一种珍珠粉‑硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法与流程

本发明属于材料学领域，涉及一种骨组织工程支架，具体来说是一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法。

背景技术：

骨骼系统是生物体最主要的支撑系统。骨骼的功能主要包括承重、力传导、保护内脏器官等，同时还参与造血、代谢等生理过程。然而，由于肿瘤切除，先天性疾病，感染和外伤等造成了大量骨组织缺损问题，这已经成为医学上常见的病症。目前，应用骨组织工程支架对缺损部位进行修复治疗被认为是解决相关问题的有效方法之一。其中，制备具有优异的力学性能及生物学性能的三维多孔骨组织工程支架材料是研究的热点与难点。半水硫酸钙是目前应用广泛的骨水泥材料，具有水硬性和良好的生物相容性。珍珠粉是由蛋白质(水解后可得到18种氨基酸，其中7种是人体必需氨基酸)、文石结构的碳酸钙，20多种微量元素及维生素B构成。研究表明，珍珠粉能够促进成骨细胞的增殖、分化，诱导新骨再生。结合半水硫酸钙的水硬性和珍珠粉优异的生物活性和丰富的微量元素及蛋白质，制备出兼顾结构力学和生物活性的多孔复合支架，有望应用于骨缺损治疗领域。

三维打印快速成型技术由于其便捷、快速、可操控性强的突出优点及构建复杂形状的能力，在组织工程支架制备领域表现出无可比拟的优势。

在现有技术背景下，采用三维打印技术制备珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，有望为骨缺损修复治疗及实现骨功能重建开辟新的途径。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，所述的这种复合支架的制备方法要解决现有技术中由于硫酸钙骨水泥快速硬化而不易三维打印和兼顾骨组织工程支架力学性能、降解性以及生物活性的技术问题。

本发明提供了一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

1)一个配制珍珠粉-硫酸钙复合墨水的步骤，将珍珠粉和半水硫酸钙粉体分别过400-800目筛，称取珍珠粉和半水硫酸钙粉体，所述的珍珠粉和半水硫酸钙粉体的质量比为10:90至90:10之间，混合均匀；再加入聚己内酯溶液作为粘结剂，所述的聚己内酯与粉体的质量比为15:75至50:50之间，搅拌均匀得到打印墨水，然后密封保存；

2)一个设计珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的外观和内部结构的步骤，运用计算机辅助软件设计支架的模型和内部结构，支架模型的尺寸小于等于15×15×15cm，内部孔径为100～1000μm，相邻两层墨水走向夹角为0°～180°可调；

3)一个采用三维打印技术制备珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的步骤，将配制好的复合墨水装进三维打印机的料筒中，安装针头，所述的针头的内径在100μm～800μm之间，打印机料筒的温度设置为20℃～30℃，气压设置为2.0～3.0bar，打印速度为2.0～10.0mm/s；将墨水打印在载物台上，得到珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架；

4)一个将珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架进行养护的步骤，将打印制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架置于鼓风干燥箱中干燥36～52小时后，置于37℃和100％相对湿度环境下养护3-7天；将养护后的支架清洗干燥备用。

进一步的，鼓风干燥箱中的温度设定为37℃。

进一步的，聚己内酯溶液中的溶剂由二氯甲烷和二甲亚砜组成，二氯甲烷与二甲亚砜的体积比为10:1，聚己内酯与溶剂的质量体积比为0.1～0.2g/ml。

进一步的，珍珠粉及硫酸钙混合粉体的质量占复合支架总质量的50％～75％。

本发明的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，采用三维打印快速成型技术，将硫酸钙的水硬特性和珍珠粉优异的生物学性能相结合，制备出三维多孔复合支架。对所述复合支架的理化性能和生物学性能测试得知，支架具有三维连通且可控的大孔结构，孔隙率在40％至80％可调，具有优异的力学性能，在模拟体液中能够诱导羟基磷灰石形成，且对人体骨髓间质干细胞的增殖、分化和成骨起促进作用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。通过本发明的方法获得的复合骨组织工程支架有望为临床上大段骨缺损的修复治疗带来新的契机。

附图说明

图1是实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的光学照片.

图2是实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的扫描电镜(SEM)图。

图3是实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的抗压强度随变形量变化关系曲线图。

图4是实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架在模拟体液浸泡5天后的扫描电镜(SEM)图。

图5是实施例2所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的光学照片.

图6是实施例2所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的扫描电镜(SEM)图。

图7是实施例2所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的抗压强度随变形量变化关系曲线图。

图8是实施例2所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架在模拟体液浸泡5天后的扫描电镜(SEM)图。

图9是实施例3所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的光学照片.

图10是实施例3所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的扫描电镜(SEM)图。

图11是实施例3所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的抗压强度随变形量变化关系曲线图。

图12是实施例3所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架在模拟体液浸泡5天后的扫描电镜(SEM)图。

具体实施方式

为了使相关领域研究人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，配制珍珠粉-硫酸钙复合打印墨水。将珍珠粉和半水硫酸钙分别过400目的筛网，然后按珍珠粉占混合粉体质量比10：90混合均匀，加入到聚己内酯(PCL)/二氯甲烷-二甲亚砜混合液(0.2g/ml)中，所述的聚己内酯与粉体的质量比为15:75，快速搅拌均匀，然后密封保存。

步骤二，设计珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的外观和内部结构。运用CAD/CAM等计算机辅助软件设计支架的外观和内部结构，支架模型为正方体(10mm×10mm×10mm),内部孔径为400μm，相邻两层墨水走向夹角为90°。

步骤三，三维打印技术制备珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，将配制好的复合墨水装进三维打印机的料筒中，安装内径为400μm的针头；打印机料筒温度设置为23℃，气压设置为2.0bar，打印速度为5mm/s；将墨水打印在载物台上，按照逐层打印、层层堆积的方式精确成型得到所需的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架。

步骤四，通过养护方式提高珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架强度，将打印制备的三维多孔支架置于37℃鼓风干燥箱中干燥48小时后，置于37℃和100％相对湿度环境中养护3天；将养护后的支架清洗干燥备用。

结果如图1-4所示，实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架具有规则有序的三维大孔结构。变形量为15％时，抗压强度可达6.36Mpa,满足人体松质骨对抗压强度的要求。将支架浸泡模拟体液5天后，可以明显地看到支架表面有一层圆形颗粒厚层沉积在支架的表面，通过能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)测试发现支架表面Ca/P比为1.67，说明支架表面有羟基磷灰石的沉积，并且复合支架具有优异的生物活性。

实施例2

一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，配制珍珠粉-硫酸钙复合打印墨水。将珍珠粉和半水硫酸钙分别过400目的筛网，然后按珍珠粉占混合粉体质量比30：70混合均匀，加入到聚己内酯(PCL)/二氯甲烷-二甲亚砜混合液(0.2g/ml)中，所述的聚己内酯与粉体的质量比为15:75，快速搅拌均匀，然后密封保存。

步骤二，设计珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的外观和内部结构。运用CAD/CAM等计算机辅助软件设计支架的外观和内部结构，支架模型为圆柱体(直径为10mm，高度为10mm),内部孔径为200μm，相邻两层墨水走向夹角为60°。

步骤三，三维打印技术制珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，将配制好的复合墨水装进三维打印机的料筒中，安装内径为400μm的针头；打印机料筒温度设置为25℃，气压设置为3.0bar，打印速度为6mm/s；将墨水打印在载玻片上，按照逐层打印、层层堆积的方式精确成型得到所需的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架。

步骤四，通过养护方式提高珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架强度，将打印制备的三维多孔支架置于37℃鼓风干燥箱中干燥48小时后，置于37℃和100％相对湿度环境中养护3天；将养护后的支架清洗干燥备用。

结果如图5-8所示，实施例2所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架具有规则有序的三维大孔结构。变形量为15％时，抗压强度可达6.74Mpa,满足人体松质骨对抗压强度的要求。将支架浸泡模拟体液5天后，可以明显地看到支架表面有一层圆形颗粒厚层沉积在支架的表面，通过能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)测试发现支架表面Ca/P比为1.67，说明支架表面有羟基磷灰石的沉积，且复合支架具有优异的生物活性。

实施例3

一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，配制珍珠粉-硫酸钙复合打印墨水。将珍珠粉和半水硫酸钙分别过400目的筛网，然后按珍珠粉占混合粉体质量比50：50混合均匀，加入到聚己内酯(PCL)/二氯甲烷-二甲亚砜混合液(0.2g/ml)中，所述的聚己内酯与粉体的质量比为15:75，快速搅拌均匀，然后密封保存。

步骤二，设计珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的外观和内部结构。运用CAD/CAM等计算机辅助软件设计支架的外观和内部结构，支架模型为正方体(10mm×10mm×10mm),内部孔径为400μm，相邻两层墨水走向夹角为30°。

步骤三，三维打印技术制珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，将配制好的复合墨水装进三维打印机的料筒中，安装内径为600μm的针头；打印机料筒温度设置为22℃，气压设置为2.0bar，打印速度为6mm/s；将墨水打印在载物台上，按照逐层打印、层层堆积的方式精确成型得到所需的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架。

步骤四，通过养护方式提高珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架强度的步骤，将打印制备的三维多孔支架置于37℃鼓风干燥箱中干燥48小时后，置于37℃和100％相对湿度环境中养护3天；将养护后的支架清洗干燥备用。

结果如图8-12所示，实施例3所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架具有规则有序的三维大孔结构。变形量为15％时，抗压强度可达7.23Mpa,满足人体松质骨对抗压强度的要求。将支架浸泡模拟体液5天后，可以明显地看到支架表面有一层圆形颗粒厚层沉积在支架的表面，通过能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)测试发现支架表面Ca/P比为1.63，接近羟基磷灰石的钙磷比，表明复合支架具有优异的生物活性。

实施例4

一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，配制珍珠粉-硫酸钙复合打印墨水。将珍珠粉和半水硫酸钙分别过400目的筛网，然后按珍珠粉占混合粉体质量比70：30混合均匀，加入到聚己内酯(PCL)/二氯甲烷-二甲亚砜混合液(0.2g/ml)中，所述的聚己内酯与粉体的质量比为15:75，快速搅拌均匀，然后密封保存。

步骤二，设计珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的外观和内部结构。运用CAD/CAM等计算机辅助软件设计支架的外观和内部结构，支架模型为正方体(10mm×10mm×10mm),内部孔径为400μm，相邻两层墨水走向夹角为90°。

步骤三，三维打印技术制备珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，将配制好的复合墨水装进三维打印机的料筒中，安装内径为400μm的针头；打印机料筒温度设置为23℃，气压设置为2.0bar，打印速度为5mm/s；将墨水打印在载物台上，按照逐层打印、层层堆积的方式精确成型得到所需的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架。

步骤四，通过养护方式提高珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架强度，将打印制备的三维多孔支架置于37℃鼓风干燥箱中干燥48小时后，置于37℃和100％相对湿度环境中养护3天；将养护后的支架清洗干燥备用。

实施例5

一种珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，配制珍珠粉-硫酸钙复合打印墨水。将珍珠粉和半水硫酸钙分别过400目的筛网，然后按珍珠粉占混合粉体质量比90：10混合均匀，加入到聚己内酯(PCL)/二氯甲烷-二甲亚砜混合液(0.2g/ml)中，所述的聚己内酯与粉体的质量比为50:50，快速搅拌均匀，然后密封保存。

步骤二，设计珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架的外观和内部结构。运用CAD/CAM等计算机辅助软件设计支架的外观和内部结构，支架模型为正方体(10mm×10mm×10mm),内部孔径为400μm，相邻两层墨水走向夹角为90°。

步骤三，三维打印技术制备珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架，将配制好的复合墨水装进三维打印机的料筒中，安装内径为400μm的针头；打印机料筒温度设置为23℃，气压设置为2.0bar，打印速度为5mm/s；将墨水打印在载物台上，按照逐层打印、层层堆积的方式精确成型得到所需的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架。

步骤四，通过养护方式提高珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架强度，将打印制备的三维多孔支架置于37℃鼓风干燥箱中干燥48小时后，置于37℃和100％相对湿度环境中养护3天；将养护后的支架清洗干燥备用。

实施例6模拟体液矿化例

实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架在模拟体液中的矿化能力，包括以下步骤：

步骤一，根据文献报道配置模拟体液(Kokubo T,Takadama H.How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity？[J].Biomaterials,2006,27(15):2907–2915)。配制方法是依次将分析纯NaCl、NaHCO₃、KCl、K₂HPO₄·3H₂O、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂和Na₂SO₄溶解在去离子水中，并用三羟甲基氨基甲烷(NH₂C(CH₂OH)₃,Tris)及1.0mol/L的盐酸调节溶液pH值为7.40。所配置模拟体液(SBF)的主要成分与人体血浆中的无机成分基本相同。

步骤二，将实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架在无水乙醇介质中超声清洗、烘干，然后将支架置于盛有SBF的聚乙烯瓶中，按照SBF体积和支架质量比为200ml/g的比例，添加新配置的SBF溶液，再将聚乙烯瓶加盖密封，置于37℃的烘箱内，整个过程中不更换SBF(即静态SBF浸泡)。到达预定时间5天后，取出支架材料，在37℃烘箱中干燥。

步骤三，通过扫描电镜(SEM)观察支架表面羟基磷灰石的沉积和通过能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)测试支架表面Ca/P比。

结果如图4所示，实施例1所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架在模拟体液中浸泡5天后仍然保持规则有序的大孔结构，并且可以明显地看出支架表面有一层圆形颗粒厚层沉积在支架的表面，通过能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)测试发现支架表面Ca/P比为1.67，说明支架表面有羟基磷灰石的沉积，并且复合支架具有优异的生物活性。

上述制备过程，可以通过改变珍珠粉和硫酸钙的质量比，有机溶剂的种类，调节打印参数，制备出不同成分含量，不同内部结构的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架。

对所述支架进行理化性能和生物学性能分析表明，本发明所制备的复合骨组织工程支架具有三维连通且可控的大孔结构，力学强度满足人体松质骨抗压强度的要求，并且能够诱导羟基磷灰石的形成。因此，本发明所制备的珍珠粉-硫酸钙复合骨组织工程支架有望为临床上大段骨缺损的治疗带来新的治疗方法。

以上内容是结合具体的实施例对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明只局限于这些实施例。因此，在不脱离本发明总体构思下的修改和替换，应属于本发明的保护范围之内。