放射性核素标记的rgd多肽药物及其制备方法

专利名称：放射性核素标记的rgd多肽药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤诊断及治疗的放射性药物，特别涉及用于integrin avp3阳性 肿瘤诊断和治疗的放射性核素标记的RGD多肽药物及其制备方法。
背景技术：
肿瘤生长过程中关键的一环是肿瘤血管生成。没有新的血管生成肿瘤在长 到几个厘米大小之后便不能再继续生长。肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控， 其中包括integrin av(33。 integrin av|33是一种细胞外基质受体，它是由a和卩两个 亚基组成的异源二聚体跨膜糖蛋白。integrin av(33是整合素家族重要的组成成员， 作为与新生血管相关的分子标志物之一，它高表达在新生血管内皮细胞表面和 某些肿瘤细胞表面(成神经细胞瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌 等)，而在已存在的血管和正常组织中不表达或表达很低。integrin avp3在肿瘤生 长和转移过程中的高度限制表达，使其成为一个非常有吸引力的靶点，用于肿 瘤的诊断和治疗。
研究证实含有RGD(Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配体与 integrin ^(33具有高亲和力和特异性。不同放射性核素标记的RGD序列配体，如 RGD环肽二聚体和四聚体等已被用于肿瘤的显像和治疗研究。RGD 二聚体或四 聚体比其单体具有更高的integrin av(33亲和力，主要源于两个因素， 一是两个 RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin av|33相结合，或者是一个RGD模 序与integrin av(33结合之后增加了细胞表面结合位点局部RGD浓度。如果两个 RGD模序之间的距离足够长，那么它们可以同时与integrinav卩3结合；如果两个 RGD模序之间的距离不是足够长，那么它们只能增加局部RGD浓度。目前报 道的RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]2 (E代表谷氨酸，c代表环化，R代表精氨 酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x为f或y，分别代表苯丙氨酸或酪氨酸)， 其两个RGD模序之间的距离为6个键，由于距离不够长，因此E[c(RGDxK)h 的两个RGD模序很难同时与细胞表面相邻的两个integrin av(33受体结合(参见图 1)。从这个意义上讲，两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin av(33
5相结合具有更重要的作用。为此，有必要提出新型的RGD多肽二聚体，使二聚
体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以能同时与细胞表面表达的相邻的 integrin otvp3受体相结合，增强RGD多肽与integrin ctvp3的亲和力，提高肿瘤对 药物的摄取，并在此基础上发明用于integrin av|33阳性肿瘤诊断和治疗的放射性 药物，以达到更好的诊治效果。

发明内容
本发明的目的在于提供一种放射性核素标记的RGD多肽药物及其制备方法。 该药物首先将三个甘氨酸分子(G3， G-glycine)或四个聚乙二醇分子(PEG4， PEG =Polyethylene glycol)与RGD单体连接，然后再将此二聚化，使二聚体分子中的 两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin avp3受体相结合(参见图2)，即以双价形式与integrin (33结合，这样会进一步 增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊治效果。该药物通过 MAG2 (S-Acetyl-Mercaptocacetyl-glycyl-glycine， 61H戈乙酰-甘氨酸-甘氨酸)或 N》2或N3S等双功能螯合剂将放射性核素99mTc或188Re标记到新型RGD环肽 二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利 用核医学的单光子断层显像技术对integrin av(33阳性肿瘤进行显像诊断，还可以 通过放射性核素放射的P—粒子杀伤肿瘤细胞，对integrin av(33阳性肿瘤进行放射 靶向治疗。当通过MAG2或N》2或N3S等双功能螯合剂标记放射性核素99mTc 时，本发明放射性核素标记的RGD多肽药物用于对integrin avp3阳性肿瘤进行单 光子断层显像诊断。当通过MAG2或N2S2或N3S等双功能螯合剂标记放射性核 素188Re时，本发明放射性核素标记的RGD多肽药物用于integrin (^|33阳性肿瘤 的放射靶向治疗。
本发明的目的是通过如下技术方案实现
一种放射性核素标记的RGD多肽药物，包括RGD多肽、双功能螯合剂 (Chelator)和放射性核素(Nuclide),所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所 述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接 剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2， 所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD 环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM;所述 放射性核素标记的RGD多肽药物为Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所 述放射性核素标记的RGD多肽药物为无色透明液体针剂。所述放射性核素为"mTc。 所述放射性核素为188Re。 所述连接剂L为PEG4或G3。
所述药代动力学修饰分子PKM为G2或G3或G4或PEG4。 所述双功能螯合剂为MAG2或N2S2或N3S。
一种放射性核素标记的RGD多肽药物的制备方法，所述方法包括以下步骤
a、 L-c(RGDxK)的制备 (L-PEG4或G3)
将Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1 mL DMF(二甲 基甲酰胺)中，加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺,也为HOSu)和DCC(二环己基碳二 亚胺)，室温下搅拌反应2小时；将c(RGDxK)加入到上述反应液中，用DIEA(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加入3 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯 化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物经ESI-MS质谱分析确认 为预期产物Boc-L-c(RGDxK);将Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0 mL TFA(三氟乙酸) 中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓冲溶 液(pH = 7.0)，经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分， 合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK);
b、 E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5mLDMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10 小时；滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物；用3 mL CH2C12 溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓縮至l mL左右；缓慢逐滴加入到30 mL乙 醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物经NMR核磁谱 分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2;将Boc-E(OSu)2溶于无水1 mL DMF中，加 入L-c(RGDxK);使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18 半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确 认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2;用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分 钟，去除Boc-保护基团；粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并 收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2;
c、 PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备 (PKM = G2或G3或G4或PEG4)
将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2 mL DMF和H20的混合液 (l:l=v:v)，使用O.l NNaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；将反应液真
7空蒸千，得到粗产品并将之溶于2mLTFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产品 经ZorbaxC18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻 干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2;
d、 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Chelator =MAG2或N2S2或N3S)
将Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用 D正A(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻千；
e、 Nuclide画Chelator-PKM-E[L画c(RGDxK)]2的制备(Nuclide =99mTc或188Re)
配置lmL含40 mg葡庚糖，25-50 (ig Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶联物 和50吗SnCl2的PB (pH = 7.4)缓冲溶液于10 mL西林瓶中，然后加入10-50 (iL 放射性核素99mTc或188Re (20-50 mCi)， 10(TC水浴加热西林瓶，反应20-25分钟， 反应结束后室温冷却10分钟，制成放射性核素标记的RGD多肽药物 Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2。
所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱， 梯度淋洗36分钟，流速2.5 mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc， B为乙 睛；淋洗梯度设定为起始时90。/。A和10%B， 5分钟时85。/。A和15°/。B， 30分 钟时65% A和35% B， 32-36分钟时50% A和50% B。
本发明的有益效果
1、 在本发明放射性核素标记的RGD多肽药物，首先将三个甘氨酸分子(G3) 或四个聚乙二醇分子(PEG4)与RGD多肽单体连接，然后再将此二聚化，即合成 E[Grc(RGDxK)]2或E[PEG4-c(RGDxK)]2，这样两个RGD模序之间的距离就从6 个键增加到26个键或38个键，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够 长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrinctvp3受体相结合，即以双价形 式与integrinoM33结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取， 达到更好的诊治效果。
2、 本发明不仅在两个RGD模序之间引入G3和PEG4，同时在RGD多肽分 子与双功能螯合剂之间引入药代动力学修饰分子PKM ，即 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，以进-一步改善药代动力学性质，特别是从非肿 瘤组织的清除动力学。
3、 本发明中使用MAG2或N2S2或N3S等化合物作为双功能螯合剂，标记放射性核素99mTc用于单光子断层显像，标记放射性核素188Re用于肿瘤的放射 耙向治疗。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。


图1为结构改造前RGD环肽二聚体与integrin av|33受体结合示意图； 图2为结构改造后RGD环肽二聚体与integrin avp3受体结合示意图； 图3为RGD环肽二聚体及其"mTc标记物结构示意图； 图4为不同RGD多肽体外受体竞争结合分析；
图5为99mTc标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在神经胶质瘤摄取的对比； 图6为注射99raTc-MAG2-3PEG4-dimer后30 min神经胶质瘤动物模型的y显像图。
具体实施例方式
本发明实施例中所采用的材料Dicyclcohexylcarbodiimide (DCC， N，N'-二 环己基碳二亚胺)，N-hydroxysuccinimide (NHS ， N-羟基琥珀酰亚胺)， N,N-Diisopropylethylamine (DIEA， N,N-二异丙基乙胺)，N,N-Dimethylform amide (DMF， N，N-二甲基甲酰胺)，Trifluoroacetic a'cid (TFA，三氟乙酸)、MAG2 (S-Acetyl-Mercaptocacetyl-glycyl-glycine，硫代乙酰-甘氨酸-甘氨酸)、N2S2、 N3S 购自美国Sigma-Aldrich公司。环化RGD多肽单体c(RGDfK)]2购自美国Peptide International, Inc.公司。Na99mTc04洗脱液购自北京原子高科股份有限公司。188Re 核素购自美国PerkinElmer公司。 实施例1:
本实施例以放射性核素99mTc标记的RGD多肽药物 99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (简称99mTc-MAG2-3PEG4-dimer)及其制备 方法为例。
在"，c-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2中，RGD环肽二聚体是将连接剂 PEG4与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有PEG4的RGD多肽单体 二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素99mTc 通过一个双功能螯合剂MAG2标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚 体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PEG4，所述放射性核 素标记的RGD多肽药物为无色透明液体针剂。
该药物首先将四个聚乙二醇分子(PEG4， PEG = Polyethylene glycol)与RGD
9单体连接，然后再将此二聚化合成新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]2，使二 聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相 邻的integrin av(33受体相结合(参见图2)，即以双价形式与integrin av|33结合， 与现有技术RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]2的两个RGD模序很难同时与细胞表 面相邻的两个的integrin av(33受体结合(参见图l)相比，新型RGD环肽二聚体 E[L-c(RGDxK)]2两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin 0^3相结合 具有更重要的作用，进一步增强了结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更 好的诊治效果。
该药物通过MAG2作为双功能螯合剂将放射性核素99mTc标记到新型RGD 环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的耙向作用浓聚到肿瘤部位， 利用核医学的单光子断层显像技术对integrin avp3阳性肿瘤进行显像诊断。 99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2制备方法如下 预先配备Zorbax C18半制备柱，HPLC方法一使用LabAlliance HPLC 系统，配备Zorbax C18半制备柱(9.4 mm x 250 mm, 100 A pore size),梯度淋洗 36分钟，流速2.5 mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc (pH 5.0)， B为乙 腈。淋洗梯度设定为起始时90。/。A和10%B， 5分钟时85。/oA和15%B， 30分 钟时65% A和35% B，. 32-36分钟时50% A和50% B。
PEG4-c(RGDfK)的制备将Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保护的 PEG4-OH溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺,也为 HOSu) (3.5 mg, 0.03 mmol)和DCC(二环己基碳二亚胺)(6.2 mg, 0.03 mmol)，室温 下搅拌反应2小时。将c(RGDfK) (26.3 mg, 0.02 mmol)加入到以上反应液中，用 DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入 3 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)并过滤，滤液经Zorbax CI8半制备柱 (HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻 干。获得产品Boc-PEG4-c(RGDfK)约7.5 mg 。 ESI-MS质谱分析结果为 m/z=1665([M+H]+)， [C75H117N20O23]+理论值为1665.85。
将上述所得Boc-PEG4-c(RGDfK) (10 mg, 6 mol)加入到3.0 mL TFA (三氟乙 酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓 冲溶液(pH^7.0),经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时 间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品PEG4-c(RGDfK)约7.0 mg。
10ESI-MS质谱分析结果为m/z=1565.2([M+H]+)， [C7QH1()9N2()021]+理论值为 1565.80。
E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备将Boc-保护的谷氨酸(E) (0.247 g, 1.0 mmol)溶 于5mLDMF，加入NHS (0.253 g, 2.2 mmol)禾B DCC (0.453 g， 2.2 mmol)，室温 搅拌10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3 mLCH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至lmL左右。缓慢逐滴加入到 30mL乙醚中，析出白色沉淀，真空干燥得到产品0.27§。获得产物经'HNMR 核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu》。
将上述所得Boc-E(OSu)2(4.4 mg， 0.01 mmol)溶于无水1 mL DMF中，加入 PEG4-c(RGDfK) (5,28 mg, 0.03 mmol)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅 拌过夜，经ZorbaxC18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干， 得到15 mg白色粉末。经ESI-MS质谱分析确认为预期产物 Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2 。 ESI-MS质谱分析结果为m/z=1913.13([M+H]+)， [C86H138N21028]+理论值为1912.99。
用无水TFA浸泡上述产物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2 5分钟，去除Boc-保护 基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并 冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[PEG4-c(RGDfK)]2 。 ESI-MS 质谱分析结果为m/z^813.0([M+H]+)， [C81H13GN21026]+理论值为1812.99。
PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备将Boc-PEG4-OSu(5.1mg， lliumol)和 E[PEG4-c(RGDfK)]2(5 mg, 2.76 nmol)溶于2 mL DMF和H20的混合液(1 :l=v:v)， 使用0.1 N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。然后反应液真空蒸干， 得到粗产品，溶于2mLTFA，将溶液在室温下搅拌15分钟。产品经ZorbaxC18 半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间为16.4分钟时的馏分，合并收 集液并冻干。获得预期产品PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]J々2.4 mg，纯度大于95%。 ESI-MS质谱分析结果为m/z=2061.46([M+H]+)， [C92H151N22031]+理论值为 2061.1。
MAGrPEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (简称MAG2-3PEG4-dimer)的制备将 MAGrOSu (4 mg, 9.7 一mol)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfk)]2 (5 mg， 2.43 |iimol)溶于 2mLDMF(二甲基甲酰胺)和H20的混合液(l:l=v:v)，用D正A(N,N-二异丙基乙 胺)将pH调节到8.5-9.0，室温搅拌过夜；反应液经Zorbax CI8半制备柱HPLC(方
11法一)分离纯化，收集保留时间为19.5分钟时的馏分，合并收集液并冻干，得到
产物4.0mg (产率为33%)。 ESI-MS质谱分析结果m/z^ 176.95 ([M+2H]+/2)， [C105H164N24O35S]2+/2理论值为1177。
99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (""nt-MAG2-3PEG4-dimer)的制备 配置lmL含40 mg葡庚糖，25-50 jig MAG2-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶联物和50吗 SnCl2的PB (pH = 7.4)缓冲溶液于10 mL西林瓶中，然后加入10-50 放射性 核素99mTc (20-50 mCi)， IO(TC水浴加热西林瓶，反应20-25分钟，反应结束后 室温冷却10分钟，制成放射性核素标记的RGD多肽药物 99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (99mTc-MAG2-3PEG4-dimer)。
本发明的放射性核素标记的RGD多肽药物中，当连接剂L为G3、药代动 力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为99mTc-MAG2-GrE[Grc(RGDfK)]2 (99mTc-MAG2-3G3-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也
可以是G2或G4。
本发明的放射性核素标记的RGD多肽药物中，当双功能螯合剂为N2SJf， 本发明药物可以是99mTc-N2S2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (99mTc-N2S2-3PEG4-dimer) 或99mTc- N2S2-GrE[G3-c(RGDfK)]2(99mTc-N2S2-3Grdimer)，其制备方法同实施例 1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G2或G4。
本发明的放射性核素标记的RGD多肽药物中，当双功能螯合剂为N3S时， 本发明药物可以是99mTc-N3S-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (99mTc-N3S-3PEG4-dimer) 或"mTc-N3S-G3-E[G3-c(RGDfK)]2("，c-N3S-3Grdimer)，其制备方法同实施例1。 药代动力学修饰分子PKM也可以是02或G4
参见图3，图3为RGD环肽二聚体及其"nt标记物结构示意图。
对依据本发明方法制备的放射性核素标记的RGD多肽药物 99mTc-MAG2-3PEG4-dimer取样进行放射性HPLC分析(HPLC方法二使用 LabAllianceHPLC系统，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm x250mm， 300 Aporesize)，梯度淋洗30分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A 为25mMNH40Ac(pH5.0)， B为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90% A 和10% B， 5分钟时85% A和15% B， 15分钟时80% A和20% B， 20-25分钟 时50°/0 A禾B 50% B， 26-30回到基线梯度90% A和10% B淋洗)， 99mTc-MAG2-3PEG4-dimer的标记率>95%，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯 度>98%。MAG2-3PEG4-dimer与integrin avp3结合亲和力测定高表达integrin av|33的 U87MG人神经胶质瘤细胞作为实验样本，使用"I-c(RGDyK)作为integrin avp3 受体特异性结合的放射性配基，采用竞争结合实验测定MAG2-3PEG4-dimer的 IC50值(半抑制浓度)，并设 c(RGDyK) 、 MAG2-PEG4-c(RGDfK) (MAG2-PEG4-monomer)、 MAG2-GrE[G3-c(RGDfK)]2(MAG2-3Grdimer)、 HYNIC隱 PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (HYNIC-3PEG4-dimer)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (3PEG4-dimer)为对照。实验结果显示，c(RGDyK)、 MAG2-PEG4-monomer、 HYNIC-3PEG4-dimer、 MAG2-3PEG4-dimer、 MAG2-3G3-dimer和3PEG4-dimer竞 争'25l-c(RGDyK)与U87MG细胞结合的IC5o值分别为50.6 士 5.5 nM， 23.5 ±3.5 nM， 4.1士2.8nM， 3.9士l,2nM， 3.7士1.3nM禾口 4.6 ± 2.1 nM (如图4所示)，表 明MAG2-3PEG4-dimer、 MAG2-3Grdimer与integrin av(33的亲和力明显好于其 RGD多肽单体和现有二聚体(7.5 ± 2.3 nM)，说明改造后的RGD环肽二聚体能 以双价形式与integrin av(33结合。
99mTc-MAG2-3PEG4-dime在荷瘤裸鼠生物分布将荷U87MG人神经胶质 瘤BALB/c裸鼠随机分成若干组，每组4只。各组实验裸鼠分别经尾静脉注射 100 (-74kBq)不同的99mTc标记的RGD多肽，于注射后0.5小时，1.0小时和 2.0小时按组分别处死实验裸鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经 衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(。/。ID/g)。在U87MG人神经胶质瘤动 物模型中，肿瘤对99mTc-MAG2-3PEG4-dimer和99mTc-MAG2-3Grdimer的摄取 明显高于肿瘤对99mTc-HYNIC-dimer的摄取(图5)，注射后1 h肿瘤对 99mTc-MAG2-3PEG4-dimer禾卩99mTc-MAG2-3G3-dimer的摄取为肿瘤对 ""^c-HYNIC-dimer摄取的两倍，这与体外受体亲和力实验结果相一致，充分说 明99mTc-MAGr3PEG4-dimer、99mTc-MAG2-3Grdimer是以双价形式与integrin av(33 结合，而99mTc-HYNIC-dimer是以单价形式与integrin av(33结合。图6为荷U87MG 人神经胶质瘤裸鼠注射"mTc-MAG;r3PEG4-dimer后30 min的y显像图，注射后 30 min肿瘤清晰可见，除肾脏以外全身放射性本底较低(标记药物主要经肾脏排 泄)，更利于肿瘤的显像诊断。 实施例2:
本实施例以放射性核素188Re标记的RGD多肽药物 鹏Re-]VlAG3-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(简称'88Re -MAGr3PEG4-dimer)为例。
13在188Re -MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2中，RGD环肽二聚体是将连接剂 PEG4与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有PEG4的RGD多肽单体 二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素188Re 通过一个双功能螯合剂MAG2标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚 体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PEG4，所述放射性核 素标记的RGD多肽药物为无色透明液体针剂。
本实施例的放射性核素标记的RGD多肽药物为188Re -MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2，该药物通过双功能螯合剂MAG2将放射性核 素188Re标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的 靶向作用浓聚到肿瘤部位。本实施例中的放射性核素标记的RGD多肽药物用于 integrin avp3阳性肿瘤的放射靶向治疗。
本实施例的放射性核素标记的RGD多肽药物制备方法同实施例1。 本发明的放射性核素标记的RGD多肽药物中，当连接剂L为G3、药代动 力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为188Re-MAG2-GrE[Grc(RGDfK)]2 (l88Re-MAG2-3Grdimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也
可以是G2或G4。
本发明的放射性核素标记的RGD多肽药物中，当双功能螯合剂为N2S2时， 本发明药物可以是188Re-N2S2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (188Re-N2S2-3PEG4-dimer) 或188Re- N2S2-GrE[Grc(RGDfK)]2 (188Re-N2Sr3Grdimer)，其制备方法同实施例 1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G2或G4。
本发明的放射性核素标记的RGD多肽药物中，当双功能螯合剂为N3S时， 本发明药物可以是188Re-N3S-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (188Re-N3S-3PEG4-dimer) 或188Re-N3S-G3-E[G3-c(RGDfK)]2(188Re-N3S-3Grdimer)，其制备方法同实施例1。 药代动力学修饰分子PKM也可以是02或G4。
权利要求
1、一种放射性核素标记的RGD多肽药物，包括RGD多肽、双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，其特征在于所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2，所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM；所述放射性核素标记的RGD多肽药物为Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述放射性核素标记的RGD多肽药物为无色透明液体针剂。
2、 根据权利要求1所述的放射性核素标记的RGD多肽药物，其特征在于 所述放射性核素为99mTc。
3、 根据权利要求1所述的放射性核素标记的RGD多肽药物，其特征在于 所述放射性核素为188Re。
4、 根据权利要求2或3所述的放射性核素标记的RGD多肽药物，其特征 在于所述连接剂L为PEG4或G3。
5、 根据权利要求2或3所述的放射性核素标记的RGD多肽药物，其特征 在于所述药代动力学修饰分子PKM为G2或G3或G4或PEG4。
6、 根据权利要求2或3所述的放射性核素标记的RGD多肽药物，其特征在于所述双功能螯合剂为MAG2或N2S2或N3S。
7、 一种权利要求1所述的放射性核素标记的RGD多肽药物的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤a、 L-c(RGDxK)的制备 (L:PEG4或G3)将Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1 mL DMF(二甲 基甲酰胺)中，加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺,也为HOSu)和DCC (二环己基碳二 亚胺)，室温下搅拌反应2小时；将c(RGDxK)加入到上述反应液中，用 DIEA(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加 入3 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱 HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物经ESI-MS 质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK);将Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0 mL TFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)，经ZorbaxC18半制备柱HPLC方法分离纯化，收 集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期 产物L-c(RGDxK);b、 E[L-c(RGDxK)]2的制备将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5 mLDMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10 小时；滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物；用3 mL CH2C12 溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓縮至l mL左右；缓慢逐滴加入到30mL乙 醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物经〗H NMR核磁谱 分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2;将Boc-E(OSu)2溶于无水1 mLDMF中，加 入L-c(RGDxK);使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18 半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确 认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2;用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]2 5 分钟，去除Boc-保护基团；粗产品经ZorbaxC18半制备柱HPLC分离纯化，合 并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物 E[L-c(RGDxK)]2;c、 PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备 (PKM = G2或G3或G4或PEG4)将Boc-PKM-OSu禾B E[L-c(RGDxK)]2溶于2 mL DMF和H20的混合液 (l:l=v:v)，使用0.1 NNaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；将反应液真 空蒸干，得到粗产品并将之溶于2 mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产 品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并 冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2;d、 Chdator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Chelator =MAG2或N2S2或N3S)将Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用 DIEA(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；e、 Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Nuclide =99mTc或188Re)配置lmL含40 mg葡庚糖，25-50吗Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶联物 和50昭SnCl2的PB (pH = 7.4)缓冲溶液于10 mL西林瓶中，然后加入10-50 放射性核素Nuclide (20-50 mCi)， 10(TC水浴加热西林瓶，反应20-25分钟，反应结束后室温冷却10分钟，制成放射性核素标记的RGD多肽药物Nuclide-Chelator-PKM隱E[L-c(RGDxK)]2。
8、根据权利要求7所述的放射性核素标记的RGD多肽药物的制备方法， 其特征在于所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半 制备柱，梯度淋洗36分钟，流速2.5 mL/min，其中流动相A为25 mMNH4OAc， B为乙睛；淋洗梯度设定为起始时90。/。A和10%B， 5分钟时85。/。A和15%B， 30分钟时65% A和35% B， 32-36分钟时50% A和50% B。
全文摘要
本发明涉及放射性核素标记的RGD多肽药物及其制备方法，该药物包括RGD多肽、双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]₂，所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM；所述放射性核素标记的RGD多肽药物为Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂，所述放射性核素标记的RGD多肽药物为无色透明液体针剂。本发明用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的诊断和治疗。
文档编号A61K51/08GK101485891SQ200910077728
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者史继云, 凡 王, 兵 贾 申请人:北京大学