一类抗氧化超短肽及其应用的制作方法

本发明涉及一类抗氧化超短肽及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

自由基是具有强氧化活性的一组物质，极易发生反应。活性氧自由基不仅会使人体内的脂质与蛋白质发生链式氧化反应导致细胞膜、组织、酶和基因受损,对肌体造成了损害和衰老，而且会促使有关的基因突变，诱发相关的疾病，如动脉硬化症、高血压、类风湿性关节炎、白内障、老年痴呆症、帕金森氏病以及神经退行性病变等。越来越多的医学研究及临床试验证据显示，体内自由基含量越高寿命越短，自由基可谓“万病之源”。

近年来抗氧化在化妆品领域的应用中很广泛。由于皮肤的光老化作用是由于紫外线诱导皮肤细胞产生大量的氧自由基堆积而造成的。现在许多护肤品中加入抗氧化剂,有减少雀斑、防辐射、延缓衰老、调节免疫和提高皮肤自我保护的作用。此外食品中营养成分的氧化反应会产生过氧化物。过氧化物影响食品的营养价值，甚至严重还可导致疾病发生，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。

目前，化工领域常用抗氧化剂多为化学合成物，如bha、bht等，虽抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺有蓄积性致癌作用。临床上常见的抗氧化剂如维生素c、维生素e与谷胱甘肽等。维生素c主要以清除·oh为主，但需大剂量使用才能达到目的，但同时，大剂量维生素c使用容易导致酸中毒；维生素e主要通过抑制细胞膜上的脂质过氧化来达到抗氧化的目的，但长期是用则有潜在的致突变风险。而临床还原型谷胱甘肽的产业化壁垒较高，已被日本协和发酵工业株式会社几乎垄断全球谷胱甘肽的供应,每公斤高达8000美金。同时，现在国内制药企业所用的谷胱甘肽制药原料还不能摆脱进口，谷胱甘肽价格一直居高不下。可见，活性佳、易合成、产量高的新型抗氧化肽已在医疗、食品、化妆品等领域中亟待开发。

小分子超短肽purin-wh1、purin-wh2，具有极强的抗氧化活性，invitro对多种自由基的清除率优于临床抗氧化制剂——谷胱甘肽，且无细胞毒、无溶血，稳定性高。purin-wh1、purin-wh2一级序列全长只有5-6个氨基酸残基、分子量小、结构简单、无蛋白修饰，通过化学合成方法制备，工艺简便、产量高且纯度高，对比临床还原型谷胱甘肽，生产成本大大降低。因此，本专利中的两种超短肽purin-wh1、purin-wh2具有十分突出有益的效果。

技术实现要素：

本发明涉及一类抗氧化超短肽，包括两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2及其在制备抗氧化药物、食品、化妆品添加剂的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供的两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2化学合成的方法得到。其中purin-wh1分子量为544.71da，等电点是8.19，含有5个氨基酸残基；purin-wh2分子量为641.83da，等电点是8.19，含有6个氨基酸残基；两种超短肽均具有极强的抗氧化活性，浓度为3mm时对dpph自由基清除率i％可以达到58.54％、59.89％；对abts^·+正离子自由基清除率i％为96.02％、72.16％。并且两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2分子量小、结构简单、溶血活性低、细胞毒性极低、制备方法简单等，因此将其应用在抗氧化药物、食品或者化妆品添加剂中，可以提高药物、食品或化妆品添加剂的抗氧化效果，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是超短肽purin-wh1、purin-wh2对hff-1细胞的毒性图。

图中：

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1

两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2的化学合成：

(1)两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2的化学合成方法：根据超短肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433a,appliedbiosystems)合成二者的全序列，通过hplc反相柱层析脱盐。

(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)。

(3)纯化的两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2用高效液相色谱hplc方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2是直链小肽，其中purin-wh1分子量为544.71da，等电点是8.19，含有5个氨基酸残基，全序列的一级结构为缬氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-赖氨酸；purin-wh2分子量为641.83da，等电点是8.19，含有6个氨基酸残基，全序列的一级结构为缬氨酸-缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-赖氨酸；

实施例2

两种抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2的抗氧化实验：

(1)两种超短肽purin-wh1、purin-wh2抗氧化活性测定

(1.1)dpph自由基清除活性(dpphradicalscavengingassay)

称取一定量的dpph(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate，sigma，美国)，用甲醇溶解，配成6×10^-5m的溶液，现配现用。将48μldpph溶液和2μl样品混合(最终样品与dpph的质量比为3:1)，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。

dpph·清除率(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白对照组吸光值；aa:样品组吸光值)。

(1.2)abts^·+自由基正离子清除活性

abts(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonicacid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用pbs缓冲液(ph7.4)配成2mm的abts储存液。将abts储存液和70mm过硫酸钾(k2s2o8)水溶液按体积比250:1混合，于室温避光放置15-16h。试验开始前，将abts^·+释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4μl样品和96μl上述校正过的abts^·+溶液混合，室温放置10min后，于734nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行。

abts^·+清除率i(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白对照组吸光值；aa:样品组吸光值)。

表1.超短肽purin-wh1、purin-wh2抗氧化活性

结果如表1所示，超短肽purin-wh1、purin-wh2具有极强的抗氧化活性。在样品浓度为3mm时，超短肽purin-wh1、purin-wh2对dpph自由基清除率i％可以达到58.54％、59.89％；对abts^·+正离子自由基清除率i％为96.02％、72.16％。与临床药物谷胱甘肽具备相当抗氧化活性。故超短肽purin-wh1、purin-wh2将在抗氧化药品、食品等领域具有优秀的开发潜力。

(2)超短肽purin-wh1、purin-wh2溶血与细胞毒测定

(2.1)溶血性检测

将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的超短肽mapin-wh2样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用tritonx-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比h％＝a样品-a阴性对照/a阳性对照×100％。

表2.超短肽purin-wh1、purin-wh2溶血性

结果表明超短肽purin-wh1、purin-wh2浓度高达160μg/ml时的溶血率只有1.66％、1.27％。说明超短肽purin-wh1、purin-wh2不具有溶血性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在抗氧化药物、食品或者化妆品添加剂领域进一步的开发应用。

(2.2)超短肽purin-wh1、purin-wh2细胞毒性检测

用mtt法检测该组超短肽对人皮肤成纤维细胞hff-1细胞(购于上海细胞库)毒性。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100u/ml)的dmem中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化下来，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μl加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到10⁵个。加入样品，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％co2培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液(用细胞培养pbs缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μldmso，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nm，参考波长630nm。

结果如图1所示，超短肽purin-wh1、purin-wh2浓度为160μg/ml时的细胞毒性只有15.48％和2.84％，说明超短肽purin-wh1、purin-wh2对人皮肤成纤维细胞的毒性极低，对正常细胞存活率无显著性影响。对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其在在抗氧化药物、食品或者化妆品添加剂领域进一步的开发应用。