专利名称：一种提高肽段离子化效率的方法
技术领域：
本发明属生化分析领域，涉及一种提高肽段离子化效率的方法。具体涉及利 用碱性和疏水性有机化合物对多肽和蛋白样品的羧基进行衍生，使得其质谱离子 化效率得到提高，并对所衍生的样品直接进行质谱分析和鉴定。
背景技术：
伴随着人类基因组计划(HGP)的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因 组时代。现阶段，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研 究和蛋白质组研究等。阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表 达规律和生物功能，与在基因组整体水平上阐明基因活动的规律相比，任务更为 复杂，也更加艰巨。
本领域公知，蛋白质组学研究包括样品或组织中的蛋白质分离和鉴定两个关 键步骤。随着新的软电离方式——基质辅助激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离 (ESI)的产生，生物质谱已经成为蛋白质组学技术平台中最为重要的技术手段之 一。蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体，样品体系极其复杂，蛋白 动态分布范围非常广。与疾病和信号传导相关的蛋白质往往属于低丰度的蛋白质， 这些重要的蛋白质由于本身存在的量极少而很难得以有效鉴定，而样品中广泛存 在的翻译后修饰特别是磷酸化修饰由于其本身离子化效率低和容易受到非磷酸化 肽段的压制等原因，使得对于磷酸化肽段和蛋白质的直接鉴定存在着很大的困难。
随着蛋白质组研究的进一步拓展和深入，尤其是对磷酸化修饰等难电离肽段 和低丰度蛋白质的分析鉴定对质谱离子化技术提出越来越高的要求。现有的针对 难电离磷酸化肽段的方法主要是对于磷酸化肽段进行特异性富集，比如采用IMAC， Ti02等富集材料选择并浓縮磷酸化肽段，从而达到去除非磷酸化肽段的压制以及 提高浓度的目的。然而，这些方法的特异性并不够高，步骤繁琐，耗时也长，大 大增加了样品损失、污染的可能性，并不适用于高通量的蛋白质鉴定。而对于低 丰度蛋白质，富集仍然是最主要的方法，而这种方法需要大量的样品做支持，且 高丰度蛋白质的压制也很难去除，导致对其的质谱检测目前仍然没有很好的改善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从根本上提高肽段质谱离子化效率的方法。具体 涉及一种通过肽段羧基衍生提高肽段离子化效率的方法。本方法操作简单、灵敏 度高、重现性好、经济、省时、适应于高通量蛋白质组学研究要求，能对磷酸化 肽段或低丰度蛋白质直接进行质谱分析。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案 1、利用碱性和疏水性有机化合物，对多肽或蛋白质样品(简称肽段)的羧基进 行衍生，实现提高多肽质谱离子化效率，其特征是通过下述方法和步骤
1) 将碱性和疏水性有机化合物、肽键缩合试剂和催化剂分别溶解于有机溶剂 中，所述三种试剂按顺序依次加入所述的肽段水溶液中形成反应体系，用 酸调节pH值7.5 7.8，将上述反应体系置室温下混悬；
2) 去除上述反应体系中的所述的溶剂，终止衍生反应，得衍生产物；
3) 将上述衍生产物溶解，直接用于MALDI-MS或ESI-MS检测。 本发明所述的多肽和蛋白质样品的羧基包括碳末端羧基和酸性氨基酸侧链羧基。
本发明所述的碱性和疏水性有机化合物是含嘧啶基的化合物，选自2-肼基嘧 啶，1-(2-嘧啶基)哌嗪，4-氨基-2- (1-哌嗪基)嘧啶或4-氨基-6-氯嘧啶。
本发明所述的肽键縮合试剂选自N，N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳、 二亚胺1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或碳酰二咪唑。
本发明所述的催化剂选自1-羟基苯并三唑、6-氯-1-羟基苯并三唑或l-羟基 -7-氮杂苯并三唑。
本发明所述的酸采用三氟乙酸、盐酸、甲酸或乙酸等酸。
本发明通过去除反应体系中的溶剂达到终止反应的目的，采用室温自然干燥、 烘干、真空干燥或氮气吹干等手段去除反应溶剂。
本发明直接将衍生产物用含5%乙腈0. 1%甲酸的水溶液溶解用于电喷雾离子源 质谱检测，或将衍生产物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于基质辅助激 光解吸离子源质谱检测。
本发明方法通过碱性和疏水性有机化合物改变肽段中带负电、亲水性的羧基 从而有效改变了肽段的性质，使其电离效率得到提高，大大提高了其质谱检测灵
敏度。例如对于磷酸化肽段(TPpTAPSLG)，经过衍生后离子化效率提高了101倍。 本发明选用的含有嘧啶基的一类化合物作为衍生羧基的有机化合物，由于嘧 啶基气相碱性度高、疏水性强、在紫外端有吸收，所以一旦应用于MALDI离子化， 它可以有效促进肽段与基质的相互作用，辅助吸收激光；而对于ESI离子化，高的 气相碱性度也可以有效改善肽段的电离效率。因此，采用含嘧啶基的化合物作为 衍生羧基的有机化合物可以有效的实现提高肽段的离子化效率的作用。
图1为肽段KRGSGAW经过衍生后的MALDI-TOF-MS谱图， 其中，显示出反应效率近100%。
图2为肽段RPPGFSP和TPpTAPSLG的MALDI-TOF-MS谱图， 其中，肽段RPPGFSP的离子化效率提高了 12.1倍，肽段TPpTAPSLG的离子化 效率提高了 101倍。
图3为七条标准肽段的离子化效率提高的倍数，
其中，显示了非磷酸化肽段的离子化效率提高了 10到50倍，磷酸化肽段的离 子化效率提高了50至U01倍。
图4为标准磷酸肽与胰蛋白酶酶解的牛血清白蛋白混合后的MALDI-TOF-MS谱 图，其中(a)是未经过衍生的谱图，(b)是经过衍生的谱图；星号表示在衍生前 未被鉴定出的牛血清白蛋白的肽段；编号表示前后都被鉴定出的牛血清白蛋白的 肽段；显示出，经过衍生，所有肽段的信号强度都得到提升，而其中磷酸化肽段 提高的幅度最大，衍生前难以检测到，衍生后成为强度最强的一条肽段。
图5是ESI-MS检测中肽段经过衍生后离子化效率大幅度提高结果图，
其中，5a是肽段TPpTALSLG ， 5b是肽段YMQSpTPLl ， 5c是肽段QYGSGAW。
具体实施例方式
下面的实例是对本发明提出的利用碱性和疏水性有机化合物对多肽和蛋白样 品的羧基进行衍生，使得其质谱离子化效率得到提高，并对所衍生的样品直接进 行质谱分析和鉴定的进一步说明。
实施例1验证衍生反应的反应效率接近100%
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和卜羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲
酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段KRGSGAW水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将上述干燥后产物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶 液溶解用于MALDI-MS检测，结果显示，衍生反应效率约为100% (图1)。
实施例2验证衍生反应的反应效率接近100%
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段DRVYIHPF水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将上述干燥后产物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶 液溶解用于MALDI-MS检测，得出两位点衍生反应效率接近100%。
实施例3肽段RPPGFSP经过衍生后离子化效率提高的倍数 将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-轻基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段RPPGFSP水溶液中，用0.1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生 肽段，将上述产物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测， 结果显示，肽段的离子化效率提高12. 1倍(图2a)。
实施例4肽段TPpTAPSLG经过衍生后离子化效率提高的倍数 将l-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N,N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50
微升浓度约为100纳克每微升的肽段TPpTAPSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真 空离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍 生肽段,将上述产物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测， 结果显示，肽段的离子化效率提高101倍(图2b)。
实施例5肽段KRGSGAW经过衍生后离子化效率提高的倍数 将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N,N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段KRGSGAW水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生 肽段，将上述产物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测， 结果显示，肽段的离子化效率提高40倍(图3)。
实施例6肽段NRGSGAW经过衍生后离子化效率提高的倍数 将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-轻基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N,N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段NRGSGAW水溶液中，用0.1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生 肽段，将上述产物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测， 结果显示，此肽段的离子化效率提高15倍(图3)。
实施例7肽段DPpTALSLG经过衍生后离子化效率提高的倍数 将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N,N-二甲基甲
酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真 空离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍 生肽段,将上述产物用含50%乙腈0. W三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测， 结果显示，此肽段的离子化效率提高99倍(图3)。
实施例8肽段TPpTAPpSLG经过衍生后离子化效率提高的倍数 将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基_7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N,N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真 空离心千燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍 生肽段，将上述产物用含50%乙腈0.1M三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测， 结果显示，此肽段的离子化效率提高47倍(图3)。
实施例9肽段TPpTAPSLG采用N， N-二环己基碳二亚胺作为肽键缩合试剂衍生 后离子化效率提高的倍数
将l-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将N,N-二环己基碳二亚胺 和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，配制成2毫克每 毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50微升浓度约为100纳克 每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液调节pH值至7. 5 和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离心干燥，去除所有 溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽段，将上述产物用 含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，此肽段的离子化效率 提高94倍,说明N， N-二环己基碳二亚胺作为肽键縮合试剂可以达到同样效果。
实施例10肽段TPpTAPSLG采用N， N-二异丙基碳作为肽键縮合试剂衍生后离
子化效率提高的倍数
将l- (2-嘧啶基)哌嗪稀释于N, N-二甲基甲酰胺中，将N, N-二异丙基碳和1-羟 基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N， N-二甲基甲酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶 液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50微升浓度约为100纳克每微升的 肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液调节pH值至7. 5和7. 8之间。 将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离心干燥，去除所有溶剂。将每一 种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽段，将上述产物用含50%乙腈0. 1% 三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，此肽段的离子化效率提高90倍，说明 N， N-二异丙基碳作为肽键縮合试剂可以达到同样效果。
实施例11肽段TPpTAPSLG采用碳酰二咪唑作为肽键縮合试剂衍生后离子化 效率提高的倍数
将l-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将碳酰二咪唑和1-羟基 -7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，配制成2亳克每毫升的溶 液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50微升浓度约为100纳克每微升的 肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液调节pH值至7. 5和7.8之间。 将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离心干燥，去除所有溶剂。将每一 种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽段，将上述产物用含50%乙腈0.1% 三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，此肽段的离子化效率提高85倍,说明 碳酰二咪唑作为肽键縮合试剂可以达到同样效果。
实施例12肽段TPpTAPSLG采用6-氯-1-羟基苯并三唑作为催化剂衍生后离子 化效率提高的倍数
将卜(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将N，N-二环己基碳二亚胺 和6-氯-l-羟基苯并三唑分别溶解于N， N-二甲基甲酰胺中，配制成2毫克每毫升 的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50微升浓度约为100纳克每微 升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液调节pH值至7. 5和7. 8 之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离心干燥，去除所有溶剂。 将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽段，将上述产物用含50%
乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检领lj，此肽段的离子化效率提高 87倍，说明用6-氯-1-羟基苯并三唑作为催化剂可以达到同样的效果。
实施例13肽段TPpTAPSLG采用1-羟基-7-氮杂苯并三唑作为催化剂衍生后离 子化效率提高的倍数
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将N,N-二环己基碳二亚胺 和l-羟基-7-氮杂苯并三唑分别溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，配制成2毫克每毫 升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50微升浓度约为100纳克每 微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液调节pH值至7. 5和 7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离心干燥，去除所有溶 剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽段，将上述产物用含 50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，此肽段的离子化效率提 高93倍，说明用1-羟基-7-氮杂苯并三唑作为催化剂可以达到同样的效果。
实施例14肽段TPpTAPSLG采用2-肼基嘧啶作为衍生试剂衍生后离子化效率 提高的倍数
将2-肼基嘧啶释于N，N-二甲基甲酰胺中，将卜(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-氮杂苯并三唑分别溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，配制 成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50微升浓度约 为100纳克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0.1%的三氟乙酸水溶液调节pH 值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离心干燥， 去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽段，将上 述产物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，此肽段的离 子化效率提高96倍，说明2-肼基嘧啶可以作为衍生试剂。
实施例15肽段TPpTAPSLG采用4-氮基-2- (1-哌嗪基)嘧啶作为衍生试剂衍 生后离子化效率提高的倍数
将4-氨基-2- (l-哌嗪基)嘧啶稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-氮杂苯并三唑分别溶解于N, N-二甲
基甲酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升 于50微升浓度约为100纳克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙 酸水溶液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然 后真空离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的 未衍生肽段，将上述产物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS 检测，此肽段的离子化效率提高90倍，说明4-氨基-2- (l-哌嗪基)嘧啶可以作 为衍生试剂。
实施例16肽段TPpTAPSLG采用甲酸调节pH经过衍生后离子化效率提高的倍
数
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N,N-二甲基甲酰胺中，将l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段TPpTAPSLG水溶液中，用0. 1%的甲酸水溶液 调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空离 心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽 段，将上述产物用含50%乙腈0. P/。三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，肽 段的离子化效率提高101倍，说明甲酸可用于调节pH。
实施例17肽段TPpTAPSLG经过衍生后，采用氮气吹干，离子化效率提高的倍
似,
数
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段TPpTAPSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液调节pH值至7.5和7.8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后氮 气吹干，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生肽 段，将上述产物用含50。/。乙腈0.iy。三氟乙酸的水溶液溶解用于MALDI-MS检测，肽 段的离子化效率提高101倍，说明氮气吹干可用于终止反应。
实施例18验证混合体系下，衍生对酶解蛋白和磷酸化肽段的影响 调整样品溶液为15nmol牛血清白蛋白酶解肽段与2pmo1的标准磷酸化肽段混 合溶液(溶剂为50%乙腈、50%水、0. 1%三氟乙酸)，重复实例2中的衍生反应与质 谱实验，结果显示，在衍生反应前磷酸肽基本无法检测到，衍生反应后磷酸肽信 号强度最强(图4)。
实施例19验证在电喷雾电离源中肽段TPpTALSLG经过衍生后离子化效率大幅 度提高。
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段TPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真 空离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍 生肽段，将上述产物用含5%乙腈0. P/。甲酸的水溶液溶解用于ESI-MS检测，结果 显示，此肽段的离子化效率大幅度提高(图5a)。
实施例20验证在电喷雾电离源中肽段YMQSpTPL经过衍生后离子化效率大幅 度提高。
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段YMQSpTPL水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生 肽段，将上述产物用含5。/。乙腈0.P/。甲酸的水溶液溶解用于ESI-MS检测，结果显 示此肽段的离子化效率大幅度提高(图5b)。
实施例21验证在电喷雾电离源中肽段QYGSGAW经过衍生后离子化效率大幅度
提高。
将1-(2-嘧啶基)哌嗪稀释于N，N-二甲基甲酰胺中，将l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐和卜羟基-7-偶氮苯并三氮唑分别溶解于N，N-二甲基甲 酰胺中，配制成2毫克每毫升的溶液。将以上三种试剂依次加6、 4和3微升于50 微升浓度约为100纳克每微升的肽段QYGSGAW水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液调节pH值至7. 5和7. 8之间。将上述混合体系在室温下混悬30秒。然后真空 离心干燥，去除所有溶剂。将每一种的肽段衍生产物中加入等物质的量的未衍生 肽段，将上述产物用含5%乙腈0. 1%甲酸的水溶液溶解用于ESI-MS检测，结果显 示，此肽段的离子化效率大幅度提高(图5c)。
权利要求
1、一种提高肽段离子化效率的方法，其特征是通过下述方法和步骤 1)利用碱性和疏水性有机化合物，对多肽或蛋白质的羧基进行衍生，采用碱性和疏水性有机化合物、肽键缩合试剂和催化剂分别溶解于有机溶 剂中，上述三种试剂按顺序依次加入多肽或蛋白质水溶液中形成反应体系，用 酸调节pH值至7.5～7.8，室温下混悬； 2)去除上述反应体系中的溶剂，终止衍生反应，得产物 3)将上述产物溶解，直接用于MALDI-MS或ESI-MS检测。
2、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的多肽或蛋白 质的羧基包括碳末端羧基和酸性氨基酸侧链羧基。
3、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的碱性和疏水 性有机化合物是含嘧啶基的化合物，选自2-肼基嘧啶，1-(2-嘧啶基)哌嗪，4-氨基-2- (1-哌嗪基)嘧啶或4-氨基-6-氯嘧啶。
4、 按权利要求3所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的含嘧啶基的 化合物是1-(2-嘧啶基)哌嗪。
5、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的肽键缩合试 剂选自N，N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳、二亚胺1- (3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或和碳酰二咪唑。
6、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的催化剂选自 l-羟基苯并三唑、6-氯-1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑。
7、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的酸选自三氟 乙酸、盐酸、甲酸或乙酸。
8、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的步骤2)的 去除反应体系中的溶剂的方式是室温自然干燥、烘干、真空干燥或氮气吹干方 式。
9、 按权利要求1所述的提高肽段离子化效率的方法，其特征是所述的步骤3)中 直接将产物用含5%乙腈0.1%甲酸的水溶液溶解用于电喷雾离子源质谱检测， 或直接将产物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用于基质辅助激光解吸 离子源质谱检测。
全文摘要
本发明属生化分析领域，涉及一种提高肽段离子化效率的方法。本发明利用碱性和疏水性有机化合物对蛋白质或肽段羧基衍生，提高肽段离子化效率，并对所衍生的样品直接进行质谱分析和鉴定。本发明选用的有机化合物能高效率、高特异性地与肽段的羧基形成共价键，从而有效地提高肽段与质子的结合能力和肽段的疏水性，极大地提高肽段的离子化效率，促使低丰度、难电离的肽段得到检测。本发明具有反应特异性高、副反应少、步骤简单、经济和省时等特点，可广泛用于蛋白质组学领域，大大提高了质谱对低丰度及难电离肽段的检测能力。
文档编号G01N27/64GK101363779SQ200810039698
公开日2009年2月11日 申请日期2008年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者张莉娟, 杨芃原, 许亚伟, 陆豪杰 申请人:复旦大学