检测间充质干细胞的标记和采用该标记识别间充质干细胞的方法

专利名称：检测间充质干细胞的标记和采用该标记识别间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及检测、分离识别间充质干细胞、尤其是涉及在检测、分离识别间充质干细胞中使用的用于检测间充质干细胞的基因标记和多肽标记，以及采用所述标记检测、识别间充质干细胞的方法。
背景技术：
众所周知，间充质干细胞是存在于哺乳类的骨髓等处，分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的多能性干细胞。由于其分化的多能性，间充质干细胞作为以再生医疗为的目的多种组织的移植材料正受到人们关注(《基因医学》第4卷第2期(2000)p58-61)。最近，发表了关于间充质干细胞研究现状与展望的综述，作出了关于间充质干细胞的收集与培养的报告(实验医学、第19卷第3期(2月号)2001、p350-356)。此外，已有报道间充质干细胞也存在于脂肪组织中(Tissue Engineering，P.A.Zuk et al.，Multilineage cells from human adipose tissueimplications for cell-based therapies.7211-228，2001)。
近年，一些专利申请公开了关于间充质干细胞的培养、分化等内容。例如，特表平11-506610号公报中公开了关于在无血清环境下维持人间充质前体细胞生存的组和物及其方法，在特表平10-512756号公报中公开了关于为了诱导间充质干细胞的分化将其与由前列腺素、抗坏血酸、胶原细胞外基质等组成的骨诱导因子、分化付随因子、软骨诱导因子等生物活性因子相接触的方法，在特开2000-217576号公报中公开了关于在催乳激素或其等效物共存下培养多能性间充质细胞，使间充质细胞分化成脂肪细胞的方法。
首先，本发明人公开了一种通过在基底膜细胞外基质存在条件下或是在含有成纤维细胞增殖因子(FGF)等物质的培养基中培养间充质干细胞，使得间充质干细胞得以显著的增殖，并且发现能够维持其分化能力，与以前的培养方法相比获得了效果显著的间充质干细胞的培养方法(特开2003-52360号公报)。并且，公开了一种为了在采集间充质干细胞时在采集母体以安全并且容易方式进行采集，从口腔组织中分离采集间充质干细胞的方法(特开2003-52365号公报)。
近年，随着再生医疗的进展，由于其分化多能性，人们正关注于将间充质干细胞作为骨、软骨、肌肉、脂肪、齿周组织等多种组织的再生医疗性的移植材料。为了在组织的再生医疗中利用间充质细胞，首先，从活体组织中采集所述干细胞，使其增殖，尤其是必需使其分化增殖，从而进行组织的制备。间充质干细胞存在于骨髓或骨膜中，为了能在组织再生医疗中实现实用化，首先，必须要开发出能够安全地从所述组织中采集间充质干细胞的方法。而且，为了间充质干细胞在组织再生医疗中实现实用化，必须要开发出足以确保干细胞数量的技术。为了实现上述目的，重要的是开发出仍能维持所采集的间充质干细胞的分化能力的培养增殖技术。
通过上述内容，本发明人开发出一种实现在采集间充质干细胞时从采集母体中以安全且容易的方式采集的分离采集的方法。尤其是，本发明人开发了一种通过在基底膜细胞外基质存在条件下或是在含有成纤维细胞增殖因子(FGF)等物质的培养基中培养间充质干细胞，以维持其的分化能力的形式大量增殖间充质干细胞的方法(特开2003-52360号公報)。但是，为了使增殖培养的间充质干细胞在再生医疗中实用化，必须确认所培养的细胞是间充质干细胞，必须开发出检测、识别该间充质干细胞的方法。以前，在间充质干细胞中，无法对该细胞的特征标记基因进行鉴定。因此、为了使间充质干细胞在再生医疗中实现实用化解决的重要课题是必须要开发出鉴定间充质干细胞的标记基因，从而检测分离识别间充质干细胞的方法。
本发明提供了用于检测识别间充质干细胞的间充质干细胞检测用基因标记和间充质干细胞检测用多肽标记，用于检测该基因标记的PCR扩增用引物，以及采用该标记和该引物检测、识别间充质干细胞的方法。
本发明人为了发现检测间充质干细胞用的标记基因，对间充质干细胞中的各种基因的表达进行了比较，对构成标记的基因进行研究，结果发现，与序列表所示的13个基因相关的间充质干细胞与成纤维细胞之间的表达量存在差异，间充质干细胞中特异表达，发现这些基因是间充质干细胞检测用的标记，从而完成本发明。本发明含有用于检测该间充质干细胞标记基因的探针，和在检测该间充质干细胞标记基因时用于扩增被检细胞的该基因子的PCR所用引物。此外，本发明还含有本发明的间充质干细胞标记基因表达的多肽构成的用于检测间充质干细胞的多肽标记、用于检测该多肽标记的与该多肽标记特异结合的抗体。更优选本发明含有—种采用用于检测间充质干细胞标记基因的探针、与多肽标记特异结合的抗体的间充质干细胞识别方法和分离方法。
下面对完成本发明的过程进行说明，在各种干细胞中，间充质干细胞在骨、软骨、肌肉、脂肪、骨骼肌、心肌、血管、神经等许多组织中保持了分化能力，因此间充质干细胞作为再生用细胞有很大前景。但是，迄今为止未有过对间充质干细胞特征标记基因鉴定的描述。因此，本发明人为了确定间充质干细胞的特征标记基因，进行了积极地研究。也就是，本发明人首次开发，通过在FGF等存在下培养间充质于细胞，采用仍维持其分化能力的快速增殖方法，增殖间充质干细胞，在FGF等存在下培养由该方法获得的间充质干细胞与人成纤维细胞，从培养细胞中抽提mRNA，以该mRNA为模板，以DNA芯片(ィンサィト社insit公司)作为探针，通过DNA微阵列法对人源间充质干细胞与成纤维细胞中表达的基因进行比较。
9400个基因中有63个基因在间充质干细胞中显著高表达，141个基因显著低表达。其中87个基因表达量差别达3倍以上(29个基因在间充质干细胞中高表达、58个基因低表达)。从来源于三个个体的间充质干细胞以及来源于三个个体的成纤维细胞中抽提全RNA，以它们为模板，通过半定量的RT-PCR法对上述87个基因的表达量进行调查。其结果是大多数基因的表达量未发现差异。此外，由于不同个体的间充质干细胞，或成纤维细胞之间也存在表达量的差异，认为由个体差异引起表达差异的情形也是很多的。
根据RT-PCR，经确认间充质干细胞中高表达的是3个基因(组织因子途径抑制剂2(tissue factor pathway inhibitor 2)，2类主要组织相容性复合体DRβ3(majorhistocompatibility complex class2 DR beta 3)，丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂)、经确认低表达的基因有10种(基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease)1，XV-α型胶原酶(collagenase type XV alpha)，CUG三联体重叠RNA结合蛋白(CUG triplet repeat RNAbinding protein)，皮肤桥蛋白，蛋白质酪氨酸激酶7(蛋白tyrosine激酶7)，异柠檬酸脱氢酶2，Sam68样磷酸酪氨酸蛋白(Sam68样phosphotyrosine protein)，C-型凝集素超家族成员2，肾上腺髓质素，载脂蛋白D)。通过测定这13个基因的表达量，使得在短时间内便宜地对难以识别的间充质干细胞进行鉴定成为可能。尤其是，本发明中，进行基因检索的结果是，确认了在间充质干细胞或成纤维细胞中表达量存在差异的许多基因。由于这些基因构成了用于检测间充质干细胞的基因表记物，其通过构建成检测基因用探针，以微阵列或DNA芯片等形式能够用于检测间充质干细胞。

发明内容
本发明具体的是由下列物质构成的用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其具有序列表1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示的碱基序列的基因、和用于检测间充质干细胞的基因标记，其特征在于其为整联蛋白，ALPHA 6(ITGA6)基因，MRNA(NM_000210)；溶质载体家族20(PHOSPHATE TRANSPORTER)、成员1(NM_005415)基因；核糖核苷酸还原酶M2多肽(RRM2)，MRNA(NM_001034)基因；滤泡素抑制素(FOLLISTATIN)(FST)，转录变异体FST317，MRNA基因(NM_006350)；SPROUTY(DROSOPHILA)HOMOLOG 2(SPRY2)，MRNA(NM_005842)；RAB3B，成员RAS ONCOGENE FAMILY(RAB3B)，MRNA(NM_002867)基因；溶质载体家族2(FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)(NM_006516)基因；白介素13受体，ALPHA2(IL13RA2)，MRNA(NM_000640)基因；丝氨酸/苏氨酸激酶12(STK12)，MRNA(NM_004217)基因；MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT(S.CEREVISIAE)5(CE)(NM_006739)基因；甲状腺激素受体中间子INTERACTOR 13(TRIP13)，MRNA(NM_004237)基因；类驱动蛋白6(有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白)(K)(NM_006845)基因；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(CDK2-ASSOCIATEDDUAL(NM_005192)基因；染色体凝缩蛋白G(HCAP-G)，MRNA(NM_022346)基因；CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA(NM_001826)基因；胞质分裂蛋白质调节子1(PRC1)，MRNA(NM_003981)基因；细胞增殖周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA(NM_001786)基因；CDC20(细胞增殖周期20，酿酒酵母，同源基因)(CD)(NM_001255)基因；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONICLEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791)基因；微染色体维持缺陷蛋白(酿酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；细胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA(NM_001237)基因；胸苷激酶1，SOLUBLE(TK1)，MRNA(NM_003258)基因；和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(黑色素瘤，p16，抑制CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)(权利要求2)、和用于检测间充质干细胞的基因标记，其特征在于其为EGF-containing fibulin-like细胞外基质蛋白1(NM 018894)基因；人胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)mRNA(AU132011)基因；人克隆24775 mRNA序列(AA402981)基因；蛋白聚糖1，分泌颗粒(AV734015)基因；人胰岛素样生长因子结合蛋白5(AA374325)基因；溶质载体家族21(有机阴离子转运蛋白)，成员3(AF085224)基因；谷氨酰胺转移酶2(C多肽，蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷酰基转移酶)(AL552373)基因；抗血友病因子II(凝血酶)受体(M62424)；纤维蛋白溶酶原活化因子，鸟激酶NM_002658)基因；金属蛋白酶3组织抑制剂(Sorsby fundus dystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基质Gla蛋白(BF668572)基因；B-cell CLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要组织相容性复合体的不变多肽，II类相关抗原)(BG333618)基因；内收蛋白(adducin)3(γ)(AL135243)基因；溶质载体家族16(一元羧酸传送子)，成员4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂酰肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜结合蛋白质(BE858855)基因；脑源性神经营养因子(X60201)基因；或者载脂蛋白E(BF967316)基因(权利要求3)、和用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人WNT抑制因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ11175(FLJ11175)，MRNA(NM_018349)基因；人RHO GDP解离抑止剂(GDI)β(ARHGDIB)，MRNA(NM_001175)基因；人钾中间体/少量电导的钙活化(SMALL CONDUCTANCECALCIUM-ACTIVATE)(NM_021614)基因；人核因子(红细胞衍生物2)-类似物3(NFE2L3)，MRNA(NM_004289)基因；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA(NM_021643)基因；人CDNA 3′端与糖蛋白相类似的MUC18(AA302605)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ21841(FLJ21841)，MRNA(NM_024609)基因；人锌指蛋白185(LIM区域)(ZNF185)，MRNA(NM_007150)基因；细胞周期控制中涉及的SC1＝假定的转移-活化因子[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH酶(辅酶Q)1α子复合体，8(19K)(NM_014222)基因；酵母YEAST MCM10的人同系物；假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)PRO2249(PRO2)(NM_018518)基因；人胶原，VII型，α1(大疱性表皮松解症，DYSTRO(NM_000094)基因；人自分泌运动因子受体(AMFR)，MRNA(NM_001144)基因；人克隆24421 MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP586E1621(源自DKFZP586E1621克隆)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因(权利要求4)、和用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人RESERVED(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素结合酶E2C(UBE2C)，MRNA(NM_007019)基因；人CDNA FLJ10517FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G(AK001379)基因；人软骨连接蛋白1(CRTL1)，MRNA(NM_001884)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP434F2322(由克隆DKFZP434F2322获得)/CDS＝未知/GB(AL133105)；人，克隆MGC9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人GLIA成熟因子，γ(GMFG)，MRNA(NM_004877)基因人CDNAFLJ23095 FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA(NM_018410)基因；人IROQUOIS类同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA(NM_005853)基因；或者人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10540(FLJ10540)，MRNA(NM_018131)基因(权利要求5)、和用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人MRNA；CDNA DKFZP434C1915(由克隆DKFZP434C1915获得)基因；PARTIAL CDS/C(AL137698)；人微染色体维持缺陷型(酿酒酵母(S.CEREVISIAE))7(M)(NM_005916)基因；人动力蛋白，细胞质的，中间体多肽1(DNCI1)，M(NM_004411)基因；蛋白质基因产物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA(NM_006479)基因；人含有杆状病毒IAP重复序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR(NM_001168)基因；人UDP-N-乙酰基-ALPHA-D-半乳糖胺多肽N-乙酰基GAL(NM_004482)基因；人细胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA(NM_031966)基因；人FLAP结构特异性内切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有丝分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-类似物1(MA)基因(NM_002358)；人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人与泛素结合酶类似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人细胞色素P450类维生素A代谢蛋白(P450RAI-2)基因，(NM_019885)；人NIMA(从未有丝分裂基因A)相关激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形态生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNAFLJ10674 FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/GI(AK001536)基因；或者人着丝粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA(NM_001809)基因(权利要求6)、和用于检测间充质干细胞的基因标记基因，特征在于其是人MRNA；CDNA DKFZP564P116(FROM克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白质激酶(TTK)，MRNA(NM_003318)基因；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT 1，IMPORTINα1)基因(KPNA(NM_002266)；人聚合酶(DNA导向的)，θ(POLQ)，MRNA(NM_006596)基因；人ETS变异体基因5(ETS相关分子)(ETV5)，MRNA基因(NM_004454)；人含转化酸性卷曲螺旋蛋白(TRANSFORMING，ACIDIC COILED-COILCONTAINING蛋白)3(TAC)(NM_006342)基因；人驱动蛋白类似物1(KNSL1)，MRNA基因(NM_004523)；人着丝粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆END＝3′/GB＝AI12(AI123815)基因；人DISTAL-LESS HOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓细胞性白血病病毒癌基因同系物类似物2基因(NM_002466)；或者人血清剥夺反应(磷脂酰丝氨酸结合PRO(NM_004657)基因(权利要求7)、和用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI基因，大亚基(RNASEHI)，MRNA(NM_006397)；人ANILLIN(果蝇SCRAPS同系物)，肌动蛋白结合蛋白基因(NM_018685)；人H4组蛋白家族，成员G(H4FG)基因，MRNA(NM_003542)；人G蛋白连结受体37(内皮缩血管肽受体B型-(NM_005302)人泛素载体蛋白(E2-EPF)，MRNA基因(NM_014501)；人，类似于肿瘤差别表达1，克隆IMAGE3639252，(BC007375)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICALPROTEIN)MGC2577(MGC2577)，MRNA(NM_031299)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEXIN A3(ANXA3)，MRNA(NM_005139)基因；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，与核糖体蛋白L39类似，克隆MGC20168IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蝇)类似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)(权利要求8)、和用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人蛋白酶复合体(PROSOME，MACROPAIN)26S亚基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻译起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氢嘧啶酶-LIKE 3(DPYSL3)基因，MRNA)(NM_001387)；人ADAPTOR相关蛋白复合体1，SIGMA 2亚基(AP1S2)基因(NM_003916)；人网蛋白1，中间丝结合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人异种核蛋白U(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I类多肽相关序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相关蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受体膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚谷氨酸结合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人干扰素诱导的C型肝炎相关MICROTUBULARAG(NM_006417)基因；人蛋白激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亚基(NON-CATALYTIC SUBUN)基因(NM_002733)；人前胶原-脯氨酸，2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE(脯氨酸(NM_004199)；人血管内皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因产物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)(权利要求9)、和具有与权利要求1-9中任一记载的用于检测间充质干细胞的基因标记在严谨条件下杂交的DNA序列的用于检测间充质干细胞基因标记的探针(权利要求10)、和由上述任一记载的碱基序列的反义链的全部或者部分构成的权利要求10记载的用于检测间充质干细胞基因标记的探针(权利要求11)、和用于检测间充质干细胞基因标记的微阵列或DNA芯片，特征在于其固定有至少一个及一个以上的权利要求10或11记载的DNA(权利要求12)、和上述的用于检测间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片，特征在于其固定有具有序列表序列号1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示碱基序列基因组、和检测出权利要求2-9中任一记载的基因组的2个以上基因的探针(权利要求13)、和用于检测间充质干细胞的多肽标记，特征在于其是具有序列表的序列3、5、8、13、16或18所示的氨基酸序列的多肽(权利要求14)、和一种抗体，特征在于其受权利要求14记载的多肽诱导、与该多肽特异性结合(权利要求15)、和权利要求15记载的抗体，其特征在于抗体是单克隆抗体(权利要求16)和权利要求15记载的抗体，其特征在于抗体是多克隆抗体(权利要求17)。
此外，本发明还由下列物质组成识别间充质干细胞的方法，特征在于从被检细胞中检测出权利要求1-9中任一项记载的间充质干细胞标记基因表达(权利要求18)、和权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用RNA印迹法检测间充质干细胞标记基因的表达(权利要求19)、和权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用用于检测权利要求10或11记载的间充质干细胞标记基因的探针对间充质干细胞标记基因的表达进行检测(权利要求20)、和权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用用于检测权利要求12或13记载的间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片对间充质干细胞标记基因的表达进行检测(权利要求21)、和识别间充质干细胞的方法，其特征是权利要求18-21中任一记载的间充质干细胞标记基因表达的检测包括定量或半定量的PCR的使用(权利要求22)、和权利要求22记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是其使用的定量的或半定量的PCR是RT-PCR法(权利要求23)。
此外，本发明还由以下物质组成由具有序列表的序列号20所示的碱基序列的正义引物以及具有序列表的序列号21所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号22所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号23所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号24所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号25所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号26所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号27所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号28所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号29所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号30所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号31所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号32所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号33所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号34所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号35所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号36所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号37所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号38所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号39所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号40所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号41所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号42所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号43所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号44所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号45所示的碱基序列的反义引物构成的用于扩增间充质干细胞的RT-PCR用引物(权利要求24)、和由具有序列表的序列号47所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号48所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号49所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号50所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号51所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号52所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号53所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号54所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号55所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号56所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号57所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号58所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号59所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号60所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号61所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号62所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号63所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号64所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号65所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号66所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号67所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号68所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号69所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号70所示的碱基序列的反义引物构成的扩增间充质干细胞标记基因的实时PCR所使用的引物(权利要求25)、和具有序列表的序列号71所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号72所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号73所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号74所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号75所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号76所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号77所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号78所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号79所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号80所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号81所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号82所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号83所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号84所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号85所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号86所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号87所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号88所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号89所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号90所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号91所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号92所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号93所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号94所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号95所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号96所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号97所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号98所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号99所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号100所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号101所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号102所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号103所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号104所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号105所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号106所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号107所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号108所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号109所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号110所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号111所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号112所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号113所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号114所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号115所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号116所示的碱基序列的反义引物构成的用于扩增间充质干细胞标记基因的RT-PCR所使用的引物(权利要求26)。
此外，本发明还由以下物质组成权利要求1-8记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用权利要求10或11中记载的间充质干细胞标记基因检测用探针对被检细胞中的基因、用权利要求24-26其中之一记载的正义引物以及反义引物中至少一对以上的引物扩增的基因进行检测(权利要求27)、和间充质干细胞的识别方法，其特征是采用权利要求15-17其中之一记载的抗体对被检细胞中的间充质干细胞标记多肽的表达进行检测(权利要求28)、和间充质干细胞的识别方法，其特征是将被检细胞中由序列表的序列号1、11和19构成的间充质干细胞标记基因组成的组中一个以上基因的表达以及由序列表的序列号2、4、6、7、9、10、12、14、15和17构成的间充质干细胞标记基因组成的组中一个以上基因的表达组合起来，进行评价(权利要求29)、和间充质干细胞的识别分离方法，其特征是采用权利要求10或权利要求11记载的间充质干细胞标记基因检测用探针和/或权利要求15-17中任一记载的抗体对被检细胞中间充质干细胞检测用标记基因和/或间充质干细胞检测用标记多肽的表达进行检测、对识别出的间充质干细胞进行分离(权利要求30)、和权利要求30记载的间充质干细胞的识别分离方法，其特征是通过采用权利要求15-17中任一记载的抗体的荧光抗体法将被检细胞中的间充质干细胞进行标识、分离经标识的间充质干细胞(权利要求31)、和用于识别间充质干细胞的试剂盒，其中装备有权利要求10或11记载的用于检测间充质干细胞标记基因的探针、固定有该探针的权利要求12或13记载的用于检测间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片、和权利要求15-17中任一记载的抗体中至少一个以上的抗体(权利要求32)。


图1.表示的是本发明的实施例中，由半定量RT-PCR法获得的人间充质干细胞或人成纤维细胞间由个体(的不同)产生差异很大的基因。
图2.表示的是本发明的实施例中，由半定量RT-PCR法获得的MSC中高表达的基因。
图3.表示的是本发明的实施例中，由半定量RT-PCR法获得的MSC中低表达的基因。
图4.表示的是对于确认了间充质干细胞中高/低表达的13个基因，从来源于7个个体的间充质干细胞和来源于4个个体的成纤维细胞中抽提全部RNA，以其为模板通过RT-PCR法，对它们的表达量进行确认的结果。
图5.表示的是本发明的实施例中，间充质干细胞和成纤维细胞中本发明的标记基因表达状况的试验结果。
图6.表示的是本发明的实施例中，间充质干细胞和成骨细胞中各标记基因的差别基因表达的状况。
图7.表示的是本发明的实施例中，间充质干细胞和成骨细胞中各标记基因的差别基因表达的状况。
图8.表示的是本发明的实施例中，间充质干细胞和成骨细胞中各标记基因的差别基因表达的状况。
图9.表示的是本发明的实施例中，各个标记基因在间充质干细胞和人成纤维细胞中基因的表达状况。
图10.表示的是本发明的实施例中，各个标记基因在间充质干细胞和人成纤维细胞中基因的表达状况。
图11.表示的是本发明的实施例中，采用流式细胞仪对人细胞中间充质干细胞DR的表达的测定结果。
图12.表示的是本发明的实施例中，对在间充质干细胞向成骨细胞分化诱导中各个基因的表达状况的测定结果。
图13.表示的是本发明的实施例中，各标记基因在骨分化诱导的第4天-28天之间基因表达的变化。
图14表示的是本发明的实施例中，各标记基因在骨分化诱导的第4天-28天之间基因表达的变化。
图15.表示的是本发明的实施例中，各标记基因在骨分化诱导的第4天-28天之间基因表达的变化。
图16.表示的是本发明的实施例中，各标记基因在骨分化诱导的第4天-28天之间基因表达的变化。
具体实施例方式
本发明由对间充质干细胞中的特异性表达的用于检测间充质干细胞的标记基因或用于检测间充质干细胞的标记多肽的表达进行检测，识别间充质干细胞构成。本发明中，用于检测间充质干细胞的基因标记构成的基因是具有序列表中序列号1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17或19所示的碱基序列的基因。
此外，在本发明中用于检测间充质干细胞的多肽标记构成的多肽是具有序列表中序列号3、5、8、13、16或18所示氨基酸序列的多肽。
序列表中序列号1所示的基因是“丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂”基因，序列表中序列号2所示的基因是“肾上腺髓质素”基因，序列表中序列号4所示的基因是“载脂蛋白D(apolopoprotein D)”基因，序列表中序列号6所示的基因是“XV-α1型胶原酶(collagenase type XV alpha 1)”基因，序列表中序列号7所示的基因是“CUG三联体重复RNA结合蛋白2(CUG triplet repeat RNA binding protein2)”基因，序列表中序列号9所示的基因是“皮肤桥蛋白”基因，序列表中序列号10所示的基因是“异柠檬酸脱氢酶2”基因，序列表中序列号11所示的基因是“2类主要组织相容性复合体DRβ3(majorhistocompatibility complex class2，DR beta 3)”基因，序列表中序列号12所示的基因是“蛋白质酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7)”基因，序列表中序列号14所示的基因是“Sam68样磷酸酪氨酸蛋白(Sam68-like phosphotyrosine protein)”基因，序列表中序列号15所示的基因是“C-型凝集素超家族(C-type lectin superfamily)成员2”基因，序列表中序列号17所示的基因是“基质金属酶1(matrix metalloprotease 1)”基因，和序列表中序列号19所示的基因是“组织因子途径抑制剂2(tissue factor pathway inhibitor2)”基因，序列表中序列号46所示的基因是“主要组织相容性复合体DRα(major histocompatibilitycomplex DR alpha)”基因。
可以通过NCBI的基因数据库中、各个登陆号AI133613(序列号1)、NM_001124(序列号2)、NM_001647(序列号4)、L01697(序列号6)、U69546(序列号7)、AW016451(序列号9)、AL545953(序列号10)、BF732822(序列号11)、AL157486(序列号12)、AA112001(序列号14)、XM_006626(序列号15)、NM_002421(序列号17)、AL550357(序列号19)、和BF795929(序列号46)获得本发明的用于检测间充质干细胞的标记基因的DNA序列的信息。
进而，经确认本发明中，与成纤维细胞相比在间充质干细胞中表达量更多的基因列举为如下基因整联蛋白，α6(ITGA6)，MRNA基因(NM_000210)；溶质载体家族20(PHOSPHATE TRANSPORTER)、成员1基因(NM_005415)；核苷酸还原酶M2多肽(RRM2)，MRNA基因(NM_001034)；卵泡抑制素(FST)，转录变异型FST317，MRNA基因(NM_006350)；SPROUTY(果蝇)同源基因2(SPRY2)，MRNA基因(NM_005842)；RAB3B，成员RAS癌基因家族成员(RAB3B)，MRNA基因(NM_002867)；溶质载体家族2(FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)基因(NM_006516)；白介素13受体，ALPHA 2(IL13RA2)，MRNA基因(NM_000640)；丝氨酸(或苏氨酸)蛋白酶抑制剂12(STK12)，MRNA基因(NM_004217)；微染色体维持缺陷蛋白(酿酒酵母)5(CE)基因(NM_006739)；甲状腺激素受体中间子13(TRIP13)，MRNA基因(NM_004237)；类驱动蛋白6(MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN)(K)基因(NM_006845)；细胞周期蛋白依赖性抑止剂3(细胞周期蛋白依赖性抑止剂3(CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3))(CDK2-ASSOCIATED DUAL基因(NM_005192)；染色体凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA基因(NM_022346)；CDC28蛋白激酶(CKS1)，MRNA基因(NM_001826)；胞质分裂的蛋白质调节子1(PRC1)，MRNA基因(NM_003981)；细胞分裂周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA基因(NM_001786)；CDC20(CDC20细胞分裂周期20，酿酒酵母同源基因)(CD)基因(NM_001255)；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINEZIPPER KINAS基因(NM_014791)；微染色体维持缺陷蛋白(酿酒酵母)7(M)基因(NM_005916)；细胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA基因(NM_001237)；胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA基因(NM_003258)；或细胞周期蛋白依赖性激酶抑止剂2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)(黑色素瘤，p16，抑止CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)。
含EGF的细胞微丝(fibulin)样细胞外基质蛋白1基因(NM_018894)；人胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)mRNA基因(AU132011)；人克隆24775 mRNA序列基因(AA402981)；蛋白聚糖1，分泌颗粒(AV734015)；胰岛素样生长因子结合蛋白质5(insulin-like growth factor binding protein 5)基因(AA374325)；基因溶质载体家族21(有机阴离子转运蛋白)，成员3(AF085224)；谷氨酰胺转移酶2(C多肽，蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷酰基转移酶)(AL552373)基因；血友病因子II(凝血酶)受体基因(M62424)；纤维蛋白溶酶原活化因子，鸟激酶(NM_002658)基因；金属蛋白酶组织抑制因子3(Sorsby fundus dystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基质Gla蛋白(BF668572)基因；B-cell CLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要组织相容性复合体的不变多肽，II类相关抗原)(BG333618)基因；内收蛋白3(γ)(AL135243)基因；溶质载体家族16(一元羧酸传送子)，成员4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂酰肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜结合蛋白质(BE858855)基因；脑源性神经营养因子(X60201)基因；或者载脂蛋白E(BF967316)基因。
人WNT抑止因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ11175(FLJ11175)，MRNA基因(NM_018349)；人RHO GDP解离抑止剂(GDI)β(ARHGDIB)，MRNA基因(NM_001175)；人钾中间体/少量电导的钙活化(SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE)基因(NM_021614)；人核因子(红细胞衍生物2)-类似物3(NFE2L3)，MRNA基因(NM_004289)；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA基因(NM_021643)；人CDNA 3′END与糖蛋白相类似的MUC18基因(AA302605)；人假拟蛋白(HYPOTHETICALPROTEIN)FLJ21841(FLJ21841)，MRNA基因(NM_024609)；人ZINC FINGER蛋白185(LIM域)(ZNF185)，MRNA基因(NM_007150)；SC1＝假定的转移-活化因子，细胞周期控制中涉及的[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH脱氢酶(辅酶Q)1α子复合体，8(19K)基因(NM_014222)；人酵母MCM10的同系物基因；假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)PRO2249(PRO2)(NM_018518)；人XV-α1型胶原酶(COLLAGEN，TYPE VII，ALPHA 1)(大疱性表皮松解症，DYSTRO基因(NM_000094)；人自分泌运动因子受体(AMFR)，MRNA基因(NM_001144)；人克隆24421 MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP586E1621(FROM克隆DKFZP586E1621)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因。
人保留(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素结合酶E2C(UBE2C)，MRNA基因(NM_007019)；人CDNA FLJ10517 FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G基因(AK001379)；人骨连接蛋白1(CRTL1)，MRNA基因(NM_001884)；人MRNA；CDNA DKFZP434F2322(FROM克隆DKFZP434F2322)/CDS＝未知/GB(AL133105)基因；人，克隆MGC；9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人神经胶质成熟因子，γ(GMFG)，MRNA基因(NM_004877)；人CDNAFLJ23095 FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA基因(NM_018410)；人IROQUOIS类同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA基因(NM_005853)；或人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10540(FLJ10540)，MRNA基因(NM_018131)。
人MRNA基因；CDNA DKFZP434C1915(FROM克隆DKFZP434C1915)；PARTIALCDS/C(AL137698)；人微染色体维持缺陷型(酿酒酵母(S.CEREVISIAE))7(M)(NM_005916)基因；人动力蛋白，细胞质的，中间体多肽1(DNCI1)，M基因(NM_004411)；蛋白质基因产物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA基因(NM_006479)；人含有杆状病毒LAP重复序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR基因(NM_001168)；人UDP-N-乙酰基-ALPHA-D-半乳糖胺多肽N-乙酰基GAL基因(NM_004482)；人细胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA基因(NM_031966)；人FLAP结构特异性内切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有丝分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-类似物1(MA)基因(NM_002358)；人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人与泛素结合酶类似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人细胞色素P450类维生素A代谢蛋白(P450RAI-2)，(NM_019885)基因；人NIMA(从未有丝分裂基因A)相关激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形态生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNA FLJ10674 FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/G基因I(AK001536)；或人着丝粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA基因(NM_001809)。
人MRNA基因；CDNA DKFZP564P116(来自克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白质激酶(TTK)，MRNA基因(NM_003318)；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT 1，IMPORTINα1)(KPNA基因(NM_002266)；人聚合酶(DNA导向的)，θ(POLQ)，MRNA基因(NM_006596)；人ETS变异体基因5(ETS相关分子)(ETV5)，MRNA基因(NM_004454)；人含转化酸性卷曲螺旋蛋白(TRANSFORMING，ACIDIC COILED-COIL CONTAINING蛋白)3(TAC)基因(NM_006342)；人驱动蛋白类似物1(KNSL1)，MRNA基因(NM_004523)；人着丝粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆_END＝3′/GB＝AI12(AI123815)；基因人DISTAL-LESSHOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓细胞性白血病病毒癌基因同系物类似物2基因(NM_002466)；或人血清剥夺反应(磷脂酰丝氨酸结合PRO(NM_004657)基因。
用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI，大亚基(RNASEHI)，MRNA(NM_006397)基因；人ANILLIN(果蝇SCRAPS同系物)，肌动蛋白结合蛋白基因(NM_018685)；人H4组蛋白家族，成员G(H4FG)，MRNA基因(NM_003542)；人G蛋白连结受体37(内皮缩血管肽受体B型-(NM_005302)人泛素载体蛋白(E2-EPF)，MRNA(NM_014501)基因；人，类似于肿瘤差别表达1，克隆IMAGE3639252，(BC007375)基因；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC2577(MGC2577)，MRNA基因(NM_031299)；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEXIN A3(ANXA3)，MRNA基因NM_005139)；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，与核糖体蛋白L39类似，克隆MGC20168 IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蝇)类似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)。
同时，本发明中经确认的、与纤维母细胞相比较、在间充质细胞中不表达或表达量的基因是，如下列举的基因
用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于人蛋白酶体(PROSOME，MACROPAIN)26S亚基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻译起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氢嘧啶酶类似物3(DPYSL3)，MRNA)基因(NM_001387)；人ADAPTOR相关蛋白复合体1，σ2亚基(AP1S2)基因(NM_003916)；人网蛋白1，中间丝结合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人异种核蛋白U基因(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)；人假拟蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I类多肽相关序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相关蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受体膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚谷氨酸结合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人干扰素诱导的C型肝炎相关MICROTUBULAR AG基因(NM_006417)；人蛋白质激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亚基(NON-CATALYTIC SUBUN)基因(NM_002733)；人前胶原-脯氨酸，2-氧代戊二酸盐4-加双氧酶(脯氨酸(NM_004199)基因；人血管内皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因产物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)本发明中，对本发明的间充质干细胞标记基因表达进行的检测中可以采用公知的基因表达检测方法。例如，为了检测本发明的间充质干细胞标记基因的表达，可以采用RNA印迹法(northern blot)。此外，为了通过本发明的基因标记，检测识别间充质干细胞，可以采用具有与本发明的间充质干细胞基因标记的DNA序列在严谨条件下杂交的DNA序列的探针。在采用该探针检测间充质干细胞中，可采用公知方法采取相应措施。例如，由序列表所示基因标记DNA序列制备出适应长度的DNA探针，给探针加上合适的荧光标记等标记，通过将其与被检体杂交，从而对间充质干细胞进行检测。该DNA探针可以采用由序列表所示的本发明的基因标记的碱基序列的反义链的全部或部分构成的用于检测间充质干细胞标记基因的探针。或者，也可以采用固定有至少1个以上所述探针的用于检测标记基因的微阵列或DNA芯片。
此外，在制备上述DNA探针时，本发明的碱基序列中，所谓“与用于检测间充质干细胞的标记基因的DNA序列在严谨条件下杂交”是指，例如42℃下的杂交，以及在42℃下通过含有1×SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液进行冲洗，最为理想的是65℃下的杂交，以及在65℃下通过含有1×SSC、0.1％SDS的缓冲液进行冲洗。此外，影响杂交的严谨度的因素除上述温度条件以外还存在各种因素，如果本领域技术人员对各种因素进行组合，就可能实现与上述列举的杂交的严谨性等同的严谨度。
尤其是，本发明中检测本发明的用于检测间充质干细胞的多肽标记时，可以使用由该蛋白质的多肽诱导，与该多肽特异性结合的抗体。该抗体可以是例如多克隆抗体和单克隆抗体。作为本发明的多肽标记的抗体，该抗体可以通过常规方法制得。采用本发明的抗体，在对被检细胞中用于检测间充质干细胞的标记多肽的表达进行检测中，可以实施采用公知抗体的免疫学测定法。所述免疫学测定法可以是例如RIA法、ELISA法、荧光抗体发等公知的免疫学测定法。
本发明可通过采用本发明的用于检测间充质干细胞的探针和/或本发明的用于检测间充质干细胞的抗体，对被检细胞中用于检测间充质干细胞的标记基因和/或用于检测间充质干细胞的标记多肽的表达进行检测，对识别出的间充质干细胞进行分离得以实现。在对被检细胞中用于检测间充质干细胞的标记基因检测时，为了扩增被检细胞的基因，可采用定量或半定量的PCR。所述PCR可采用RT-PCR(逆转录PCR)。进行所述PCR时，采用用于扩增用于检测间充质干细胞的标记基因的正义引物和反义引物组成的引物。
用于扩增本发明的用于检测间充质干细胞的标记基因的引物举例如下具有序列表的序列号20所示的碱基序列的正义引物以及具有序列表的序列号21所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号22所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号23所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号24所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号25所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号26所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号27所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号28所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号29所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号30所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号31所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号32所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号33所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号34所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号35所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号36所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号37所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号38所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号39所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号40所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号41所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号42所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号43所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号44所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号45所示的碱基序列的反义引物。
尤其是，用于扩增本发明的用于检测间充质干细胞的标记基因的引物举例如下由具有序列表的序列号47所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号48所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号49所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号50所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号51所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号52所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号53所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号54所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号55所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号56所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号57所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号58所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号59所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号60所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号61所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号62所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号63所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号64所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号65所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号66所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号67所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号68所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号69所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号70所示的碱基序列的反义引物构成的扩增间充质干细胞标记基因的实时PCR所使用的引物。
进而，用于扩增本发明的用于检测间充质干细胞的标记基因的引物列举如下由具有序列表的序列号71所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号72所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号73所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号74所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号75所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号76所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号77所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号78所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号79所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号80所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号81所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号82所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号83所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号84所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号85所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号86所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号87所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号88所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号89所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号90所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号91所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号92所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号93所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号94所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号95所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号96所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号97所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号98所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号99所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号100所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号101所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号102所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号103所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号104所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号105所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号106所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号107所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号108所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号109所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号110所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号111所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号112所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号113所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号114所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号115所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号116所示的碱基序列的反义引物构成的用于扩增间充质干细胞标记基因的RT-PCR所使用的引物。
本发明中，对间充质干细胞的识别是以下述方式进行在被检细胞中以上述正义引物和反义引物的至少一对以上的引物进行扩增，采用用于检测本发明的间充质干细胞的标记基因的探针对扩增出的基因进行检测。
本发明的用于检测间充质干细胞的标记基因是在间充质干细胞中特异性高表达的基因和特异性低表达的基因，通过以组合方式检测这些基因表达，能够提高间充质干细胞检测的精确度。因此，作为在间充质干细胞中特异性高表达的基因，可例举为序列表的序列号1、11和19构成的间充质干细胞标记基因，作为在间充质干细胞中特异性低表达的基因，可例举为序列号2、4、6、7、9、10、12、14、15、17和46构成的间充质干细胞标记基因。进而，可以列举出本发明中经证实的间充质干细胞标记基因。因此，通过对各个基因的组合中的一个以上基因的表达进行组合，可以以更高的检测精确度对间充质干细胞进行识别。
在通过采用利用本发明的抗体的荧光抗体法，对被检细胞中的间充质干细胞标记多肽的表达进行检测，从而识别分离间充质干细胞的过程中可通过公知的方法对间充质干细胞进行标记、分离。所述标记方法，可举例为如荧光抗体法。在通过荧光抗体法对未分化的造血细胞进行标记中，对与本发明的用于检测间充质干细胞的多肽标记特异性结合的抗体进行荧光标记，通过与表达所述抗原的间充质干细胞结合，标记间充质干细胞(直接荧光抗体法)，或在表达抗原的间充质干细胞与未标记的本发明的特异抗体结合后，对与标记的二次抗体结合的间充质干细胞标记(间接荧光抗体法)、对所述经标记的间充质干细胞分离，收集。
本发明的间充质干细胞的检测识别中所使用的用于检测间充质干细胞标记基因的探针，固定有该探针的用于检测间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片以及本发明的用于检测间充质干细胞的抗体可以以装备有上述物质的用于识别间充质干细胞的试剂盒制品化形式存放。
下面，通过实施例更为具体地对本发明进行说明，本发明的技术范围不受其实施例所举例的内容限制。
实施例材料和方法(细胞)在Dalbecco’s modified Eagle’s medium(低葡萄糖)(Sigma公司制造)中添加了10％胎牛血清、1ng/ml bFGF的培养基中在37℃对人间充质干细胞(human mesenchymal stemcell)和人成纤维细胞(human fibroblast)进行培养。
(DNA微阵列)用TRIZOL试剂(Invitrogen公司制造)从一个10cm皿的各个细胞中抽提全部RNA，用micro poly(A)purist(Ambion公司制造)提取mRNA，进行DNA微阵列(IncyteGenomics公司Kurabo Life Array analysis servis；Lot.No.KL01081)。并且，DNA微阵列分析委托Kurabo公司进行。
(半定量RT-PCR)用TRIZOL试剂(Invitrogen公司制造)从各个细胞中抽提全部RNA后，以各个1mg全部RNA为模板，采用用于RT-PCR的SuperScript first-strand合成系统(Invitrogen公司)，42℃下进行50分钟逆转录反应从而合成cDNA。以合成的cDNA为模板采用Advantage 2 PCR enzyme system(Clontech公司制造)对各个基因进行扩增。94℃下变性30秒，68℃下1分钟内退火30个循环。用于扩增各个基因的引物序列汇集在表1中。通过采用1％琼脂糖凝胶的电泳分离扩增出的基因，通过溴乙锭染色进行检测。

实施例检测结果(DNA微阵列)DNA微阵列的结果表明，9400个基因中，与在成纤维细胞中相比63个基因在间充质干细胞中的显著表达更高，141个基因表达较低。此外，还看出了除这些基因之外的其它基因的显著差异。其中，发现存在3倍以上差异的87个基因中，在间充质干细胞中高表达的基因为29个基因，低表达的基因为58个基因。
(半定量RT-PCR)从源于3个个体的间充质干细胞和源于3个个体的成纤维细胞中抽提全长RNA，以其为模板，通过半定量RT-PCR法就上述87个基因的表达量进行调查。其结果是表达量未发现差异的基因最多。此外，不同个体的间充质干细胞或成纤维细胞间表达量存在差异，认为由个体不同产生的表达差异也很大(图1)。
经RT-PCR证实在间充质干细胞中高表达的基因是丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止剂(序列表的序列号1)、2类主要组织相容性复合体DRβ3(序列号11)、和组织因子途径抑制物2(序列号19)这三个基因(图2)。
此外，经证实低表达的基因是(序列号2)、载脂蛋白D(序列号4)、XV-α型胶原酶(collagenase type XV alpha 1)(序列号6)、CUG三联体重叠RNA结合蛋白(CUGtriplet repeat RNA binding protein)(序列号7)、皮肤桥蛋白(序列号9)、异柠檬酸脱氢酶2(序列号10)、酪氨酸激酶7(序列号12)、Sam68样磷酸酪氨酸蛋白(序列号14)、C-型凝集素超家族成员2(序列号15)、和基质金属酶1(matrix metalloprotease 1)(序列号17)这10个基因(图3)。并且，通过半定量RT-PCR法对这13个基因的表达量进行证实，所述半定量RT-PCR法是以从源于7个个体的间充质干细胞和4个个体成纤维细胞中抽提的全长RNA作为模板的(图4)。
实施例间充质干细胞中各个基因的表达量的测定I以与实施例1相同方法，对本发明的基因标记在人间充质干细胞和人成纤维细胞中的表达进行测定。所使用的RT-PCR和实时PCR的引物和实时PCR所用探针示于表2中。

间充质干细胞和成纤维细胞中的mRNA水平的表达状况示于图5。此外，间充质干细胞和成纤维细胞中相对的mRNA水平的表达状况示于图6、7、8。
实施例间充质干细胞中各个基因的表达量的测定II以与实施例1相同方法，对本发明的各个基因标记在人间充质干细胞和人成纤维细胞中的表达进行测定。所使用的RT-PCR的正义及反义引物如序列表的序列号71-116的序列所示。间充质干细胞和成纤维细胞中的mRNA的表达状况示于图9和图10。此外，间充质干细胞/成纤维细胞的表达之比示于表3。
表3


实施例间充质干细胞中各个基因的表达量的测定III以与实施例1相同方法，对本发明的各个基因标记在人源间充质干细胞和人成纤维细胞中的表达进行测定。间充质干细胞/成纤维细胞的表达之比示于表4。
(表4)(间充质干细胞/成纤维细胞) (基因名称)







实施例间充质干细胞中各个基因的表达量的测定IV以与实施例1相同方法，对本发明的各个基因标记在人源间充质干细胞和人成纤维细胞中的表达进行测定。间充质干细胞/成纤维细胞的表达之比示于表5。表中的-表示的是在间充质干细胞中基因不表达或极少量表达。
表5(间充质干细胞/成纤维细胞) (基因名称)


实施例人细胞中间充质干细胞DR的表达的测定采用流式细胞仪测定人细胞中间充质干细胞DR的表达。结果示于图11中。
实施例8在间充质干细胞的分化诱导中个基因的表达的变化以与实施例1相同方式进行RT-PCR，测定间充质干细胞的分化诱导中各基因表达的表化。成骨细胞的分化诱导中各基因的表达示于图12-16中。
产业上利用的可能性近年来，随着再生医疗的发展，间充质干细胞作为可用于多种组织的再生医疗的移植材料受到人们关注。为了将间充质干细胞利用于组织的再生医疗中，必须要开发出确保间充质干细胞有足够数量的技术，同时还必须证实所培养的细胞是间充质干细胞，重要的是检测、分离该间充质干细胞的方法。此外，采用抗体等从多种类型的细胞集团中分离间充质干细胞也是有用的。根据本发明，通过对间充质细胞的特征标记基因进行指示，就可能容易且确实地检测识别间充质干细胞，故而可期待为将间充质干细胞在再生医疗中实用化作出重大贡献。
序列表<110>独立行政法人科学技术振兴机构(Japan Science and Technology Agency)加藤幸夫(Yukio KATO)智再如股份公司(Two Cells Co.，Ltd.)<120>检测间充质干细胞的标记和采用该标记识别间充质干细胞的方法<130>V320P006US(PCT)<150>JP2003-63077<151>2000-03-10<160>116<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>652<212>DNA<213>人<400>1gaattgccaa ttccttgttt gtgcaaaatg gatttcatgt caatgaggag tttttgcaaa 60tgatgaaaaa atattttaat gcagcagtaa atcatgtgga cttcagtcaa aatgtagccg 120
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Phe Arg Gln Ala Trp Val Pro Leu Arg Trp Met Ser Pro Glu Ala Ile260 265 270Leu Glu Gly Asp Phe Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val275 280 285Leu Met Trp Glu Val Phe Thr His Gly Glu Met Pro His Gly Gly Gln290 295 300Ala Asp Asp Glu Val Leu Ala Asp Leu Gln Ala Gly Lys Ala Arg Leu305 310 315 320Pro Gln Pro Glu Gly Cys Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Leu Met Gln Arg325 330 335Cys Trp Ala Leu Ser Pro Lys Asp Arg Pro Ser Phe Ser Glu Ile Ala340 345 350Ser Ala Leu Gly Asp Ser Thr Val Asp Ser Lys Pro355 360<210>14<211>430<212>DNA<213>人
<400>14ggttgatgtt tcaacaaagt agttttaagt tccatccatt cagattttaa gcattttgat 60ttatttaaaa agggattgtt catagaaaaa aattactttg aacagtatac aggactggtg 120gagattggct atttcacaac atcagacagt acaatcagta tctgccatat ggctggtctc 180tgtagacgcc ctttgctgtc ctcgctgaag gtgccttgtg tcttgagtta gtccactctt 240cttgcccgta ggaatcataa gtctcctcac tgagtccatg tccgtaatca tagtaatcag 300caccactttg ggctggggtg ctatagctgt tatcatagga atcataactc tgttcatcat 360aagcagtgcc atatccatca tcatagtcat attctccata agtctcttgg tgtcgggggt 420ggcggtggaa430<210>15<211>616<212>DNA<213>人<400>15ggtatgatga ccaaacataa aaagtgtttt ataattgttg gtgttttaat aacaactaat 60
attattactc tgatagttaa actaactcga gattctcaga gtttatgccc ctatgattgg 120attggtttcc aaaacaaatg ctattatttc tctaaagaag aaggagattg gaattcaagt 180aaatacaact gttccactca acatgccgac ctaactataa ttgacaacat agaagaaatg 240aattttctta ggcggtataa atgcagttct gatcactgga ttggactgaa gatggcaaaa 300aatcgaacag gacaatgggt agatggagct acatttacca aatcgtttgg catgagaggg 360agtgaaggat gtgcctacct cagcgatgat ggtgcagcaa cagctagatg ttacaccgaa 420agaaaatgga tttgcaggaa aagaatacac taagttaatg tctaagataa tggggaaaat 480agaaaataac attattaagt gtaaaaccag caaagtactt ttttaattaa acaaagttcg 540agttttgtac ctgtctggtt aattctgctt acgtgtcagg ctacacataa aagccacttc 600aaagattggc aaaaaa 616<400>16Met Met Thr Lys His Lys Lys Cys Phe Ile Ile Val Gly Val Leu Ile1 5 10 15Thr Thr Asn Ile Ile Thr Leu Ile Val Lys Leu Thr Arg Asp Ser Gln20 25 30Ser Leu Cys Pro Tyr Asp Trp Ile Gly Phe Gln Asn Lys Cys Tyr Tyr
35 40 45Phe Ser Lys Glu Glu Gly Asp Trp Asn Ser Ser Lys Tyr Asn Cys Ser50 55 60Thr Gln His Ala Asp Leu Thr Ile Ile Asp Asn Ile Glu Glu Met Asn65 70 75 80Phe Leu Arg Arg Tyr Lys Cys Ser Ser Asp His Trp Ile Gly Leu Lys85 90 95Met Ala Lys Asn Arg Thr Gly Gln Trp Val Asp Gly Ala Thr Phe Thr100 105 110Lys Ser Phe Gly Met Arg Gly Ser Glu Gly Cys Ala Tyr Leu Ser Asp115 120 125Asp Gly Ala Ala Thr Ala Arg Cys Tyr Thr Glu Arg Lys Trp Ile Cys130 135 140Arg Lys Arg Ile His145<210>17<211>1973<212>DNA<213>人<400>17gggatattgg agtagcaaga ggctgggaag ccatcactta ccttgcactg agaaagaaga 60caaaggccag tatgcacagc tttcctccac tgctgctgct gctgttctgg ggtgtggtgt 120
ctcacagctt cccagcgact ctagaaacac aagagcaaga tgtggactta gtccagaaat 180acctggaaaa atactacaac ctgaagaatg atgggaggca agttgaaaag cggagaaata 240gtggcccagt ggttgaaaaa ttgaagcaaa tgcaggaatt ctttgggctg aaagtgactg 300ggaaaccaga tgctgaaacc ctgaaggtga tgaagcagcc cagatgtgga gtgcctgatg 360tggctcagtt tgtcctcact gaggggaacc ctcgctggga gcaaacacat ctgacctaca 420ggattgaaaa ttacacgcca gatttgccaa gagcagatgt ggaccatgcc attgagaaag 480ccttccaact ctggagtaat gtcacacctc tgacattcac caaggtctct gagggtcaag 540cagacatcat gatatctttt gtcaggggag atcatcggga caactctcct tttgatggac 600ctggaggaaa tcttgctcat gcttttcaac caggcccagg tattggaggg gatgctcatt 660ttgatgaaga tgaaaggtgg accaacaatt tcagagagta caacttacat cgtgttgcgg 720ctcatgaact cggccattct cttggactct cccattctac tgatatcggg gctttgatgt 780accctagcta caccttcagt ggtgatgttc agctagctca ggatgacatt gatggcatcc 840aagccatata tggacgttcc caaaatcctg tccagcccat cggcccacaa accccaaaag 900cgtgtgacag taagctaacc tttgatgcta taactacgat tcggggagaa gtgatgttct 960
ttaaagacag attctacatg cgcacaaatc ccttctaccc ggaagttgag ctcaatttca1020tttctgtttt ctggccacaa ctgccaaatg ggcttgaagc tgcttacgaa tttgccgaca1080gagatgaagt ccggtttttc aaagggaata agtactgggc tgttcaggga cagaatgtgc1140tacacggata ccccaaggac atctacagct cctttggctt ccctagaact gtgaagcata1200tcgatgctgc tctttctgag gaaaacactg gaaaaaccta cttctttgtt gctaacaaat1260actggaggta tgatgaatat aaacgatcta tggatccagg ttatcccaaa atgatagcac1320atgactttcc tggaattggc cacaaagttg atgcagtttt catgaaagat ggatttttct1380atttctttca tggaacaaga caatacaaat ttgatcctaa aacgaagaga attttgactc1440tccagaaagc taatagctgg ttcaactgca ggaaaaattg aacattacta atttgaatgg1500aaaacacatg gtgtgagtcc aaagaaggtg ttttcctgaa gaactgtcta ttttctcagt1560catttttaac ctctagagtc actgatacac agaatataat cttatttata cctcagtttg1620catatttttt tactatttag aatgtagccc tttttgtact gatataattt agttccacaa1680atggtgggta caaaaagtca agtttgtggc ttatggattc atataggcca gagttgcaaa1740
gatcttttcc agagtatgca actctgacgt tgatcccaga gagcagcttc agtgacaaac1800atatcctttc aagacagaaa gagacaggag acatgagtct ttgccggagg aaaagcagct1860caagaacaca tgtgcagtca ctggtgtcac cctggatagg caagggataa ctcttctaac1920acaaaataag tgttttatgt ttggaataaa gtcaaccttg tttctactgt ttt 1973<210>18<211>469<212>PRT<213>人<400>18Met His Ser Phe Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Trp Gly Val Val1 5 10 15Ser His Ser Phe Pro Ala Thr Leu Glu Thr Gln Glu Gln Asp Val Asp20 25 30Leu Val Gln Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly35 40 45
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Ile Ser Phe Val Arg Gly Asp His Arg Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly165 170 175Pro Gly Gly Asn Leu Ala His Ala Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ile Gly180 185 190Gly Asp Ala His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asn Asn Phe Arg195 200 205Glu Tyr Asn Leu His Arg Val Ala Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu210 215 220Gly Leu Ser His Ser Thr Asp Ile Gly Ala Leu Met Tyr Pro Ser Tyr225 230 235 240Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu Ala Gln Asp Asp Ile Asp Gly Ile245 250 255Gln Ala Ile Tyr Gly Arg Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro
260 265 270Gln Thr Pro Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr275 280 285Thr Ile Arg Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg290 295 300Thr Asn Pro Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe305 310 315 320Trp Pro Gln Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Phe Ala Asp325 330 335Arg Asp Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln340 345 350Gly Gln Asn Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe355 360 365
Gly Phe Pro Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu370 375 380Asn Thr Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr385 390 395 400Asp Glu Tyr Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala405 410 415His Asp Phe Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys420 425 430Asp Gly Phe Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp435 440 445Pro Lys Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe450 455 460Asn Cys Arg Lys Asn465
<210>19<211>1141<212>DNA<213>人<400>19ccgccaggcg ctttctcgga cgccttgccc agcgggccgc ccgaccccct gcaccatgga 60ccccgctcgc cccctggggc tgtcgattct gctgcttttc ctgacggagg ctgcactggg 120cgatgctgct caggagccaa caggaaataa cgcggagatc tgtctcctgc ccctagacta 180cggaccctgc cgggccctac ttctccgtta ctactacgac aggtacacgc agagctgccg 240ccagttcctg tacgggggct gcgagggcaa cgccaacaat ttctacacct gggaggcttg 300cgacgatgct tgctggagga tagaaaaagt tcccaaagtt tgccggctgc aagtgagtgt 360ggacgaccag tgtgaggggt ccacagaaaa gtatttcttt aatctaagtt ccatgacatg 420tgaaaaattc ttttccggtg ggtgtcaccg gaaccggatt gagaacaggt ttccagatga 480agctacttgt atgggcttct gcgcaccaaa gaaaattcca tcattttgct acagtccaaa 540agatgaggga ctgtgctctg ccaatgtgac tcgctattat tttaatccaa gatacagaac 600
ctgtgatgct ttcacctata ctggctgtgg agggaatgac aataactttg ttagcaggga 660ggattgcaaa cgtgcatgtg caaaagcttt gaaaaagaaa aagaagatgc caaagcttcg 720ctttgccagt agaatccgga aaattcggaa gaagcaattt taaacattct taatatgtca 780tcttgtttgt ctttatggct tatttgcctt tatggttgta tctgaagaat aatatgacag 840catgaggaaa caaatcattg gtgatttatt caccagtttt tattaataca agtcactttt 900taaaaaattt ggattttttt atatataact agctgctatt caaatgtgag tctaccattt 960ttaatttatg gttcaactgt ttgtgagact gaattcttgc aatgcataag atataaaagc1020aaatatgact cactcatttc ttggggtcgt attcctgatt tcagaagagg atcataactg1080aaacaacata agacaatata atcatgtgct tttaacatat ttgagaataa aaaggactag1140c1141<210>20<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>序列丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子正义引物<400>20ccaaactttg aaagccaagg tg 22<210>21<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子反义引物<400>21tgcacttcaa agaccagcag g21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肾上腺髓质素正义引物<400>22
aggaatagtc gcgcaagcat c21<210>23<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>肾上腺髓质素反义引物<400>23cacgcattgc acttttcctc tt 22<210>24<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>载脂蛋白D正义引物<400>24tgaagccacc ccagttaacc t21
<210>25<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>载脂蛋白D反义引物<400>25ggtcaacttc ctttgtgcgt ggt 23<210>26<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>a-1 XV型胶原蛋白正义引物<400>26accaaaccct atttcaagtg cc 22<210>27<211>21<212>DNA
<213>人工系列<220>
<223>a-1 XV型胶原蛋白反义引物<400>27tagttatcca caaggcggac g21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CUG三联体重复RNA结合蛋白2正义引物<400>28atgtttgtcg gacagatccc c21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CUG三联体重复RNA结合蛋白2反义引物<400>29atgtgacaaa cgcacagcct c21<210>30<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>皮肤桥蛋白正义引物<400>30atttgaaccg gcaaggcttc 20<210>31<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>皮肤桥蛋白反义引物<400>31
aagtggttgt tgctcctcgg a21<210>32<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>异柠檬酸脱氢酶正义引物<400>32tgccatccag aagaaatggc 20<210>33<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>异柠檬酸脱氢酶反义引物<400>33aggcaaagat gctggcgat 19
<210>34<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MHC II类DRβ3正义引物<400>34tagctgtgga caaagccaac ct 22<210>35<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MHC II类DRβ3反义引物<400>35ggcacacacc acgttctctg ta 22<210>36<211>22<212>DNA
<213>人工系列<220>
<223>蛋白质酪氨酸激酶7正义引物<400>36tggaaccaga gcgtacgact gt 22<210>37<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>蛋白质酪氨酸激酶7反义引物<400>37tggctttgca gcgcttctt 19<210>38<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>类Sam68磷酸化酪氨酸蛋白质，T-STAR正义引物<400>38aggagaaggc aaggatgaag aa 22<210>39<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>类Sam68磷酸化酪氨酸蛋白质，T-STAR反义引物<400>39tgttaactcc tggagctgtg ct 22<210>40<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>C-型凝集素超家族成员2正义引物<400>40
gcccctatga ttggattggt tt 22<210>41<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>C-型凝集素超家族成员2反义引物<400>41catccttcac tccctctcat gc 22<210>42<211>25<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MMP(基质金属蛋白酶)1正义引物<400>42cgactctaga aacacaagag caaga25
<210>43<211>25<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MMP(基质金属蛋白酶)1反义引物<400>43aaggttagct tactgtcaca cgctt25<210>44<211>17<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>TFPI(组织因子途径抑制物)2正义引物<400>44gtcgattctg cttttcc 17<210>45<211>20<212>DNA
<213>人工系列<220>
<223>TFPI(组织因子途径抑制物)2反义引物<400>45atggaatttt ctttggtgcg 20<210>46<211>1045<212>DNA<213>人<400>46ctcccgagct ctactgactc ccaacagagc gcccaagcaa gaaaatggcc ataagtggag 60tccctgtgct aggatttttc atcatagctg tgctgatgag cgctcaggaa tcatgggcta 120tcaaagaaga acatgtgatc atccaggccg agttctatct gaatcctgac caatcaggcg 180agtttatgtt tgactttgat ggtgatgaga ttttccatgt ggatatggca aagaaggaga 240cggtctggcg gcttgaagaa tttggacgat ttgccagctt tgaggctcaa ggtgcattgg 300ccaacatagc tgtggacaaa gccaacctgg aaatcatgac aaagcgctcc aactatactc 360
cgatcaccaa tgtacctcca gaggtaactg tgctcacgaa cagccctgtg gaactgagag 420agcccaacgt cctcatctgt ttcatcgaca agttcacccc accagtggtc aatgtcacgt 480ggcttcgaaa tggaaaacct gtcaccacag gagtgtcaga gacagtcttc ctgcccaggg 540aagaccacct tttccgcaag ttccactatc tccccttcct gccctcaact gaggacgttt 600acgactgcag ggtggagcac tggggcttgg actgagcctc ttctcaagca ctgggaggtt 660gatgctccaa gcccgtctcc agagacttac gagacgtggt gtgtgccctg gggctgactg 720tgggtctggt cgggcttcct ttgggaccct ctttcatcat ccacggcgag tgcgccaaaa 780gcattgccca gaaacccagg gggccctctg taaggcctgt gcgggggcag aacggtccct 840taaaaagaag aacctcgtgg gcaaaacctg gegcaagacg tcatacaaag ggggggcata 900taacacgcgt gccccagaac gaccgcactc agggctcgcc gcctataaca ccccggtgtg 960gtacccccaa ggcgcgctaa aactaaacag cgcgcacata gtagctcagg cgatacacca1020ctcacatata taatagcacc gctaa 1045<210>47<211>18
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的肾上腺髓质素引物<400>47ggtttccgtc gccctgat18<210>48<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的肾上腺髓质素引物<400>48gagcccactt attccacttc tttc 24<210>49<211>22<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>用于RT-PCR的基质金属蛋白酶1引物<400>49gatggacctg gaggaaatct tg 22<210>50<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的基质金属蛋白酶1引物<400>50ccgcaacacg atgtaagttg tact 24<210>51<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的组织因子途径抑制物2引物
<400>51ggcaacgcca acaatttcta c21<210>52<211>26<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的组织因子途径抑制物2引物<400>52caaactttgg gaactttttc tatcct 26<210>53<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止因子引物<400>53tgggtggaga ataacacaaa caa 23
<210>54<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止因子引物<400>54ccagataagt ggcagcatca aa 22<210>55<211>28<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的蛋白质酪氨酸激酶7引物<400>55gggagttcct taatattctc aagttctg 28<210>56<211>27
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>蛋白质酪氨酸激酶7<400>56gctgtgtcct ctataatcct ggtctag 27<210>57<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的胶原蛋白，XV型，α1引物<400>57ccagcaaccc acatcagctt 20<210>58<211>23<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>用于RT-PCR的胶原蛋白，XV型，α1引物<400>58atgcagagca ggcttctcat aat 23<210>59<211>29<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的类Sam68磷酸化酪氨酸蛋白质引物<400>59tcacaacatc agacagtaca atcagtatc29<210>60<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的类Sam68磷酸化酪氨酸蛋白质引物
<400>60acgggcaaga agagtggact aa 22<210>61<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的载脂蛋白D引物<400>61tgagaagatc ccaacaacct ttg 23<210>62<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的载脂蛋白D引物<400>62tgatctttcc gttttccatt agtg 24
<210>63<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>主要组织相容性复合体DRβ<400>63ggctgaagtc cagagtgtcc tt 22<210>64<211>18<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的主要组织相容性复合体DRβ引物<400>64gctgggcctg ctcttcct18<210>65<211>19
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的主要组织相容性复合体DRα引物<400>65gcccagggaa gaccacctt 19<210>66<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的主要组织相容性复合体DR α引物<400>66cagtcgtaaa cgtcctcagt tga 23<210>67<211>27<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>用于RT-PCR的C型凝集素引物<400>67atccattttc tttcggtgta acatcta 27<210>68<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的C型凝集素引物<400>68catgagaggg agtgaaggat gtg 23<210>69<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的CUG三联体重复RNA结合蛋白2引物
<400>69catgaatgct ttacagttgc agaa 24<210>70<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的CUG三联体重复RNA结合蛋白2引物<400>70gcgctgcteg tggtagaga 19<210>71<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>整联蛋白，α6(ITGA6)，MRNA<400>71gatgacagtg ttccccgata cc 22
<210>72<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>整联蛋白，α6(ITGA6)，MRNA<400>72tgtaagtcag ccacgccaaa 20<210>73<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶质运载蛋白家族20(磷酸盐转运)成员1<400>73aatggagaag ctgacatggc c21<210>74<211>21
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶质运载蛋白家族20(磷酸盐转运)成员1<400>74ccaaacccac agaccaacac a21<210>75<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>核苷酸还原酶M2多肽(RRM2)MRNA<400>75tccaaggaca ttcagcactg g21<210>76<211>19<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>核苷酸还原酶M2多肽(RRM2)MRNA<400>76atcgacgcaa aagaaccgg 19<210>77<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>卵泡抑制素转录变异型FST317，MRNA<400>77ggaagtccag taccaaggca ga 22<210>78<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>卵泡抑制素转录变异型FST317，MRNA
<400>78tggcattgtc actggcaca 19<210>79<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>SPROUTY(果蝇)同源基因2(SPRY2)，MRNA<400>79gccatccgaa acaccaatga 20<210>80<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>SPROUTY(果蝇)同源基因2(SPRY2)，MRNA<400>80tgccacagtc ctcacacctg ta 22
<210>81<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>RAB3B，癌基因家族成员RAS，MRNA<400>81atgctgatga cacgttcacc c21<210>82<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>RAB3B，癌基因家族成员RAS，MRNA<400>82ggcctgcctt acactgatgt tc 22<210>83<211>21
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶质运载蛋白家族2(利于葡萄糖转运)<400>83gccttttcgt taaccgcttt g21<210>84<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶质运载蛋白家族2(利于葡萄糖转运)<400>84tcctcgttgc ggttgatga 19<210>85<211>21<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>白介素13受体，α2(IL13RA2)，MRNA<400>85tgaaggctat ttgaagtcgc c21<210>86<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>白介素13受体，α2(IL13RA2)，MRNA<400>86cttcgcttca atgcccttg 19<210>87<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>丝氨酸/苏氨酸激酶12(STK12)，MRNA
<400>87tggaaacgtg tacttggctc g21<210>88<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>氨酸/苏氨酸激酶12(STK12)，MRNA<400>88accagcc gaa gtcagcaatc t 21<210>89<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>微染色体维持缺陷蛋白(啤酒酵母)5<400>89aagtttggcc tgactaccag ca 22
<210>90<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>微染色体维持缺陷蛋白(啤酒酵母)5<400>90ccagacgtgt ataccccaat gg 22<210>91<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>甲状腺激素受体中间子13(TRIP13)，MRNA<400>91cctgtgtaaa gcgttagccc ag 22<210>92<211>22
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>甲状腺激素受体中间子13(TRIP13)，MRNA<400>92gtggcccaat gtactgcttg at 22<210>93<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>类驱动蛋白6(KINESIN-LIKE 6)<400>93ccagctttaa cgaagccatg ac 22<210>94<211>22<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>类驱动蛋白6(KINESIN-LIKE 6)<400>94gcatttacca gaacctgtcc ca 22<210>95<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物3<400>95tcggtttatg tgctcttcca gg 22<210>96<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物3<400>96atcctcttag gtctcgcagg ct 22
<210>97<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>染色体凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA<400>97gctcgccaga aattcgagtc ta 22<210>98<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>染色体凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA<400>98catgatcact ttcagagtcg gc 22<210>99
<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA<400>99gcccactacc caagaaacca a21<210>100<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA<400>100cataaatccg caagtcacca ca 22<210>101<211>20<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>胞质分裂的蛋白质调节子1(PRC1)，MRNA<400>101cccaagtgga attgatgcga 20<210>102<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>胞质分裂的蛋白质调节子1(PRC1)，MRNA<400>102cccctcacac actgcttcat tt 22<210>103<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞分裂循环2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA
<400>103ctgattttgg ccttgccaga g21<210>104<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞分裂循环2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA<400>104ggatgattca gtgccatttt gc 22<210>105<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC20细胞分裂周期20，酿酒酵母，同源基因<400>105acagttcgcg ttcgagagtg a21
<210>106<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC20细胞分裂周期20，酿酒酵母，同源基因<400>106ttccactgag ccgaaggatc t21<210>107<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS<400>107tggctctctc ccagtagcat tc 22<210>108
<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS<400>108tcacttgcgg tcacatcttc c21<210>109<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>微染色体维持缺陷蛋白(啤酒酵母)7<400>109agagaacaca aggattgccc ag 22<210>110<211>22<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>微染色体维持缺陷蛋白(啤酒酵母)7<400>110atgacaggag ctgagacttg gc 22<210>111<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA<400>111ggcactgctg ctatgctgtt ag 22<210>112<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA
<400>112tgaaggtcca tgagacaagg c21<210>113<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA<400>113ggcgcaatga gctgcatta 19<210>114<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA<400>114aaatggcttc ctctggaagg tc 22
<210>115<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物2A(黑素瘤，p16，inhibits CDK4)(CDKN2A)，mRNA<400>115tccccgattg aaagaaccag a21<210>116<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>细胞周期蛋白依赖性激酶抑止剂2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A)(黑色素瘤p16，抑止CDK 4)(CDKN2A)，mRNA<400> 16aagagaagcc agtaaccccc ct 2权利要求
1.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是具有序列表的序列号1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示碱基序列的基因。
2.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是整联蛋白，ALPHA 6(ITGA6)，MRNA基因(NM_000210)；溶质载体家族20(磷酸盐转运)、成员1(NM_005415)基因；核糖核苷酸还原酶M2多肽(RRM2)，MRNA(NM_001034)基因；FOLLISTATIN(FST)，转录变异体FST317，MRNA(NM_006350)基因；SPROUTY(果蝇)同源基因G2(SPRY2)，MRNA(NM_005842)；RAB3B，成员RAS原癌基因(RAB3B)，MRNA(NM_002867)基因；溶质载体家族2(促进葡萄糖转运蛋白)(NM_006516)基因；白介素13受体，ALPHA 2(IL13RA2)，MRNA(NM_000640)基因；丝氨酸/苏氨酸激酶12(STK12)，MRNA(NM_004217)基因；微染色体维持缺陷蛋白(酿酒酵母)5(CE)(NM_006739)基因；甲状腺激素受体中间子13(TRIP13)，MRNA(NM_004237)基因；类驱动蛋白6(有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白)(K)(NM_006845)基因；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(CDK2-ASSOCIATED DUAL(NM_005192)基因；染色体凝缩蛋白G(HCAP-G)，MRNA(NM_022346)基因；CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA(NM_001826)基因；胞质分裂蛋白质调节子1(PRC1)，MRNA(NM_003981)基因；细胞增殖周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA(NM_001786)基因；CDC20(细胞增殖周期20，酿酒酵母，同源基因)(CD)(NM_001255)基因；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONICLEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791)基因；微染色体维持缺陷蛋白(酿酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；细胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA(NM_001237)基因；胸苷激酶1，SOLUBLE(TK1)，MRNA(NM_003258)基因；或细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(黑色素瘤，p16，抑制CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)。
3.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是含EGF的细胞微丝样细胞外基质蛋白1基因(NM_018894)；人胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)mRNA基因(AU132011)；人克隆24775mRNA序列基因(AA402981)；蛋白聚糖1，分泌颗粒基因(AV734015)；人胰岛素样生长因子结合蛋白5基因(AA374325)；溶质载体家族21(有机阴离子转运蛋白)，成员3基因(AF085224)；谷氨酰胺转移酶2(C多肽，蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷酰基转移酶)(AL552373)基因；抗血友病因子II(凝血酶)受体(M62424)；纤维蛋白溶酶原活化因子，鸟激酶(NM_002658)基因；金属蛋白酶组织抑制因子3(Sorsby fundusdystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基质Gla蛋白(BF668572)基因；B-cellCLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要组织相容性复合体的不变多肽，II类相关抗原)(BG333618)基因；内收蛋白3(γ)(AL135243)基因；溶质载体家族16(一元羧酸传送子)，成员4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂酰肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜结合蛋白质(BE858855)基因；脑源性神经营养因子(X60201)基因；或者载脂蛋白E(BF967316)基因。
4.用于检测间充质干细胞的基因标记，其特征在于其是为人WNT抑制因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假拟蛋白FLJ11175(FLJ11175)，MRNA(NM_018349)基因；人RHO GDP解离抑止剂(GDI)BETA(ARHGDIB)，MRNA(NM_001175)基因；人钾中间体/少量电导的钙活化(NM_021614)基因；人核因子(红细胞衍生物2)-类似物3(NFE2L3)，MRNA(NM_004289)基因；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA(NM_021643)基因；人CDNA 3′端与糖蛋白相类似的MUC18(AA302605)基因；人假拟蛋白FLJ21841(FLJ21841)，MRNA(NM_024609)基因；人锌指蛋白185(LIM区域)(ZNF185)，MRNA(NM_007150)基因；细胞周期控制中涉及的SC1＝假定的转移-活化因子[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH酶(辅酶Q)1α子复合体，8(19K)(NM_014222)基因；酵母MCM10的人同系物；假拟蛋白PRO2249(PRO2)(NM_018518)基因；人胶原，VII型，α1(大疱性表皮松解症，DYSTRO(NM_000094)基因；人自分泌运动因子受体(AMFR)，MRNA(NM_001144)基因；人克隆24421MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；以CDNADKFZP586E1621(源自克隆DKFZP586E1621)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因。
5.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人RESERVED(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素结合酶E2C(UBE2C)，MRNA(NM_007019)基因；人CDNA FLJ10517FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G(AK001379)基因；人软骨连接蛋白1(CRTL1)，MRNA(NM_001884)基因；人MRNA基因；CDNADKFZP434F2322(由克隆DKFZP434F2322获得)/CDS＝未知/GB(AL133105)；人，克隆MGC9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假拟蛋白DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人GLIA成熟因子，GAMMA(GMFG)，MRNA(NM_004877)基因人CDNAFLJ23095FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假拟蛋白DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA(NM_018410)基因；人IROQUOIS类同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA(NM_005853)基因；或者人假拟蛋白FLJ10540(FLJ10540)，MRNA(NM_018131)基因。
6.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人MRNA；CDNADKFZP434C1915(由克隆DKFZP434C1915获得)基因；PARTIAL CDS/C(AL137698)；人微染色体维持缺陷型(酿酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；人动力蛋白，细胞质的，中间体多肽1(DNCI1)，M(NM_004411)基因；蛋白质基因产物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA(NM_006479)基因；人含有杆状病毒IAP重复序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR(NM_001168)基因；人UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺N-乙酰基GAL多肽(NM_004482)基因；人细胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA(NM_031966)基因；人FLAP结构特异性内切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有丝分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-类似物1(MA)(NM_002358)；基因人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人与泛素结合酶类似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人细胞色素P450类维生素A代谢蛋白(P450RAI-2)基因，(NM_019885)；人NIMA(从未有丝分裂基因A)相关激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形态生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNAFLJ10674FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/GI(基因AK001536)；或者人着丝粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA(NM_001809)基因。
7.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人MRNA基因；CDNADKFZP564P116(FROM克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白质激酶(TTK)，MRNA基因(NM_003318)；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT1，IMPORTINα1)(KPNA基因(NM_002266)；人聚合酶(DNA导向的)，θ(POLQ)，MRNA基因(NM_006596)；人ETS变异体基因5(ETS相关分子)(ETV5)，MRNA(NM_004454)基因；人含转化酸性卷曲螺旋蛋白3基因(TAC)(NM_006342)；人驱动蛋白类似物1基因(KNSL1)，MRNA(NM_004523)；人着丝粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆_END＝3′/GB＝AI12基因(AI123815)；人DISTAL-LESS HOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓细胞性白血病病毒癌基因同系物类似物2(NM_002466)基因；或者人血清剥夺反应(磷脂酰丝氨酸结合)PRO(NM_004657)基因。
8.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人假拟蛋白FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI，大亚基(RNASEHI)，MRNA基因(NM_006397)；人ANILLIN(果蝇SCRAPS同系物)，肌动蛋白结合蛋白基因(NM_018685)；人H4组蛋白家族，成员G(H4FG)基因，MRNA(NM_003542)；人G蛋白连结受体37(内皮缩血管肽受体B型-基因(NM_005302)；人泛素载体蛋白(E2-EPF)，MRNA基因(NM_014501)；人，类似于肿瘤差别表达1基因，克隆IMAGE3639252，(BC007375)；人假拟蛋白MGC2577(MGC2577)，MRNA基因(NM_031299)；人假拟蛋白FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEX IN A3(ANXA3)，MRNA基因(NM_005139)；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，与核糖体蛋白L39类似，克隆MGC20168 IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蝇)类似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)。
9.用于检测间充质干细胞的基因标记，特征在于其是人蛋白酶复合体(PROSOME，MACROPAIN)26S亚基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻译起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氢嘧啶酶类似物3(DPYSL3)基因，MRNA)(NM_001387)；人ADAPTOR相关蛋白复合体1，σ2亚基(AP1S2)基因(NM_003916)；人网蛋白1，中间丝结合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人异种核蛋白U基因(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)；人假拟蛋白MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I类多肽相关序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相关蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受体膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚谷氨酸结合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人干扰素诱导的C型肝炎相关MICROTUBULAR AG基因(NM_006417)；人蛋白质激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亚基(NON-CATALYTICSUBUN)基因(NM_002733)；人前胶原-脯氨酸，2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE(脯氨酸(NM_004199)基因；人血管内皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因产物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)。
10.用于检测间充质干细胞基因标记的探针，其具有与权利要求1～9中任一记载的用于检测间充质干细胞的基因标记在严谨条件下杂交的DNA序列。
11.根据权利要求10记载的用于检测间充质干细胞基因标记的探针，其由权利要求1～9中任一记载的碱基序列的反义链的全部或者部分构成。
12.用于检测间充质干细胞基因标记的微阵列或DNA芯片，特征在于其固定有至少一个以上的权利要求10或11记载的DNA。
13.根据权利要求12记载的用于检测间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片，其特征在于其固定有具有序列表序列号1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19、或46所示碱基序列的基因组合和检测出权利要求2～9中任一记载的基因组合的2个以上基因的探针。
14.用于检测间充质干细胞的多肽标记，其特征在于其是具有序列表的序列3、5、8、13、16或18所示的氨基酸序列的多肽。
15.一种抗体，其特征在于其受权利要求14记载的多肽诱导、与该多肽特异性结合。
16.根据权利要求15记载的抗体，其特征在于抗体是单克隆抗体。
17.根据权利要求15记载的抗体，其特征在于抗体是多克隆抗体。
18.识别间充质干细胞的方法，特征在于对被检细胞中权利要求1-9中任一项记载的间充质干细胞标记基因的表达进行检测。
19.根据权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用RNA印迹法检测间充质干细胞标记基因的表达。
20.根据权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用用于检测权利要求10或11记载的间充质干细胞标记基因的探针对间充质干细胞标记基因的表达进行检测。
21.根据权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征是采用用于检测权利要求12或13记载的间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片对间充质干细胞标记基因的表达进行检测。
22.识别间充质干细胞的方法，其特征是权利要求18-21中任一记载的对间充质干细胞标记基因表达的检测包括定量或半定量PCR的使用。
23.根据权利要求22记载的识别间充质干细胞的方法，其特征是其使用的定量的或半定量的PCR是RT-PCR法。
24.用于扩增间充质干细胞标记基因的RT-PCR所使用的引物，其由以下物质组成由具有序列表的序列号20所示的碱基序列的正义引物以及具有序列表的序列号21所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号22所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号23所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号24所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号25所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号26所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号27所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号28所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号29所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号30所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号31所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号32所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号33所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号34所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号35所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号36所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号37所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号38所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号39所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号40所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号41所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号42所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号43所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号44所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号45所示的碱基序列的反义引物。
25.扩增间充质干细胞标记基因的实时PCR所使用的引物，其由下列物质构成具有序列表的序列号47所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号48所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号49所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号50所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号51所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号52所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号53所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号54所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号55所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号56所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号57所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号58所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号59所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号60所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号61所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号62所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号63所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号64所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号65所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号66所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号67所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号68所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号69所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号70所示的碱基序列的反义引物。
26.用于扩增间充质干细胞标记基因的RT-PCR所使用的引物，其由下列物质组成具有序列表的序列号71所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号72所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号73所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号74所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号75所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号76所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号77所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号78所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号79所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号80所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号81所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号82所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号83所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号84所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号85所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号86所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号87所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号88所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号89所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号90所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号91所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号92所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号93所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号94所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号95所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号96所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号97所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号98所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号99所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号100所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号101所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号102所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号103所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号104所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号105所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号106所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号107所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号108所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号109所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号110所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号111所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号112所示的碱基序列的反义引物、具有序列表的序列号113所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号114所示的碱基序列的反义引物、或具有序列表的序列号115所示的碱基序列的正义引物和具有序列表的序列号116所示的碱基序列的反义引物。
27.根据权利要求18记载的间充质干细胞的识别方法，其特征在于用权利要求24-26其中之一记载的正义引物以及反义引物中至少一对以上的引物扩增被检细胞中的基因，采用权利要求10或11中记载的用于检测间充质干细胞基因标记的探针对扩增的基因进行检测。
28.间充质干细胞的识别方法，其特征在于采用权利要求15-17其中之一记载的抗体对被检细胞中的间充质干细胞标记多肽的表达进行检测。
29.间充质干细胞的识别方法，其特征在于将被检细胞中由序列表的序列号1、11和19构成的间充质干细胞标记基因组成的组中一个以上基因的表达以及由序列表的序列号2、4、6、7、9、10、12、14、15和17构成的间充质干细胞标记基因组成的组中一个以上基因的表达组合起来，进行评价。
30.间充质干细胞的识别分离方法，其特征在于采用权利要求10或权利要求11记载的用于检测间充质干细胞基因标记的探针和/或权利要求15-17中任一记载的抗体对被检细胞中用于间充质干细胞检测的标记基因和/或用于间充质干细胞检测的标记多肽的表达进行检测、对识别出的间充质干细胞进行分离。
31.根据权利要求30记载的间充质干细胞的识别分离方法，其特征是通过采用权利要求15-17中任一记载的抗体的荧光抗体法将被检细胞中的间充质干细胞进行标识、分离经标识的间充质干细胞。
32.用于识别间充质干细胞的试剂盒，其中装备有权利要求10或11记载的用于检测间充质干细胞基因标记的探针、固定有该探针的权利要求12或13记载的用于检测间充质干细胞标记基因的微阵列或DNA芯片、和至少一个以上的权利要求15-17中任一记载的抗体。
全文摘要
本发明提供一种用于检测、分离识别间充质干细胞的标记以及采用该标记检测、分离识别间充质干细胞的方法。序列表所示基因在间充质干细胞中特异表达。该基因构成作为检测间充质干细胞的标记。尤其是，本发明含有用于检测该间充质干细胞标记基因的探针，以及在检测该间充质干细胞基因标记时扩增被检细胞所述基因的PCR所使用的引物，还含有本发明的间充质干细胞标记基因表达的多肽构成的用于检测间充质干细胞的多肽标记、用于检测该多肽标记的与该多肽标记特异结合的抗体，尤其是含有一种采用用于检测间充质干细胞标记基因的探针、与多肽标记特异结合的抗体对间充质干细胞进行识别、分离的方法。
文档编号C12P21/08GK1761749SQ200480007550
公开日2006年4月19日 申请日期2004年2月27日 优先权日2003年3月10日
发明者加藤幸夫, 辻纮一郎, 小池千加 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 加藤幸夫, 智再如股份有限公司