专利名称：麦芽酚在防治神经退行性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及麦芽酚在防治神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病中的应用。尤其涉及麦芽酚在防治阿尔茨海默氏病中的应用。
氧自由基对神经细胞的损伤在阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病的发生具有严重的危害。本发明人发现麦芽酚具有保护神经细胞免受氧自由基损伤作用，以SH-SY5Y(人类神经细胞瘤)细胞株为研究对象，从细胞学到分子生物学的实验结果都证明麦芽酚对神经细胞的损伤，DNA的修复，钙的拮抗，线粒体功能的恢复，核因子的调控以及神经细胞的凋亡都有明显的保护作用。另外，采用拟痴呆小鼠模型也测试了麦芽酚的防治作用。也即本发明人首次发现麦芽酚具有防治阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病的潜力，经过进一步深入研究，终于完成了本发明。
发明内容
本发明涉及麦芽酚在防治阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病中的应用。
本发明还涉及一种防治阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病的药物组合物，其包括治疗有效量的麦芽酚。优选地，治疗有效量为5mg/kg/日。
附图描述
图1示出麦芽酚对SH-SY5Y细胞形态的保护作用，其中A为对照，SH-SY5Y细胞未经任何保护，B为100μM H2O2处理，C为100μM H2O2+2mM麦芽酚保护，D为200μM H2O2处理，E为200μM H2O2+2mM麦芽酚保护。
图2示出麦芽酚对SH-SY5Y细胞的促进生长作用。
图3示出麦芽酚对细胞DNA损伤的保护作用，其中A为对照(SH-SY5Y细胞未经任何保护)，B为100μM H2O2处理，C为100μM H2O2+2mM麦芽酚保护，D为200μM H2O2处理，E为200μM H2O2+2mM麦芽酚保护。
图4示出麦芽酚对SH-SY5Y细胞DNA含量的保护作用。
图5示出麦芽酚可以使SH-SY5Y细胞PS外翻率减少而抑制细胞凋亡。
图6是示出麦芽酚对SH-SY5Y细胞线粒体功能具有保护作用的Rh123荧光探针标记分析图。
图7为示出麦芽酚对SH-SY5Y细胞胞内钙减少的图象采集分析图，其中A100μM H2O2，B100μM H2O2+2mM麦芽酚，C200μM H2O2，D200μM H2O2+2mM麦芽酚处理。
图8示出麦芽酚对SH-SY5Y细胞NF-κB核因子Western Blot结果图，其中A对照(SH-SY5Y细胞未经任何保护)，B200μMH2O2，C200μM H2O2+2mM麦芽酚处理。
图9为麦芽酚对SH-SY5Y细胞APP蛋白荧光标记的细胞形态图，其中A对照(SH-SY5Y细胞未经任何保护)，B200μM H2O2，C200μM H2O2+2mM麦芽酚。
图10为麦芽酚对SH-SY5Y细胞APP蛋白Western Blot分析图，其中A对照(SH-SY5Y细胞未经任何保护)，B200μM H2O2，C200μM H2O2+2mM麦芽酚。
具体实施方案本发明以下参照附图和实施例进一步描述。
本发明人以前的工作发现麦芽酚具有抗氧化作用，于是，本发明人以SH-SY5Y(人骨髓神经母细胞瘤，细胞来源于Clinica Pediatrica，Ospedale S.Orsola-Malpighi) 细胞株为研究对象，从细胞学到分子生物学的实验结果都可以证明麦芽酚对神经细胞的损伤，DNA的修复，钙的拮抗，线粒体功能的恢复，核因子的调控以及神经细胞的凋亡都有明显的保护作用。另外，采用拟痴呆小鼠模型也测试了麦芽酚的防治作用。实验证明是有效的。因此，麦芽酚是用于防治阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病的潜在药物。实施例1麦芽酚对SH-SY5Y细胞形态的保护作用采用1640培养基培养SH-SY5Y细胞，接种密度为105/ml，加入2mmol/l麦芽酚作用2小时后，加入H2O2，37℃细胞培养箱培养10小时，倒置显微镜下观察细胞形态。
结果如图1的A-E所示，H2O2作用后细胞缩小变形，边界模糊，内有空泡等形态学改变，麦芽酚保护后形态改变减少。实施例2麦芽酚对SH-SY5Y细胞的促生长作用采用MTT实验测定麦芽酚对细胞的促生长作用。MTT化学名为3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，商品名是噻唑蓝(简称MTT)，它可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的兰紫色结晶物并沉积在细胞体内，但是在死细胞内MTT却不能被还原为兰紫色结晶物，DMSO可以溶解这兰色的结晶，故通过测定在特定波长下吸光度的不同可以反映细胞的生长状态。
结果如图2所示，通过MTT实验，结果显示麦芽酚保护后，细胞存活率明显升高，说明麦芽酚可以促进神经细胞的生长。实施例3麦芽酚对SH-SY5Y细胞DNA损伤的保护作用一、麦芽酚对SH-SY5Y细胞DNA小片段形成的保护作用在细胞凋亡过程中，核内基因组DNA可以被活化的内源性核酸内切酶降解为180-200bp的整倍数小片段，此种DNA小片段是细胞凋亡的特征性改变。提取细胞内DNA，进行琼脂糖凝胶电泳分析，检测是否存在这种DNA小片段是检验细胞凋亡的重要指标之一。
具体步骤如下取106细胞在冷PBS中洗两遍；于2ml裂解液中裂解(50mMTris-HCl PH8；20mM EDTA，PH8 2％SDS)；37℃过夜；在冰上置10min；加入0.8ml饱和NaCl，3000rpm离心1小时，取上清，再用同样条件离心一次；加入RNase于上清中(终浓度20μg/ml)，37℃，15min；两倍体积的无水乙醇沉淀DNA。
结果如图3所示，麦芽酚可以明显保护DNA损伤，减少小片段DNA的形成。二、麦芽酚对SH-SY5Y细胞内DNA含量的保护作用通过碘化丙啶(PI)测量胞内DNA含量，评价麦芽酚对细胞DNA损伤的保护作用。PI可以与细胞内的DNA结合，故用PI染色后可以测定细胞内的DNA含量。在细胞凋亡的过程中，细胞内DNA被片段化，此类细胞经乙醇固定后，小片段的DNA会从细胞内漏出，采用流式细胞仪检测，可以发现凋亡细胞的PI荧光强度降低，可以在二倍体峰前出现一个亚二倍体峰，所以亚二倍体峰的比例可以反映凋亡细胞的比例。
具体步骤取106细胞，以PBS洗两次，以0.5ml PBS悬浮细胞，将细胞悬液加入5ml 70％冷乙醇中，4℃固定12小时以上；用PBS洗去乙醇，1500rpm离心5min；用0.5ml PBS悬浮细胞，加入1mg/ml RNase25ul(终浓度50ug/ml)30min 37℃。加入25ul PI(使用浓度为1mg/ml，终浓度为50ug/ml)，30min 37℃。
结果如图4所示，PI标记流式细胞仪结果表明麦芽酚可以保护DNA免受损伤，氧化损伤后细胞内亚二倍体峰的比例增加，而麦芽酚保护后该比例可明显降低。实施例4 麦芽酚可以抑制SH-SY5Y神经细胞的凋亡采用荧光标记试剂盒检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻率，原理是在细胞凋亡的早期，由于膜脂不对称性的消失，使原本定位在细胞质膜内表面的PS转移至质膜外表面。PS可以特异的与FITC偶联的Annexin-V结合，通过流式细胞仪可以检测PS的外翻率，反映细胞凋亡百分率。
具体步骤取106细胞，1200rpm离心，5min；PBS洗沉淀，离心1200rpm，5min；加反应液100μl，室温10-15min(反应液为，1000μl PS孵育液，20μl PS溶液，20μl，50μg/ml PI)；洗去反应液，加入400μlPS孵育液(孵育液为，10mM Hepes/NaOH，140mM NaCL，5mMCaCL2)；最后流式细胞仪检测分析。
结果如图5所示，麦芽酚可以明显使PS外翻率降低，表明麦芽酚可有效保护细胞的凋亡。实施例5 麦芽酚可以保护SH-SY5Y细胞线粒体的功能线粒体膜电位(Δψm)的检测按照文献Brain Res Brain ResProtoc 1999 Dec；4(3)280-7方法分析。检测原理是线粒体膜电位(Δψm)是由线粒体膜内外两侧质子和其他离子不对称分布造成的，阳离子亲脂荧光素罗丹明-123(Rh123)可以扩散到线粒体内，而当线粒体膜电位(Δψm)降低后，线粒体内的罗丹明-123会发生外漏，故通过检测细胞内罗丹明-123的荧光强弱可以反映出线粒体膜电位的高低。用PI和Rh123双染细胞可以排除一些晚期凋亡的细胞，可以更早期的发现线粒体膜电位的改变。
具体步骤收集处理过的约106个细胞，1000rpm离心5分钟，PBS(pH7.4)洗涤2遍，1000rpm离心5分钟，用10μg/mL罗丹明123(Rh-123)1mL重悬细胞，37℃下避光孵育1小时。PBS洗涤一遍后，500μLPBS重悬，加入1mg/ml RNase2.5ul(终浓度5ug/ml)30min 37℃，加入2.5ulPI(使用浓度为1mg/ml，终浓度为5ug/ml)，30min 37℃。流式细胞仪检测分析。
结果如图6所示，麦芽酚保护后的细胞线粒体膜电位比氧化损伤后的细胞的变化小，证明麦芽酚可以保护线粒体的损伤。实施例6 麦芽酚可有效的抑制SH-SY5Y细胞内钙的生成采用Fura-2/AM荧光标记法测定细胞内的游离钙浓度，Fura-2的化学名为2-[6-双乙酸基-5-(2-双乙酸氨基)-5-甲苯氧乙氧基]-2-苯并呋喃基-5-恶唑羧酸五钾盐。Fura-2因有较强的亲水性难以进入细胞，在Fura-2的负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基脂成为Fura-2/AM后与细胞温孵时很容易透过细胞膜，胞浆内的酯酶将Fura-2/AM水解为Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞浆内游离的钙结合形成复合物。Fura-2及其与钙结合的复合物的最大激发光波长分别为380nm和340nm。其发射光的强度与钙量呈正比例关系，据此可测定钙浓度。本例采用了日本滨松(HAMAM ATSU)光子学株式会社的AQUA COSMOS图像采集分析系统。
具体步骤收集2×106细胞，离心后用1mL HBSS缓冲液悬浮，加入1μmol/LFura-2/AM，37℃标记45分钟。未负载的探针用大量HBSS洗掉后，再用1ml HBSS缓冲液悬浮，滴加在多聚赖氨酸处理过的平皿中，采用380nm和340nm两种滤光片在荧光显微镜下进行双波长测定。条件是数据记录间隔为10秒，每份样品记录200个点，曝光时间为222mS。随机选取4-5个细胞，计算机监测走基线，基线平稳代表细胞内游离钙浓度稳定。然后加入H2O2进行诱导，观察游离钙浓度的变化情况。
结果如图7所示，麦芽酚可以抑制氧自由基引起的胞内钙升高，细胞内的钙浓度上升比未保护的明显减小。实施例7麦芽酚可调控SH-SY5Y细胞核因子NF-κB提取SH-SY5Y细胞核因子，将提取的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后进行电转移。电转移后取下硝酸纤维膜(NC)，放入封闭液，室温封闭2h(或摇动封闭过夜)。将NC膜在TBS中洗30min，重复2次。NC膜放入小塑料袋中，加入I抗，将小塑料袋封好。37℃摇动2h左右，也可4℃过夜。用去离子水洗NC膜，然后在TBS-T中彻底洗30min，重复2次。将NC膜放入封小塑料袋中，加入辣根过氧化物酶标记的II抗，37℃摇动2h。用去离子水洗NC膜，然后在TBS-T中彻底的洗30min，重复2次。最后显色液显色。
结果如图8所示，200μM H2O2作用后，细胞核蛋白NF-κB表达明显下降，本例中已经检测不到表达，麦芽酚保护后，其表达水平与对照组相近。实施例8 麦芽酚可抑制SH-SY5Y细胞APP表达的作用β淀粉样肽是老年斑形成的始动因子，它来自它的前体蛋白淀粉样肽前体(amyloid peptide precursor，APP)或淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)。因此，APP的表达过高，是老年性痴呆病因之一，有效降低APP的产生对治疗阿尔茨海默氏病有重要作用。
本例用市售APP单克隆抗体采用荧光标记免疫组织化学和Western印迹分析方法检测APP蛋白表达具体步骤一、组织化学方法将细胞涂片放入4％多聚甲醛，室温固定20-30min；PBS洗去多聚甲醛；0.5％ BSA in PBS封闭细胞涂片30min；PBS洗两次；一抗APP(120)染色1-2小时，FITC标记的二抗IgG(140)染色30min，4℃；PBS洗两次，荧光显微镜下观察。结果如图9所示。二、麦芽酚可以调控SH-SY5Y细胞APP蛋白采用Western印迹分析麦芽酚对SH-SY5Y细胞APP蛋白的调控，结果如图10所示。
组织化学及Western印迹分析结果发现，麦芽酚均可抑制200μM H2O2作用后SH-SY5Y细胞APP表达水平升高，两种方法结果一致，说明麦芽酚可以使APP蛋白下调，从而保护神经细胞的损伤。实施例9 动物模型测试麦芽酚对防治阿尔茨海默氏病的作用本例中通过观察动物的认知行为、多种抗氧化酶活性及脑内胆碱能、谷氨酸能神经功能的变化等指标，评价麦芽酚对Aβ致痴呆小鼠的作用，并与两种阳性对照药晶珠舒欣宁(中药)和安理申(西药)进行比较，为麦芽酚防治阿尔茨海默氏病的药效学提供实验依据。1、受试药物名称麦芽酚，含量≥99％溶剂生理盐水配制方法以生理盐水将麦芽酚配置成不同浓度的等容量混悬液2、阳性药物对照及选择依据阳性药(1)晶珠舒欣宁青卫药准字(1995)第000394号，青海晶珠藏药药业有限公司产品。选其提高机体清除自由基的能力，抗疲劳，增强记忆功能，脑保护及拮抗记忆力衰退作用。阳性药(2)安理申(Aricept)卫材制药有限公司产品，美国FDA和英国MCA批准上市。该药选择性抑制乙酰胆碱酯酶。选其对临床老年痴呆症的治疗作用。3、麦芽酚三个用药剂量选择根据本实验室过去在小鼠动物实验取得的较好实验结果，本实验选择了25mg/kg，50mg/kg，75mg/kg。4、动物采用昆明系小鼠(一级)，购自军事医学科学院实验动物中心。体重20.14±1.33g性别雌雄各半各组动物16只方法与结果1.模型制作和给药小鼠随机分成7组，雌雄各半。各组动物经灌胃给药(对照和模型组给等量生理盐水)7天后，所有动物单侧侧脑室进行定位(A-2mm，L2mm，H-3mm)，一次脑室内注射Aβ25-35(3mmol/L)2.5ul，造成拟痴呆模型，对照组注射等量灭菌生理盐水。
药物剂量设置被试药物麦芽酚设上述三个剂量组，即高剂量为75mg/kg，中剂量为50mg/kg，低剂量为25mg/kg。术后各药物组继续治疗7天。阳性对照药晶珠舒欣宁和安理申投药量分别参考人用临床剂量30ml/70kg和5mg/70kg与小鼠换算求得，分别为3.87ml/kg，0.645mg/kg。
由于晶珠舒欣宁的生药含量资料无法获得，暂以ml/kg表示。2.学习记忆行为测试(1)避暗实验试验装置由明暗两室组成，两室间有一圆洞可容小鼠通过。两室底部铺有铜栅，暗室铜栅可通25v直流电。实验时，将小鼠放入箱内，由于其喜暗性，通常愿钻入暗室内，因受电击刺激而返回明室，此时取出小鼠，记录其从放入明室至进入暗室受电击所需时间，此即潜伏期。12h内重复测验，记录动物进入暗室的潜伏期和错误次数，180s完成实验，此为短期学习记忆指标。24h后重复相同实验为长期记忆指标。此实验于术后第6天和第7天进行。结果如下表1所示。表1麦芽酚对小鼠回避性条件反射的影响剂量 电击次数/3min组别 mg/kg (n) 12h内(短期记忆) 24h后(长期记忆)对照 等量生理盐水 14 0.73±0.23 0.13±0.09模型组 等量生理盐水 14 0.47±0.13 0.47±0.22*阳性药(1) 0.5ml/kg 14 0.40±0.19 0.40±0.16阳性药(2) 0.645 14 0.47±0.17 0.33±0.16麦芽酚(低) 2514 0.47±0.19 0.27±0.15麦芽酚(中) 5014 0.13±0.09 0.20±0.11麦芽酚(高) 7514 0.47±0.17 0.13±0.09#注阳性药(1)晶珠舒欣宁；阳性药(2)安里申*P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.01，与模型组比较小鼠12h内回避试验电击次数短期记忆，各组间无显著性差异，24h后长期记忆测试，模型组与对照组存在显著性差异，治疗组电击次数均比模型组减少，其中麦芽酚三个剂量组均有明显的减少并呈剂量-效应关系。
(2)Morris水迷宫实验水迷宫由一圆型水池(高70cm，直径80cm)和一站台(直径8cm)组成。水池上空设有一数字摄相机与计算机连接。池中水深15cm，加入炭素墨水后呈不透明的黑色，水面高出站台表面0.5cm，使小鼠不能看到站台。水温控制在22±0.5℃。小鼠每次从相同入水点入水。记录120s内动物从入水至找到站台所需时间及路程和速度，以找到站台所需时间作为学习和记忆成绩，若在120s内未找到站台，实验自动结束。此实验在给药第3天进行训练，给药后第4天，第5天，第7天(三次)进行实验并记录成绩。结果如下表2所示。表2 麦芽酚对小鼠空间学习记忆(Morris水迷宫试验)的影响组别 剂量mg/kg (n) 第一次实验第二次实验对照组等量生理盐水 1497.1±35.475.4±44.2模型组等量生理盐水 1480.3±46.880.1±46.1阳性药(1) 3.87ml/kg 1487.6±43.476.6±47.5阳性药(2) 0.645 1489.3±38.468.8±50.8麦芽酚(低)251492.4±36.676.6±43.5麦芽酚(中)501487.0±49.793.4±42.6麦芽酚(高)751488.5±40.680.4±49.3组别 剂量mg/kg (n) 第三次实验第四次实验对照组等量生理盐水 1456.4±45.928.7±23.8模型组等量生理盐水 1466.0±46.375.3±44.0*阳性药(1) 3.87ml/kg 1469.8±47.545.3±43.2阳性药(2) 0.645 1481.9±48.440.4±37.9#麦芽酚(低)251462.9±46.867.1±45.5麦芽酚(中)501483.8±49.058.9±44.6麦芽酚(高)751468.1±42.853.0±43.8*P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.01，与模型组比较以Morris水迷宫测定小鼠空间学习记忆能力。通过三次学习以后，第四次测试，模型组与对照组比较，找到站台的时间明显延长(P＜0.01)，所有治疗组所需时间均比模型组缩短，其中麦芽酚低，中，高剂量组的减少呈一定线性关系。
回避性条件反射--明暗箱法试验和MORRIS水迷宫试验观察到小鼠学习记忆能力和空间学习能力明显受损。说明拟痴呆小鼠模型的建立成功。经麦芽酚和两种阳性药治疗后，小鼠行为学各指标明显改善。在回避性条件反射实验长期记忆测试中，麦芽酚三个剂量组优于晶珠舒欣宁和安理申组，且麦芽酚高剂量组有显著性差异。3.抗氧化酶类测定样品制备(a)10％脑组织匀浆的制备取鼠脑称重量，加入10倍体积(M/V)的冷生理盐水，冰浴中匀浆，充分研磨。作SOD，MDA和神经生化的测定。
(b)蛋白浓度测定采用Folin-酚法，分别测定，10％小鼠大脑皮层，10％小鼠海马的蛋白浓度。用牛血清白蛋白作为标准蛋白。
抗氧化酶类测定(1)超氧化物歧化酶(SOD)测定氧自由基氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫色。当SOD活性较高时，超氧阴离子自由基被专一性的抑制，使形成的亚硝酸盐减少，用可见分光光度计测其吸光度，在550nm处比色测定SOD活性。结果如下表3所示。
表3.麦芽酚对小鼠大脑皮层，海马SOD酶活性的影响组别 剂量 (n)大脑皮层海马mg/kg (亚硝酸盐单位/mg prot)对照组等量生理盐水 1424.6±4.8 33.8±5.1模型组等量生理盐水 1418.3±9.8*21.9±8.6*阳性药(1) 3.87ml/kg 1429.0±9.4#34.3±4.6#阳性药(2) 0.645 1430.8±5.0#39.1±6.3#麦芽酚(低)251429.1±6.6#35.6±4.9#麦芽酚(中)501429.0±4.1#36.0±4.1#麦芽酚(高)751432.1±8.1#36.9±6.2#*P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.01，与模型组比较与对照组相比，模型组小鼠大脑皮层和海马SOD酶活性均有明显下降。两个阳性药物与模型组有显著性差异(P＜0.01)，经麦芽酚三个剂量治疗组亦均有显著性差异(P＜0.01)。
(2)丙二醛(MDA)测定MDA为脂质过氧化物以及其降解产物，MDA可与硫巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。通过MDA的测定可以间接的反映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度。测定结果如下表4所示。表4 麦芽酚对小鼠大脑皮层，海马MDA含量的影响组别 剂量(n) 大脑皮层海马mg/kg (nmol/mg prot)对照组等量生理盐水143.3±0.93.5±1.6模型组等量生理盐水144.1±0.9*4.7±1.4*阳性药(1) 3.87ml/kg 143.3±0.7#4.1±0.6阳性药(2) 0.645 143.5±0.6#4.1±0.4麦芽酚(低) 25 143.8±1.14.1±0.7麦芽酚(中) 50 143.6±0.54.1±0.8麦芽酚(高) 75 143.4±0.7#4.0±0.6*P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.01，与模型组比较与对照组相比，模型组小鼠大脑皮层和海马MDA含量均有明显增加。在皮层组织中，两个阳性药物与模型组有显著性的差异(P＜0.01)，都有显著性的差异(P＜0.05)。在海马组织中，模型组与对照组有显著性的差异(P＜0.01)。
模型组的大脑皮层和海马的抗氧化酶SOD活性明显降低，过氧化物产物MDA明显增加，说明Aβ25-35拟小鼠痴呆模型的神经损伤与自由基产生有关。经麦芽酚和两种阳性药物治疗后可增加SOD活性，无论是大脑皮层还是海马，两种阳性药和麦芽酚均有显著的抗氧化作用和治疗效果。另外，对模型组MDA脂质过氧化产物的增高，晶珠舒欣宁，安理申麦芽酚(高)均有显著的治疗作用，大脑皮层的改善较明显。4.神经生化测定(1)受体结合实验(a)脑突触粗膜制备取冻存的脑匀浆液，加入Tris-醋酸缓冲液(50mmol/L，pH7.4)，在冰浴中用玻璃匀浆器研磨1min，匀浆于4℃ 15000g离心30min，重复4遍，弃上清，将沉淀冻于-70℃备用，此即为脑突触粗膜。
(b)M受体测定取100μl用50mmol/L的PBS(pH7.7)悬浮的突触粗膜，加入M受体的配基3H-QNB(二苯羟乙酸奎宁酯)10μl(终浓度0.1nmol/L)，非特异结合管中加入0.1mmol/L阿托品，于25℃水浴振荡孵育60min后，加入预冷的PBS 5ml，抽滤在纤维素膜上，再用15ml缓冲液淋洗。滤膜移入液闪杯中，加入甲苯含triton的甲苯闪烁液7ml，于液闪计数仪上测放射活性。结果如下表5所示。
表5 麦芽酚对小鼠大脑皮层、海马M受体结合活性的影响组别 剂量 大脑皮层 海马mg/kg(n)3H-QNB结合(nmol/mg蛋白)对照 等量生理盐水 14997.3±64.7875.3±36.5模型组 等量生理盐水 14928.4±96.8746.1±52.7*阳性药(1) 3.87ml/kg14997.0±53.7951.7±52.1#阳性药(2) 0.64514969.6±25.6879.4±57.1#麦芽酚(低 25 14924.2±70.2945.9±26.1##麦芽酚(中 50 141056.4±66.2 851.6±28.1麦芽酚(高 75 141042.5±70.9 866.3±32.3P＜0.001，与对照组比较；#p＜0.01，##p＜0.001，与模型组比较胆碱能M受体结合活性变化大脑皮层M受体结合活性各组间未见明显统计学差异。在海马部位，模型组该受体结合明显低于对照组(p＜0.01)，所有治疗组的M受体结合活性均有明显提高，其中阳性药(1)和麦芽酚低剂量组p(0.001，阳性药(2)组p＜0.05。(c)NMDA受体测定取100μl用50mmol/L的Tris-醋酸缓冲液(pH7.4)稀释的突触粗膜，加入NMDA受体的配基3H-MK801 10μl(终浓度0.5nmol/L)。非特异结合管中加入非标记的MK801，于30℃水浴振荡孵育30min后，加入预冷的Tris-醋酸缓冲液5ml，抽滤在纤维素膜上，再用20ml缓冲液淋洗。滤膜移入液闪杯中，加入含Triton的甲苯闪烁液7ml，于液闪计数仪上测放射活性。结果如下表6所示。
表6 麦芽酚对小鼠大脑皮层、海马NMDA受体结合活性的影响组别 剂量 大脑皮层 海马mg/kg (n)3H-QNB结合(nmol/mg蛋白)对照 等量生理盐水 14 202.3±13.245.6±3.5模型组 等量生理盐水 14 189.0±17.836.0±1.4*阳性药(1) 3.87ml/kg 14 202.4±10.240.7±1.5阳性药(2) 0.645 14 198.2±10.447.9±2.9#麦芽酚(低) 2514 247.2±23.2##49.3±4.3#麦芽酚(中) 5014 258.7±16.6##37.0±2.8麦芽酚(高) 7514 263.7±28.0#41.3±1.4*P＜0.05，与对照组比较；# p＜0.05，## p＜0.01，与模型组比较NMDA受体结合活性变化在大脑皮层，模型组的NMDA受体结合活性比对照组下降但无明显统计学差异。经麦芽酚低、中、高三个剂量治疗后其结合量明显上升，低、中剂量组达到p＜0.001，高剂组达到p＜0.05。在海马部位，模型组NMDA受体结合活性较对照组明显下降(P＜0.05)。所有药物治疗组均可以提高NMDA受体的结合活性，其中阳性药(2)和麦芽酚(低)组有明显的统计学意义(P＜0.05)。
(2)胆碱乙酰转移酶(ChAT)测定采用同位素标记合成法。取新鲜脑匀浆20μl加入50μl反应液(含氯化胆碱10mmol/L，硫酸毒扁豆碱1mmol/L，乙二胺四乙酸10mmol/L，溶于300mmol/LPBS，pH7.4)和10μl3H-乙酰辅酶A(3H-CoA，终浓度0.1mmol/L)，于37℃反应30min后，用3ml冷的PBS(含氯化乙酰胆碱35.7mg/L)终止反应。并加入含有10mg四苯硼钠的乙腈2ml，再加入6ml甲苯闪烁液，轻轻振摇1min，使生成的3H-Ach移向有机溶媒层，10min后测其生成量。结果以每分钟每毫克蛋白生成的3H-Ach的克分子数表示。结果如下表7所示。
表7 麦芽酚对小鼠大脑皮层、海马ChAT活性的影响组别 剂量大脑皮层 海马mg/kg(n) (pmol/mg蛋白/min)对照 等量生理盐水 14 236.1±22.8314.0±15.5模型组 等量生理盐水 14 242.5±17.2269.5±6.3*阳性药(1) 3.87ml/kg14 222.1±11.5259.2±9.0阳性药(2) 0.64514 226.3±12.3296.8±19.2麦芽酚(低) 25 14 249.6±14.5254.6±14.5麦芽酚(中) 50 14 223.2±7.6 326.7±44.5麦芽酚(高) 75 14 223.6±19.0378.4±37.3#*P＜0.05，与对照组比较；# p＜0.05，与模型组比较ChAT活性的变化小鼠大脑皮层各组间ChAT的活性差异不明显。在海马部位，模型组的ChAT活性比对照组明显降低(p＜0.05)，麦芽酚中、高剂量组ChAT活性明显增高，其中高剂量组有显著统计学差异(p＜0.05)。
模型组海马部位的ChAT酶活性明显降低，胆碱能M受体和谷氨酸NMDA受体结合活性均明显低于对照组，表明这些神经功能的改变是造成学习记忆障碍的重要原因。经麦芽酚和两种阳性对照药治疗后，上述神经生化学改变均得到不同程度的恢复。麦芽酚高剂量组chAT活性明显增高，有显著统计学差异。麦芽酚还明显增加大脑皮层M和NMDA受体的结合活性，优于两种阳性对照药，该受体加强兴奋性突触传递，促进长时程突触电位(LTP)增强，是改善痴呆模型小鼠学习记忆的重要机理之一。
综合动物实验和细胞学的实验结果，可以说明麦芽酚对Aβ拟痴呆的小鼠模型和神经细胞SH-SY5Y均有明显的保护作用，是一种潜在的防治阿尔茨海默氏病的药物。
权利要求
1.麦芽酚在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
3.一种防治神经退行性疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的麦芽酚。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述治疗量为5mg/kg日。
全文摘要
本发明涉及麦芽酚在防治神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病中的应用。本发明还涉及以麦芽酚为活性成分的用于防治阿尔茨海默氏病的药物组合物。
文档编号A61P25/00GK1452959SQ0211849
公开日2003年11月5日 申请日期2002年4月27日 优先权日2002年4月27日
发明者许彩民, 潘华珍 申请人:中国医学科学院基础医学研究所