一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法与流程

本发明涉及医用材料
技术领域：
，具体涉及一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法。
背景技术：
：皮肤作为人体最大的组织，是与外界环境接触的屏障，当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，常常造成创面水分、电解质及蛋白质的丢失。自体断层皮片移植是公认的标准疗法。但是在大面积皮肤缺损患者，仍存在着供区不足及造成机体新的损伤等缺陷。因此，寻找一种理想的皮肤代用品一直是临床上一个急需解决的难题。随着组织工程学的飞速发展，使在体外构建组织工程皮肤成为可能。构建组织工程皮肤所需的生物支架一直是的一个重点和热点。理想的支架应具有以下特点：良好的生物相容性、一定的机械强度、易降解等。羊膜是胎盘上最靠近胎儿的一种薄膜状组织，这种半透明薄膜由单层立方上皮较厚的基底膜以及一层无血管的间质组成，上皮细胞层含有羊膜上皮细胞和多种生长因子，具有促进细胞生长的作用。目前羊膜作为皮肤组织修复材料，常用的技术为新鲜羊膜或深低温冷冻羊膜，但仍存在异体细胞引入免疫原性以及保存不便无法随用随取等特点。因此以脱细胞羊膜这种天然的细胞外基质皮肤修复材料作为组织工程产品已经成为重要的产品化策略之一。但是，目前现有的脱细胞羊膜制备方法普遍关注羊膜基质的完整程度，而忽略了脱细胞羊膜的细胞因子的含量，而这些细胞因子的存在能够更好地促进上皮形成、增生，使伤口快速愈合。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法，使得所述制备方法能够保证脱细胞羊膜基质的完整性以及较佳的细胞相容性，并具有较高含量的细胞因子(如egf、fgf和hgf等)。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法，包括：步骤1、对羊膜进行漂洗消毒，然后浸泡于dmem和甘油中-80℃保存6个月；步骤2、将浸泡的羊膜从-80℃到37℃反复冻融2～4次，然后将dmem和甘油洗去在trypsin-edta中过夜孵育；步骤3、用含有血清的dmem对孵育的羊膜进行终止消化，之后用pbs冲洗，冻干后获得脱细胞羊膜。针对现有脱细胞羊膜制备方法缺少对羊膜细胞因子考量的缺陷，本发明以dmem和甘油作为承载基质，采用反复冻融和胰酶细胞消化液结合的方式，实现脱细胞羊膜基质的完整性、并提高了羊膜中细胞因子的含量。作为优选，步骤1所述漂洗消毒为：用pbs反复漂洗多遍后，用抗生素溶液浸泡5分钟，然后pbs浸泡10分钟，如此浸泡重复3次。其中，抗生素溶液可选自青霉素溶液、链霉素和两性霉素b等抗生素，在本发明具体实施过程中，所述抗生素溶液为100-200u的青霉素、链霉素或阿奇霉素。作为优选，步骤1所述dmem和甘油体积比为1:(1～5)，在本发明具体实施过程中，dmem和甘油体积比为1:1、1:2.5或1:5。作为优选，步骤2所述trypsin-edta中胰酶质量浓度为0.1％～0.5％，在本发明具体实施过程中，所述质量浓度可以为0.1％、0.25％或0.5％。作为优选，步骤3所述血清为胎牛血清。作为优选，步骤3所述血清的体积浓度为5％。在一般的脱细胞羊膜制备中，采用胰酶细胞消化液处理的时间都较短，这是出于对羊膜基质完整性的考虑，防治其被胰酶降解，本发明出于对细胞因子含量和羊膜基质完整性综合考量，在反复冻融后延长胰酶消化时间(过夜孵育，一般可指代10-12小时)，达到了预期的目的。此外，本发明制备方法还包括从胎盘剥离羊膜的步骤：取胎盘并经血清检测排除病毒和细菌感染，如排除hiv，梅毒，hbv和hcv等感染，在无菌条件下从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗除去羊膜表面的血迹，并用镊子钝性去除羊膜的绒毛膜，获得羊膜。其中，胎盘的经过合法途径和正规来源获得，并经过产妇同意。按照本发明制备方法获得的脱细胞羊膜与制备前的新鲜羊膜相比，在完全去除上皮细胞的同时，基本保留了基底膜的完整结构，基质也未受影响；egf、fgf和hgf三种细胞因子的含量也显著高于其他对照的制备方法。同时，所制备的脱细胞羊膜无毒性，具备较佳的细胞相容性。由以上技术方案可知，本发明将反复冻融的物理脱细胞方法和胰酶消化的化学脱细胞方法相结合，并调整各工艺步骤相适应，促使羊膜中的细胞被高效彻底地去除且避免机械性损伤，同时保留了羊膜中较多的细胞因子。附图说明图1所示为脱细胞羊膜前后基底膜结构的变化电镜图；a为未脱细胞羊膜基底膜结构；b为脱细胞羊膜基底膜结构。具体实施方式本发明公开了一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下就本发明所提供的一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法做进一步说明。实施例1：制备脱细胞羊膜取胎盘并经血清检测排除hiv，梅毒，hbv和hcv等感染。在无菌条件下从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗除去羊膜表面的血迹，并用镊子钝性去除羊膜的绒毛膜。将羊膜用ph＝6.5-7.0的pbs反复漂洗多遍后，用100u的青霉素浸泡5分钟，pbs浸泡10分钟，此浸泡过程重复3次；pbs重新冲洗后将羊膜放入含dmem：甘油＝1：1的溶液中，-80℃条件下储存6个月；检测无病毒感染的羊膜，从-80℃到37℃反复冻融3次，这个过程完成后，羊膜4℃在0.25％trypsin-edta中过夜孵育约12h左右；用含有5％的胎牛血清的dmem对其进行终止消化，之后用pbs冲洗三次，然后冻干、辐照常温保存。实施例2：制备脱细胞羊膜取胎盘并经血清检测排除hiv，梅毒，hbv和hcv等感染。在无菌条件下从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗除去羊膜表面的血迹，并用镊子钝性去除羊膜的绒毛膜。将羊膜用ph＝6.5-7.0的pbs反复漂洗多遍后，用200u的链霉素浸泡5分钟，pbs浸泡10分钟，此浸泡过程重复3次；pbs重新冲洗后将羊膜放入含dmem：甘油＝1：2.5的溶液中，-80℃条件下储存6个月；检测无病毒感染的羊膜，从-80℃到37℃反复冻融2次，这个过程完成后，羊膜4℃在0.5％trypsin-edta中过夜孵育约12h左右；用含有5％的胎牛血清的dmem对其进行终止消化，之后用pbs冲洗三次，然后冻干、辐照常温保存。实施例3：制备脱细胞羊膜取胎盘并经血清检测排除hiv，梅毒，hbv和hcv等感染。在无菌条件下从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗除去羊膜表面的血迹，并用镊子钝性去除羊膜的绒毛膜。将羊膜用ph＝6.5-7.0的pbs反复漂洗多遍后，用150u的阿奇霉素浸泡5分钟，pbs浸泡10分钟，此浸泡过程重复3次；pbs重新冲洗后将羊膜放入含dmem：甘油＝1：5的溶液中，-80℃条件下储存6个月；检测无病毒感染的羊膜，从-80℃到37℃反复冻融4次，这个过程完成后，羊膜4℃在0.1％trypsin-edta中过夜孵育约12h左右；用含有5％的胎牛血清的dmem对其进行终止消化，之后用pbs冲洗三次，然后冻干、辐照常温保存。实施例4：脱细胞羊膜与制备前新鲜羊膜的结构对比将实施例1中用于制备的新鲜羊膜和制备后的脱细胞羊膜在电镜下观察拍照。见图1。完整羊膜上皮细胞的基底面通过大量的半桥粒结构紧密连接在基底膜表面。图1中用于制备的新鲜羊膜基质的结构完整性并未受影响，间质网状胶原纤维致密，排列整齐；脱细胞羊膜在完全去除上皮细胞的同时，基本保留了基底膜的完整结构，基质也未受影响。此外，实施例2和实施例3的对比结果也显示，本发明制备的脱细胞羊膜基本保留了基底膜的完整结构，基质也未受影响。实施例5：不同工艺的脱细胞羊膜的细胞因子含量对比实验组1-3为本发明实施例1-3制备的脱细胞羊膜，实验组4为0.25％胰酶+0.2％edta处理羊膜，实验组5为0.25％胰酶处理的羊膜，实验组6为0.2％edta处理的羊膜，实验组7为-80℃到37℃反复冻融处理的羊膜，实验组8为羊膜经0.25％trypsin-edta处理，然后-80℃到37℃反复冻融；实验组4-8其他操作均参照实施例1制备方法。将各组处理的羊膜，放于细胞培养皿中，加入适量的无血清培养基，在细胞培养相中静置7d，收集浸提培养液并用0.22μm滤器过滤消毒。用elisa试剂盒检测egf、fgf、hgf含量。结果见表1。表1羊膜脱细胞后细胞生长因子含量的检测从表1可以看出，实验组1-3中的羊膜所含有的细胞因子egf、fgf、hgf含量均高于实验组4-8(p<0.05)，说明本发明制备方法获得的脱细胞羊膜能够保留更多的细胞因子。实施例6：脱细胞羊膜细胞毒性和细胞相容性检测1、脱细胞羊膜的毒性检测1)将实施例1-3脱细胞羊膜(实验组1-3)，置含血清的培养基中，37℃下静置24h集浸提培养液并用0.22μm滤器过滤消毒。2)将小鼠成纤维细胞以1×104cells/孔的浓度种植到96孔板中，待细胞完全贴壁后换成浸提培养液培养48h。3)阳性对照组为5g/l的苯酚，阴性对照组为高浓度的聚乙烯瓶；两组的处理同实验组。4)cck-8检测法测定96孔板中成纤维细胞的活性，并用分光光度计读取450nm的吸光度(od450nm)。5)结果见表2。表2脱细胞羊膜的细胞毒性检测组别od值rgr(％)细胞毒性计分阴性对照组0.894897.20阳性对照组0.0191.33脱细胞羊膜浸提液组10.867696.540脱细胞羊膜浸提液组20.855895.770脱细胞羊膜浸提液组30.824592.560从表2中可以看出实验组处理的羊膜无毒性，可以初步判定可以用于组织工程支架材料。2、脱细胞羊膜的细胞相容性检测将实施例1-3脱细胞羊膜(实验组1-3)，制成与96孔板大小，至于96孔板中使其紧贴底部，加入5×104cells/孔的表皮细胞血液。以只培养表皮细胞为对照组，分别培养2、4、6、8天。用cck-8剂盒检测吸光度，测得的值与细胞增殖率呈正比例关系。结果见表3。表3脱细胞羊膜的细胞相容性检测组别2d4d6d8d对照组0.1880.3850.4570.568实验组10.1880.4020.4680.584实验组20.1850.4040.4600.578实验组30.1790.4110.4670.582从表3中可以看出实验组中表皮细胞的增殖率与对照组相比无明显差异，说明本发明制备的脱细胞羊膜适于皮肤种子细胞表皮细胞的生长而且还具有一定的促进作用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12