一种脱细胞组织膜的制备方法与流程

本发明涉及一种脱细胞组织膜的制备方法,它是一种以哺乳动物组织膜为原料加工成医用材料的方法，该材料可用于组织工程支架、组织膜修补材料和医用敷料等的制备。
背景技术：
：脱细胞组织膜材料作为医疗器械在医疗领域广泛应用，例如生物补片、创面敷料、创口修复材料、组织修复支架等。用于制备脱细胞组织的原材料来源广泛，比如人体皮肤、动物皮肤、腹腔膜、体腔膜、肌腱、小肠粘膜、羊膜、血管、心包膜等。脱细胞组织膜制备大致方法是将新鲜的组织通过物理、化学或者生物的方法脱除组织的细胞成分（如dna、蛋白质、多糖），降低材料的免疫原性，保留下组织的胞外基质，主要由胶原、氨基聚糖、蛋白聚糖、弹性蛋白等组成，对细胞组织起支持、保护、提供营养、细胞分化、细胞运动迁移、细胞识别、细胞黏着和通信联络等作用，甚至有报道称其中可以保留一定含量的生长因子，如血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子和成纤维细胞生长因子，使其在组织的修复和重建过程中发挥重要作用。脱细胞组织制备方法有很多种。中国专利cn103191466b公开的脱细胞组织操作方法简单，但其中组织保存步骤所需时间长达1～12个月，导致整个加工艺耗时太长。cn103432627b采用碱泡、核糖核酸酶消化、α-半乳糖苷酶、病毒灭活、灭菌等步骤，能很好地去除细胞成分和α-gal抗原，但其中的核糖核酸酶和α-半乳糖苷酶等酶制剂价格昂贵，处理起来成本高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种脱细胞组织膜的制备方法，采用常规的一些试剂材料，经简单的加工步骤得到脱细胞组织。本加工工艺具有抗原去除彻底，加工周期短的特点，所用试剂价格便宜易获得，组织结构破坏小，具有有利于组织细胞生长的孔隙，有助于提升细胞贴附生长，在临床上有利于组织再生。本发明提供的脱细胞组织膜的制备方法具体包括以下步骤：1)组织修剪：去除组织膜上脂肪组织，冲洗干净血渍。2)碱液浸泡：将修剪后的组织放入碱液浸泡裂解细胞，然后取出用酸中和后清洗干净。3)表面活性剂溶液浸泡：将中和清洗后的组织放入表面活性剂溶液中，以充分浸出杂蛋白。4)蛋白复性溶液浸泡：将组织膜放入蛋白复性溶液中浸泡进一步去除杂蛋白，然后清洗干净。5)有机溶剂浸泡：将组织膜放入有机溶剂中浸泡去除脂质，然后通过水或亲水性有机溶剂与水组合清洗掉有机溶剂。6)组织孔隙制备：将组织膜放入碱溶液中浸泡以产生空隙，然后进行中和。7)交联：利用交联剂与抗原位点的氨基、羟基、羟基等发生反应，进一步降低脱细胞组织的抗原性，或提升脱细胞组织的降解周期，或提升脱细胞组织的拉伸强度。8)灭菌：将上述步骤的得到的组织膜片，以（通常的方法）湿性状态进行辐射灭菌；或者以冻干的形式（通常的方法）进行辐射灭菌或eo灭菌。本方法没有使用一些价格昂贵的酶去除细胞和α-gal抗原，大大降低成本，也可达到很好的去除效果。步骤1)中所采用的组织包括来人类、哺乳动物（猪、牛、羊等）的真皮组织、血管、消化腔道、脏器膜、体腔膜等。步骤2)中所用碱包括但不限于氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙等，所用的浓度为0.001m～5m，优选0.01m～1m，浸泡时间5min～5h，优选10min～2h。步骤2)中所用的酸包括但不限于磷酸、醋酸、柠檬酸、盐酸、硫酸、硫酸氢盐、草酸、苯甲酸、苯乙酸，甲酸等。步骤3)中所用表面活性剂溶液成分包括表面活性剂、缓冲盐、无机盐、巯基化合物等中一种或多种成分。其中表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、tritonx-100等中的一种或多种，浓度为0.1%～5%，优选为0.5%～4%。缓冲盐包括tris-hcl、氨盐、磷酸盐、醋酸盐等中的一种或多种，浓度为1mm～1m，优先5mm～500mm。无机盐包括但不限于氯化物、硫酸盐、硝酸盐等一种或多种，浓度为1mm～100mm，优选2mm～50mm。巯基化合物包括但不限于β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等，浓度为0.5mm～20mm，优选1mm～5mm。表面活性剂溶液的ph值在5～9之间，优选为6～8。浸泡时间为0.5d～7d，优选1d～5d。浸泡温度为10℃～40℃，优选为18℃～30℃。步骤4）中蛋白复性溶液成分包括但不限于尿素、盐酸胍中至少一种。所用尿素浓度为4m～10m，优选浓度为6m～8m；浸泡时长为1h～5h，优选2h～4h；浸泡温度为4℃～40℃，优选为20℃～30℃。所用盐酸胍浓度为1m～5m，优选浓度为2m～4m；浸泡时长为1h～5h，优选2h～4h；浸泡温度为4℃～40℃，优选为20℃～30℃。步骤5）中所用的有机溶剂包括但不限于亲水性和亲油性有机溶剂中一种或多种。亲水性有机溶剂包括但不限于甲醇，乙醇，乙二醇，丙酮，正丙醇，异丙醇，丙二醇，丙三醇，丁醇等，亲油性有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯，甲苯，石油醚，丁酸乙酯、醋酸戊酯、丁酸戊脂、乳酸乙酯等。步骤6）中所用的碱为氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙等，所用碱的浓度为0.01m～5m，优选为0.5m～2m，浸泡时间为5min～10h，优选为10min～5h。不同碱浓度和浸泡时间调节孔隙大小，孔隙大小范围为10μm～400μm，优选为50μm～200μm。步骤7）中所用交联剂包括但不限于环氧类化合物，醛类，二酰二胺，二异氰酸酯，碳化二亚胺，酸酐等。所用浓度为0.1%～10%，优选为1%～5%。交联时长2h～48h，优选12h～30h。步骤2），3），6）和8）可以单独或组合作为病毒灭活步骤。上述的方法得到的脱细胞组织膜；其拉伸强度大于0.1mpa。该脱细胞组织膜的孔隙大小范围为10μm～400μm，优选为50μm～200μm。本发明提供了一种脱细胞组织膜的制备方法，采用常规的一些试剂材料，经简单的加工步骤得到脱细胞组织。该方法可以将人源或动物源组织膜中细胞、脂质、杂蛋白等抗原物质去除干净，同时又保留细胞外基质并产生合适的孔隙。本加工工艺具有抗原去除彻底，加工周期短的特点，所用试剂价格便宜易获得，组织结构破坏小，具有有利于组织细胞生长的孔隙，有助于提升细胞贴附生长，在临床上有利于组织再生。该方法制备的脱细胞组织膜可以作为组织工程支架、组织膜破损的修补材料以及创面敷料。附图说明图1表面结构的电镜扫描图。图2h&e染色和免疫组化检测结果。图3组织孔隙对细胞粘附生长的影响。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。实施例1一种脱细胞组织膜的制备方法：(1)取出6个月龄牛的腹腔膜，进行清洗；(2)组织修剪：以腹腔膜为原材料，用剪刀剪除脂肪组织等残留组织碎片，用纯化水冲洗干净血渍。(3)碱液浸泡：取上述清洗后的膜组织称取10g，加入100ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液中浸泡20min；取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为4%的醋酸溶液中浸泡10min，然后将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(4)表面活性剂溶液浸泡：表面活性剂溶液的配方为1%十二烷基硫酸钠、50mm醋酸钠、20mm氯化钾、10mm氯化镁、10mm氯化钠、5mm的β-巯基乙醇，用醋酸调节ph值至7.0；将上一步的膜放入100ml表面活性剂溶液中，浸泡2d，浸泡温度为26℃；然后更换浸泡液，再浸泡2d，浸泡温度为26℃。将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(5)盐酸胍溶液浸泡：配制2m的盐酸胍水溶液100ml，将上一步骤的膜放入盐酸胍溶液中，于25℃条件下浸泡2h。取出膜，放入纯化水清洗3次，每次5min。(6)脱脂处理:将上述步骤膜放入50%乙醇中浸泡1h；放入60%乙醇中浸泡1h；放入70%乙醇中浸泡1h；放入80%乙醇中浸泡1h；放入90%乙醇中浸泡1h；放入100%乙醇中浸泡1h；然后放入石油醚中浸泡2h；再更换100%乙醇浸泡1h；更换90%乙醇浸泡1h；更换80%乙醇浸泡1h；更换70%乙醇浸泡1h；将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(7)交联：取上一步浸泡后的膜组织加入体积浓度为1％丁二醇缩水甘油醚的0.1m碳酸钠溶液中浸泡24h，温度控制为25℃。将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(8)灭菌：将膜放入复合塑料袋中，加入30ml生理盐水进行封装，用15kgy的剂量进行钴-60辐射灭菌。实施例2(1)取膜：取出6个月龄牛的腹腔膜，进行清洗；(2)组织修剪：以腹腔膜为原材料，用剪刀剪除脂肪组织等残留组织碎片，用纯化水冲洗干净血渍。(3)碱液浸泡：取上述清洗后的膜组织称取10g，加入100ml浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液中浸泡1h；取上述步骤浸泡后的膜组织加入质量浓度为4%的醋酸溶液中浸泡10min，然后将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(4)表面活性剂溶液浸泡：表面活性剂溶液的配方为1%十二烷基硫酸钠、50mm醋酸钠、20mm氯化钾、10mm氯化镁、10mm氯化钠、5mm的β-巯基乙醇，用醋酸调节ph值至7.0；将上一步的膜放入100ml表面活性剂溶液中，浸泡2d，浸泡温度为26℃；然后更换浸泡液，再浸泡2d，浸泡温度为26℃。将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(5)盐酸胍溶液浸泡：配制2m的盐酸胍水溶液100ml，将上一步骤的膜放盐酸胍溶液中，于25℃条件下浸泡2h。取出膜，放入纯化水清洗3次，每次5min。(6)脱脂处理:将上述步骤膜放入50%乙醇中浸泡1h；放入60%乙醇中浸泡1h；放入70%乙醇中浸泡1h；放入80%乙醇中浸泡1h；放入90%乙醇中浸泡1h；放入100%乙醇中浸泡1h；然后放入石油醚中浸泡2h；再更换100%乙醇浸泡1h；更换90%乙醇浸泡1h；更换80%乙醇浸泡1h；更换70%乙醇浸泡1h；将膜取放入纯化水清洗3次，每次5min。(7)组织孔隙处理：将制备的膜放入1m的氢氧化钠，浸泡时间为1h。(8)交联：取上面浸泡后的膜组织加入体积浓度为1％乙醛的磷酸盐缓冲溶液（ph=7.0）中进行，反应温度为25℃，交联24h。将膜取出放入纯化水清洗3次，每次5min。(9)冻干与灭菌：将上述得到的组织膜在-40℃～-5℃范围内冷冻真空干燥，冻干结束后将膜放入透析纸袋进行eo灭菌。对照例1:本实施例与实施例1的制备方法相比，其区别仅在于没有经过盐酸胍溶液浸泡的步骤。对照例2:本实施例与实施例1的制备方法相比，其区别在于没有经过脱脂处理的步骤。对照例3:本实施例与实施例2相比，其区别仅在于没有组织孔隙处理的步骤。对照例4:本实施例与实施例2相比，其区别仅在于组织孔隙处理步骤中浸泡时间为4h。效果例：通过实验例来考察本发明下述相关实施例及对照例制备的脱细胞组织膜各项性能：1.降解性能将实施例2，对照例3和对照例4制备的样品，放入于1m氢氧化钠溶液，在37℃条件下观察其降解情况，每隔1h观察其是否完全降解。降解情况见表1。表1体外降解情况组别降解时间实施例25h对照例38h对照例41h结论：组织孔隙制备处理过程所用时间越久，其体外降解的时间就越短。2.拉伸强度将实施例2、对照例3和对照例4的制备的样品裁剪为用哑铃型模具制成待检测的样品条，中间窄处宽度为5mm(w)，两端宽处宽度为10mm。将哑铃型样品的两端分别固定于拉力机的两个夹具上，测量补片的中间窄处的厚度(t)，然后开动拉力试验机，以500mm/min的速度拉伸直至待测样品断裂。记录断裂力（f）。拉伸强度=f/(wt)。表2拉伸强度测量结果组别拉伸强度mpa实施例22.3±0.3对照例34.8±0.4对照例40.4±0.2结果分析：组织孔隙处理过程所用碱时间越长，样品的拉伸强度，这一结果与降解性能具有相关性。3.材料孔径大小及对细胞粘附效果的影响。将实施例2和对照例3制得的样品孔径用扫描电镜进行表面扫描，测量表面孔径大小。结果见表3。实施例2和对照例3的电镜结果见图1。表3孔径测量结果组别孔径（μm）孔径范围（μm）实施例286.2±23.631-184对照例3未观察到明显孔径/结果分析：从结果上看，组织孔隙处理步骤有助于组织孔隙的生成。4.脂肪含量将实施例1和对照例2制备得到的样品进行脂肪含量检测。脂肪含量的按下列步骤进行：准确称取两组样品1.00g并置具塞锥形瓶中，同时设置空白对照组加乙醚10ml密塞，不定时振荡，放置约2小时后，将乙醚液倾倒至用乙醚润湿的滤纸上，滤过,残渣用乙醚10ml照上法处理，再用乙醚5ml洗涤残渣，合并滤液及洗液至已恒重的蒸发皿中，使乙醚自然挥散后，在105°c干燥2小时，精密称定遗留脂肪量。脂肪含量计算方法如下：表4脂肪含量测量结果组别脂肪含量实施例10.04%对照例20.52%结果分析：从结果来看，通过脱脂处理步骤，脂肪含量有了很大的降低。5.体外细胞毒检测结果将实施例1、实施例2制备的样品加入细胞培养基，按6cm2/ml于37℃条件下浸提24h，制备浸提液；将l929细胞消化后，分散在96孔板中，2000个/孔。置于37℃，5%二氧化碳条件下培养过夜（14-16）小时。第二天，弃掉96孔板中的培养基，加入浸提液或对照样品。置于37℃，5%二氧化碳条件下培养48h。待细胞汇合率为80%时，每孔加mtt20μl，置37℃孵育3小时，弃上清后加dmso150μl/孔。避光震荡10min后，酶标仪测量570nm和630nm的吸光度，计算各组细胞的相对增殖率，相对增殖率=实验组吸光度均值（od570-od630）/阴性对照组吸光度均值（od570-od630）×100%。结果见表5。表5体外细胞毒测量结果组别细胞增殖情况实施例1106%实施例294%结果分析：经过实施例1和实施例2制备得到的样品对细胞增殖没有明显的影响，没有明显的细胞毒性。6.抗原去除效果将未经过处理的牛腹腔膜、实施例1和对照例1制备的样品，制备出石蜡切片，然后进行he染色和免疫组化染色，其中免疫组化染色观察了两种常见抗原mch-ⅰ和α-gal的残留情况。结果见图2。结果分析：从h&e染色结果来看，经过加工工艺的处理，膜内组织结构条理整齐清晰，结构未受到破坏，未见到细胞结构。实施例1和对照例1相比，在抗原去除效果上更佳。实施例1工艺中虽然没有用到α-半乳糖苷酶，但α-gal去除效果良好。7.组织孔隙对细胞粘生长的作用将实施例2和对照例3中的样品用细胞培养基浸渍后，种入l929成纤维细胞，培养72h小时。取出膜组织用4%多聚甲醛固定1天后冻干，用扫描电镜观察l929细胞在表面微孔内的生长情况，结果见图3。结果分析：通过组织孔隙制备工艺后得到样品中的空隙有大量的成纤维细胞生长，没有孔隙的样品中细胞生长较少。而成纤维细胞的生长有助创面伤口的修复，因此具有合适孔径的脱细胞组织膜更适合临床应用。当前第1页12