Stat3和tyk2作为神经退行性疾病的药物靶点的制作方法

专利名称：Stat3和tyk2作为神经退行性疾病的药物靶点的制作方法
STAT3和TYK2作为神经退行性疾病的药物靶点
背景技术：
神经退行性疾病例如阿尔茨海默病(AD)主要影响老年人。AD是一种进行性 疾病，其导致认知下降和痴呆。AD的两个病理性标志是细胞内神经原纤维缠结(neuro fibrillary tangle，NFT)和细胞外老年斑(senile plaque，NP)。前者在快死亡的细胞 中累积，而后者在神经细胞之间建立。神经退行性发病中牵涉到多个过程，包括β-淀粉 样蛋白的产生、tau的高度磷酸化、氧化应激、炎症、突触衰竭和神经元调亡。但是，AD的 真实诱因仍待阐明。一种假设认为，AD中的神经元损失是由于毒性蛋白的积累。β-淀 粉样蛋白是衍生自淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的切割产物，其作为细胞外斑在AD脑中积 累。新兴的研究揭示特异性细胞内信号途径的失调导致AD或Αβ-诱导的神经元调亡。 例如，发现JNK和ρ38的激活与小鼠AD模型相关(Savage等人，(2002) J Neurosci 22: 3376-8 。也已经证明糖原合酶激酶(GSK)-3途径参与氧化应激诱导的神经元细胞死亡机 制(Koh 等人，(2003)Brain Res Mol Brain Res 118 :72-81 ;Takadera 等人，(2004)EurJ Pharmacol. 499 :239-45)。此外，GSK-3的抑制降低了 Αβ -诱导的神经毒性(Koh等人， (2008) Brain Res 1188 =254-62) 类似地，Wnt和Notch 二者的信号传导在AD发病中具有 一定作用(De Strooper 等人，(2001) J Cell Biol 152 :F17_20 ；Anderton等人，(2000)Mol Med Today6 54-9)。目前，AD的临床诊断需要评估医疗史和体检，包括神经学、神经心理学和精神病学 评估，以及各种生物学、放射学和电生理学测试。虽然有这一连串检测，但是只能通过死后 脑检查来达到确切的诊断。因此，存在尚未满足的需要，即需要一种可以在早期检测神经退化并监视相关疾 病和病症进展的简单生化测试。老龄化人口，例如美国、欧洲和中国的老龄化人口正日益寻 求改进的诊断和治疗AD和其它神经退行性病症的工具。本发明涉及另一种信号途径与AD病症的关联，以及涉及AD的分子机理中涉及的 两个新靶标的鉴定，即STAT3蛋白和 Κ2， Κ2是STAT3的上游调节剂。STAT3和 Κ2主 要牵涉于AD诊断以及针对该疾病的治疗药物的开发中。之前仅仅表明STAT3的过表达与 炎症和癌症有关。STAT3及其上游调节剂 Κ2均在A β -诱导的神经细胞毒性中具有主要作用。在 AD脑的皮层和海马中STAT3在705位酪氨酸的磷酸化增强，这可以促进皮层神经元的调亡， 而 Κ2调节STAT3的磷酸化和激活。阻断这些靶标中的一个或二者能够阻止A β -诱导的 细胞死亡并且能够潜在地阻断疾病进展。因此，本发明在开发治疗AD的药物、以及在诊断 该疾病中具有重要意义。

发明内容
在一些实施方式中，本发明提供了鉴定调控神经退行性病症例如阿尔茨海默病 (AD)的化合物的方法和组合物。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤(i)将化合 物与STAT3或 Κ2多肽接触；和(ii)测定该化合物对于STAT3或 Κ2的功能效应，其中所述功能效应指示该化合物调控神经退行性病症。在一些实施方式中，所述方法包括以下 步骤(i)将化合物与编码STAT3或 Κ2多肽的多核苷酸接触；和(ii)测定该化合物对于 STAT3或 Κ2的功能效应，其中所述功能效应指示该化合物调控神经退行性病症。本领域 技术人员将认识到此方法包括对照，例如在不存在所述化合物的情况下，或者在存在已知 激活剂化合物的情况下，测定STAT3和 Κ2的表达或活性。在一些实施方式中，神经退行性病症的特征在于淀粉样肽在脑中的沉积，例如阿 尔茨海默病(AD)。在一些实施方式中，神经退行性病症选自AD、轻度认知损伤、帕金森病、 齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明包涵体病(NIHID)、路易体痴 呆、唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层基底退化、拳击员 痴呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病(Gerstmann-Strausslerlcheinker disease)、哈 勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全 脑炎、脊髓小脑共济失调、亨廷顿病、皮克病和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。在一些实施方式中，多核苷酸或多肽是重组的。在一些实施方式中，在体外测定功 能效应。在一些实施方式中，在真核细胞例如神经元细胞中测定功能效应。在一些实施方式中，通过测定 Κ2或STAT3的表达来测定功能效应。在一些实施 方式中，使用基于杂交的测定法例如RT-PCR来测定表达。或者，使用基于蛋白的测定法例 如免疫测定法来测定表达。在一些实施方式中，通过测定 Κ2的磷酸化或激酶活性来测定功能效应。在一些 实施方式中，通过测定STAT3的磷酸化例如705位酪氨酸的磷酸化来测定功能效应。在一 些实施方式中，通过测定STAT3的活性，例如二聚体化或下游转录激活来测定功能效应。在 一些实施方式中，通过测定细胞的调亡来测定功能效应。在一些实施方式中，化合物选自对 Κ2或STAT3特异性的反义分子、RNAi分子、 抗体或抗体片段、小肽、或有机小分子。本发明还提供了用于诊断神经退行性病症和疾病的方法和组合物。在一些实施方 式中，所述方法包括以下步骤(i)从个体获得生物样品；(ii)测定所述样品中 Κ2多核 苷酸或多肽的水平；和(iii)将步骤(ii)的样品中 Κ2的水平与正常生物样品中 Κ2的 水平进行比较，从而诊断所述个体中的神经退行性病症。在一些实施方式中，测定步骤包括基于杂交的测定例如RT-PCR，或者，基于蛋白的 测定例如免疫测定。在一些实施方式中，测定步骤包括功能测定，例如激酶测定。在一些实 施方式中，测定并比较磷酸化的Tyk2的水平。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤(i)从个体获得生物样品；(ii)测定 所述样品中STAT3多核苷酸或多肽的水平；和(iii)将步骤(ii)的样品中STAT3的水平与 正常生物样品中STAT3的水平进行比较，从而诊断所述个体中的神经退行性病症。在一些实施方式中，测定步骤包括基于杂交的测定例如RT-PCR，或者，基于蛋白的 测定例如免疫测定。在一些实施方式中，测定步骤包括功能测定，例如，测定STAT3依赖性 的基因表达。在一些实施方式中，测定磷酸化的STAT3多肽的水平，例如在705位酪氨酸磷 酸化的STAT3。在一些实施方式中，神经退行性病症的特征在于淀粉样肽在脑中的沉积，例如AD 患者的脑。在一些实施方式中，神经退行性病症选自阿尔茨海默病(AD)、轻度认知损伤、帕金森病、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明包涵体病(NIHID)、路 易体痴呆、唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层基底退化、 拳击员痴呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼 曼-皮克病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、亨廷顿病、 皮克病和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。在一些实施方式中，相对于正常样品的 Κ2或STAT3的表达或活性水平指示个体 中的神经退行性病症。在一些实施方式中，所述方法与其它诊断方法例如本文描述的那些 联合使用。


图1 转基因AD小鼠模型的皮层和海马中STAT3的酪氨酸磷酸化增加。A 裂解来 自9月龄APP/PS1 (具有Swedish突变KM670/671NL禾口 PSl ΔE9的ΑΡΡ695)双转基因小鼠 的脑的皮层、海马和小脑并按照图中所示进行免疫印迹。B 裂解来自不同阶段的APP/PS1 转基因小鼠的脑的皮层并按照图中所示进行免疫印迹。图2 在以A β 25-35刺激的培养的皮层神经元中，STAT3的酪氨酸磷酸化增加。使 用A β 25-35 (40 μ M ;Η20用作溶剂对照)处理7DIV的原代皮层神经元，持续图中所示时间。 收集细胞裂解物并使用P_TyrSTAT3和总STAT3抗体进行免疫印迹。图3 :STAT3的敲除保护神经元免受A β -诱导的调亡。A :STAT3的敲除减少了 Aβ 25-35处理诱导的PC12细胞的细胞死亡。使用STAT3siRNA转染PC12细胞。STAT3的 Western印迹分析确认了经过STAT3siRNA转染3天的PC12细胞中STAT3的敲除，但是使 用混杂siRNA转染的PC12细胞则没有STAT3的敲除(α -微管蛋白用作上样对照)。以 Aβ 25-35将经过STAT3siRNA转染3天的PC12细胞处理M小时。通过MTT测定法评估 细胞存活性，*代表P < 0. 05。B 阻断STAT3的激活减弱了 Αβ 25-35处理后的神经元中 切割的胱天蛋白酶-3的增加。在Αβ 25-35处理之前，使用细胞通透性的STAT3抑制剂肽 (200yg/ml)预处理皮层神经元30分钟。然后使用胱天蛋白酶_3抗体通过免疫印迹分析 细胞裂解物。对切割的胱天蛋白酶-3的水平进行定量。图4 β -淀粉样肽诱导的STAT3的磷酸化和神经元细胞死亡需要Tyk2。A 使用 各种抑制剂按图中所示预处理原代皮层神经元2个小时，所述抑制剂包括JAK的强抑制剂 (JAK抑制剂1)、JAK2抑制剂(AG490)、Src酪氨酸激酶抑制剂(PP》和蛋白合成抑制剂(环 己酰亚胺)；然后使用A β 25-35肽处理4小时或M小时。使用P-TyrSTAT3和总STAT3抗 体对细胞裂解物进行免疫印迹。B 使用A β 25-35处理原代皮层神经元。使用Tyk2或JAK2 抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后以磷酸化-酪氨酸(P-Tyr)抗体进行Western印迹 分析。C:使用A β 25-35处理从Tyk2+小鼠制备的原代皮层神经元。使用P-Tyr STAT3、 总STAT3和胱天蛋白酶-3抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。对酪氨酸磷酸化的STAT3和 切割的胱天蛋白酶-3的倍数变化进行定量分析(下面的图版)。图5 使用Aβ 25-35处理之后，PC12细胞中的STAT3的转录活性和培养的皮层神 经元中的iNOS RNA升高。A.使用STATl (pGAS_Luc)或STAT3 (pSTAT3_Luc)报道基因构建 体联合内部对照质粒(β -半乳糖苷酶-PCMV)转染PC12细胞。通过NGF使细胞分化4天， 然后使用A β 25-35或NGF (阳性对照)处理1天。测定样品中的荧光酶活性并根据半乳糖苷酶的活性进行校正。结果根据半乳糖苷酶的活性进行校正；平均值士S.E.，η =3 ； *，ρ < 0. 05。B.使用STAT3抑制剂或JAK抑制剂I预处理7DIV的原代皮层神经元 30分钟，然后使用A β 25-35 (40 μ Μ)处理6个小时。收集总RNA并进行逆转录。然后使用 iNOS引物对cDNA进行实时PCR分析。图6 阿尔茨海默病患者的海马中STAT3酪氨酸磷酸化增加。使用P_Tyr STAT3抗 体和神经元特异性标志物NeuN或神经胶质特异性标志物GFAP将AD患者的脑的石蜡切片 染色。P-Tyr STAT3染色的定量分析表明NeuN和GFAP的共定位。
具体实施例方式本发明建立了增加的STAT3磷酸化与神经退行性病症例如阿尔茨海默病(AD)之 间的关联。我们发现，AD的标志物β淀粉样蛋白(Αβ)诱导STAT3的激活，并且这种STAT3 的激活是神经元细胞调亡所需要的。
Κ2是上游调节剂，其介导AD中Αβ诱导的STAT3的
酪氨酸磷酸化。如以下实施例中所证明，在多个表现出AD病症的小鼠模型的脑的皮层和海马中， STAT3的酪氨酸磷酸化一致升高。在具有老年斑(其为Αβ的沉积)的脑区域中也检测到 了活化的STAT3(即，在705位酪氨酸磷酸化的STAT3)。相反，在野生型小鼠的皮层中则几 乎检测不到STAT3的酪氨酸磷酸化，因此说明了增加的pTyr-STAT3水平与AD病症之间的关联。STAT3与AD的另一个联系是在705位酪氨酸磷酸化的STAT3与A β的关联。发现 Αβ诱导STAT3的磷酸化和激活，其导致神经元细胞死亡。此外，当阻断STAT3的激活时， A β诱导的细胞死亡显著减少，这说明STAT3活性在A β诱导的神经元细胞死亡中具有重要 作用。本发明还包括新发现的 Κ2在AD病症中的作用，其介导Αβ诱导的STAT3的酪 氨酸磷酸化。在源自 Κ2敲除小鼠的皮层神经元中，Αβ诱导的STAT3在705位酪氨酸的 磷酸化减少。因此，我们的累积发现鉴定了 STAT3和 Κ2作为开发用于神经退行性病症的 药物以及用于诊断的核心靶标。Α.定义本文使用的“STAT3”是指信号传导子和转录激活子(STAT)蛋白家族的成员。 STAT3具有两种剪接变体，命名为STAT3a (P92)和β (ρ83)。STAT3多肽的一个实例是 Genbank登记号Ρ40763. 2中描述的人类STAT3多肽，其705位氨基酸是酪氨酸。示例性的 STAT3编码序列是Genbank登记号L29277中描述的人类序列。STAT3还指具有STAT3信号 传导活性的物种同源物、剪接变体、多态性变体和STAT3的保守性修饰变体。本文使用的“ Κ2”是指酪氨酸激酶的Janus激酶(JAK)家族的成员。
Κ2多肽 的一个实例是Genbank登记号Ρ^597. 3中描述的人类多肽序列。示例性的 Κ2编码序列 是Genbank登记号)(54637中描述的人类序列。
Κ2还包括具有 Κ2酪氨酸激酶活性的物 种同源物、剪接变体、多态性变体和 Κ2的保守性修饰变体。术语“神经退行性疾病”和“神经退行性病症”在本文中相互替换地使用，是指以 下病症，包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神 经元核内透明包涵体病(NIHID)、路易体痴呆、唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层基底退化、拳击员痴呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病、哈勒沃 登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、 脊髓小脑共济失调、亨廷顿病、皮克病和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。神经退行性病症 的通常特征在于脑中的神经原纤维缠结和/或淀粉样肽的沉积。神经退行性疾病或病症的“诊断”是指预测与这些病症相关的症状，例如受损的认 知功能、累积的Αβ沉积和神经元细胞死亡。在一些实施方式中，可以通过常规的简易精神 状态检查(Mini-Mental StateExam)测定认知功能。在一个实施方式中，可以使用预后以 调整治疗从而提供更好的结果。“生物样品”包括组织切片，例如活组织检查样品(例如神经元活组织检查)或用 于组织学目的的冷冻切片。此类样品还包括血液和血液组分(例如血清、血小板、红细胞 等)、脑脊髓液、培养的细胞，例如原代培养物、外植体和转化的细胞、粪便、尿等。通常从哺 乳动物例如灵长类或人类获取生物样品。本文使用的“正常生物样品”或“正常个体”代表基线值或对照。“正常”代表不患 有神经退行性病症或不会患上神经退行性病症的健康个体(按照标准方法测定，例如认知 测试或使用生物样品，例如神经元活组织检查或脑脊髓液)中的多核苷酸或核酸的水平。“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及它们的 单链或双链形式的聚合物，及其互补物。该术语包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨 架残基或键的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其与参考核酸具有相似的结 合特征，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。此种类似物的实例包括但不限于，硫代磷 酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有指明，否则具体的核酸序列还暗指包括其保守性修饰的变体(例如简并 密码子替换)和互补序列，以及明确指明的序列。具体而言，可以通过产生“其中一个或 多个所选(或全部)密码子的第三个位置被替换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基的序列” 来实现简并密码子替换(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka 等人， J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes8 :91-98 (1994))。 术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸相互替换地使用。术语“多肽”、“肽”和“蛋白，，在本文中相互替换地使用，其是指氨基酸残基的聚合 物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的 氨基酸的人造化学模拟物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合 物。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸 的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基 酸，以及后来经修饰的氨基酸，例如羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸 类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和 R基团结合的碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此种类似物具有修 饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化 学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构、但是以类似于天然存在的 氨基酸的方式作用的化学化合物。本文中可以通过其通常已知的三字符或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字符来指称氨基酸。类似地，可以通过其通常接受的单字符代码来指称核苷酸。“保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。关于具体的核酸序列，保守 性修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者，当核酸不编码氨基酸 序列时，该术语是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能上相同的核酸 编码任意给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每 个被密码子指定为丙氨酸的位置处，该密码子可以改变成所描述任何相应密码子而不改变 所编码的多肽。此类核酸变体是“沉默变体”，其为保守性修饰变体的一种。本文中编码多 肽的每个核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变体。本领域技术人员将认识到，核酸 中的每个密码子(除了 AUG之外，其通常是蛋氨酸的唯一密码子；和TGG，其通常是色氨酸 的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默 变体暗示在每个所描述的序列中，这是就表达产物而言，不是就实际探针序列而言。关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到对于核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的 单个替换、删除或添加(其改变、增加或删除编码序列中的单个氨基酸或很小百分率的氨 基酸)是“保守性修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被替换为化学上相似的氨基酸。 提供功能上相似氨基酸的保守性替换表格是本领域众所周知的。此类保守性修饰的变体是 除了本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因之外的变体，但保守性修饰的变体不 排除上述这些。术语“过表达(overexpress)，，、“过表达(overexpression)，，或“过表达 (overexpressed)，，相互替换地指，相对于正常细胞而言，在细胞中以可检测的更高的水平 转录或翻译的蛋白或核酸(RNA)。该术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细 胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)，以及RNA和蛋白质稳定性(相对于正常 细胞而言)而引起的过表达。可以使用检测mRNA的常规技术(即RT-PCR、PCR、杂交)或 检测蛋白质的常规技术(即ELISA、免疫组化技术)来检测过表达。过表达可以是比正常细 胞高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在一些实例中，过表达是 相对于正常细胞而言高1倍、2倍、3倍、4倍或更高的转录或翻译水平。术语“低表达(underexpress)”、“低表达(underexpression)，，或“低表达 (underexpressed) ”相互替换地指，相对于正常细胞而言，细胞中以可检测的较低的水平转 录或翻译的蛋白或核酸。该术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位 (例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)，以及RNA和蛋白质稳定性(相对于对照而言) 而引起的低表达。可以使用检测mRNA的常规技术(即RT-PCR、PCR、杂交)或检测蛋白质 的常规技术(即ELISA、免疫组化技术)来检测低表达。低表达可以是对照低10 %、20 %、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更低。在一些实例中，低表达是相对于对照而言 低1倍、2倍、3倍、4倍或更低的转录或翻译水平。术语“差别化表达”或“差别化调节的” 一般是指相对于至少一种其它样品而言， 在一种样品中的蛋白或核酸是过表达(上调)或低表达(下调)。为了本发明的目的，通常 将来自于怀疑患有神经退行性病症的个体的样品与来自于已知患有该病症(阳性对照)或 已知对该病症为阴性(阴性对照)的个体的样品进行比较。“标记物”或“可检测部分”是可以通过分光光度法、光化学法、生物化学法、免疫化 学法、化学法或其它物理方法检测的成分。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子密度高的试剂、酶(例如ELISA中通常使用的酶)、生物素、异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin) 或半抗原和可以被制备成可检测的蛋白(例如通过向肽中掺入放射性标志物)或用于检测 与肽特异性反应的抗体的蛋白。标记物可以结合至靶向分子，例如抗体或用于特异性检测 靶标化合物的核苷酸序列。当用于指称例如细胞、核酸、蛋白或载体时，术语“重组”代表已经通过导入异源核 酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而经过修饰的细胞、核酸、蛋白或载体，或者该细胞衍生自 经过所述修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的 基因，或者表达那些异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。“抗体”是指这样的多肽，其包含来自特异性识别并结合抗原的免疫球蛋白基因的 框架区或其片段。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε、和μ恒定区基因，以 及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为Y、μ、α、δ或 ε，其继而又定义了免疫球蛋白的类别，分别是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗 原结合区对于结合的特异性和亲和性是最重要的。抗体可以是多克隆的或单克隆的，衍生 自血清、杂交瘤的或重组克隆的，还可以是嵌合的、灵长源化的或人源化的。示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多 肽链组成，每对具有一条“轻链”(大约25kDa)和一条“重链”(大约50-70kDa)。每条链的 N-末端定义了大约100至110或更多的氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语轻链可 变区和重链可变区(Vh)分别指这些轻链和重链。抗体以例如完整免疫球蛋白的形式存在，或以通过各种肽酶消化而产生的多种清 楚表征的片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键下消化抗体，从而产生 F(ab) ’ 2，其为Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键与Vh-ChI连接的轻链。F(ab)，2可以 在温和条件下被还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’ 2 二聚体转化为Fab’单体。 Fab，单体基本上是具有部分铰链区的Fab (参见Fundamental Immunology (Paul ed.，3d ed. 1993)。虽然根据完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员将认识到 可以通过化学方式或通过使用重组DNA方法从新(de novo)合成此类片段。因此，本文使 用的术语抗体还包括通过对整个抗体进行修饰产生的抗体片段，或那些使用重组DNA方法 从新合成的抗体片段(例如单链Fv)或那些使用噬菌体显示文库鉴定的抗体片段(参见， 例如 McCafferty 等人，Nature 348 :552-554 (1990))。本文使用的术语“单链抗体”(scFv)是指在多肽连接中包含VH结构域和VL结 构域(一般通过间隔子肽，例如[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x连接)的多肽，其可以在氨基和 /或羧基末端包含两外的氨基酸序列。例如，单链抗体可以包含用于连接至编码多核苷酸 的系绳区段(tethersegment)。作为一个实例，scFv是单链抗体。单链抗体一般是由一 个或多个多肽区段组成的蛋白，所述区段是实质上由免疫球蛋白超家族的基因编码的至少 10 个连续氛基酸(例如，参见 Thelmmunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams and Α. N. Barclay, in Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, and T. H. Rabbitts, eds., (1989)Academic Press =San Diego,Calif.，pp. 361-387，通过引用并入本文)，最通常是由 啮齿类、非人灵长类、禽类、猪、牛、绵羊、山羊或人类重链或轻链基因序列编码。功能性单链 抗体通常包含足以保持对特定靶分子(通常是受体或抗原(表位))的结合特性的免疫球 蛋白超家族基因产物的一部分。
本文使用的“抗体”还可以指任何功能性VH和VL对(即能够特异性结合表位)， 其各自以多种构型连接至可以执行多种功能的其它多肽，例如受体、受体抑制剂或VH-VL 复合物的稳定剂。本文使用的“免疫球蛋白可变区结构域”是指用作结合部分(不伴有VH或VL结 构域)的任何VH或VL结构域。就抗体而言，此类结构域可以以多种构型连接至可以执行 多种功能的其它多肽，例如受体、受体抑制剂或报道分子激活剂。当指称蛋白、核酸、抗体或小分子化合物时，词语“特异性(或选择性)结合”是 指结合反应，其通常测定在蛋白或核酸及其它生物制剂的异质群体中是否存在蛋白或核酸 (例如STAT3、TYK2或其修饰形式)。在抗体的情况下，在指定的免疫测定条件下，指定抗 体与特定蛋白的结合可以是背景的至少2倍，更通常是背景的10倍以上至100倍。在这 样的条件下与抗体的特异性结合需要那些就其针对特定蛋白的选择性而被选择的抗体。例 如，可以筛选多克隆抗体以只获得那些与所选抗原具有特异性免疫反应而与其它蛋白没有 特异性免疫反应的多克隆抗体。这种筛选可以通过减掉与其它分子有交叉反应的抗体来实 现。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白具有特异性免疫反应的抗体。例如，固 相ELISA免疫测定被常规地用于选择与蛋白具有特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow & Lane，Antibodies, ALaboratory Manual (1988)，其描述了可用于测定特异性免疫反应性 的免疫测定的形式和条件)。在测定调控AD的化合物或神经退化生物标志物的测定中，词语“功能效应”包括 测定间接或直接受本发明的生物标志物影响的参数，例如化学或表型效应。因此，功能效应 包括即刻的信号传导事件，例如转录激活或磷酸化，或更间接的效应，例如基因表达或细胞 凋亡。“功能效应”包括体外的、体内的和离体的活性。“测定功能效应”意思是测定升高或降低那些间接或直接受本发明的生物标志物 影响的参数的化合物，例如测定物理和化学或表型效应。可以通过本领域技术人员已知 的任何方法来测定此类功能效应，例如通过分光光度特性的变化(例如，荧光、吸收、折射 率)；流体力学(例如形状)、色谱法；或蛋白的溶解性特性；测定可诱导的标志物或标志物 的转录激活；测定酶(例如激酶)活性的变化；增加或减少细胞增殖、凋亡、细胞周期阻滞 的能力；测定细胞表面标志物的变化。可以通过本领域技术人员已知的很多方法来评估功 能效应，例如用于定量或定性测定形态特征变化的显微镜法，测定细胞中表达的其它基因 的RNA或蛋白水平的变化，测定RNA稳定性，鉴定下游或报道分子基因表达(CAT、荧光素酶、 β -gal、GFP等)，例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、可诱导标志物等。神经退化生物标志物多肽的“活性”是指其天然细胞或组织中的多肽的结构、调节 或生物化学功能。神经退化生物标志物的活性包括直接活性和间接活性二者。示例性的直 接活性是催化活性，即 Κ2的激酶活性。磷酸化的STAT3的直接活性包括二聚体化和转录 激活。示例性的间接活性是针对多肽的直接活性产生的细胞或组织的表型变化或响应，例 如凋亡。可以通过例如测定被磷酸化的底物的量来测定催化活性。可以使用本领域已知的 方法评估其它活性，例如凋亡。标志物的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”用于指使用神经退化生物标志物(例 如STAT3、 Κ2、磷酸化的STAT3、磷酸化的 Ι^)的体外和体内测定法鉴定的激活、抑制或 调节分子。“抑制剂”是例如结合、部分阻断或完全阻断活性、降低、阻止、延迟激活、灭活、去敏、或下调神经退化生物标志物的活性或表达的化合物。“激活剂”是增加、开启、激活、 促进、增强激活、敏化、激动或上调神经退化生物标志物的活性的化合物，例如激动剂。抑 制剂、激活剂或调节剂还包括经过遗传修饰的神经退化生物标志物，例如具有改变的活性 的形式，以及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核 酶、RNAi和SiRNA分子，有机小分子等。抑制剂和激活剂的此类测定法包括，例如在体外、 细胞或细胞提取物中表达神经退化生物标志物、施用假定的调节剂化合物、然后测定对于 活性的功能效应，如上所述。将经过潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的包含神经退化生物标志物(例如 Κ2、STAT3、磷酸化的STAT3、磷酸化的 Ι^)的样品或测定与不含抑制剂、激活剂或调节 剂的对照样品进行比较以检测活性改变的程度。对照样品(未经处理的或经过已知的调节 剂处理的)被分配为100%的相对蛋白活性值。当相对于对照的活性值是大约80%，优选 50%，更优选25-0%时，达到对于神经退化生物标志物的抑制。当相对于对照(未经激活剂 处理)的活性值是110%，更优选150%，更优选200-500% (即相对于对照高2至5倍)， 更优选高1000-3000%时，达到对于神经退化生物标志物的激活。术语“测试化合物”、“测试试剂”、“调节剂”或等价术语在本文中用于描述其直接 或间接调节神经退化生物标志物的能力待测的任何分子，无论是天然存在的还是合成的， 例如蛋白质、寡肽(例如长度是大约5至大约25个氨基酸，优选地，长度是大约10至20，或 12至18个氨基酸，优选地，长度是12、15或18个氨基酸)、有机小分子、多糖、肽、环肽、脂、 脂肪酸、siRNA、多核苷酸、寡核苷酸等。测试化合物可以是测试化合物的文库的形式，例如 提供足够多的多样性的组合文库或随机文库。测试化合物任选地连接至融合伴侣，例如靶 向化合物、挽救化合物(rescue compound)、二聚体化化合物、稳定化化合物、可寻址化合物 (addressable compound)和其它功能部分。方便地，通过鉴定具有某些想要的特性或活性 (例如抑制活性)的测试化合物(称作“先导化合物”)、产生所述先导化合物的变体、评价 这些变体化合物的特性和活性来产生具有有用性质的新的化学实体。通常，应用高通量筛 选(HTQ来进行此类分析。术语“有机小分子”和“小分子”是指天然存在的或合成的有机分子，其具有大约 50道尔顿以上且大约2500道尔顿以下的分子量，优选大约2000道尔顿以下，优选大约100 至大约1000道尔顿，更优选大约200至大约500道尔顿。B. STAT3 禾口 TYK2STAT3属于信号传导子和转录激活子(STAT)蛋白家族。与该家族其它成员一样， 它通过受体结合的激酶通过磷酸化被激活。一旦被磷酸化，STAT蛋白即形成同二聚体或异 二聚体，所述二聚体转位至细胞核，在那里它们作为转录激活子发挥作用。除了二聚体化和 转位至细胞核所需的酪氨酸磷酸化之外，STAT蛋白还需要丝氨酸磷酸化以进行最佳转录激 活(Zhang 等人，(1995) Science 267 :1990-94)。响应于生长因子(例如表皮生长因子、CSF-I和PDGF)和多种干扰素和细胞因子 (例如 IFNa、IL-6、LIF)的刺激，STAT3 被激活(Akira (2000) Oncogene 19 :2607-11)。通过 IL-6家族的细胞因子的STAT3激活导致多种功能响应。在刺激后，细胞因子与gpl30和其 它相关受体结合以引发Janus激酶(JAK)对STAT3的磷酸化。磷酸化发生在转激活结构域 内的705位的氨基酸的单一酪氨酸位点，这导致STAT3的二聚体化、转位和DNA结合(Levyand Lee(2002)J ClinInvest 109:1143-48)。由于它响应于大量的信号传导分子而被激活并且介导多种不同的信号途径，所 以STAT3的功能是普遍性的(即其作用可以引起增殖、促进存活或引起凋亡)。基于很多 已发表的报道，其功能包括诱导肝细胞癌细胞中的急性期应答(Alonzi等人，O001)Mol Cell Biol21 1621-32)，刺激B淋巴细胞增殖，激活单核细胞分化和生长阻滞(Heinrich 等人，(1998) Biochem J 334 :297-314)，维持胚胎干细胞的多能性(Raz等人，(1999) Proc Natl Acad Sci USA 96 J846-51)，以及在肝脏再生中的作用(Moh等人，(2007) Lab Invest 87 :1018-28).还发现STAT3的转录活性对于神经元细胞存活具有重要意义(Battle andFrank(2002)Curr Mol Med 2:381-92)。Tyk2属于细胞内蛋白-酪氨酸激酶(PTK)的JAK家族，其包括JAK1、JAK2和JAK3。 这些PTK具有两个串联排列的激酶结构域羧基末端、功能性酪氨酸激酶(TK)结构域和邻 近的激酶样(KL)结构域。JAK通过多种细胞受体在信号传导中发挥重要作用，如最初通过 其补充对于干扰素(IFN)无响应的突变细胞系的遗传缺陷的能力所证明的。后来发现，与 几乎所有已知的细胞因子受体的配体结合诱导一个或多个JAK家族成员的酪氨酸磷酸化。 这些PTK使下游效应子分子磷酸化，并且对于正确的配体-受体信号传导是至关重要的。C. 一般的重组方法为了表达克隆的基因，例如编码STAT3或 Κ2的cDNA，人们通常将编码序列亚 克隆进入表达载体，所述表达载体包含指导转录的启动子、转录/翻译终止子、和用于翻 译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的，见例如Sambrook等人和 Ausubel等人(见上文)的描述。用于表达CMRl蛋白的细菌表达系统可以在例如大肠杆 菌、杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)中获得(Palva等人，Gene 22: 229-235(1983) ；Mosbach 等人，Nature302 :543-545 (1983))。用于此类表达系统的试剂盒 可以从商业渠道获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域熟知 的，也可以从商业渠道获得。逆转录表达系统也可用于本发明中。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于特定的应用。优选地，启动子距离 异源转录起始点的距离大约等于在其天然环境中其距离转录起始点的距离。但是，本领域 已知的是，可以接受该距离的一些改变而不丧失启动子功能。除了启动子之外，表达载体通常包含转录单元或表达盒，其包含在宿主细胞中表 达编码STAT3或 Κ2的核酸所需的所有其它元件。因此，典型的表达盒包含与编码序列可 操作地连接的启动子和转录物有效多聚腺苷化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止。 盒的另外的元件可以包括增强子，如果使用基因组DNA作为结构基因，还可以包括具有功 能性剪接供体和受体位点的内含子。除了启动子序列之外，表达盒还应该包含位于结构基因下游的转录终止区，以提 供有效的终止。终止区可以从获取启动子序列的相同基因获得，或者可以从不同基因获得。用于将遗传信息传递至细胞的特定表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真 核或原核细胞中表达的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒，例如基于PBR322的 质粒、pSKF、pET23D，以及融合表达系统，例如MBP、GST和LacZ。还可以向重组蛋白中加入 表位标签以提供常规的分离方法，所述标签为例如c-myc。可以在表达盒中包括序列标签 以进行核酸挽救。可以在载体中包括标志物，例如荧光蛋白、绿色或红色荧光蛋白、β-gal、CAT等，它们作为载体转导的标志物。包含来自真核病毒的调控元件的表达载体通常用于真核表达载体，例如SV40载 体、乳头瘤病毒载体、逆转录病毒载体和衍生自EB病毒的载体。其它示例性的真核载体包 括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及任何其它允许在以下启动 子的指导下表达蛋白的载体CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白 启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它显示出对 于在真核细胞中的表达有效的启动子。还可以使用可诱导的启动子调控从真核载体进行的蛋白表达。使用可诱导启动 子，通过将响应于试剂(例如四环素或蜕皮激素)的元件引入启动子中，使表达水平关联于 这些诱导剂的浓度。一般而言，只有在存在诱导剂的情况下，从可诱导启动子获得高水平的 表达；基础表达水平是极低的。使用标准转染方法来产生细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，它们表达所选的蛋 白，然后可通过使用标准技术纯化所述蛋白(参见，例如Colley等人，J. Biol. Chem. 264 17619-17622 (1989) ；Guide toProtein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher编，1990))。根据标准技术进行真核和原核细胞的转化(参见， 例如 Morrison, J.Bact. 132 :349-351 (1977) ;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101 :347-362 (Wu 等人编，1983)。可以使用任何熟知的用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞的程序。这些包括使用 磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、生物弹(biolistics)、脂质体、 微注射、血浆载体、病毒载体和任何其它熟知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA 或其它外源遗传材料导入宿主细胞的方法(参见例如Sambrook等人，见上文)。所用的具 体遗传工程程序仅需要能够成功地将至少一个基因导入宿主细胞。将表达载体导入细胞之后，在有利于表达所选蛋白(例如 Κ2或STAT3)的条件 下培养转染的细胞。D.诊断方法本发明提供了预测、诊断神经退行性病症例如AD的方法或为其提供预后的方法， 所述方法是通过检测STAT3和 Κ2的表达或激活。预测和预后包括测定来自个体的生物样 品中神经退化生物标志物表达或激活的水平，然后将该水平与对照基线或范围进行比较。 通常而言，基线值代表不患有或不会患上神经退行性病症(通过使用生物样品例如神经元 细胞活组织检查或体液样品例如脑脊髓液来测定)的健康个体的多核苷酸或核酸的水平。 神经退化生物标志物的表达或激活水平的改变可以指示该患者具有神经退化的增加的风 险。此类方法可以与本领域已知的其它诊断方法联合使用。1.基于核苷酸的测定在一些实施方式中，使用来自生物样品的RNA通过实时或定量PCR来检测 STAT3或 Κ2的表达。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来提取RNA，例如使用 Trizol和RNeasy。可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行实时PCR，例如使用 AppliedBiosystem测定法的Taqman实时PCR。相对于汇集的正常肺RNA计算基因表达，并 将该表达针对持家基因进行校正。合适的寡核苷酸引物由本领域技术人员选择。在一个实施方式中，使用核酸结合分子例如探针、寡核苷酸、寡核苷酸阵列和引物来检测RNA生物标志物，以检测患者样品中的差别化的RNA表达。在一个实施方式中，根据 本领域已知的标准方法使用RT-PCR。在另一个实施方式中，可以使用定量PCR测定法(例 如可以从例如Applied Biosystems获得的Taqman 测定法)来检测核酸及其变体。在 其它实施方式中，可以使用核酸微阵列来检测核酸。可以使用常规技术例如northern分析 来实现核酸的分析，或者，任何其它基于与核酸序列杂交(所述核酸序列互补于标志物编 码序列的一部分)的方法(例如条形斑点杂交)也包括在本发明的范围内。可以根据本领 域技术人员已知的方法制备与选择的核酸生物标志物结合的试剂，或者从商业渠道购买。可应用的PCR扩增技术描述于例如Ausubel等人和hnis等人(见上文)。一 般性的核酸杂交方法描述于 Anderson，“Nucleic AcidHybridization, ” BIOS Scientific Publishers，1999。多个核酸序列(例如基因组DNA、mRNA或cDNA)的扩增或杂交还可 以从排列在微阵列中的mRNA或cDNA序列进行。微阵列方法的一般性描述见Hardiman， "Microarrays Methods and Applications :Nuts & Bolts,"DNA Press,2003 ；禾口 Baldi 等 人，“DNA Microarrays and GeneExpression :From Experiments to Data Analysis and Modeling,，，Cambridge University Press, 2002。2.基于蛋白的测定和免疫测定在另一个实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的多种免疫测定法中的任意 方法，在测定中使用抗体试剂来检测生物样品中本发明的神经退化生物标志物的表达和/ 或活性水平。免疫测定技术和程序的一般性描述见I^rice and Newman, "Principles and Practice ofImmunoassay, "2nd Edition, Grove ' s Dictionaries, 1997 ；禾口 Gosling, "Immunoassays :A Practical Approach,，，Oxford University Press,2000。可以使用 多种免疫测定技术，包括竞争性和非竞争性免疫测定。参见，例如klf等人，Curr. Opin. Biotechnol.，7 :60-65(1996)。术语“免疫测定”涵盖的技术包括但不限于，酶免疫测 定(EIA)，例如酶放大免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、IgM抗体捕获 ELISA (MAC ELISA)和微颗粒酶免疫测定(MEIA)；毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射免疫测 定(RIA)；免疫放射性测定(IRMA)；荧光极化免疫测定(FPIA)；和化学发光测定(CL)。如果 需要的话，此类免疫测定法可以进行自动化。免疫测定还可以与激光诱导的荧光联合使用。 参见，例如 Schmalzing 等人，Electrophoresis, 18 :2184-93(1997) ；Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.，699 :463-80 (1997)。脂质体免疫测定，例如流注射脂质体免疫测定和脂 质体免疫传感器也适合用于本发明。参见，例如Rongen等人，J. Immunol. Methods, 204 105-133(1997)。此外，比浊法测定也适合用于本发明的方法中，其中，蛋白质/抗体复合 物的形成引起增加的光散射，其被转化为峰速信号作为标志物浓度的函数。比浊法测定可 通过商业渠道从Beckman Coulter (Brea，CA ；Kit#449430)获得，并且可以使用Behring Nephelometer Analyzer (Fink 等人，J. Clin. Chem. Clin. Biochem.，27 :261-276 (1989))来 进行。可以在本文描述的测定法中使用可检测的部分以进行直接或间接检测。可以使 用多种可检测部分，标记物的选择取决于所需的灵敏性、与抗体缀合的容易程度、稳定性需 求和可用的仪器和处理规定(disposal provision) 0合适的可检测部分包括但不限于， 放射性核苷酸、荧光染料(例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC) .OregonGreen 、若丹明、 Texas red、异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、由肿瘤相关的蛋白酶激活的自动猝灭荧光化合物、酶(例如，荧光 素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、异羟基洋地黄毒苷、金属等。使用核酸特异性的化学发光抗体的化学发光测定法适合于进行蛋白水平的灵敏 性、非放射活性检测。以荧光团标记的抗体也是适合的。荧光团的例子包括但不限于DAPI、 荧光素、Hoechst 33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、若丹明、Texas red和丽 丝胺(lissamine)。间接的标记物包括各种本领域熟知的酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、 碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。辣根过氧化物酶检测系统可以与例如发色底物 四甲基联苯胺(TMB) —起使用，其在存在过氧化氢的情况下产生可以在450nm检出的可溶 性产物。碱性磷酸酶检测系统可以与例如发色底物对硝基苯磷酸盐一起使用，其产生可在 450nm容易地检出的可溶性产物。类似地，β _半乳糖苷酶检测系统可以与发色底物邻硝基 苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG) —起使用，其产生可在410nm检出的可溶性产物。脲酶检 测系统可以与底物例如脲-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals ；St. Louis, MO) 一起使用。来自直接或间接标记物的信号可以这样分析，例如使用分光光度计检测来自发 光底物的颜色；使用放射计数器检测放射，例如使用Y计数器检测125I ；或者使用荧光计 在存在一定波长的光的情况下检测荧光。对于酶联抗体的检测，可以使用分光光度计例如 EMAXMicroplate Reader (Molecular Devices ；Menlo Park, CA)根据生产商的说明书进行 定量分析。如果需要的话，本发明的测定可以自动化或由机器人操作，并且可以同时检测来 自多个样品的信号。可以将抗体固定在多种固体载体上，例如磁性或色谱基质颗粒、测定板的表面 (例如微量滴定孔)、多片固体基底物质或膜(例如塑料、尼龙、纸)等。可以通过将抗体或 多个抗体包被在固体载体上的阵列上来制备检测条(assay strip)。然后可以将这种条浸 没在测试样品中并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测定的信号，例如有色斑点。有用的物理形式包括，具有多个不连续、可寻址的位置的表面，以检测多个不同的 标志物。此类形式包括微阵列和一些毛细设备。参见，例如Ng等人，J. Cell Mol. Med. ,6 329-340(2002)；美国专利号6，019，944。在这些实施方式中，每个不连续表面位置可以包 含抗体以固定一种或多种标志物，以便在每个位置进行检测。或者，表面可以包含一个或多 个不连续颗粒(例如微颗粒或纳米颗粒)，它们固定在表面的不连续位置上，其中所述微颗 粒包含抗体以固定一种或多种标志物以进行检测。可以通过多种物理形式进行分析。例如，微量滴定板或自动化设备可用于促进大 量测试样品的处理。或者，可以开发单一样品形式以促进以实时的方式进行诊断或预后。或者，本发明的抗体或核酸探针可应用于固定在显微镜玻片上的患者活组织检查 样品的切片上。可以使用本领域已知的多种光学或荧光显微镜方法中的任一种来显示产生 的抗体染色或原位杂交模式。在另一种形式中，本发明的各种标志物还提供了用于体内成像的试剂，例如标记 试剂的图像，其检测本发明的生物标志物的核酸或编码的蛋白。非侵入性医学成像技术，例如正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断 层扫描(SPECT)成像对于检测脑疾病是特别有用的。PET和SPECT成像显示器官和组织的 化学功能，其它成像技术，例如X-射线、CT和MRI则显示结构。PET和SPECT成像的使用在 定性和监视脑疾病例如AD的进展中的作用正日益增强。在一些情况中，使用PET或SPECT成像允许在症状出现数年之前检出神经退行性病症。该策略已经用于开发适合于人类脑中的淀粉样蛋白沉积的体内成像的化合物。在 患有AD的患者中进行测试时，脑对于针对A β的单克隆抗体和肽片段的摄取是有限的。迄 今为止，用于淀粉样蛋白成像的小分子方法是最成功的，其描述见例如Nordberg A5Lancet Neurol. ,3(9) :519-27(2004) ；Kung MP et al，Brain Res. , 1025(1-2) :98-105(2004)； Herholz K ·入，Mol Imaging Biol. ,6(4) :239-69(2004) ；NeuropsycholRev. ， Zakzanis KK 等人，13 :1-18(2003) ；HerhoIz K, Ann Nucl Med. , 17 :79-89(2003) 本文公开的诊断化合物或其片段可用于PET和SPECT成像应用的环境中。为了 PET或SPECT应用，以合适的示踪残基修饰后，可以使用诊断化合物(例如抗体片段，其与 神经退化生物标志物蛋白相互作用)来显示这些生物标志物在个体中的水平。此类检测是 AD脑的特征性神经毒性淀粉样蛋白沉积的位置的指征。3.功能测定还可以使用功能测定来检测神经退化生物标志物的表达或活性。鉴于 Κ2的已 知活性(例如酪氨酸激酶)和STAT3的已知活性(二聚体化、转录激活)以及本文公开的 那些活性，此类测定对于本领域技术人员是显而易见的。用于检测神经退化生物标志物的 活性的测定在以下部分中有更详细的讨论。4.另外的诊断方法用于诊断神经退行性病症的方法是本领域已知的(参见，例如Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, FourthEdition(DSM-IV-TR), American Psychiatric Assoc. 2000)。一般而言，医生或神经学者在对特定个体或患者进行诊断时将 考虑多个因素。例如，家族史经常是AD和其它神经退行性病症风险的指征。医生将进行化 学测试以检查正常血液计数、甲状腺功能、肝功、葡萄糖水平。脊髓液的分析通常是这种测 试的一部分。医生还可以使用神经心理学测试来评估记忆、解决问题、注意力、视觉动作协调性 和抽象思维。这些包括空间练习和简单的计算。简易精神状态检查也是普遍的。CAT扫描和MRI也可用于排除肿瘤，并且可以提供关于脑退化区域的线索。E. STAT3和TYK2调节剂化合物作为神经退化生物标志物的调节剂进行测试的试剂可以是任何小的化学化合物， 或生物实体，例如蛋白质、糖、核酸或脂。通常，测试化合物将是小的化学分子、肽、寡核苷酸 或抗体片段。1.抗体和抗体片段在一些实施方式中，抗体或其表位结合片段可用于抑制STAT3和 Κ2活性。本领 域已知有数种对这些蛋白特异性的抗体，并且可从商业渠道获得(参见，例如^witrogen 产品目录，可从网站invitrogen. com获得；以及BD Biosciences的产品目录，可从网站 bdbiosciences. com 获得)。或者，可以使用标准技术从新(de novo)产生 Κ2或STAT3抗体(参见，例如 Kohler & Milstein， Nature 256 :495-497(1975) ；Kozbor φ A, Immunology Today 4 72(1983) ；Cole 等人，pp. 77_96inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985))。 用于生产单链抗体的技术(美国专利4，946，778)可适用于生产针对本发明的多肽的抗体。另外，转基因小鼠或其它生物体例如其它哺乳动物，可用于表达人源化抗体。或 者，噬菌体显示技术可用于鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚的Fab片段(参见， 例如 McCafferty 等人，Nature348 :552-554(1990) ；Marks 等人，Biotechnology 10 779-783(1992))。一般而言，抗体抑制剂包括保持对于抗原或表位(例如 Κ2、STAT3、磷酸化的 STAT3、磷酸化的 Κ2)的特异性的抗体片段。抗体抑制剂通常靶向抗原的功能性结构域， 例如，TYK2的激酶结构域或STAT3的二聚体化结构域。在一些实施方式中，抗体抑制剂包括单链抗体，例如scFV。在一些实施方式中，抗 体抑制剂包括Fab区域。在一些实施方式中，抗体抑制剂是人源化的。2.核酸抑制剂调节剂还包括设计为降低编码神经退化生物标志物多肽的mRNA的水平的试剂 (例如反义分子、核酶、DNA酶、小的抑制性RNA等)或降低从mRNA的翻译水平的试剂(例 如翻译阻滞剂，例如互补于翻译起始点或mRNA分子上的其它序列的反义分子)。在一些实 施方式中，使用已知的方法来鉴定抑制神经退化生物标志物的核酸序列。此类抑制剂可以 包括但不限于，siRNA寡核苷酸和反义寡核苷酸。抑制剂siRNA或反义寡核苷酸可用于特 异性地靶向 Κ2和STAT3表达。在一些实施方式中，使用RNA干扰来产生小的双链RNA，小的干扰RNA (SiRNA)或 短发夹RNA(shRNA)抑制剂以影响 Κ2和STAT3的表达，这一般是通过切割和破坏其同源 RNA来进行。小的干扰RNA (siRNA或shRNA，二者相互替换地使用)通常是19_22nt的双链 RNA。可以通过化学合成或通过基于DNA载体的RNAi技术获得siRNA。使用基于DNA载体 的siRNA技术，将小的DNA插入子(大约70bp，其编码靶向目标基因的短发夹RNA)克隆进 入商业上可获得的载体。包含插入子的载体可以转染进入细胞，并表达所述短发夹RNA。发 夹RNA迅速被细胞机制处理成19-22nt的双链RNA (siRNA)。siRNA —般插入到合适的RNAi 载体中，因为合成制备的siRNA倾向于具有较低的稳定性并且在转染中不那么有效。可以使用例如以下参考文献中描述的方法和算法来制备siRNA :Wang等人， (2004)A Web-based Design Center for Vector-basedsiRNA and siRNA cassette Bioinformatics. (In press) ；Khvorova 等人，(2003)Cell. 115(2) :209-16 ；Harborth φ 人，(2003)Antisense NucleicAcid Drug Dev. 13(2) :83-105 ；Reynolds ^A, (2004)Nat Biotechnol. 22 :326-30 ；以及 Ui-iTei 等人，(2004)Nucleic Acids Res. 32 :936-48 用 于构建siRNA序列的其它工具是网上的工具，例如siRNA TargetFinder and Construct Builder,可从 GenScript 获得；Oligo Design andAnalysis Tools,可从 Integrated DNA Technologies 获得；或 siDESIGN Center，可从 Dharmacon, Inc.获得。建议使用 ORF(开 放读码框)作为靶标选择区，优选起始密码子下游50-100nt处，来构建siRNA。3.肽和小分子抑制剂作为本发明的多肽或多核苷酸的调节剂进行测试的试剂可以是任何小的化学化 合物或生物实体，例如蛋白、糖、核酸或脂。测试化合物通常包括小的化学分子和肽。肽抑 制剂可以被设计为模拟所靶向的分子的天然配体或结合伴侣。在本发明的上下文中，示例 性的STAT3的肽抑制剂可以从例如STAT3 二聚体化伴侣来设计。示例性的 Κ2的肽抑制 剂可以从例如 Κ2的天然底物来设计。
基本上任何化学化合物可用作本发明的测定中的潜在调节剂，虽然最经常使用的 是可溶于水或有机(尤其是基于DMSO的)溶液的化合物。测定被设计为通过自动化进行 测定步骤并从任何方便的来源为测定提供化合物来筛选大的化学文库，通常平行地运行 (例如，在自动化测定中在微量滴定板上以微量滴定的形式进行)。将认识到，有很多化学 化合物的供应商，包括 Sigma (St. Louis, MO)、Aldrich (St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)、FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs, Switzerland)等。在一个实施方式中，高通量筛选方法包括提供组合化学或肽文库，其包含大量的 潜在的治疗化合物(潜在的调节剂化合物)。然后按照本文的描述，在一个或多个测定中筛 选此类“组合化学文库”或“肽文库”，以鉴定那些显示出想要的特征性活性的文库成员(尤 其是化学种类或亚类)。由此鉴定的化合物可以作为常规的“先导化合物”或者它们自身可 用作潜在的或实际的治疗剂。组合化学文库是一般通过化学合成或生物合成而产生的多种化学化合物的集合， 通过组合多个化学“构建模块”来实现。例如，通过以对于给定化合物长度(即多肽化合物 中的氨基酸数目)而言每种可能的方式组合一组化学构建模块(氨基酸)而形成线性组合 化学文库，例如多肽文库。可以通过化学构建模块的此类组合混合来合成数以百万的化学 化合物。组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员熟知的。此类组合化学文库包括 但不限于，肽文库(参见，例如，美国专利5,010, 175，Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37 487-493(1991)和 Houghton 等人，Nature 354:84-88(1991))。也可以使用其它用于产 生化学多样性文库的化学法。此类化学法包括但不限于，拟肽(ρ印toid)(例如PCT国 际公开号WO 91/19735)、编码的肽(例如PCT国际公开号WO 93Λ0242)、随机生物寡聚 物(例如PCT国际公开号WO 92/00091)、苯并二氮萆(例如美国专利号5，观8，514)、 diversomers 例如乙内酰脲、苯并二氮革和二肽(Hobbs 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 6909-6913(1993))(vinylogous polypeptide) (Hagihara ^A, J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽类模拟肽(Hirschmann等人，J. Amer. Chem. Soc. 114 :9217-9218(199 )、小化合物文库的类似物有机合成(Chen等人，J. Amer. Chem. Soc. 116 :2661 (1994))、寡氨基甲酸酉旨(Cho 等人，Science :1303 (1993))、和 / 或肽基 膦酸酯(Campbell 等人，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))、核酸文库(参见 Ausubel，Berger 和Sambrook，均见上文)、肽核酸文库(参见，例如美国专利5，539，083)、抗体文库(参见， 例如 Vaughn 等人，Nature Biotechnology,14(3) :309-314(1996)和 PCT/US96/10287)、 碳水化合物文库(参见，例如Liang等人，Science, 274 :1520-1522(1996)和美国专利 5，593，85 、有机小分子文库(参见，例如苯并二氮革，Baum C&EN, 1月18日，第33页 (1993)；类异戊二烯，美国专利5，569，588 ；噻唑烷酮和间噻嗪酮，美国专利5, 549, 974 ；吡 咯烷，美国专利5，525，735和5，519，134 ；吗啉化合物，美国专利5，506，337 ；苯并二氮革， 5，288，514 等)。用于制备组合文库的设备可从商业渠道获得(参见，例如，357MPS，390MPS， Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, ΜΑ,433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，很多组合文库本身可从商业渠道获得(参见，例如，ComGenex, Princeton, N. J.，Tripos, Inc.，St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD 等)。F.鉴定神经退化生物标志物的调节剂的方法用于筛选测定的神经退化生物标志物多肽和多核苷酸一般类似于野生型STAT3 和 Κ2序列并保持蛋白的至少一种生物活性。任选地，用于活性测定的神经退化生物标志 物多肽或多核苷酸将包含全长序列的片段，例如激酶结构域、或转激活结构域。本发明的多 肽或其结构域将共价连接至异源蛋白以产生用于本文描述的测定中的嵌合蛋白。当本发明 的多肽相对于对照具有110%，任选为150%、200%、300%、400%、500%或1000-2000%的 活性值时，其是有活性的。使用重组的或天然存在的多肽来测定神经退化生物标志物活性的候选调节剂。蛋 白可以是分离的、在细胞中表达、在源自细胞的膜中表达、在组织或在动物中表达，可以是 重组的或天然存在的。例如，可以使用组织切片、解离的细胞(例如来自于表达本发明的多 肽的组织)、转化的细胞、或膜。使用本文描述的体外或体内测定法之一来测试抑制情况。测试化合物与本发明的多肽、结构域或嵌合蛋白的结合可以在溶液中、在双层膜 中、附着至固相、在脂单层中、或在囊泡中测定。可以使用例如分光光度特性(例如荧光、吸 收值、折射率)、流体力学(例如形状)、色谱的或溶解性特性的变化来检测所述测试化合物 的结合情况。将经过潜在的调节剂(例如，“测试化合物”)处理的样品或测定与不含测试化合 物的对照样品进行比较以检测调节的程度。对照样品(未经候选化合物处理)被分配为 100的相对活性值。当相对于对照的活性值是大约90%，任选50%，任选25-0%时，达到对 本发明的多肽的抑制。还提供了用于调节神经退化生物标志物多核苷酸和多肽的表达的化合物的筛选 测定。筛选方法一般包括进行基于细胞的测定，其中，将测试化合物与一种或多种表达 STAT3或 Κ2的细胞接触，然后检测表达的增加或减少(转录物或翻译产物)。可以使用 任何表达STAT3或 Κ2多肽的细胞，例如神经元细胞，进行所述测定。可以通过多种不同方式检测表达情况。如上文所述，神经退化生物标志物多核苷 酸的表达水平可以这样测定使用与神经退化生物标志物转录物(或由其衍生的互补性核 酸)特异性杂交的探针来探测细胞中表达的mRNA。或者，可以使用免疫学方法检测神经退 化生物标志物多肽，例如这样的测定使用特异性结合多肽的抗体来探测细胞裂解物。报道分子系统也可用于鉴定神经退化生物标志物表达的调节剂。多种不同类型的 细胞可用于报道分子测定中。不内源表达神经退化生物标志物多肽的细胞可以是原核的， 但优选是真核的。真核细胞可以是任何常规用于产生具有重组核酸构建体的细胞的细胞。 示例性的真核细胞包括但不限于，HCN-I (皮层神经元)、132mi (星细胞瘤)、H4(神经胶质 瘤)、IMR32和PC12细胞系。可以设置各种对照以确保观察到的活性是可信的，这包括使用不含报道分子构建 体的细胞进行平行反应，或者不将携带报道分子构建体的细胞与测试化合物接触。可以使用多种体外和体内测定法来评估活性，从而测定功能、化学和物理效应。在 TYK2的情况下，这些测定法包括监视例如底物的催化磷酸化。在实施例中提供了示例性的 激酶测定。或者，可以通过将底物与 Κ2多肽在含有32P-YATP的缓冲液中温育并测定磷酸化的底物的量来测定 Κ2将底物(例如STAB)磷酸化的能力。还可以使用形式为高通量用途的测定。例如，激酶催化Y-磷酰基从ATP转移至合 适的羟基受体，并释放质子。因此，使用适当匹配的缓冲液/指示剂系统的基于检测该质子 的测定可用于检测活性(参见,例如Chapman & Wong Bioorg Med Chem 10 :551-5,2002) 或者，可以使用 Κ2和STAT3-介导的胱天蛋白酶3的切割和细胞调亡来测定活 性。在此类测定中，检测细胞调亡的标志，例如DNA片段化，细胞存活性。可以使用适合于 高通量筛选形式的测定法来检测细胞存活性，例如比色法或荧光存活性测定。例如，Alamar blue (A^测定，引入氧化还原指示剂，其响应于代谢活性而改变颜色或荧光。在存在活细胞 的情况下，Alamar blue发荧光；在存在死细胞时，则不发荧光。可以在微量滴定板中或通 过流式细胞术读取此类测定。比色测定例如MTT测定法(其测定MTT (3-G，5-二甲基)噻 唑-2-基-2，5- 二苯基四唑溴盐还原为甲臜)也可方便地用于高通量形式，以测定细胞存 活性和增殖。还可以使用测定细胞数目的其它测定。这些包括测定染料掺入细胞DNA中的测定 法。掺入的染料的量直接与细胞数目成比例。例如，可以使用诸如Hoechst 33342的染料 将细胞染色，其掺入到活细胞的DNA中，通过测定荧光的量来确定细胞数目。还可以直接对 细胞进行计数。或者，可以使用 Κ2和STAT3下游的信号传导事件来测定活性。例如，可以使用 本文描述的技术测定通过STAT3转激活而激活的基因表达(例如iNOS、IRF-1)。或者，可 以检测胱天蛋白酶-3的切割，如实施例中所描述。可以进一步测试那些通过任意前述筛选方法最初鉴定的化合物以验证表观活性。 优选地，使用合适的动物模型进行此类研究。此类方法的基本形式包括，向用作人类AD模 型的动物施用在最初筛选中鉴定的先导化合物，然后测定AD是否确实被调节和/或改善。 用于验证研究的动物模型一般是任意种类的哺乳动物。合适的动物的具体实例包括但不限 于，灵长类、小鼠和大鼠。用于AD的示例性动物模型是APP/PS1小鼠。G.实施例1.实施例1 在阿尔茨海默病(AD)模型小鼠的脑组织中，STAT3在Tyr705的磷酸
化升高为了鉴定AD病症中涉及的信号传导途径，筛选了 AD小鼠脑中多个信号传导分子 的表达水平和功能状态。从APP/PS1转基因小鼠[APP (Swe)/PSl ( Δ E9)] (9月龄，其为清楚 表征的AD小鼠模型)制备脑组织的不同部分(包括皮层、海马和小脑)的裂解物。发现 STAT3的酪氨酸磷酸化水平在AD小鼠脑的皮层中一致性升高(图1Α)。这些发现表明在升 高的pTyr-STAT3水平和AD病症之间存在关联。在4个月至18个月大的AD小鼠的皮层中检测到了升高的STAT3的酪氨酸磷酸化 (图1B)。已经报道了这些AD小鼠在 6至7月龄时具有β-淀粉样蛋白(Αβ)沉积，其 为AD脑中老年斑的主要成分，这表明STAT3的酪氨酸磷酸化发生在形成老年斑之前。在野生型小鼠的皮层中几乎检测不到STAT3的酪氨酸磷酸化，而在APP/PS1小鼠 的皮层中观察到酪氨酸磷酸化的STAT3的显著升高。通过免疫染色，我们发现有活性的(酪 氨酸磷酸化的)STAT3与NeuN阳性的神经元(> 80% )共定位，但不与GFAP-阳性的神经 胶质细胞共定位，这进一步表明STAT3的激活主要发生在AD小鼠脑的神经元中。此外，发现STAT3的酪氨酸磷酸化在AD小鼠脑中的产生区域类似于老年斑产生的区域(通过A β 染色指示)。2.实施例2 :Αβ诱导皮层神经元中STAT3的酪氨酸磷酸化使用培养的大鼠皮层神经元作为细胞培养模型来研究STAT3酪氨酸磷酸化在AD 中的作用。使用A β肽25-35处理皮层神经元(7DIV)。观察到STAT3的酪氨酸磷酸化的显 著升高，并且在Αβ处理的所有4个小时中持续磷酸化(图幻。免疫染色显示由Αβ处理 诱导的STAT3的酪氨酸磷酸化集中于β -微管蛋白III-阳性的神经元中。3.实施例3 :STAT3的敲低或STAT3活性的抑制保护神经元细胞免受A β诱导的 细胞调亡为了研究STAT3在AD中的神经元细胞死亡中的作用，使用STAT3siRNA敲低PC12 细胞中STAT3的表达。敲低了大约80%的STAT3蛋白(图3A)。经过4天分化(通过NGF 诱导)之后，使用Αβ肽处理细胞。STAT3的敲低减少了 Αβ诱导的细胞死亡(图4Α)。此 外，STAT3激活的抑制(通过使用特异性STAT3抑制剂处理细胞)降低了 Αβ诱导的切割 的胱天蛋白酶-3的水平(图:3Β)，这指示了神经元细胞调亡的程度。胱天蛋白酶-3是细胞 内的半胱氨酸蛋白酶，其参与神经元细胞调亡。其作为针对细胞损伤的调亡响应的一部分 被激活。综上，这些发现表明31413活性在々0肽诱导的神经元细胞死亡中具有重要作用。4.实施例4 :Tyk2介导A β诱导的STAT3的酪氨酸磷酸化，并且是A β诱导的神 经元细胞调亡所需要的。由于Αβ诱导STAT3的酪氨酸磷酸化，所以下一个目标是鉴定STAT3的上游调节 剂。在Αβ处理之前使用不同的抑制剂预处理皮层神经元。JAK抑制剂1(其对于STAT3上 游的多种酪氨酸激酶包括JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2具有强烈抑制效应)完全抑制了 A β诱 导的STAT3的酪氨酸磷酸化(图4Α)。但是，JAK2的抑制剂AG490则不显示类似于JAK抑 制剂1的抑制效应。这些发现说明A β诱导的STAT3的磷酸化是通过除了 JAK2之外的JAK 家族成员介导的。另外，Src激酶抑制剂ΡΡ2和蛋白合成抑制剂己酰亚胺都不影响Αβ诱导 的STAT3的磷酸化，这表明A β诱导的STAT3的磷酸化(i)不是通过Src途径进行的；和 ( )不需要蛋白合成。使用Αβ肽处理皮层神经元1个小时。通过特异性抗体将内源性 Tyk2或JAK2免疫沉淀，通过单克隆的磷酸化-酪氨酸的抗体4G10来检测沉淀物。与JAK2 不同，在Αβ处理的细胞中可以检测出Tyk2酪氨酸磷酸化(图4B)。然后检测了 Tyk2在Αβ诱导的神经元细胞调亡中的参与情况。从Tyk2+小鼠制 备原代皮层神经元培养物。在对照神经元中，Αβ肽处理导致STAT3在Tyr705的酪氨酸磷 酸化。但是，在Tyk2+神经元中，这种特异性磷酸化降低(图4C)。此外，在Tyk2+神经元 中，由Αβ诱导的胱天蛋白酶-3激活和神经元细胞调亡也减少。综上，Tyk2是Αβ诱导的 STAT3磷酸化所需要的，并且其介导A β诱导的胱天蛋白酶-3切割和神经元细胞死亡。5.实施例5 皮层神经元中的Aβ处理诱导iNOS基因表达为了进一步表征A β肽是否影响STAT3的转录活性，使用连接至STAT3-响应增强 子元件的荧光素酶构建体(pSTAT3-Luc)转染PC12细胞。连接至STATl-响应增强子元件 的荧光素酶构建体(pGAS-Luc)用作对照。与以前的报道相一致，NGF处理诱导了 STAT3和 STATl的启动子活性，但是A β肽仅诱导STAT3启动子活性(图5Α)。以Αβ肽处理原代皮层神经元6个小时。通过实时PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA水平。iNOS是哺乳动物中的3种类型的一氧化氮合酶(NOS)之一，其负责 产生气体信号传导分子一氧化氮(NO)。iNOS在炎症和病原体诱导的免疫应答中具有重要 作用。在暴露于某些细胞因子例如干扰素-Y (IFN-γ)之后，iNOS产生N0，其通过JAK家 族和STAT蛋白进行信号传导。激活的STAT 二聚体化并转位至细胞核，在那里它们增加转 录因子例如IRF-I的表达，IRF-I继而结合至iNOS基因启动子区域的特定DNA元件以增加 iNOS基因的表达。在Αβ肽处理之后，iNOS基因表达水平升高。有趣的是，iNOS基因表达的这种升 高可以通过STAT3抑制剂或JAK抑制剂I的预处理被阻断，这表明JAK-STAT途径对于A β 诱导的iNOS基因表达的上调是必需的(图5B)。6.实施例6 :STAT3酪氨酸磷酸化在AD脑切片中是可见的为了确定在AD患者的脑中是否观察到STAT3的酪氨酸磷酸化，将来自4位AD患 者的海马脑切片进行染色。所有4位患者显示出相似的染色样式。在AD脑切片中清楚地 观察到STAT3的酪氨酸磷酸化。通过免疫染色，我们还发现活性的STAT3与NeuN阳性的神 经元(大约70% )共定位，但不与GFAP-阳性的神经胶质细胞(大约7% )共定位，这与来 自APP/PS1转基因小鼠脑切片的结果是一致的(图6)。7.方法脑提取物、细胞提取物的制备和Wfestern印迹从不同阶段(从2个月至18个 月)的转基因小鼠中分离4个脑部分，包括皮层、海马、小脑和纹状体，并保持在干冰上。在 具有多种蛋白酶抑制剂的勻浆缓冲液05mM Tris-HCl, pH 7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA, pH 7.4,50mM NaF)中将冷冻的脑组织勻浆。保留上清用于Western印迹，使用RIPA裂解缓冲 液(150mM NaCl, 1% (v/v)Nonidet Ρ-40，0. 5%去氧胆酸，0. 1% (w/v) SDS ；(其中含有多种 蛋白酶抑制剂O μ g/ml抑肽酶，ImM苯基甲基磺酰化氟，5mM苄脒，ImM原钒酸钠(NaOV)和 1(^8/!111大豆胰蛋白酶抑制剂)重新提取沉淀物。收集原代培养的皮层神经元或PC12细 胞，并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解。免疫组化分析将石蜡脑切片在ImM EDTA缓冲液(pH 8. 0)中煮沸5分钟，以 进行抗原恢复。按照生产商的说明书进行DAB或AEC染色。对于荧光免疫染色，在室温 使用含0.4% "Triton X-100的PBS中的4%山羊血清将脑切片封闭20分钟。在4°C使 用一抗(抗-NeuN ;1 200)和抗-磷酸化STAT3(Tyr705) (1 100)将切片温育过夜， 然后在室温使用Alexa Fluor 488-缀合的抗-小鼠和Alexa Fluor 568-缀合的抗-兔 子IgG(Invitrogen，l 1000)温育1小时。然后洗涤切片并使用抗褪色剂(anti-fade reagent) (Invitrogen)进行封片，然后在 Olympus 共聚焦显微镜(Fluoview BX61, Olympus)下分析。使用4%多聚甲醛在室温将培养的皮层神经元固定30分钟，然后使用 含0. 4% Triton X-100的PBS中的4%山羊血清在室温封闭20分钟。在4°C使用抗-NeuN 单克隆抗体(1 500)和P-Tyr STAT3多克隆抗体(1 200)进行免疫组化分析过夜。 然后在室温使用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568-缀合的抗-小鼠或抗-兔子 IgG(Invitrogen,l 1000)将细胞标记1小时。然后使用抗褪色剂(Invitrogen)将神经 元进行封片，并在Olympus共聚焦显微镜(Fluoview BX61, Olympus)下分析。细胞存活性根据生产商的说明书(细胞增殖试剂盒I，Roche)，通过细胞将四唑 盐(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑溴盐(MTT)还原为有颜色的甲臜产物的能力来定量细胞存活性。简而言之，向细胞中加入(培养基体积的1/10)MTT试剂(5mg/ ml，在DPBS中)。在37°C将细胞温育4个小时。向细胞中加入2倍体积的MTT增溶缓冲 液(0.01M HC1，10% SDS)，然后在37°C在黑暗中温育M小时。使用平板读数器(EYNEX REVELATION 4.22，MRC TC REVELATIONDYNEX TECHNOLOGIES)在 570nm 测定吸收值。仅有 活细胞摄入MTT。细胞存活性表示为Αβ处理的细胞的吸收值相对于对照培养物的吸收值 的百分率。胱天蛋白酶-3活性测定使用 CaspACE Assay System, Fluorometric kit (Promega)测定胱天蛋白酶_3的活性。简而言之，将细胞裂解，并通过荧光测定法来测 定细胞提取物中胱天蛋白酶-3的活性。使用SpectraMaxGemini (激发波长为360nm ；发射 波长为460nm)测定由于胱天蛋白酶_3对荧光团AMC标记的底物肽DEVD的特异性切割而 产生的AMC的荧光发射。根据校正对照进行蛋白测定。定量RT-PCR 根据生产商的说明书，使用RNeasy微量试剂盒^jiagen)从Αβ处 理的皮层神经元分离总RNA。使用随机六联体(random hexamer) (Roche)合成第一条cDNA 链。使用Bio-RadMX3000P实时PCR系统，使用靶向特定基因的特异性引物进行定量PCR。应该理解本文描述的实施例和实施方式仅仅为了解释的目的，其各种修饰或改变 对于本领域技术人员是可知的，并且包括在本申请的精神和范围以及随附的权利要求的范 围内。本文引用的所有的公开物、专利和专利申请为了所有目的通过引用的方式全文并入 本文。
权利要求
1.用于鉴定调控神经退行性病症的化合物的方法，所述方法包括以下步骤 (i)将化合物与STAT3或 Κ2多肽接触；和( )测定该化合物对于STAT3或 Κ2的功能效应，其中所述功能效应指示该化合物调 控神经退行性病症。
2.权利要求1的方法，其中所述神经退行性病症的特征在于淀粉样肽在脑中的沉积。
3.权利要求1的方法，其中所述神经退行性病症选自阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、齿 状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明包涵体病(NIHID)、路易体痴呆、 唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层基底退化、拳击员痴 呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克病3 型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、亨廷顿病、皮克病和齿状 核红核苍白球路易体萎缩症。
4.权利要求1的方法，其中所述多肽是重组的。
5.权利要求1的方法，其中在体外测定所述功能效应。
6.权利要求1的方法，其中在真核细胞中测定所述功能效应。
7.权利要求6的方法，其中所述细胞是神经元细胞。
8.权利要求6的方法，其中通过测定细胞的调亡来测定所述功能效应。
9.权利要求6的方法，其中通过测定STAT3激活的转录来测定所述功能效应。
10.权利要求1的方法，其中通过测定STAT3的磷酸化来测定所述功能效应。
11.权利要求10的方法，其中所述磷酸化是在STAT3的705位酪氨酸处。
12.权利要求1的方法，其中所述功能效应是抑制STAT3的磷酸化。
13.权利要求1的方法，其中通过测定 Κ2激酶活性来测定所述功能效应。
14.权利要求1的方法，其中所述化合物是对于STAT3或 Κ2特异性的抗体或抗体片段。
15.权利要求1的方法，其中所述化合物是对于STAT3或 Κ2特异性的肽抑制剂。
16.权利要求1的方法，其中所述化合物是有机小分子。
17.用于鉴定调控神经退行性病症的化合物的方法，所述方法包括以下步骤 (i)将化合物与编码STAT3或 Κ2多肽的多核苷酸接触；和( )测定该化合物对于STAT3或 Κ2的功能效应，其中所述功能效应指示该化合物调 控神经退行性病症。
18.权利要求17的方法，其中所述神经退行性病症的特征在于淀粉样肽在脑中的沉积。
19.权利要求17的方法，其中所述神经退行性病症选自阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、 齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明包涵体病(NIHID)、路易体痴 呆、唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层基底退化、拳击员 痴呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克 病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、亨廷顿病、皮克病和 齿状核红核苍白球路易体萎缩症。
20.权利要求17的方法，其中所述多核苷酸是重组的。
21.权利要求17的方法，其中在体外测定所述功能效应。
22.权利要求17的方法，其中在真核细胞中测定所述功能效应。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞是神经元细胞。
24.权利要求22的方法，其中通过测定细胞的调亡来测定所述功能效应。
25.权利要求22的方法，其中通过测定STAT3激活的转录来测定所述功能效应。
26.权利要求17的方法，其中通过测定STAT3或 Κ2的表达来测定所述功能效应。
27.权利要求沈的方法，其中使用免疫测定法来测定STAT3或 Κ2的表达。
28.权利要求沈的方法，其中通过RT-PCR来测定STAT3或 Κ2的表达。
29.权利要求17的方法，其中所述化合物是对于STAT3或 Κ2特异性的反义分子。
30.权利要求17的方法，其中所述化合物是对于STAT3或 Κ2特异性的RNAi分子。
31.诊断个体中的神经退行性病症的方法，所述方法包括以下步骤 (i)从个体获得生物样品；( )测定所述样品中STAT3多核苷酸或多肽的水平；(iii)将步骤(ii)的样品中STAT3的水平与正常生物样品中STAT3的水平进行比较， 从而诊断所述个体中的神经退行性病症。
32.权利要求31的方法，其中检测STAT3多肽的水平。
33.权利要求32的方法，其中检测磷酸化的STAT3多肽的水平。
34.权利要求33的方法，其中所述磷酸化是在STAT3的705位酪氨酸处。
35.权利要求31的方法，其中测定步骤包括免疫测定。
36.权利要求31的方法，其中所述测定步骤包括RT-PCR。
37.权利要求31的方法，其中所述神经退行性病症的特征在于淀粉样肽在脑中的沉积。
38.权利要求31的方法，其中所述神经退行性病症选自阿尔茨海默病(AD)、轻度认 知损伤、帕金森病、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明包涵体病 (NIHID)、路易体痴呆、唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层 基底退化、拳击员痴呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二 氏病、尼曼-皮克病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、亨 廷顿病、皮克病和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。
39.诊断个体中的神经退行性病症的方法，所述方法包括以下步骤 (i)从个体获得生物样品；( )测定所述样品中 Κ2多核苷酸或多肽的水平；(iii)将步骤(ii)的样品中 Κ2的水平与正常生物样品中 Κ2的水平进行比较，从 而诊断所述个体中的神经退行性病症。
40.权利要求39的方法，其中所述测定步骤包括免疫测定。
41.权利要求39的方法，其中所述测定步骤包括RT-PCR。
42.权利要求39的方法，其中所述测定步骤包括测定 Κ2激酶活性。
43.权利要求39的方法，其中所述神经退行性病症的特征在于淀粉样肽在脑中的沉积。
44.权利要求39的方法，其中所述神经退行性病症选自阿尔茨海默病(AD)、轻度认 知损伤、帕金森病、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明包涵体病(NIHID)、路易体痴呆、唐恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜银颗粒痴呆、皮层 基底退化、拳击员痴呆、弥散性神经原纤维缠结、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二 氏病、尼曼-皮克病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、亨 廷顿病、皮克病和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。
全文摘要
本发明提供了对于诊断神经退行性病症例如阿尔茨海默病的诊断具有重要意义的Stat3和Tyk2靶标。Stat3和Tyk2也是用于神经退行性疾病的药物开发的重要靶标。
文档编号G01N33/566GK102112879SQ200880130414
公开日2011年6月29日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者万峻, 傅洁瑜, 叶玉如, 王学荆, 邬振国 申请人:生物科技研究有限公司