专利名称：一种菜籽生物活性肽的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及利用菜籽粕为原料，采用蛋白酶水解工艺，制备菜籽生物活性肽的方法。
背景技术：
菜籽中含有20% 25%的蛋白质，脱脂后的菜籽粕中含有32% 40%的蛋白质。 菜籽蛋白主要是由高相对分子质量的12S蛋白和低相对分子质量的2S蛋白组成，菜籽蛋白是一种优质蛋白质，其氨基酸组成符合FA0/WH0推荐模式值，PER值高于其它的植物蛋白， 甚至高于酪蛋白，最大特点是含硫氨基酸和赖氨酸的含量较高。菜籽蛋白除了具有较好的营养特性外，其功能性也优于其它蛋白，特别是吸油性、保水性和乳化性能优于其它蛋白。 菜籽蛋白的酶水解是一种不完全、不彻底的水解，其产物主要是生物活性肽。菜籽生物活性肽除了具有菜籽蛋白的优点以外，还具有比菜籽蛋白和氨基酸更容易被小肠吸收，并且比菜籽蛋白质和氨基酸具有更多的生理活性。现有菜籽生物活性肽的制备工艺主要有三种(1)基因工程方法；(2)化学合成方法；C3)酶解法。其中，酶解法具有投资少，操作简单，产品含量高等优点。现有利用酶解法制备菜籽肽的技术中，酶解过程中均加入大量碱液或酸液来调节酶解反应时溶液的酸碱度，且工艺中没有脱盐处理，使成品盐分含量过高；而且，酶解液中含有大量色素类成分，影响成品的色泽。另外，由于酶解条件的不同，酶解后产物的分子量大小分布不均勻，影响了产品的生理活性。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种将菜籽粕作为原料，制备菜籽生物活性肽的方法。为达到上述目的，本发明提供的菜籽生物活性肽的制备方法以脱脂菜籽粕为原料，先用碱溶酸沉法制备菜籽蛋白，而后添加蛋白酶水解蛋白质，依次经过活性炭脱色、超滤分级、阴阳离子交换树脂脱盐，最后经浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥得到菜籽生物活性肽。本发明的制备菜籽生物活性肽的方法，包括如下步骤—种菜籽生物活性肽的制备方法，该方法包括如下步骤(1)将脱脂菜籽粕与水按1 5 1 15(质量比)溶解至水中，用胶体磨粉碎， 用NaOH试剂调节pH至9. 0 13. 0，不停搅拌15min，3000 4000rpm，15min,离心取上清液；(2)将步骤1的上清液加热至70 90°C，用柠檬酸调节pH值至3. 0 5. 0，温度 40 60°C，搅拌速度30 50r/min，使蛋白质沉淀15 45min，然后3000r/min离心分离 5 15min，去除上层清液，收集固相，重新按以上步骤加水混勻，使蛋白质在等电点沉淀， 重复三次，最后水洗两次，离心得固相，即得为菜籽蛋白；(3)将步骤2的菜籽蛋白与水按1 5 1 15(质量比)溶解至水中，加热至 80 95°C，保持15 30min，然后冷却至35 50°C，用NaOH试剂调节并保持pH在6. 0 8. 0，按E/S比为3.0% 5.0%加入中性蛋白酶Asl. 398，酶解2 4h，酶解过程中用NaOH 试剂调节并保持PH在6. 0 8. 0，不断搅拌；(4)待酶解结束后，用柠檬酸调节PH值至3. 0 5. 0，3000 4000rpm，15min，离心取上清液，为菜籽肽粗制液；(5)在上清液加入占菜籽蛋白质量比为3% 5%的活性炭，用搅拌器搅拌2 Ι，用真空抽滤将活性炭除掉；(6)将步骤5所得的菜籽肽脱色液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为IOOODa超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为菜籽肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤3中再次酶解；(7)交换树脂于去离子水中浸泡处理M小时后装柱，然后分别用7. 5%盐酸和 10% NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和0H_型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7. 0待用；将步骤6中所得的菜籽肽超滤液，以5 10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH = 4. 0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过Off型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7. O时停止加样，收集为菜籽肽精制液；(8)由步骤7中得到的菜籽肽精制液，减压浓缩至固型物含量20% 30% ；(9)精制的菜籽肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果上述步骤(1)的目的是利用蛋白质在碱性条件下溶解的特性，将菜籽蛋白和碱不溶性物质分离开，以提高菜籽蛋白的含量。同时，菜籽粕中含有硫甙、植酸等抗营养成分， 这些成分在碱性条件下溶解率很低，采用碱溶法可有效去除这些成分。上述步骤(2)酸沉的目的是利用蛋白质在酸性等电点条件下沉淀的特性，将菜籽蛋白和酸溶性物质分开，以提高菜籽蛋白的含量。上述步骤(1)、(2)的目的是为了去除菜籽蛋白中的杂质成分，提高菜籽蛋白的含量，为酶解提供原料。一般菜籽粕中蛋白的含量为30%左右，经过上述方法处理后，蛋白含量可达65%以上。上述步骤C3)酶解的目的是将菜籽中的大分子蛋白质酶解为小分子蛋白质和肽；上述步骤(4)调酸的目的是为了使酶失活，停止酶解反应；离心的目的是为了固液分离，收集酶解液。上述步骤(5)中活性炭脱色的目的是为了利用活性炭吸附色素的特性，去除菜籽肽中的色素成分。上述步骤(6)中超滤的目的是为了截取需要分子量的产品；二次酶解的目的是为了将分子量IOOODa以上的大分子蛋白水解成小分子，使最终产品的分子量都在IOOODa以下。上述步骤(7)中脱盐的目的是为了去除酶解液中因酶解过程中不断调节pH而带入的盐离子。没有经过脱盐处理的产品盐分含量大于8%，经过脱盐处理的产品研发含量小于2%。本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果(1)采用碱溶酸沉法提高用来酶解的菜籽蛋白的含量，同时去除菜籽粕中硫甙、植酸的抗营养成分；(2)利用活性炭脱去菜籽肽中的色素；(3)采用超滤法对菜籽肽进行分级处理，保证100%的菜籽肽分子量在IOOODa 以下，并对于分子量IOOODa以上的米糠肽进行二次酶解，使最终产品的分子量分布均在 IOOODa 以下；(4)利用阴阳交换树脂对菜籽肽粗品进行脱盐，没有经过脱盐处理的产品盐分含量大于8%，经过本方法脱盐处理的产品盐分含量小于2% ；本方法制备的菜籽肽，其产品在于包括如下特点(1)本方法制备的菜籽肽为白色或淡绿色粉末，无肉眼可见外来物质；(2)本方法制备的菜籽肽产总氮含量(以干基计)彡80.0%，肽含量(以干基计)彡70. 0%，所得的相对分子质量均在IOOODa以下，水分含量彡5. 0%，灰分含量(以干基计)< 2.0%，相脂肪含量(以干基计)<2.0%。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步详细的说明。图1为本发明菜籽生物活性肽的制备方法的工艺流程图。
具体实施例方式本发明中所述的E/S比是指酶的用量与菜籽蛋白的质量比；本发明中所述的中性蛋白酶Asl. 398的酶活性为130000U/g ；本发明中的比例如无特别说明均指质量比。实施例1(1)取脱脂菜籽粕IOOg溶解至SOOmL水中，用胶体磨粉碎，用NaOH试剂调节pH至 10. 0，不停搅拌15min, 3000rpm, 15min,离心取上清液；(2)将步骤1的上清液加热至90°C，用柠檬酸调节pH值至3.5，温度45°C，搅拌速度45r/min，使蛋白质沉淀30min，然后3000r/min离心分离lOmin，去除上层清液，收集固相，重新按以上步骤加水混勻，用柠檬酸调节PH值至3. 5，使蛋白质沉淀，重复三次，最后水洗两次，离心得固相，即得为菜籽蛋白，称重为58g ；(3)将步骤2的沉淀按倒入600mL水中，加热至90°C，保持30min，然后冷却至 50°C，加入中性蛋白酶Asl. 398(酶活性为130000U/g)2. 32g，用NaOH试剂调节并保持pH在 7. 0，酶解池，酶解过程中不断搅拌；(4)待酶解结束后，用柠檬酸调节pH值至3. 0，3000rpm离心15min，离心后取上清液，为菜籽肽粗制液；(5)加入1. 74g活性炭，用搅拌器搅拌池，用真空抽滤将活性炭除掉；(6)将步骤5中的菜籽肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为 IOOODa超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为菜籽肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤3 二次水解；(7)交换树脂于去离子水中浸泡处理M小时后装柱，然后分别用7. 5%盐酸和 10% NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和0H_型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7. 0待用；将步骤6中所得的菜籽肽超滤液，以5倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH = 4. 0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过 OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样，收集为菜籽肽精制液；；(8)由步骤7中得到的菜籽肽精制液，减压浓缩至固型物含量30% ；(9)精制的菜籽肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，称重为50. 6g。本方法制备的菜籽肽产总氮含量(以干基计)87.6%，肽含量(以干基计)78.4%，所得的相对分子质量均在IOOODa以下，水分含量8 %，灰分含量(以干基计)1. 8%，粗脂肪含量(以干基计)1. 5% ；实施例2(1)取菜籽粕500g溶解至5L水中，用胶体磨粉碎，用NaOH试剂调节pH至12.0， 不停搅拌15min，3000rpm，15min，离心取上清液；(2)将步骤1的上清液加热至90°C，用柠檬酸调节pH值至4.2，温度50°C，搅拌速度30r/min，使蛋白质沉淀45min，然后3000r/min离心分离5min，去除上层清液，收集固相， 重新按以上步骤加水混勻，用柠檬酸调节PH值至4. 2，使蛋白质沉淀，重复三次，最后水洗两次，离心得固相，即得为菜籽蛋白，称重为326g ；(3)将步骤2的沉淀倒入4L水中，加热至95°C，保持30min，然后冷却至45°C，加入中性蛋白酶Asl. 398 (酶活性为130000U/g) 14. 67g，用NaOH试剂调节并保持pH在7. 5， 酶解池，酶解过程中不断搅拌；(4)待酶解结束后，用柠檬酸调节pH值至4. 0，3000rpm离心15min，离心后取上清液，为菜籽肽粗制液；(5)上清液加入13. 04g活性炭，用搅拌器搅拌池，用真空抽滤将活性炭除掉；(6)将步骤5中的菜籽肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为 IOOODa超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为菜籽肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤3 二次水解；(7)交换树脂于去离子水中浸泡处理M小时后装柱，然后分别用7. 5%盐酸和 10% NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和0H_型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7. 0待用；将步骤6中所得的菜籽肽超滤液，以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH = 4. 0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过 OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样，收集为菜籽肽精制液；(8)由步骤8中得到的菜籽肽精制液，减压浓缩至固型物含量30% ；(9)精制的菜籽肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，称重为231. 7g。
本方法制备的菜籽肽产总氮含量(以干基计)84.5%，肽含量(以干基计)75. 1%，所得的相对分子质量均在IOOODa以下，水分含量8. 2%，灰分含量(以干基计)1. 8%，粗脂肪含量(以干基计)1. 9%。实施例3(1)取菜籽粕IOOOg溶解至12L水中，用胶体磨粉碎，用NaOH试剂调节pH至9. 0， 不停搅拌15min，3000rpm，15min，离心取上清液；(2)将步骤1的上清液加热至90°C，用柠檬酸调节pH值至4.5，温度40°C，搅拌速度40r/min，使蛋白质沉淀20min，然后3000r/min离心分离lOmin，去除上层清液，收集固相，重新按以上步骤加水混勻，使蛋白质在等电点沉淀，重复三次，最后水洗两次，离心得固相，即得为菜籽蛋白，称重为589g;(3)将步骤2的沉淀倒入6L水中，加热至90°C，保持30min，然后冷却至50°C，加入中性蛋白酶Asl. 398 (酶活性为130000U/g) 29. 45g，用NaOH试剂调节并保持pH在8. 0， 酶解池，酶解过程中不断搅拌；(4)待酶解结束后，用柠檬酸调节pH值至4. 2，3000rpm离心15min，离心后取上清液，为菜籽肽粗制液；(5)在上清液加入29. 45g活性炭，用搅拌器搅拌池，用真空抽滤将活性炭除掉；(6)将步骤5中的菜籽肽粗制液注入储槽中，调节至一个固定的流速，溶液经微滤后通过分子量截留量为IOOODa超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为菜籽肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤3 二次水解；(7)交换树脂于去离子水中浸泡处理M小时后装柱，然后分别用7. 5%盐酸和 10% NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和0H_型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7. O待用；将步骤6中所得的菜籽肽超滤液，以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH = 4. O左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过 OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样，收集为菜籽肽精制液；(8)由步骤8中得到的菜籽肽精制液，减压浓缩至固型物含量30% ；(9)精制的菜籽肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，称重为503. 9g。本方法制备的菜籽肽产总氮含量(以干基计)81.6%，肽含量(以干基计)72.9%，所得的相对分子质量均在IOOODa以下，水分含量9. 1 %，灰分含量(以干基计)1. 9%，粗脂肪含量(以干基计)1. 9%。
权利要求
1. 一种菜籽生物活性肽的制备方法，该方法包括如下步骤(1)将脱脂菜籽粕与水按1 5 1 15(质量比)溶解至水中，用胶体磨粉碎，用 NaOH试剂调节pH至9. 0 13. 0，不停搅拌15min, 3000 4000rpm, 15min,离心取上清液；(2)将步骤1的上清液加热至70 90°C，用柠檬酸调节pH值至3.0 5. 0，温度40 60°C，搅拌速度30 50r/min，使蛋白质沉淀15 45min，然后3000r/min离心分离5 15min，去除上层清液，收集固相，重新按以上步骤加水混勻，使蛋白质在等电点沉淀，重复三次，最后水洗两次，离心得固相，即得为菜籽蛋白；(3)将步骤2的菜籽蛋白与水按1 5 1 15(质量比)溶解至水中，加热至80 950C，保持15 30min，然后冷却至35 50°C，用NaOH试剂调节并保持pH在6.0 8. 0， 按E/S比为3. 0% 5. 0%加入中性蛋白酶Asl. 398，酶解2 4h，酶解过程中用NaOH试剂调节并保持pH在6. 0 8. 0，不断搅拌；(4)待酶解结束后，用柠檬酸调节pH值至3.0 5. 0，3000 4000rpm，15min,离心取上清液，为菜籽肽粗制液；(5)在上清液加入占菜籽蛋白质量比为3% 5%的活性炭，用搅拌器搅拌2 池，用真空抽滤将活性炭除掉；(6)将步骤5所得的菜籽肽脱色液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为 IOOODa超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为菜籽肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤3中再次酶解；(7)交换树脂于去离子水中浸泡处理M小时后装柱，然后分别用7.5%盐酸和10% NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和0H_型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7. 0待用；将步骤6中所得的菜籽肽超滤液，以5 10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH = 4. 0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过 Off型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7. O时停止加样，收集为菜籽肽精制液；(7)由步骤7中得到的菜籽肽精制液，减压浓缩至固型物含量20% 30% ；(9)精制的菜籽肽液浓缩后，经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。
全文摘要
本发明提供了一种菜籽生物活性肽的制备方法以脱脂菜籽粕为原料，先用碱溶酸沉法制备菜籽蛋白，而后添加蛋白酶水解蛋白质，依次经过活性炭脱色、超滤分级、阴阳离子交换树脂脱盐，最后经浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥得到菜籽生物活性肽。
文档编号C07K1/36GK102174627SQ20111000482
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者亓培实, 何东平, 何莉萍, 倪倩, 刘良忠, 刘雪姣, 宋洋, 江思佳, 陈燕飞, 黄迪惠 申请人:武汉百信食品有限公司