天然软组织去细胞基质的制备方法与流程

本发明涉及临床医学、生物医学与再生医学技术领域，尤其是涉及一种天然软组织去细胞基质的制备方法。

背景技术：

组织由细胞和细胞外基质(ecm)组成，细胞外基质是由结构蛋白和功能性蛋白形成复杂的网架结构、支持并连接组织结构，对细胞的生理活动(迁移、分化和增殖)进行调节，完成特定的功能。

与金属、塑料等非动物来源的材料相比，细胞基质的成分和结构更接近人体组织，生物相容性更优异，这使之成为组织工程修复中应用最为广泛的材料。但由于细胞外基质的三维结构复杂，难以在体外重现与体内细胞外基质组成和结构一致的细胞外基质材料。通过去细胞技术将组织中的细胞成分除去，从而获得各种天然组织的细胞外基质，是目前制备天然组织细胞外基质的有效办法。

理想的去细胞基质材料制备方法应既能有效除去组织/器官中的细胞成分，最大程度地降低基质材料的免疫原性，又能最大程度的保持基质的三维结构和原始形态，最大程度的保留其中的有效活性分子，满足组织再生修复的要求。

去细胞的过程就是通过物理方法、化学方法或者生物酶等方法除去基质中的细胞。去细胞方法的有效性取决于细胞类型、组织致密程度、组织厚度和脂肪含量等。

而传统的组织去细胞基质制备工艺容易导致基质成分和三维结构被破坏，而且试剂残留严重，植入组织中可能引起严重的免疫排斥反应。且传统的组织去细胞基质制备工艺需要耗费大量的时间才能让化学去垢剂渗透至组织内部，作用于细胞，除去组织中的细胞成分，所以，去细胞效率较低。

针对现有技术中存在的上述问题，提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种天然软组织去细胞基质的制备方法，该方法去细胞效率高，对基质成分的破坏小，去细胞基质的免疫原性低，生物相容性好。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种天然软组织去细胞基质的制备方法，该方法包括：取材，预处理，消毒，脱脂，酶处理，去细胞，漂洗和灭菌步骤。

优选地，所述天然软组织包括小肠组织，血管组织，肌肉组织，心脏组织，瓣膜组织，肺组织，脾脏组织，肾脏组织，肝脏组织，胃组织，胆囊组织，脂肪组织，软骨组织，气管组织，食道组织，膀胱组织，输尿管组织，输卵管组织或子宫组织。

优选地，所述取材，预处理为将准备脱细胞的天然软组织用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液进行清洗，待用。

优选地，所述消毒为用过氧乙酸溶液、乙醇溶液、或新洁尔灭溶液中的一种或几种溶液的混合液进行浸泡，再用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液漂洗。

优选地，所述过氧乙酸溶液的浓度为0.01-0.3wt％；所述乙醇溶液的浓度为1-10％；所述新洁尔灭溶液的浓度为0.05-1wt％，所述浸泡时间为0.5-12h；所述生理盐水的浓度为0.9wt％；所述磷酸盐缓冲溶液ph值为7.2-7.8，浓度为0.01m。

优选地，所述脱脂为将所述天然软组织置于脱脂剂中0.5-12h；所述脱脂剂选自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一种或多种；所述脱脂剂的用量为所述天然软组织体积的1-30倍。

优选地，所述酶处理为将脱脂后的天然软组织置于含有生物酶的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中。

优选地，所述脱脂后的天然软组织置于含有生物酶的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中的时间为1-48h；所述生物酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；所述生物酶的浓度为0.1-10wt％。

优选地，所述去细胞为将经过脱脂及酶处理后的天然软组织置于含有化学去垢剂的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中。

优选地，所述化学去垢剂选自tritonx-100、tritonx-200、tween-20、tween-40、tween-60、脱氧胆酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或多种；所述化学去垢剂的浓度为0.1-5wt％。

上述方法制备的天然软组织去细胞基质。

本发明的有益效果如下：

1.脱脂处理可以将细胞膜中的脂质成分溶解除去，破坏细胞膜的完整性，有利于细胞内容物的释放，便于后续处理中将细胞内容物更彻底地除去，降低组织基质中的免疫原性。

2.生物蛋白酶处理可以特异性地作用于基质中的蛋白成分，削弱基质成分间相互作用，让后续的化学去垢剂更快渗透到基质内部，作用于基质细胞，从而缩短化学去垢剂渗透到基质中的时间，提高去细胞效率。

3.在生理盐水或磷酸盐缓冲溶液环境对基质进行去细胞处理，可以避免组织基质出现吸水/脱水状态，避免改变胶原纤维的构象和排列，这样能使组织有效地保持原始形态和三维结构，不仅能有效除去基质中细胞成分降低基质的免疫原性，更能有效保持组织基质的特定微观结构。

附图说明

图1a为实施例1中制备得到的猪小肠黏膜下层去细胞后的he染色图；

图1b为实施例4-1中制备得到的猪小肠黏膜下层去细胞后的he染色图。

图1c为实施例4-2中制备得到的猪小肠黏膜下层去细胞后的he染色图。

图1d为实施例4-3中制备得到的猪小肠黏膜下层去细胞后的he染色图。

图2为实施例1，实施例4-1，实施例4-2，实施例4-3的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

生物衍生材料是指天然生物组织经过特殊处理后形成的一种生物材料。近年来去细胞组织基质(acellulartissuematrix)越来越多的被用于生物衍生材料。

传统的组织去细胞基质制备工艺容易导致基质成分和三维结构被破坏，而且试剂残留严重，植入组织中可能引起严重的免疫排斥反应。且传统的组织去细胞基质制备工艺需要耗费大量的时间才能让化学去垢剂渗透至组织内部，作用于细胞，除去组织中的细胞成分，所以，去细胞效率较低。

而脱脂处理可以将细胞膜中的脂质成分溶解除去，破坏细胞膜的完整性，有利于细胞内容物的释放，便于后续处理中将细胞内容物更彻底地除去，降低组织基质中的免疫原性；

生物蛋白酶处理可以特异性地作用于基质中的蛋白成分，削弱基质成分间相互作用，让后续的化学去垢剂更快渗透到基质内部，作用于基质细胞，从而缩短化学去垢剂渗透到基质中的时间，提高去细胞效率；

在生理盐水或磷酸盐缓冲溶液环境对基质进行去细胞处理，可以避免组织基质出现吸水/脱水状态，避免改变胶原纤维的构象和排列，这样能使组织有效地保持原始形态和三维结构，不仅能有效除去基质中细胞成分降低基质的免疫原性，更能有效保持组织基质的特定微观结构。

所以，本发明的发明人将上述手段应用于天然软组织去细胞基质。

天然软组织去细胞基质，以猪小肠黏膜下层为例包括如下步骤：

取材，预处理，消毒，脱脂，酶处理，去细胞，漂洗和灭菌步骤。

天然软组织包括小肠组织，血管组织，肌肉组织，心脏组织，瓣膜组织，肺组织，脾脏组织，肾脏组织，肝脏组织，胃组织，胆囊组织，脂肪组织，软骨组织，气管组织，食道组织，膀胱组织，输尿管组织，输卵管组织或子宫组织。

在一个优选的实施方式中，预处理为将准备去细胞的天然软组织用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液进行清洗，待用。

在另一个优选的实施方式中，消毒为用过氧乙酸溶液、乙醇溶液或新洁尔灭溶液中一种或几种溶液的混合液进行浸泡，再用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液漂洗。

在一个优选的实施方式中，过氧乙酸溶液的浓度为0.01-0.3wt％；

在一个优选的实施方式中，乙醇溶液的浓度为1-10％；

在一个优选的实施方式中，新洁尔灭溶液的浓度为0.05-1wt％，

在一个优选的实施方式中，浸泡时间为0.5-12h；

在一个优选的实施方式中，生理盐水的浓度为0.9wt％；

在一个优选的实施方式中，磷酸盐缓冲溶液ph值为7.2-7.8，浓度为0.01m。

在一个优选的实施方式中，脱脂为将选择的天然软组织置于脱脂剂中0.5-12h；

本发明中，作为典型但非限制性的天然软组织在脱脂剂中的放置时间为：0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12h。

在一个优选的实施方式中脱脂剂选自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一种或多种；

在一个优选的实施方式总，脱脂剂的用量为选择的天然软组织体积的1-30倍；

本发明中，作为典型但非限制性的脱脂剂的用量为选择的天然软组织体积的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30倍。

酶处理为将脱脂后的天然软组织置于含有生物酶的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中。

在一个优选的实施方式中，天然软组织置于含有生物酶的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中的时间为1-48h；本发明中，作为典型但非限制性的天然软组织置于含有生物酶的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中的时间可以为，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40h。

在一个优选的实施方式中，生物酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；在一个优选的实施方式中，生物酶的浓度为0.1-10wt％，本发明中，作为典型但非限制性的生物酶的浓度，还可以为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10wt％。

在一个优选的实施方式中，去细胞为将所述组织置于含有化学去垢剂的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中。

在一个优选的实施方式中，化学去垢剂选自tritonx-100、tritonx-200、tween-20、tween-40、tween-60、脱氧胆酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或多种；化学去垢剂的浓度优选为0.1-5wt％。

漂洗采用浓度为0.9wt％的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液进行漂洗24-96h。

将漂洗干净后的天然软组织基质用γ射线进行辐照，辐照剂量为25kgy。

实施例1

对天然软组织进行去细胞处理得到去细胞基质，以猪小肠黏膜下层为例，包括如下步骤：

取材：取猪小肠空肠段，用浓度为0.9wt％的生理盐水清洗干净；

预处理：小心剥离并除去猪小肠肠壁中的浆膜层、基层，刮除黏膜层，得到猪小肠黏膜下层，用浓度为0.9wt％的生理盐水清洗干净；

消毒：用含有0.02wt％过氧乙酸和5％乙醇的溶液浸泡1h，用浓度为0.9wt％生理盐水漂洗干净；

脱脂：将消毒后的猪小肠黏膜下层置于脱脂试剂中4h，脱脂试剂选用三氯甲烷，脱脂试剂总体积为猪小肠黏膜下层体积的30倍；

酶处理：将脱脂后的猪小肠黏膜下层置于含有胰蛋白酶的生理盐水中12h，溶液浓度为0.25wt％，用浓度为0.9wt％生理盐水漂洗；

去细胞：将酶处理后的猪小肠黏膜下层置于含有化学去垢剂十二烷基磺酸钠的生理盐水中24h，其中十二烷基磺酸钠浓度为0.3wt％，用浓度为0.9wt％生理盐水漂洗；

漂洗：用浓度为0.9wt％生理盐水漂洗经过上述各步骤处理的猪小肠黏膜下层48h；

灭菌：将漂洗干净后的猪小肠黏膜下层去细胞基质用γ射线进行辐照，辐照剂量为25kgy。

将实施例1中的脱脂，酶处理，去细胞三个步骤中的时间及试剂优化如下表1-3所示：

与实施例1的步骤和条件相同，不同的是脱脂步骤的时间，酶处理步骤的时间，去细胞步骤的去垢剂浓度和时间，具体情况如表1所示，

表1

与实施例1的步骤和条件相同，不同的是，脱脂步骤的时间，酶处理步骤的胰蛋白酶浓度和时间，去细胞步骤的时间，具体情况如表2所示，

表2

与实施例1的步骤和条件相同，不同的是，脱脂步骤的时间，酶处理步骤的时间，去细胞步骤的时间，化学去垢剂的选择，具体情况如表3所示，

表3

实施例5

参考国家标准yy/t0606.25-2014分别对未经去细胞处理的猪小肠黏膜下层与实施例2-1至4-3的去细胞处理后的猪小肠黏膜下层进行了dna残留量检测，未经去细胞工艺处理的猪小肠黏膜下层的dna残留量为696.53ng/mg，实施例2-1至4-3的测试结果如表4所示，经上述去细胞工艺处理后，猪小肠黏膜下层基质中的dna残留量显著降低。

表4不同工艺参数猪小肠黏膜下层dna残留量

实施例6

对实施例1和实施例4-1、4-2、4-3中去细胞处理后的猪小肠黏膜下层基质进行he染色，如图1a、图1b、图1c、图1d所示，，染色结果表明，实施例1和实施例4-1、4-2、4-3中处理后的猪小肠黏膜下层中基本看不到细胞了，镜下并未观察到明显差异。说明该工艺均可有效除去猪小肠黏膜下层基质中的细胞，降低基质的免疫原性。

实施例7

对实施例1和实施例4-1、4-2、4-3进行聚丙烯酰胺凝胶电泳表征(sds-page)，如图2所示。sds-page结果显示，实施例1中的75kda条带较弱，可能是该条带位置中的蛋白丢失，而实施例4-1、4-2、4-3的蛋白条带位置及数量基本一致，且未见条带弥散现象出现，说明该处理工艺并未造成基质蛋白的降解，且效果优于实施例1。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。