天然宿主防御肽Alligatorin4的应用的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种天然宿主防御肽alligatorin4的应用。

背景技术：

我国是养殖业生产大国，禽蛋、肉类和水产品总量连续多年居世界第一，总产值达到1万多亿元。抗生素是指由微生物产生的在低浓度下能够抑制或杀死其它微生物的化学物质。抗生素由于具有促进动物生长、提高饲料利用率、预防和治疗动物疫病的作用，曾在养殖业发展中发挥了重要作用。

但是，随着抗生素在养殖业中的大量使用，特别是不科学的滥用，细菌耐药性和药物残留等问题日益突出。由于抗生素残留超标等问题，我国养殖业产品出口量仅占生产量的0.9％-1.2％，严重影响我国养殖业经济的发展。因此研发新型高效抗菌抗感染、无残留的新型抗生素替代药物日益重要。

宿主防御肽(hostdefensepeptides,hdps)是动物体内一类由基因编码的天然小分子多肽，具有抵抗外界微生物侵袭和调节宿主免疫反应等作用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种天然宿主防御肽alligatorin4的应用，本发明公开了alligatorin4对水产致病菌的抗菌作用、对水产动物的免疫增强作用、及其在水产养殖领域的应用。

在一方面，本发明提供了天然宿主防御肽alligatorin4在制备抗水产致病菌药物中的应用。

进一步地，致病菌为温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌和霍乱弧菌中的一种或几种。

在另一方面，本发明还公开了天然宿主防御肽alligatorin4在制备水产养殖动物免疫激活剂中的应用。

在又一方面，本发明还公开了天然宿主防御肽alligatorin4在制备水产养殖动物饲料中的应用。

进一步地，天然宿主防御肽alligatorin4的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，天然宿主防御肽alligatorin4来源于爬行类动物扬子鳄。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明中的天然宿主防御肽alligatorin4对常见水产致病菌具有广谱高效的抗菌作用，杀菌作用迅速，能够增强水产养殖动物免疫功能，提高水产养殖动物对细菌感染的抵抗力，提高水产养殖动物的存活率，在水产养殖领域具有广泛的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1图示了alligatorin4对大闸蟹血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响；

图2图示了alligatorin4对大闸蟹副溶血弧菌感染后存活率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1alligatorin4的制备

(1)、用自动多肽合成仪(433a,appliedbiosystems)合成来源于爬行类动物扬子鳄alligatorin4的全序列，通过hplc反相柱层析脱盐纯化。

(2)、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)。

(3)、纯化的alligatorin4用高效液相色谱hplc方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

本发明的天然宿主防御肽alligatorin4的氨基酸序列如seqidno.1所示。其由38个氨基酸组成，分子量为4402.5da，等电点为12.78，其中所有氨基酸均为l-型。

实施例2alligatorin4对常见水产致病菌的抗菌活性检测

(1)、分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于营养肉汤固体培养基(nutrientbrothmedium，英国oxoid公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的alligatorin4样品溶液10μl，于37℃倒置培养18-20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。

(2)、alligatorin4最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration)测定(2倍稀释法)：

选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行mic测定实验。试验菌株接种到nb液体培养基(英国oxoid公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜nb液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×10⁵cfu/ml待用。

按照表1中的稀释方法，在无菌96孔板各孔中预先加入100μlnb液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用nb液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的alligatorin4样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。

表1稀释方法

将96孔板放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度，结果如表2所示。

表2.alligatorin4对水产致病菌抗菌活性

由表2可见，alligatorin4对表2中的水产致病菌均表现出极强的抗菌活性，其中包括多种对氨苄青霉素耐药的菌株。mic值处于4.69-37.5μg/ml的范围。

实施例3alligatorin4杀菌速度测定

副溶血弧菌用nb液体培养基(英国oxoid公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的nb液体培养基稀释成10⁶cfu/ml的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的alligatorin4样品加入到菌悬液中，使终浓度为5×mic(23.45μg/ml)。将加入alligatorin4样品的菌液放置于37℃培养箱中震荡培养，分别在0、10、20、30、45、60、90、120和180分钟取50μl菌液稀释1000倍，然后取50μl稀释的菌液涂布到nb固体培养基平板上，37℃培养箱培养过夜后菌落计数。该实验用氨苄青霉素作为阳性对照，灭菌的去离子水作为阴性对照。

结果如表3所示，alligatorin4对副溶血弧菌的杀菌速度迅速，在90分钟内即可杀死所有细菌，而阳性对照氨苄青霉素杀菌速度较慢，需要180分钟才能杀死所有细菌。

表3alligatorin4对副溶血弧菌的杀菌速度

实施例4alligatorin4对大闸蟹免疫系统调节活性测定

以下实施例中所用大闸蟹购自苏州阳澄湖大闸蟹养殖场，在实验室暂养1周后，挑选规格整齐、健康的个体(1-2g/只)随机分组饲养于整理箱中，每组15只。实验共设4个组：空白对照组，10、25、50mg/kgalligatorin4组。

用pbs溶解alligatorin4多肽样品，自大闸蟹的第3或第4步足的基关节膜处注射入体内(50μl/只)，空白对照组注射相同体积的pbs缓冲液。注射后24h，从每一组中随机取大闸蟹3只，采集血淋巴制成血清，用酸性磷酸酶和碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物研究所生产)检测大闸蟹血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性。具体实验方法参照试剂盒说明书进行。

结果如图1所示，与空白对照组相比，10、25、50mg/kgalligatorin4组大闸蟹血清中碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性显著升高(*p<0.05，**p<0.01)，说明alligatorin4能够增强大闸蟹的免疫功能。

实施例5alligatorin4对大闸蟹alligatorin4对大闸蟹抗病力(免疫保护率)的测定

副溶血弧菌用nb液体培养基(英国oxoid公司)在37℃培养12小时，用pbs缓冲液洗涤两次并重悬成1×10⁶cfu/ml的菌悬液备用。

大闸蟹购自苏州阳澄湖大闸蟹养殖场，实验室暂养1周后，挑选规格整齐、健康的个体(3-5g/只)随机分组饲养于整理箱中，每组25只。实验共设2个组：空白对照组和50mg/kgalligatorin4组(实验中所用alligatorin4浓度为50mg/kg)。alligatorin4多肽样品用pbs溶解，自大闸蟹的第3或第4步足的基关节膜处注射入体内，空白对照组注射相同体积的pbs缓冲液。样品注射后12h，用同样方法注射上述稀释好的细菌菌液(1×10⁵cfu/g)感染大闸蟹。大闸蟹继续暂养5天，观察大闸蟹活力，计算最终存活率。

结果如图2所示，alligatorin4能够为大闸蟹提供有效的免疫保护作用。预先12h注射50mg/kg的alligatorin4能够显著提高细菌感染后大闸蟹的存活率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

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序列表

<110>苏州大学

<120>天然宿主防御肽alligatorin4的应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>38

<212>prt

<213>氨基酸序列

<400>1

argargglyleuphelyslysleuargarglysilelyslysgly

51015

phelyslysilephelysargleuproprovalglyvalglyval

202530

serileproleualaglyargarg

35