Catechin)。
实施例2 儿茶精(Catechin)对体外培养的中脑腹侧多巴胺神经元的保护作用一、中脑黑质多巴胺神经元培养取孕14-16天的大鼠，用CO2窒息后颈椎脱臼致死。乙醇消毒腹部后用剪刀剪开腹部，暴露腹腔内容物。在无菌条件下取出怀孕子宫，用75％酒精浸30s，置于冰D-Hank(D-Hank′s平衡盐溶液)液内。剪开子宫，取出胚胎，于解剖显微镜下检查胎鼠的顶臀距(CRL)为10-12mm，置于盛有冰D-Hank液的平皿中待用。用眼科剪沿胚胎嘴巴到眼睛剪一刀，通过嘴部切口沿脑部矢状线剪开皮肤和软脑壳；用镊子掀开两侧皮肤和软脑壳直到可看见大脑到脑干部分；从脑干祛除前脑，暴露侧脑室系统和它作为第三脑室及中央导水管在脑干的延伸；用镊子夹剪以去除两边的脑室，接着近尾部剪一刀，在中脑皱褶的底部再剪一刀；腹侧中脑(ventral mesencephalon，VM)的残余就与脑的其他部分分离了。清除其上的脑膜后将分离的VM放入另一个装有冷解剖液(500ml中含有氯化钠36.25g，氯化钾2g，NaH2PO4·2H2O0.91g，葡萄糖13g，酚红50mg，HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)29.7g，pH 7.4)的皿中。用组织切片机切碎组织后加入0.1％胰酶溶液(在37℃浴槽内预热)15ml，在37℃下消化15-20min后加入10ml预热的DNA酶和胰酶抑制剂终止反应。1,500rpm离心5min去上清，加入破碎液15ml(含1.2mg DNase I(脱氧核糖核酸酶1)，7.8mg胰酶抑制剂，15ml解剖液，150μl 3.82％MgSO4)；用吸管吹打至成细胞悬液；加入静止沉淀液12.5ml(含100μl 3.82％MgSO4，15μlCaCl2)，吹打混匀后静置15min，将上清吸至另一试管中。1,500rpm离心5min，去上清，沉淀物用培养基稀释成细胞悬液至计数为5×105个/ml。将细胞悬液接种在预先用Poly-Lysine(多聚赖氨酸)包被的24孔板(每孔0.5ml)内。置37℃，5％CO2培养箱内培养，24h后在培养液内加入5μMAra-C(阿糖胞苷)以抑制胶质细胞生长。每3天换一次培养液，在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。
在培养的第五天，不同浓度的儿茶精预孵2h后，在培养基中加入终浓度为10μM的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)，48h后做特异性抗酪氨酸羟化酶(TH)染色，观察儿茶精对MPP+诱导凋亡的黑质神经元的保护作用；对照组加等体积的DMEM/F12(Dulbecco′s培养基)培养基；阳性对照组加10μM的SP600125(特异性JNK抑制剂)预孵2h后加入MPP+；阴性对照组直接加10μM的MPP+。
二、神经细胞形态学分析采用荧光显微镜随机取三个视野观察细胞的形态并拍照，计数TH阳性细胞及同一视野内总细胞个数。
三、儿茶精对MPP+诱导的黑质神经元凋亡具有保护作用体外培养的多巴胺神经元占成活细胞的阳性率约为1-3％。用10μM的MPP+处理后48h，TH-阳性细胞数明显降低(
图1)。在10μM MPP+处理细胞前2h，在阳性对照组加入10μM的SP600125，同时在各实验组加入不同浓度的儿茶精，对照组加入等体积的DMEM/F12培养基。结果发现儿茶精能够保护TH-阳性细胞。
图1为儿茶精抑制MPP+诱导的体外培养的多巴胺神经元的凋亡的结果图，从左至右依次为(A)对照组，显示cy3(一种红色荧光探针)标记的TH-阳性细胞；(B)加入10μM MPP+处理后减少TH-阳性细胞数量和细胞质体积；(C)SP600125对照组；(D)加入MPP++1μg/ml儿茶精后挽救TH-阳性细胞数量；(E)加入MPP++10μg/ml儿茶精后强烈挽救TH-阳性细胞数量；(F)加入MPP++30μg/ml儿茶精后较少影响因MPP+毒化的多巴胺神经元细胞挽救TH-阳性细胞数量。
实施例3 儿茶精对PD动物模型的作用一、儿茶精(Catechin)对PD动物模型的作用1、MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)腹腔注射建立PD动物模型选取雄性C57BL/6N型小鼠90只，随机分为生理盐水(NS)组、MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)(M)组、司来吉兰+MPTP(D)组和不同剂量儿茶精+MPTP(R3)三组，每组15只。实验第一天开始，NS组、M组用生理盐水以10mg/kg灌胃，R3组分别用浓度为0.3mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg的儿茶精灌胃，D组用司来吉兰3mg/ml以10ml/kg腹腔注射；实验第三天开始，灌胃后2小时M组、R3组和D组一起以10ml/kg腹腔注射浓度为3mg/ml的MPTP，NS组腹腔注射等容量的生理盐水，连续5天(共7天)。MPTP末次注射后第7天，每实验组取两只小鼠，用10％水合氯醛麻醉后，从左心室进针入主动脉，顺序灌注血管冲洗液和4％PFA(多聚甲醛)各50ml。血管冲洗液成分为PBS 1000ml，1％NaNO22ml，肝素0.02g和NaCl 9g。小鼠断头取全脑，在4％PFA中室温浸泡2小时后转移至30％蔗糖溶液中4℃过夜。用冰冻切片机于黑质致密部切取40μm的黑质脑片，悬浮于24孔板内的PBS液中。每隔6片取一片做酪氨酸羟化酶(TH)的ABC染色，分析黑质内残存神经元的情况。MPTP末次注射后第10天，各实验组的小鼠在完成了行为学的检测后，颈椎脱臼致死。取全脑，沸水中煮2分钟后，小心地剥离纹状体，称重后保存于-70℃，准备利用高效液相分析纹状体内多巴胺含量。
2、酪氨酸羟化酶(TH)的ABC染色MPTP末次注射后第七天，切取经黑质致密部的40μm的脑片。在TBS/Triton(缓冲盐溶液)(0.1％)漂洗后，用新鲜制备的溶于PBS的0.3％H2O2孵育切片30min。室温下，用TBS/Triton洗切片两次，每次5min；然后用TBS/Triton备配的3％山羊血清在室温下封闭非特异结合位点1小时。在鼠抗TH抗体4℃孵育过夜后，用TBS/Triton室温下洗两次，每次5min(分钟)。室温下，用生物素标记的山羊抗鼠二抗孵育切片2小时；期间准备ABC试剂的溶液，在室温静置至少15min。室温下用TBS/Triton洗两次，每次5min后，在ABC溶液中孵育1小时；用TBS/Triton洗两次，每次5min，最后在DAB中孵育切片直到利用光学显微镜判断染色理想(一般2-5分钟)。室温下用TBS漂洗脑片后，把切片贴于硅化玻片上，4℃过夜。第二天，把切片依次放入50％，70％，80％，90％，95％和100％的乙醇中脱水，每次2min；然后是50％∶50％的乙醇/二甲苯2min；100％二甲苯3min透明；最后以中性树脂封片，室温保存。
3、行为学检测从MPTP注射的第二天开始，在MPTP注射后计时，记录从MPTP注射完毕到小鼠出现震颤、竖尾、竖毛等表现的时间(即潜伏期)和这些表现所持续的时间，所得数据进行统计学处理。
最后一次注射后的第十天观察小鼠行为学改变，检测指标为爬杆试验(pole test)目的检测小鼠肢体运动协调情况。
方法将一直径为2.5厘米的软木小球固定于一根长50厘米粗1厘米的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下几个时间小鼠在顶球上停留的时间；小鼠爬完杆子的上半部分所用的时间；小鼠爬完杆子的下半部分所用的时间。然后按以下标准计分3秒内完成上述某一动作的记3分；6秒内完成的记2分；超过6秒的记1分。最后计算三项累计得分情况，并作统计学分析。
4、高效液相色谱仪检测纹状体多巴胺含量末次注射后第十天，各实验组小鼠在完成行为学测试后，取双测纹状体称重后，置-70℃保存。检测当日，每一标本内加0.5ml高氯酸提取液(0.1mol/L高氯酸，内含0.1％半胱氨酸)在冰浴中磨成匀浆，18000转/min 4℃离心20min，取上清液25～100μl进行分析。色谱条件WATERS公司510高压泵，7125进样器，HP1049A电化学检测器，BDS C18色谱柱(大连依利特公司)，4.6×250mm，5μm粒径。缓冲液3mM庚烷璜酸钠，100mM醋酸钠，85mM柠檬酸，0.2mM EDTA，PH 4.0。流动相缓冲液∶甲醇＝90∶10(v/v)。流量1.0ml/min，柱温40℃。检测器电极为玻璃碳电极，检测电压0.7V，N2000色谱数据工作站由浙江大学智能信息工程研究所提供。定性分析以样品峰的保留时间与标准物保留时间对照定性。定量方法以DHBA为内标物，以样品峰面积与内标峰面积的比值进行定量分析。附标准曲线Y＝92.71X+2.35，r＝0.9999(Y取值范围2.25～700ng/ml)。
二、结果1、儿茶精减少多巴胺神经元的丢失在MPTP末次注射后7天，用ABC方法检测黑质内残余多巴胺神经元的数目。结果发现与对照组相比，MPTP导致黑质内多巴胺神经元的大量丢失，大约只残留对照组的55.21±10.54(P＜0.05)；而儿茶精能减少因MPTP毒性所引起的多巴胺神经元的丢失。司来吉兰对黑质内多巴胺神经元的数量没有影响。
表1 儿茶精挽救了MPTP诱导的黑质多巴胺神经元的丢失
(*P＜0.05，MPTP+Catechin组与MPTP组比较).
2、儿茶精抑制MPTP引起的纹状体多巴胺浓度的降低在MPTP末次注射后十天，我们检测了纹状体多巴胺的浓度。与对照组(0.57±0.20ng/mg)相比，MPTP引起了纹状体多巴胺浓度的明显下降，只有0.23±0.03ng/mg(P＜0.05)；而儿茶精6mg/kg剂量能提高纹状体多巴胺的含量，使多巴胺浓度上升至0.41±0.12(P＜0.05)。司来吉兰对纹状体多巴胺浓度没有影响。
表2儿茶精和MPTP对纹状体多巴胺浓度的影响
平均值±标准误差 (*P＜0.05).
3、儿茶精改善了PD小鼠的行为学异常在MPTP末次注射后十天，对PD小鼠实施行为学检查。在MPTP撤离后，我们能够从爬杆试验中清楚地观察到实验动物肢体运动的不协调性。在爬杆试验中，对照组小鼠爬完杆子的上半部分所用的时间和爬完杆子的下半部分所用的时间要比MPTP组的少得多。与MPTP组相比，儿茶精使所用时间明显减少。
表3.儿茶精改善了MPTP引起的行为学障碍
平均值±标准误差(*P＜0.05)实施例4 儿茶精的急性毒性实验按国家药政管理规定，用昆明种封闭群健康小白鼠，体重20.0±0.5g，雌雄各10只，以2g/kg剂量(总液体量0.8ml)，经口服灌胃一次性给药。观察7天，每天观察小鼠反应、活动情况。服药后小鼠未见异常反应，毛色、活动正常。7天后未见小鼠死亡。说明儿茶精急性毒性较低。
实施例5 2％浓度的儿茶精注射液的制备称取儿茶精20克，9克NaCl溶于1000毫升注射用水中，溶解、超微滤膜过滤，即制成浓度为2克/100毫升(2％)的注射液，灭菌、分装。
实施例6 儿茶精颗粒剂的制备取茅莓干燥全草10kg，经过乙醇提取后，回收乙醇，制成浸膏，经纯化后，加淀粉、蔗糖适量，干法制粒，烘干，制成约0.2kg冲剂，分装成10包，即得。
取上述茅莓颗粒剂，予已出现帕金森疾病的自愿者服用，每日三次，每次一包，其症状得到迅速缓解。与左旋多巴配伍制成复方制剂后，其缓解效果更佳。
实施例7 3，5，7，3′，4′-五羟基黄烷醇乙酰化物的制备取儿茶130mg，加入无水C5H5N1.5mL和醋酸酐2.5mL，室温放置3天，倾入冰中，析出白色固体，过滤，用MeOH重结晶得白色针状晶体。
将上述化合物进行实施例2、3的实验，取得与实施例2、3中儿茶精相类似的结果。
实施例8 2R，3R(-)儿茶精5，7，3′，4′-四甲基醚的制备将2R，3R(-)儿茶精53.2mg(0.17mmol)溶于乙醚20mL中，加入重氮甲烷-乙醚溶液30mL，于0℃封闭反应28h，反应后除去乙醚，得粗结晶65.6mg，经硅胶薄层层析，用苯-丙酮(5∶1)展开，Rf＝0.45，洗脱后得儿茶精四甲基醚52.1mg(82.5％)。
将上述化合物进行实施例2、3的实验，取得与实施例2、3中儿茶精相类似的结果。
实施例9 2R，3R(-)儿茶精3，5，7，3′，4′-五醋酸酯的制备将2R，3R(-)儿茶精40.0mg(0.13mmol)与醋酸酐2mL、吡啶2滴混合，搅拌下室温反应18h，经处理后，用硅胶薄层层析，苯-丙酮(10∶1)展开，Rf＝0.65，洗脱后得儿茶精五醋酸酯59.1mg(88.0％)。
将上述化合物进行实施例2、3的实验，取得与实施例2、3中儿茶精相类似的结果。
实施例10 2R，3R(-)儿茶精3-β葡吡喃糖甙的制备2R3R(-)儿茶精3-β葡吡喃糖甙，其提取方法参照实施例1进行，但洗脱时间略长于儿茶精。
将上述化合物进行实施例2、3的实验，取得与实施例2、3中儿茶精相类似的结果。
本发明的儿茶精的衍生物不限于上述实施例，其它的衍生物均与上述
权利要求
1.式1所示的化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用。 式1其中R1，R2，R3，R4，R5＝H，卤素，SH，OH，NO2，-O-(CH2)nCH3，-O-CO-(CH2)nCH3，-O-CN-(CH2)nCH3，，-O-(一、二价金属盐离子)，-(CH2)nCH3，五碳、六碳、七碳单糖或双糖，n≤5。
2.根据权利要求1所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物为儿茶精。
3.根据权利要求1或2所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物作为防治帕金森氏疾病的药物的应用。
4.根据权利要求1或2所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物作为防治老年性痴呆的药物的应用。
5.根据权利要求1或2所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物与其它辅料配伍制成口服制剂。
6.根据权利要求1或2所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物与其它辅料配伍制成注射制剂。
7.根据权利要求1或2所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物与其它辅料配伍制成透皮吸收制剂。
8.根据权利要求1或2所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物与左旋多巴配伍制成复方制剂。
9.根据权利要求所述的式1化合物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，其特征在于所述的化合物为R2，R3，R4，R5＝H，R1＝葡萄糖化合物。
全文摘要
儿茶精及其衍生物作为制备防治神经退行性疾病的药物的应用，通过动物体及人体试验，表明其对神经退行性疾病包括帕金森氏病、老年性痴呆等具有良好的治疗作用，且其治疗指数高，安全性好。
文档编号A61P25/16GK1891216SQ200510035559
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月4日 优先权日2005年7月4日
发明者陈汝筑, 于占洋 申请人:中山大学