专利名称：融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对组织因子的融合蛋白、强化融合蛋白及其在制备治疗肿瘤 (癌症)的药中的应用与制备方法。
背景技术：
组织因子(tissue factor，TF)是一种在正常组织血管内皮细胞不表达，但在实体瘤新生血管内皮细胞和恶性肿瘤细胞表面特异性高表达的肿瘤细胞表面受体，是肿瘤治疗的重要靶点。力达霉素(lidamycin，LDM)，也叫C1027，是由我国湖北省潜江市土壤中分离得到的一株放线菌(Sti^ptiomyces globisporus C-1027，菌种保藏号CGMCC No. 0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。力达霉素的分子由两部分组成一部分为烯二炔发色团(AE，相对分子质量为843Da)， 具有很强的细胞毒作用，但不稳定；另一部分为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP，相对分子质量为10500Da)，对烯二炔发色团的稳定起保护作用。所述发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，二者可以拆分和进行分子重建，重建后的分子与天然分子活性类似。体内动物实验表明，力达霉素(LDM)对小鼠结肠癌细胞CT-26的移植瘤有非常显著的疗效，对Bel-7402和Hce-8693等多种人肿瘤细胞的移植瘤均有显著疗效(中国抗生素杂志，1994，19 :164-8)。分子药理学研究表明，其主要作用机制是引起特异DNA断裂，从而诱导细胞凋亡。由于力达霉素具有很强的细胞毒作用，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有杀伤作用，致使动物耐受剂量受到限制。然而正是由于其很强的细胞毒作用，力达霉素可用作制备靶向药物的高效“弹头”药物。人凝血因子VII (human factor VILhFVII)的蛋白质分子由406个氨基酸残基组成，分子量约为50kD。其分子包含四个结构域N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域(Gla 结构域)，两个表皮生长因子(EGF)样结构域和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。迄今为止， 尚未见以人凝血因子VII或其轻链作为药物的靶向结构域及人凝血因子VII或其轻链与力达霉素构成的强化融合蛋白的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码融合蛋白LhFVII-LDP的基因、表达融合蛋白 LhFVII-LDP的重组质粒及融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII_LDP_AE，本发明的再一目的是证明融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE具有与肿瘤细胞表面组织因子结合的活性，为制备靶向肿瘤治疗药物提供一种新方法。本发明所述编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因，由编码人凝血因子VII轻链(light chain of human factor VII，简称LhFVII)的基因和编码力达霉素辅基蛋白 (lidaprotein，简称LDP)的基因连接而成，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0. 3所示。本发明所述表达融合蛋白LhFVII-LDP的重组质粒，含有编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。本发明所述融合蛋白LhFVII-LDP，由上述重组质粒表达而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示，分子量约为33kDa。本发明所述强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE，由氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4 所示的融合蛋白LhFVII-LDP和烯二炔发色团(active enediyne，简称AE)构成。所述烯二炔发色团与融合蛋白LhFVII-LDP中的力达霉素辅基蛋白(LDP)结合。本发明通过实验证明融合蛋白LhFVII-LDP具有与人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、 人肝癌细胞等肿瘤细胞表面组织因子结合的活性。融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白 LhFVII-LDP-AE对人肺癌A549细胞、人结肠癌HCT-116和HT-四细胞、人肝癌IfepG2细胞、 人乳腺癌MDA-MB-231细胞具有杀伤力；强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE与力达霉素相比，对肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌的抑瘤率明显提高。因此，本发明所述融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE可在制备治疗肿瘤的药中的应用。可以通过将本发明所述的融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。本发明具有以下有益效果1、本发明所述融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE与其受体一组织因子结合的亲和力强(Kd值在10_8 I(T11M)，并且可被内吞进入细胞，对肿瘤细胞具有良好的靶向性，有望成为新型高效的靶向抗肿瘤药物，本发明为肿瘤药物的制备提供了一种新方法。2、人凝血因子VII轻链是人体的天然成分，本发明以其为靶向结构域可以有效降低药物的免疫原性。3、融合蛋白LhFVII-LDP可以直接通过基因工程技术在大肠杆菌细胞内表达获得，生产成本较低，有利于工业化生产。
图1是本发明所述编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因的全长序列PCR扩增电泳图，图中，1泳道DNA分子量标记(1Kb、Markerl，购自天根公司)；2泳道编码人凝血因子VII轻链的序列；3泳道编码力达霉素辅基蛋白LDP的序列；4泳道编码融合蛋白 LhFVII-LDP的融合基因的序列。图2是本发明所述重组质粒(pET19blhfVIIldp)的一种示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。图3是本发明所述重组质粒(pET19blhfVIIldp)的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道DNA分子量标记(Markerl，购自天根公司)；2泳道用限制性内切酶 (NdeI和XhoI)双酶切重组质粒(pET19blhfVIIldp)后所得的pET19b载体片段(5717bp) 和编码融合蛋白LhFVII-LDP的DNA片段(858bp) ；3泳道DNA分子量标记(1Kb，购自天根公司)。图4是本发明所述重组质粒(pET19blhfVIIldp)在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道蛋白质分子量标记(proteinRuler I，购自北京自全式生物技术有限公司)；2泳道诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体经超声波破碎后的可溶性部分，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP的电泳条带；3泳道诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体经超声波破碎后的不可溶性部分，箭头所指为融合蛋白 LhFVII-LDP的电泳条带；4泳道诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体总蛋白，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP的电泳条带；5泳道诱导之前未表达融合蛋白LhFVII-LDP的菌体总蛋白。图5是诱导表达的融合蛋白LhFVII-LDP的western-blot鉴定分析图，其中， 1泳道诱导之前未表达融合蛋白LhFVII-LDP的菌体总蛋白；2泳道诱导表达融合蛋白 LhFVII-LDP后的菌体总蛋白，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP。图6是经亲合层析纯化后的各馏分中融合蛋白LhFVII-LDP的SDS-PAGE鉴定分析图，其中，1泳道蛋白质分子量标记(#SM0431，购自i^ermentas) ；2_10泳道纯化后的9个馏分，泳道中条带为纯化后的融合蛋白LhFVII-LDP。图7是本发明所述的融合蛋白LhFVII-LDP与人肺癌细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞表面表达的组织因子结合后的免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation, IP)分析图，其中，1泳道NCI_H292细胞总蛋白经免疫共沉淀后的产物；2泳道融合蛋白LhFVII-LDP与NCI-H292细胞共孵育后的总蛋白经免疫共沉淀后的产物；3泳道HepG2细胞总蛋白经免疫共沉淀后的产物；4泳道融合蛋白LhFVII-LDP 与HepG2细胞共孵育后的总蛋白经免疫共沉淀后的产物；5泳道MDA_MB_231细胞总蛋白经免疫共沉淀后的产物；6泳道融合蛋白LhFVII-LDP与MDA-MB-231细胞共孵育后的总蛋白经免疫共沉淀后的产物-J泳道融合蛋白LhFVII-LDP经免疫共沉淀后的产物；8泳道 融合蛋白LhFVII-LDP。图8是本发明所述的融合蛋白LhFVII-LDP与烯二炔发色团AE强化后的产物 (LhFVII-LDP-AE)的高效液相色谱(HPLC)分析图。图9是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和LDM 抑制人肝癌细胞H印G2裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中，+control 注射生理盐水的实验组；+ LDM 0. 05 注射剂量为0. 05mg/kg的LDM的实验组；LhFVII-LDP 10 注射剂量为10mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组；务LhFVII-LDP-AE04 注射剂量为0. 4mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE的实验组；—t— LhFVII-LDP-AE 0. 4+LhFVII-LDP 10 同时注射剂量为0. 4mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE和IOmg/ kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组；+ LhFVII-LDP-AE 0. 8 注射剂量为0. 8mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE的实验组。图10是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和LDM 抑制人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中，+control 注射生理盐水的实验组；+ LDM0. 05 注射剂量为0. 05mg/kg的LDM的实验组；+LhFVII-LDP 10 注射剂量为10mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组；^LhFVII-LDP-AE 02 注射剂量为0. 2mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组；LhFVII-LDP-AE 0. 4 注射剂量为0. 4mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组。图11是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和 LDM抑制人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中，+ control 注射生理盐水的实验组；+ LhFVII-LDP(0.6)注射剂量为0. 6mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组；LDM (0. 05)注射剂量为0. 05mg/kg的LDM的实验组； LhFVII-LDP-AE(0. 15)注射剂量为0. 15mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； 一 LhFVII-LDP-AE (0. 3)注射剂量为0. 3mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； -·-LhFVII-LDP-AE (0. 6)注射剂量为0. 6mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组。图12 是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP 和LDM抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中，+ control 注射生理盐水的实验组；+ LDI (0. 05)注射剂量为0. 05mg/kg的LDM的实验组；+ LhFVII-LDP(0. 3)注射剂量为0. 3mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组； ——LhFVII-LDP-AE(0. 15)注射剂量为0. 15mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组；LhFVII-LDP-AEE(0. 3)注射剂量为0. 3mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组；LhFVII-LDP-AE (0. 45)注射剂量为0. 45mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组。本发明将表达LhFVII-LDP 的菌株命名为 lhfVII-LDP-pET19b-Rosetta_gami B(DE3)pLysS,并送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类大肠埃希氏菌hcherichia coli，保藏编号=CGMCC NO. 4528，保藏日期2011年1月5日。
具体实施例方式实施例1 编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因的克隆引物 1 :5’ -TAACCATGGGCCATCATCATCATCATCACGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCG-3’Nco I弓丨物 2 :5， -CCACCACTGCCGCCGCCGCCGCTACCACCACCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCAT T-3，Linker =GGGGS X 3 连接肽弓I 物 3 :5，-GTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGCGGTGGCTCTGCGCCCGCCTTCTCCGT C-3，Linker =GGGGS X 3 连接肽引物 4 5，-TATCTCGAGTTAGCCGAAGGTCAGAGCCACGT-3，Xho I以上引物由英俊生物技术有限公司合成。以人凝血因子VIIcDNA(广州复能基因有限公司)为模板，用引物1和引物2进行
PCR扩增，得到长521bp、含有人凝血因子VII轻链和GGGGSX 3连接肽编码序列的DNA片段 (见图1)，引物1序列中引入Nco I酶切位点，引物2序列中引入GGGGS X 3连接肽编码序列。PCR反应条件参照I^rimer star DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书，反应体系 (50ul)如下水蒸水31.5ul5 X 反应 buffer IOuldNTP Mix :4ul引物 I(IOmM) Iul引物 2 (IOmM) :lul
人凝血因子VII cDNA(100ng/ul) :2ulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul以含有编码力达霉素辅基蛋白(LDP)基因的质粒pEFL(专利申请号03150M0. 7，
发明者刘秀均, 宋旭, 廖东升, 张青, 胡莲, 郑艳波 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所, 四川大学