纤维支架材料、其制备方法、及亚甲蓝负载量的调节方法与流程

本发明属于可用于神经退行性疾病治疗的支架材料的制备领域，尤其涉及一种具有优越的神经退行性疾病治疗性能的纤维支架材料、其制备方法、及亚甲蓝负载量的调节方法，主要应用于神经再生医学领域。

背景技术：

阿尔茨海默病(ad)是一种慢性中枢神经系统退行性疾病，一般表现为神经元的坏死，β淀粉样蛋白(aβ)沉积和tau蛋白过度磷酸化。目前治疗方法主要有干细胞移植，利用干细胞的增殖和分化潜能补充缺失的神经元，但是移植的干细胞增殖率和分化率都很低，一方面患者脑内存在毒性物质，例如aβ和病变的tau蛋白，另一方面移植的干细胞缺乏可以支持其增殖或分化用的基底。

目前主要采用各种形式的支架材料，例如静电纺丝纳米纤维支架。为提高细胞存活率或分化率，一般采用在支架上负载生长因子或分化因子，或者移植转基因干细胞，但是支架上负载因子后不利于保存和运输，而转基因干细胞会增加细胞癌变概率。亚甲蓝是一种正在研发的治疗ad的药物，目前的研究表明亚甲蓝患者脑内的毒性物质，例如能够促进aβ清除，并减弱tau蛋白病变。但是单独使用亚甲蓝不能补充受损的神经元。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种纤维支架材料、其制备方法、及亚甲蓝负载量的调节方法，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例公开了一种纤维支架材料，包括基体以及负载于基体表面的亚甲蓝，所述基体包括纤维支架、以及包被于所述纤维支架表面的氧化石墨烯。

优选的，在上述的纤维支架材料中，所述纤维支架为plga纳米纤维支架。

相应的，本发明还公开了一种纤维支架材料的制备方法，包括步骤：

(1)通过静电纺丝方法制备纤维支架；

(2)将氧化石墨烯通过物理吸附方法包被到纤维支架表面；

(3)通过物理吸附将亚甲蓝负载到氧化石墨烯包被的纤维支架上。

优选的，在上述的纤维支架材料的制备方法中，所述物理吸附包括π-π共轭作用和/或静电作用。

优选的，在上述的纤维支架材料的制备方法中，所述步骤(1)中，将plga溶解于四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液中，制备静电纺丝前驱体溶液；采用静电纺丝方法制备plga纳米纤维支架，然后采用等离子体进行处理。

优选的，在上述的纤维支架材料的制备方法中，所述步骤(2)中，将氧化石墨烯分散到去离子水中，获得氧化石墨烯溶液，然后将纤维支架浸泡在氧化石墨烯溶液中，取出干燥后获得氧化石墨烯包被的纤维支架。

优选的，在上述的纤维支架材料的制备方法中，所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.1g/l～1.0g/l，尤其优选为0.5g/l。

本发明实施例还公开了一种纤维支架材料表面亚甲蓝负载量的调节方法，在纤维支架材料表面先物理吸附氧化石墨烯，然后再通过物理吸附方法负载亚甲蓝，通过提高氧化石墨烯的用量来增加亚甲蓝的负载量。

优选的，当所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.5g/l或1.0g/l时，亚甲蓝负载量接近最大，约为1.56±0.12ng/cm²。

与现有技术相比，本发明的优点包括：通过改变氧化石墨烯的浓度，使纳米纤维上包被的氧化石墨烯的量不同，而通过π-π堆垛、静电作用等物理作用吸附在支架材料上的亚甲蓝的量也不同。从而治疗处于不同阶段的ad病变，使其既能够清除患者脑内毒性物质，又能补充受损的神经元。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为本发明具体实施例中纤维支架材料的制备流程图；

图2a所示为本发明具体实施例中不同浓度氧化石墨烯包被的纳米纤维膜的扫描电镜图；

图2b所示为本发明具体实施例中包被于纤维支架上氧化石墨烯的拉曼特征峰；

图2c所示为本发明具体实施例中纤维支架材料总亚甲蓝释放量；

图2d所示为本发明具体实施例中纤维支架材料中氧化石墨烯的拉曼特征峰；

图3a所示为本发明具体实施例步骤三中细胞活性的示意图；

图3b所示为本发明具体实施例步骤三中共聚焦显微镜采集图片；

图4所示为本发明具体实施例步骤四中纤维支架材料对tau蛋白磷酸化的抑制作用示意图。

具体实施方式

本发明实施例提供一种更好的能够负载干细胞，并能清除患者脑内毒性物质的支架材料及其制备方法。利用氧化石墨烯特殊的化学结构以及对亚甲蓝超强的吸附性能，通过改变石墨烯的浓度而调控支架上亚甲蓝的负载量，制备出可控缓释亚甲蓝的氧化石墨烯-静电纺丝纳米纤维复合支架材料，该材料既可以清除患者脑内毒性物质，又能有效补充受损的神经元。

具体地，本发明实施例提供一种纤维支架材料，包括基体以及负载于基体表面的亚甲蓝，所述基体包括plga(聚乳酸羟基乙酸)纳米纤维支架、以及包被于所述plga纳米纤维支架表面的氧化石墨烯。

plga纳米纤维支架还可以为其他任意一种纤维支架。

本发明实施例还提供一种纤维支架材料的制备方法，包括步骤：

(1)通过静电纺丝方法制备plga纳米纤维支架；

(2)将氧化石墨烯通过物理吸附方法包被到plga纳米纤维支架表面；

(3)通过物理吸附将亚甲蓝负载到氧化石墨烯包被的plga纳米纤维支架上。

优选的，所述物理吸附包括π-π共轭作用、静电作用。

优选的，所述步骤(1)中，将plga溶解于四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液中，制备静电纺丝前驱体溶液；采用静电纺丝方法制备plga纳米纤维支架，然后采用等离子体进行处理。所述步骤(2)中，将氧化石墨烯分散到去离子水中，获得氧化石墨烯溶液，然后将plga纳米纤维支架浸泡在氧化石墨烯溶液中，取出干燥后获得氧化石墨烯包被的plga纳米纤维支架。其中氧化石墨烯溶液的浓度为1.0g/l与0.5g/l时对纤维膜的覆盖面积相当，几乎达到完全覆盖

本发明实施例还公开一种纤维支架材料表面亚甲蓝负载量的调节方法，在纤维支架材料表面先物理吸附氧化石墨烯，然后再通过物理吸附方法负载亚甲蓝，通过改变氧化石墨烯的用量以调节亚甲蓝的负载量。

当所述氧化石墨烯溶液的浓度为1.0g/l或0.5g/l时，亚甲蓝的负载量相当，约为1.56±0.12ng/cm²。

本发明通过下列实施例作进一步说明：根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

纤维支架复合材料的制备如图1的合成示意图所示，是通过物理吸附的方法将氧化石墨烯包被在纳米纤维表面，并通过物理作用将亚甲蓝负载在纳米复合材料上。

材料的详细制法分为三个部分：静电纺丝纳米纤维制备、表面包被不同浓度的氧化石墨烯、负载不同量的亚甲蓝。具体步骤如下：

步骤一，不同浓度氧化石墨烯包被的静电纺丝纳米纤维的制备：

3gplga溶解于20ml四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶液(3/1,v/v)，用 超声清洗仪超声溶解10min(53w，sk、1200h，上海kudosinc.)。

plga溶液通过bgg40/2(北京高科生物技术有限公司)在10kv高压下以0.25ml/h的速率纺织到覆盖有玻璃基底的金属接收器上。喷射器和接收器之间的距离为20cm。真空干燥两天后，plga纳米纤维用等离子体处理30s。

单层的氧化石墨烯是通过hummer’s法制备的。然后将氧化石墨烯分散到去离子水中(浓度1.0g/l、0.5g/l、0.25g/l、0.1g/l)，再将材料浸泡在氧化石墨烯溶液中15min，然后将基底材料放在真空干燥箱里干燥6h。扫描电镜照片显示氧化石墨烯包被在静电纺丝纳米纤维膜表面(图2a)，拉曼光谱也检测到氧化石墨烯的拉曼特征峰(图2b)。

步骤二，可控缓释亚甲蓝的氧化石墨烯-静电纺丝纳米复合支架材料的制备和表征：

将氧化石墨烯包被的纳米纤维支架材料浸泡在0.5g/lmb溶液中2h。将材料用pbs溶液清洗3次后，真空干燥过夜后用扫描电镜观察表面形态。mb的缓释是检测面积约为635mm²纳米纤维上mb在不同的时间点(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天)在脑脊液模拟液中的释放。总mb释放量如图2c，mb在材料上的缓释结果如图2d。

步骤三，可控缓释亚甲蓝的氧化石墨烯-静电纺丝纳米复合支架材料用于神经前体细胞培养：

神经前体细胞接种到聚赖氨酸(pdl)和层粘连蛋白(laminin)包被的plga，plga-go，plga-go-mb纳米纤维支架上以密度为5×10⁴每孔接种到48孔板里。用wst-1测定在不同的时间点里(1、3、5、7天)的细胞活性，结果如图3a所示。为了考察npc在材料上的分化行为，单个神经前体细胞被接种到pdl和laminin包被的基底上培养24h后，添加神经分化培养基培养6天，每3天换一次液。其中分化培养基的组成是在不含有egf和bfgf的neurobasalmedium中添加b27(1:100)和2nml-谷氨酸。之后细胞用4％多聚甲醛固定，用anti-betaiiitubulinantibody和cy3-标记的二抗进行免疫染色，然后用共聚焦显微镜采集图片(图3b)。

步骤四，可控缓释亚甲蓝的氧化石墨烯-静电纺丝纳米复合支架材料减弱tau蛋白磷酸化：

将用慢病毒构建的过表达tau蛋白的神经前体细胞接种到复合材料上，用3nm冈田酸诱导tau蛋白过度磷酸化，结果发现mb能显著抑制tau蛋白磷酸化(图4)。

综上所述，本发明方法优点在于：可以通过改变氧化石墨烯的浓度来调节亚甲蓝的负载量，并且可以同时实现ad患者脑部有害物质的清除和受损神经元的补充。该方法制备的材料已显现出抑制tau蛋白病变的效果。并且该材料易于保存和运输，并且制备方法简单成本低，排除了负载生长因子的缺陷。

还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。