本发明属于再生医学材料领域，具体涉及一种抗菌性阳离子改性的可吸收人工硬脑膜及其制备方法与应用。
背景技术：
硬脑膜是一层位于头骨内侧和大脑外侧的结缔组织，是保护脑组织的天然屏障。开放性颅骨损伤、肿瘤转移及其他脑颅疾患等原因均会造成硬脑膜缺损，进而导致脑脊液漏的发生。同时，由于细菌性脑膜炎等导致的颅内感染仍然是颅脑术后常见的严重并发症。文献报道，术后颅内感染的发生率仍然高达0.2％～5％。术后一旦出现感染，不仅大大增加患者的医疗费用，严重者会导致手术的失败及死亡。因此如何有效修复硬脑膜缺损并防治术后感染是脊柱外科、神经外科医生及生物材料领域的科学家亟待解决的问题。
目前已有多种材料制成的人工硬脑膜正在临床使用，主要可分为两大类：生物衍生材料和人工合成高分子材料。生物衍生材料主要有同种异体的人体硬脑膜及异种的猪/牛源心包膜、真皮基质以及利用牛肌腱I型胶原制备的生物膜等。人工合成高分子材料主要包括聚酯类可降解高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯以及聚氨酯等，此外还包括聚四氟乙烯等不可降解高分子材料。但到目前为止，临床中使用上述材料制成的人工硬脑膜产品都不具有防治术后感染的功能，不能完全满足临床要求。
ε-聚赖氨酸是一种由25-30个赖氨酸缩聚而成的同型单体聚合物，一般由微生物天然发酵得到。由于结构中富含氨基阳离子，已被证实具有良好的抑菌活性，且降解产物为人体必需的八种氨基酸之一，安全无毒，被誉为“营养型抗菌剂”，在医药、食品防腐等领域有着广泛的应用。因此，将抗菌性阳离子——ε-聚赖氨酸添加到人工硬脑膜修复材料中，预期在临床使用后可使其具有优异的抗感染特性。
中国专利“一种可水分散遗弃的广谱无毒敷料及其制备方法”(专利号CN105963762A)，公开了一种利用静电纺丝或离心纺丝制备含有聚赖氨酸等抗菌活性成分的水溶或醇溶高分子纤维敷料的方法。该专利中的聚赖氨酸是通过将其直接混合到高分子纺丝溶液中的方式添加到敷料纤维内部，不足之处在于聚赖氨酸成分在与创面接触时易快速从敷料中游离，无法实现长效抑菌的目的。中国专利“聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及应用”(专利号CN102277737A)，公开了一种利用静电纺丝和冷冻干燥技术制备含有聚赖氨酸等结构中带有氨基的天然高分子/聚己内酯电纺纤维膜复合支架材料的方法。该方法侧重于将聚己内酯分子链中引入羧基并活化后，接枝聚赖氨酸等天然高分子以提高聚己内酯纤维的表面润湿性，专利内容中没有涉及该聚己内酯电纺纤维膜支架材料的抑菌特性。此外，在聚己内酯纤维表面的天然高分子海绵层在冻干后又经过了交联处理，在与创面接触后不能即刻水溶发挥粘附性。
因此，目前临床上迫切需要一种可有效防治术后颅内感染、制备和临床使用过程简单、可缝合又可直接粘附使用、产业化前景广阔的人工硬脑(脊)膜修补材料。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有良好抗感染功能的抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料。
本发明所提供的抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料，呈双层结构，一层是经ε-聚赖氨酸改性的可降解聚酯纳米纤维膜，另一层是三维多孔结构的高分子材料。
所述经ε-聚赖氨酸改性的可降解聚酯纳米纤维膜通过静电纺丝工艺将可降解聚酯高分子制成纳米纤维膜，后经表面改性使得ε-聚赖氨酸存在于纳米纤维表面制得。
所述纳米纤维膜的厚度为0.05-2毫米，纤维直径在100-1000纳米之间、纤维间孔径尺寸在300-3000纳米之间。
所述可降解聚酯高分子选自聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸、聚对二氧环己酮、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚丁二酸丁二醇酯及聚氨酯中的一种或几种的共聚物，重均分子量在30-500KDa之间。
优选地，所述可降解聚酯高分子为左旋聚乳酸-己内酯共聚物，重均分子量为300KDa。
所述三维多孔结构的高分子材料由天然高分子经冷冻干燥工艺制成，具有海绵状多孔结构，其孔径尺寸在10-1000微米之间，厚度为0.1-5毫米。
所述天然高分子选自羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、透明质酸钠、羧甲基纤维素、羟乙丙纤维素、氧化再生纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、硫酸软骨素及纤维蛋白中的至少一种，重均分子量为10-100万。
优选地，所述天然高分子为透明质酸钠，重均分子量为50万。
本发明还提供了上述抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料的制备方法。
所述方法包括下述步骤：
1)配制可降解聚酯高分子静电纺丝溶液，并通过静电纺丝工艺得到可降解聚酯纤维膜材料；
2)在步骤1)中得到的纳米纤维膜材料表面引入羧基；
3)在步骤2)得到的羧基化纳米纤维膜材料表面接枝ε-聚赖氨酸，得到ε-聚赖氨酸改性的纳米纤维膜；
4)将天然高分子溶液流延涂覆在步骤3)得到的ε-聚赖氨酸改性的纳米纤维膜表面，得到表面涂覆有天然高分子溶液的纳米纤维膜，冷冻干燥得到含有三维多孔高分子层的双层结构复合膜，即，抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料。
上述方法步骤1)中，所述可降解聚酯高分子静电纺丝溶液通过将可降解聚酯高分子溶解在特定的溶剂中制备而成。
所述可降解聚酯高分子选自聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸、聚对二氧环己酮、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚丁二酸丁二醇酯及聚氨酯中的一种或几种的共聚物，重均分子量在30-500KDa之间。
所述溶剂选择为丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、去离子水、1,4-二氧六环、六氟异丙醇、乙醇、二甲基亚砜、三氟乙酸中的一种或几种的混合物。
所述可降解聚酯高分子静电纺丝溶液中可降解聚酯高分子的重量占溶液总重的1-20％。
较佳的，所述可降解聚酯高分子为聚乳酸-己内酯共聚物，重均分子量为300KDa，纺丝溶液中高分子重量占溶液总重的10％。较佳的，所述静电纺丝溶液的溶剂可选择六氟异丙醇。
上述方法步骤1)中，所采用的静电纺丝工艺为：先将配制好的静电纺丝溶液装入静电纺丝液供给装置；通过流量泵调控电纺丝液的供给流量为0.1-20毫升/小时，具体可为1毫升/小时；调节高压发生端同收集装置之间的距离为3厘米-30厘米，具体可为15厘米；通过高压发生器给静电纺丝过程提供高压，可在0.1-40千伏(具体可为15千伏)之间调控；将转速为100-1000转/分(具体可为100转/分)、直径为2-20厘米(具体可为8厘米)的滚筒与接地端相连，作为静电纺丝过程的收集基板；在旋转滚筒上收集获得可降解聚酯高分子纳米纤维膜，厚度在0.05-2毫米，具体可为0.2毫米、0.25毫米。
上述纺丝工艺中，较佳的，供给流量设定为3毫升/小时,高压发生端同收集装置之间的距离设定为10厘米，高压设定为15千伏，滚筒的转速设定为100转/分，滚筒直径为8厘米，可降解聚酯高分子纤维膜厚度为0.2毫米。
上述方法步骤2)中，所述在可降解聚酯高分子纳米纤维膜表面引入羧基的方法可选择低温等离子体处理、碱处理或紫外辐照处理中的一种。
所述低温等离子体处理方法为：将步骤1)得到的聚酯纳米纤维膜放置在低温等离子体反应室中，关闭反应室后抽真空至0-10Pa(具体可为5Pa)。之后通入氮气、氦气或氧气等至少一种反应气体(具体可为氦气)，调节工作压力为5-50Pa(具体可为20Pa)。待气流稳定后开启射频电源，调节功率为10-100W(具体可为40W)，对纤维膜的处理时间为0.1-10分钟(具体可为1分钟)，之后将样品取出，得到表面引入羧基的可降解聚酯高分子纳米纤维膜。
所述碱处理方法为：在0-10℃(具体可为4℃)下，将步骤1)得到的聚酯纳米纤维膜浸泡在浓度为0.05-1M(具体可为0.1M)的碱溶液中，浸泡时间为1-30分钟(具体可为10分钟)，之后将纤维膜取出用大量去离子水清洗，得到表面引入羧基的可降解聚酯高分子纳米纤维膜。
所述碱溶液所选用的碱可为氢氧化钠、氢氧化钾等的至少一种。
所述紫外辐照处理方法为：将步骤1)得到的聚酯纳米纤维膜浸泡在体积分数为3-30％(具体可为10％)的过氧化氢溶液中，后置于波长为300-400nm、功率为30-60W(具体可为40W)的紫外灯下，距离5-20cm(具体可为10cm)，反应20-90分钟(具体可为30分钟)后取出用大量去离子水清洗，得到表面引入羧基的可降解聚酯高分子纳米纤维膜。
上述方法步骤3)中，所述在聚酯纳米纤维膜表面进行ε-聚赖氨酸接枝的方法为：在0-10℃(具体可为4℃)下，将步骤2)得到的羧基化聚酯纳米纤维膜浸泡在含有5-50mM(具体可为30mM)1-乙基-3-(二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)及5-50mM(具体可为10mM)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液中，浸泡时间为4-24小时(具体可为18小时)，取出用大量去离子水清洗后，在0-10℃(具体可为4℃)下浸泡在质量分数为0.5％-10％(具体可为1％)的ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡时间为4-24小时(具体可为10小时)，之后取出并用大量去离子水清洗，得到ε-聚赖氨酸改性的纳米纤维膜。
上述方法步骤4)中，所述天然高分子溶液的加入量与纳米纤维膜表面积的比例可为0.1-5ml/cm2(具体可为2ml/cm2)。
所述冻干工艺为将表面涂覆有天然高分子溶液的纳米纤维膜整体放置在冷冻干燥机内冻干12-48小时(具体可为20小时)，冻干温度为-45～-5℃(具体可为-15℃)。
上述天然高分子选自羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、透明质酸钠、羧甲基纤维素、羟乙丙纤维素、氧化再生纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、硫酸软骨素及纤维蛋白中的至少一种，重均分子量为10-100万。
所述天然高分子溶液中的溶剂为去离子水，天然高分子重量占溶液总重的0.1-10％。
较佳的，所述天然高分子为透明质酸钠，重均分子量为50万，高分子重量占溶液总重的2％。
上述方法还可包括将步骤4)得到的双层结构复合膜进行分剪、灭菌的操作。
上述抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料在制备硬脑(脊)膜缺损修补产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所述的抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料具有以下有益效果：
1、组成中含有具有优异抗感染性能的ε-聚赖氨酸，且其以表面接枝方式存在于纳米纤维表面，可长期有效防止术后颅内感染。
2、组成中含有的可降解聚酯高分子纳米纤维可提供良好的力学强度，使得该人工硬脑膜能承受一定的缝合力，不撕裂、不脱边，可发生形变但不至于破损；同时纳米级微孔结构也可有效防止组织粘连的发生。
3、组成中含有的三维多孔天然高分子可使得该硬脑膜修复材料有良好的水化特性和顺应性，同时天然高分子自身良好的水溶特性使产品在临床使用中可直接贴附使用，实现免缝合固定。
4、植入体内后随着时间延长缓慢发生降解，最终可完全降解和吸收，避免了膜片致癌的风险。
5、产品组成和制备工艺简单，产品质量易于控制，能实现高效率低成本的产业化生产。
本发明所述的抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料是一种结构新颖、性能优越的新型医用生物材料，在硬脑膜缺损修复领域显示出了良好的应用前景。
附图说明
图1是抗菌性阳离子改性的硬脑膜修复材料的结构示意图，其中1表示三维多孔天然高分子层，2表示经ε-聚赖氨酸表面改性的可降解聚酯纳米纤维层。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
将重均分子量为30万的聚乳酸-己内酯共聚物(PLCL)溶解于六氟异丙醇中，浓度为0.08克/毫升，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液。之后将溶液置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。溶液供给流量控制在1毫升/小时，施加电压为15千伏，高压端同接地端的距离为15厘米，使用直径为8厘米的旋转滚筒作为收集装置，转速为100转/分。将PLCL溶液纺丝后可收集到厚度在0.2毫米左右的纳米纤维膜。
将PLCL纳米纤维膜放置在低温等离子体反应室中，关闭反应室后抽真空至5Pa，之后通入氦气，调节工作压力为20Pa。待气流稳定后开启射频电源，调节功率为40W，对纤维膜的处理1分钟后将样品取出。
在4℃下，将羧基化的PLCL纳米纤维膜浸泡在含有30mM EDC和15mM NHS的混合溶液中，浸泡18小时后取出用大量去离子水清洗。之后在4℃下将PLCL纤维膜浸泡在质量分数为1％的ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡10小时后取出并用大量去离子水清洗。
配制质量分数为2％的透明质酸钠(重均分子量为50万)溶液，按照1.0ml/cm2将溶液流延到ε-聚赖氨酸改性后的PLCL纳米纤维膜上，之后其整体放置在冷冻干燥机内冻干12小时，冻干温度为-15℃，取出后裁剪并灭菌即可得到抗菌性阳离子改性的可吸收硬脑膜修复材料。
实施例2
将重均分子量为30万的左旋聚乳酸(PLLA)溶解于三氯甲烷中，浓度为0.1克/毫升，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液。之后将溶液置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。溶液供给流量控制在1.5毫升/小时，施加电压为17.5千伏，高压端同接地端的距离为12.5厘米，使用直径为8厘米的旋转滚筒作为收集装置，转速为100转/分。将PLLA溶液纺丝后可收集到厚度在0.25毫米左右的纳米纤维膜。
在4℃下，将PLLA纳米纤维膜浸泡在浓度为0.1M的氢氧化钠溶液中，浸泡时间为15分钟，之后将纤维膜取出用大量去离子水清洗。在4℃下，将羧基化的PLLA纳米纤维膜浸泡在含有20mM EDC和10mM NHS的混合溶液中，浸泡12小时后取出用大量去离子水清洗。之后在4℃下将PLLA纤维膜浸泡在质量分数为0.5％的ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡5小时后取出并用大量去离子水清洗。
配制质量分数为1.5％的羧甲基壳聚糖(重均分子量为60万)溶液，按照1.5ml/cm2将溶液流延到ε-聚赖氨酸改性后的PLLA纳米纤维膜上，之后其整体放置在冷冻干燥机内冻干14小时，冻干温度为-10℃，取出后裁剪并灭菌即可得到抗菌性阳离子改性的可吸收硬脑膜修复材料。
实施例3
将重均分子量为25万的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶解于丙酮中，浓度为0.2克/毫升，在室温下搅拌后形成均一稳定的溶液。之后将溶液置入注射器中，注射器针头处连接高压电源。溶液供给流量控制在2毫升/小时，施加电压为20千伏，高压端同接地端的距离为20厘米，使用直径为8厘米的旋转滚筒作为收集装置，转速为100转/分。将PLGA溶液纺丝后可收集到厚度在0.15毫米左右的纳米纤维膜。
将PLGA纳米纤维膜浸泡在体积分数为10％的过氧化氢溶液中，后置于波长为350nm、功率为40W的紫外灯下，距离10cm，反应30分钟后取出用大量去离子水清洗。在4℃下，将羧基化的PLGA纳米纤维膜浸泡在含有40mM EDC和20mM NHS的混合溶液中，浸泡10小时后取出用大量去离子水清洗。之后在4℃下将PLGA纤维膜浸泡在质量分数为1.5％的ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡3小时后取出并用大量去离子水清洗。
配制质量分数为2.5％的羧甲基纤维素(重均分子量为70万)溶液，按照0.5ml/cm2将溶液流延到ε-聚赖氨酸改性后的PLGA纳米纤维膜上，之后其整体放置在冷冻干燥机内冻干10小时，冻干温度为-5℃，取出后裁剪并灭菌即可得到抗菌性阳离子改性的可吸收硬脑膜修复材料。
实施例4
称取实施例2中的人工硬脑膜样品0.75g剪碎后放入一个50mL的锥形瓶中，加入含有103CFU/mL大肠杆菌菌悬液的营养肉汤10mL，使膜完全浸没在菌液中。将锥形瓶固定于振荡摇床上，以180r/min，37℃共培养至48小时。分别取4h、8h、20h、24h、32h、44h、48h共培养后的样液0.6mL，在570nm下测定其光密度值。同时设对照组和空白组，对照组为不含有ε-聚赖氨酸的聚酯纳米纤维膜，空白组为不加样品的空白菌液。试验共重复3次。结果表明，当共培养时间超过12小时后，阳离子改性人工硬脑膜组抑菌率可达99％以上，即实施例2中的人工硬脑膜产品具有显著的抗菌作用。
实施例5
采用健康成年的新西兰家兔20只，19月龄，体重在2.5和3.4千克之间，雌雄不限。耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠(30毫克/千克)麻醉。沿头部正中切口纵形切开头皮，逐层分离至颅骨骨膜，微型磨钻在双侧颅顶部制备直径约1.2厘米的对称圆形骨窗，于手术显微镜下制备8×8mm2大小硬脑膜缺损。
将实施例2制备得到的可吸收硬脑膜修复材料剪成12×12mm2尺寸，贴附在右侧硬脑膜缺损区，左侧不做任何处理作为空白对照。硬脑膜修复材料植入完毕后，将头部皮肤缝合。在植入6个月后将动物处死，取出硬脑膜补片及周围组织，观察其外观形貌，检测是否有炎症反应，并观察硬脑膜重建情况，及与周围组织是否发生粘连。术后实验动物单笼饲养，维持环境温度并定时投喂饲料。
术后所有的实验兔保持健康，没有明显的癫痫等异常行为发生。切口愈合良好，手术部位无囊肿和膨出，无脑脊液漏。硬脑膜修复材料发生明显降解，无炎症反应，与周围组织无粘连，植入部位有一层新生的类硬脑膜结缔组织生成。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。