系列镇痛活性肽dkk及类似物的获得方法和应用的制作方法

系列镇痛活性肽dkk及类似物的获得方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药生物【技术领域】，涉及系列镇痛活性肽DKK及其类似物与其获得方法和作为镇痛药物在医药领域中的应用。所述镇痛活性肽分别含有如下氨基酸序列：DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACW?CEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRA?YGASYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCK?ISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCG?GKK。所述系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段，可利用基因工程技术表达获得，获得方法简单，获得的产物具有很好的镇痛活性。
【专利说明】系列镇痛活性肽DKK及类似物的获得方法和应用
[0001]本申请是沈阳药科大学2010年3月9日申请的申请号为201010120159.9，发明名称为“系列镇痛活性肽DKK及其类似物的获得方法和应用”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物医药【技术领域】，涉及系列镇痛活性肽DKK及其类似物的获得方法和作为镇痛药物在医药领域中的应用，具体地说，本发明涉及系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段结构及其获得方法和作为镇痛药物在医药领域中的应用。
【背景技术】
[0003]疼痛是人类共有而又有较大个体差异性的一种不愉快的主观感觉，它在躯体受到威胁时提供警报信号，是生命不可缺少的一种保护机制。专利名称为蝎抗神经兴奋肽(发明专利号:ZL00112016.6)的发明提供了一种蝎抗神经兴奋肽及其基因序列和作用为预防、治疗神经兴奋性疾病(如癫痫、惊厥等)的药物。Chun-Guang Wang等在文章中报道了抗癫痫月太结构(Chun-Guang Wang, Xiao-Lin He, Feng Shao, Wei Liu, Min-Hua Ling, Da-Cheng Wangand Cheng—Wu Ch1.Molecular characterization of an ant1-epilepsy peptide from thescorpion Buthus martensi Karsch.Eur.J.Biochem.268, 2480-2485，2001)。上述专利和论文所涉及的多肽是 否具有镇痛生物活性并没有报道，因此，有必要针对其镇痛生物活性进行系统研究。

【发明内容】

[0004]本发明的一个目的是利用基因工程技术表达系列镇痛活性肽DKK，针对纯化的系列镇痛活性肽DKK，进行其体内镇痛生物活性研究。
[0005]本发明的第二个目的是在证明系列镇痛活性肽DKK具有镇痛生物活性的基础上，利用基因工程技术获得系列镇痛活性肽DKK的衍生物或类似物或活性片段，所获得的系列镇痛活性肽DKK的衍生物或类似物或活性片段仍具有镇痛生物活性。
[0006]本发明的第三个目的是提供获得系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的方法，该方法包括:
[0007]1.分别构建系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段所编码DNA的重组表达载体；
[0008]2.用步骤I的重组载体分别转化适当的宿主细胞；
[0009]3.在适合于表达系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的条件下培养步骤2的被转化的宿主细胞；
[0010]4.收获并纯化所得到的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段。
[0011]本发明的第四个目的是提供含有如上限定的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段和一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0012]本发明的另一个目的是提供如上限定的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段在生产镇痛药物中的应用。
[0013]本发明提供了一种上述载体转化的宿主细胞。
[0014]本发明提供的上述表达产物分离纯化可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法，从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达产物。在产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测产物的存在及相应分子大小。
[0015]本发明还提供了系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段在生物制药领域的应用，具体地说包括镇痛生物活性的应用。
[0016]本发明首次进行系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的小鼠体内镇痛生物学活性实验。
[0017]本发明进一步涉及含有上述系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段和至少一种医药上可接受的惰性载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington’ sPharmaceutical Science, 15th., Mack Publishing Company, 1980)。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。
[0018]可使用本发明的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段或含有该系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。
[0019]在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
[0020]本发明的系列镇痛活性肽及DKK及其衍生物或类似物或活性片段获得方法简单，获得的产物具有较好的镇痛活性。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
[0022]实施例1:
[0023]镇痛活性肽DKK-1的获得
[0024]1.镇痛活性肽DKK-1表达质粒的构建
[0025]本实施例列举描述用于表达本发明镇痛活性肽DKK-1的重组表达质粒的构建策略和基本方法。
[0026]根据镇痛活性肽DKK-1 (— 级结构:DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK)的氨基酸序列，设计相应寡核苷酸引物I和引物2，同时在上述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上限制性核酸内切酶Nde I和BamH I水解位点序列。以已经构建含有DKK-1基因的质粒为模板，利用上述引物I和引物2进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收，经过限制性核酸内切酶Nde I和BamH I双酶切后，与同样进行双酶切的表达质粒在T4DNA Iigase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后进行DNA序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法构建获得镇痛活性肽DKK-1表达质粒。
[0027]2.镇痛活性肽DKK-1的获得
[0028]将上述镇痛活性肽DKK-1表达质粒热转化大肠杆菌BL21 ( λ DE3)，然后从该LB固体平板上挑取单菌落后接种至3ml LB (含卡那抗生素,50 μ g/ml),于37°C, 200r/min振荡过夜培养。按照1%接种量将过夜培养物接种至400ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37°C，200r/min振荡培养至OD6tltl为0.6-0.8，加入终浓度为0.166mmol/L的诱导物异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养4h。结束发酵，3000g，4°C离心20min，收集菌体。用40ml裂解缓冲液(0.1M PBS, 0.15M NaCl, 50mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12，000g，4°C离心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，上样于0.1MPBS(PH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的PH缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0.5M咪唑(pH9.0)进行洗脱并收获洗脱液。所得产物经过15%SDS-PAGE验证纯度。该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为:MHHHHHHM DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCffTWGLACffCEGLPDDKTffKSESNTCGGKKo上述获得的表达产物，利用化学法在M处断裂肽链，从而获得镇痛活性肽DKK-1，结构特征为:DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSES NTCGGKK。
[0029]实施例2: [0030]镇痛活性肽DKK-2的获得
[0031]本实施例获得镇痛活性肽DKK-2的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本方法。
[0032]镇痛活性肽DKK-2 的结构特征为:DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCffTffGLACffCEGLPDDKTffKSESNTCGGKK。
[0033]实施例3:
[0034]镇痛活性肽DKK-3的获得
[0035]本实施例获得镇痛活性肽DKK-3的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本方法。
[0036]镇痛活性肽DKK-3 的结构特征为:DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCffTffGLACffCEGLPDDKTffKSESNTCGGKK。
[0037]实施例4:
[0038]镇痛活性肽DKK-4的获得
[0039]本实施例获得镇痛活性肽DKK-4的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本方法。
[0040]镇痛活性肽DKK-4 的结构特征为:DGYIRGSNGCKVSCLLGNEGCNKECRAYGASYGYCffTffKLACffCQGLPDDKTffKSESNTCGGKK。
[0041]实施例5:[0042]系列镇痛活性肽DKK类似物的获得
[0043]本实施例获得系列镇痛活性肽DKK类似物的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本方法。系列镇痛活性肽DKK的类似物结构包括:
[0044]
【权利要求】
1.系列镇痛活性肽DKK及其衍生物在制备镇痛药物中的应用，其特征在于， 所述的镇痛活性肽DKK的序列为:
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物利用基因工程技术表达获得，其表达宿主细胞为原核细胞或真核细胞，其方法包括: 分别构建系列镇痛活性肽DKK及其衍生物所编码DNA的重组表达载 体； (2)用步骤I的重组载体分别转化适当的宿主细胞； (3)在适合于表达系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的 条件下培养步骤2的被转化的宿主细胞； (4)收获并纯化所得到的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的系列镇痛活性肽DKK 及其衍生物利用化学合成技术获得，化学合成为人工合成或合成仪合成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的系列镇痛活性肽DKK 及其衍生物与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。
【文档编号】A61K38/17GK103990110SQ201410145558
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2010年3月9日 优先权日:2010年3月9日
【发明者】张景海, 宋永波, 吴春福 申请人:沈阳药科大学