本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学的领域。本发明还涉及药物的领域。
背景技术：
：：稳态(体内平衡)本质上是平衡的状态，并且不同于用限定的物理参数(例如温度、压力)通过微环境中底物(基质，substrate)和产物的相对浓度确定的化学平衡。在稳态中，对每个生命系统限定平衡，并且这种平衡是对生物体的生存力最有益的点。其也是各种生物系统努力达到和维持的状态。稳态可以指生物体、系统(例如，心血管系统、免疫系统)、器官、组织或细胞内的稳定内部生物微环境。微环境可以包括细胞的数量、状态和类型，细胞外基质的组成，生物化学和生物物理学参数。生命系统仅在狭义的微环境中发挥最佳机能。偏离限定的微环境或损失稳态造成次佳机能，其会导致疾病或组织损伤。反过来，疾病或组织损伤中断稳态，并且修复和恢复涉及回到稳态。例如，血液的生理ph为7.4，并且血液缓冲系统已演变成在ph7.4平衡，以维持7.4的稳态ph。该缓冲系统具有针对由外部因素引起的变化缓冲稳态ph的能力。当超出或耗尽该能力时，无法维持生理ph，而且存在ph稳态损失，从而造成具有可怕后果的酸中毒或碱中毒。另一实例是免疫稳态。调节免疫稳态对于身体防御病原体和病变组织以及最小化附带组织损害是很重要的。免疫稳态的调节异常损害身体的防御以及自体识别对非自体识别，从而导致疾病或自身免疫。因此，恢复或维持稳态不仅在维持生物体的健康或健全方面是重要的，而且在疾病和损伤的修复和恢复方面也是重要的。调节或维持稳态的主要参与者是信号传导分子(signalingmolecule)，诸如细胞因子、趋化因子、生长因子荷尔蒙，它们的受体以及将信号翻译为生理结果的酶。这些荷尔蒙及其受体的活动在很大程度上由对微环境敏感的正反馈系统和负反馈系统调节。对微环境的这种敏感度以及正反馈系统和负反馈系统主要由酶支持。酶基本上是所有生物活性的主力，从基因复制和转录到通讯、新陈代谢和细胞死亡。酶具有使其成为对稳态的重要贡献者的属性。酶活性取决于底物、产物和辅助因子的相对浓度以及外部因素诸如温度、ph和组织或细胞结构，即，酶对其生物化学和生物物理微环境敏感，并且其平衡状态逐步校准至稳态状态。偏离平衡状态会抑制、促进或反转反应，直到恢复平衡。与催化剂不同，大部分酶特别是限速酶必须激活，并且其活性在很大程度上由反馈机制调节，以维持生理平衡而非化学计量平衡。技术实现要素：现在，我们将说明外泌体(外来体，exosome)诸如间充质干细胞外泌体恢复稳态诸如细胞和免疫稳态的能力。外泌体诸如间充质干细胞外泌体因此在治疗或预防稳态被中断或以其他方式异常的疾病诸如移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)方面是特别有用的。根据本发明的第一方面，我们提供了一种用于促进、恢复或加强患有移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)的个体的稳态的方法中的外泌体。稳态可以包括免疫稳态。稳态可以包括免疫应答的维持。该方法可以包括向个体施用治疗有效量的外泌体。疾病可以包括移植物抗宿主病(gvhd)。疾病可以包括急性移植物抗宿主病(agvhd)。疾病可以包括慢性移植物抗宿主病(cgvhd)。疾病可以包括输血(输液)相关的移植物抗宿主病。疾病可以包括大疱性表皮松解症(eb)。疾病可以包括单纯型大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosasimplex)。疾病可以包括交界型大疱性表皮松解症(结合型大疱性表皮松解症，junctionalepidermolysisbullosa)。疾病可以包括营养不良型大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysisbullosa)。疾病可以包括致死性棘层松懈性大庖性表皮松解症(lethalacantholyticepidermolysisbullosa)。疾病可以包括获得性大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosaacquisita)。外泌体可以包括间充质干细胞外泌体。外泌体可以包括间充质干细胞的至少一种生物性质。外泌体可以包括间充质干细胞条件培养基(msc-cm)的生物活性。外泌体可以包括心脏保护活性。外泌体可以能够减少梗死面积(梗塞面积，梗死尺寸，infarctsize)。外泌体可以能够减少如在心肌缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型中测定的梗死面积。外泌体可以能够减少氧化应激。外泌体可以能够减少在过氧化氢(h2o2)诱导细胞死亡的体外测定中所测定的氧化应激。外泌体可以具有如通过电子显微镜确定的在50nm至100nm之间的大小。根据本发明的第二方面，提供了一种用于治疗或预防特征在于稳态的改变的疾病的方法的外泌体。疾病可以包括移植物抗宿主病(gvhd)。疾病可以包括大疱性表皮松解症(eb)。根据本发明的第三方面，我们提供了一种外泌体在制备用于促进、恢复或加强患有移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)的个体的稳态的药物中的用途。作为本发明的第四方面，提供了一种外泌体在制备用于治疗或预防特征在于稳态的改变的疾病的药物中的用途，其中，疾病包括移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)。根据本发明的第五方面，我们提供了一种治疗患有移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)的个体的方法，该方法包括向个体施用外泌体，优选地为间充质干细胞外泌体。除非另有说明，否则本发明的实践将采用常规化学技术、分子生物学技术、微生物学技术、重组dna和免疫学技术，这些均在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中得到解释。参见，例如j.sambrook,e.f.fritsch和t.maniatis,1989,molecularcloning:alaboratorymanual，第二版，1-3册，coldspringharborlaboratorypress；ausubel,f.m.等人(1995和定期增刊；currentprotocolsinmolecularbiology,第9、13和16章，johnwiley&sons,newyork,n.y.)；b.roe、j.crabtree和a.kahn,1996,dnaisolationandsequencing:essentialtechniques,johnwiley&sons；j.m.polak和jameso’d.mcgee,1990,insituhybridization:principlesandpractice；oxforduniversitypress；m.j.gait(editor),1984,oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,irlpress；d.m.j.lilley和j.e.dahlberg,1992,methodsofenzymology:dnastructureparta:synthesisandphysicalanalysisofdnamethodsinenzymology,academicpress；usingantibodies:alaboratorymanual:portableprotocolno.i，作者edwardharlow,davidlane,edharlow(1999,coldspringharborlaboratorypress,isbn0-87969-544-7)；antibodies:alaboratorymanual，作者edharlow(编辑)、davidlane(编辑)(1988,coldspringharborlaboratorypress,isbn0-87969-314-2),1855.handbookofdrugscreening，ramakrishnaseethala编辑，prabhavathib.fernandes(2001,newyork,ny,marceldekker,isbn0-8247-0562-9)；以及labref:ahandbookofrecipes,reagents,andotherreferencetoolsforuseatthebench，janeroskams和lindarodgers编辑，2002,coldspringharborlaboratory,isbn0-87969-630-3。这些整体文本中的每一个通过引用合并到本文中。附图说明图1是示出了外泌体对erk1/2磷酸化的诱导随amp浓度增加而增加的图。图2是示出了erk1/2磷酸化的诱导在非限制amp浓度下不受外泌体的浓度增加影响的图。图3a是示出了在盐水处理的小鼠和外泌体处理的小鼠中同种异体皮肤移植物的平均排斥分数的图。图3b是示出了在盐水处理的小鼠和外泌体处理的小鼠中的代表性皮肤移植物的图。图3c是示出了外泌体诱导的treg水平在移植物受体中增加但在未移植动物中未增加的图。图3d是示出了外泌体对未被免疫刺激的动物中的treg水平没有影响的图。图4是示出了铺在包被有6.25μg/ml、25μg/ml和200μg/ml的msc外泌体或1mg/ml明胶溶液的组织培养板上的单细胞悬液2小时和24小时后的细胞粘附的图。图5是示出了治疗组平均的握力测量结果(kg)的图。误差条表示平均值的标准误差(sem)。图6a是示出了细胞或外泌体溶解产物(裂解物，lysate)的胶原蛋白7的蛋白质印迹分析的图。从左至右的泳道为：分子量标准、过量表达胶原蛋白7的rdeb人真皮成纤维细胞、rdeb人真皮成纤维细胞、正常人真皮成纤维细胞和人间充质干细胞(msc)外泌体。通过将培养基从原代人真皮成纤维细胞汇合皿中移除并向皿中添加细胞溶解产物缓冲液来制备成纤维细胞溶解产物。根据前文所述来制备msc外泌体(参考文献：lairc、arslanf、leemm、szens、chooa、chents等人的exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellres.2010；4:214-22)。使用abeam的anti-collagenvii抗体[lh7.2](ab6312)通过标准免疫印迹测定来分析成纤维细胞和外泌体溶解产物。*表示胶原蛋白7。图6b是估计msc外泌体中胶原蛋白7的浓度相对于正常人真皮成纤维细胞中胶原蛋白的浓度的图。制备了起始具有20μg蛋白质的msc外泌体溶解产物二倍连续稀释液并平行上样200μg成纤维细胞溶解产物。还对cd81探测了印迹，作为上样对照。图7是示出了外泌体处理的滞后淋巴细胞输注(dli)小鼠(移植物抗宿主病模型)的存活曲线(生存曲线，survivalcurve)的图。图8是示出了外泌体处理的营养不良型大疱性表皮松解症的亚等位基因(hypomorphic)小鼠模型的存活曲线的图。具体实施方式本公开内容描述了使用msc外泌体在疾病过程或损伤中恢复稳态并加强组织修复和再生。外泌体可以用于在稳态不正常的疾病中恢复稳态。在患有这种疾病的患者中，稳态可能被中断、影响或存在缺陷等。表现异常稳态的疾病的实例包括移植物抗宿主病(gvhd)和大疱性表皮松解症(eb)。相应地，我们提供了外泌体诸如来自间充质干细胞的外泌体在治疗或预防移植物抗宿主病(gvhd)和大疱性表皮松解症(eb)中的用途。前文我们已经说明了msc外泌体具有多样且生化活跃的蛋白质组(参考文献1、参考文献2、参考文献3、参考文献4、参考文献5、参考文献6、国际专利公布wo2012/108842)。蛋白质中的许多都是管家酶，诸如，糖解酶、蛋白酶体等，并且具有恢复许多系统、组织等中的稳态的能力。相应地，外泌体诸如间充质干细胞外泌体可以用于促进、恢复或加强稳态。外泌体可以例如用于在需要细胞稳态、免疫稳态的生物环境中，例如，在患有移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)的患者中促进、恢复或加强细胞稳态、免疫稳态。外泌体诸如间充质干细胞外泌体还可以用于缓解、治疗或预防与稳态异常或稳态缺陷相关联的任何疾病。外泌体诸如间充质干细胞外泌体还可以用于缓解、治疗或预防杜氏肌营养不良(dmd)、移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)。恢复细胞稳态在发育、生长、损伤或疾病期间，细胞或者快速增殖或者死亡。两种过程在生成新组织、组织重建、病变或受损组织移除以及组织修复或再生方面都是重要的。必须仔细调节这两种过程的相对速率，以维持细胞稳态，从而确保每个组织和器官中有正常功能所需的足够细胞数和适当的细胞混合。在应激或创伤期间，通过特定细胞类型的增殖或细胞死亡暂时中断这种稳态，以发起适当的防御和攻击，并保护生物体免受进一步的损伤。延长的中断可能危害生物体中的正常生物活性，从而导致组织修复和恢复的不足。因此，在解决应激或创伤后快速恢复细胞稳态对于修复和恢复是重要的要件。幸运的是，细胞稳态如大多数生物系统具有正反馈和负反馈机制，以根据损伤的程度校准中断，并且在解决损伤后恢复稳态。此处我们表明间充质干细胞外泌体具有加强更加校准地中断和恢复细胞稳态的能力，尤其是在损伤的程度上校准细胞凋亡和增殖方面。我们表明间充质干细胞外泌体可以用于治疗或预防移植物抗宿主病(gvhd)。我们还表明间充质干细胞外泌体可以用于治疗或预防大疱性表皮松解症(eb)。组织在危机时发出的经典危险信号是细胞外atp(在参考文献7、参考文献8中综述)。细胞外atp刺激免疫原性细胞死亡(参考文献9、参考文献10)并且移除受损的和垂死的细胞。在组织创伤(例如，剪切应力或机械应力(参考文献11、参考文献12)、化学治疗(参考文献9)或缺氧(参考文献13))期间，受损和垂死的细胞将atp和adp释放到细胞外空间中，以移除受损和垂死的细胞。虽然细胞外atp和adp的作用非常受限于它们分别不到1秒(参考文献14)和3.2分钟(参考文献15)的半寿期，但持续性损伤可以导致细胞外atp的积聚，并造成过度atp信号诱导的细胞死亡并对健康的相邻细胞造成“旁观者效应”。细胞外atp被若干胞外酶迅速降解为amp，然后amp被降解为腺苷。将细胞外amp水解为腺苷的唯一已知的酶是cd73(bc065937.1)，一种胞外5’核苷酸酶(参考文献16)。在msc外泌体的表面上存在酶活性的cd73(参考文献16)。由于腺苷激活促存活蛋白激酶(pro_survivalproteinkinase)诸如akt和erkl/2的磷酸化，以诱导抗凋亡效应，并且腺苷已显示出具有抗心肌损伤的保护性(参考文献17、参考文献18)，因此msc外泌体具有通过amp将促死亡atp分子转化为促存活腺苷分子的潜力。细胞粘附稳态多细胞组织和生物体的结构完整性、组织和组合排列(patterning)取决于细胞之间以及细胞与细胞外基质(ecm)之间的粘附。这些粘附由细胞粘附分子(cam)介导。cam主要是位于细胞表面的糖蛋白。它们通过与其他cam或ecm组分形成复合物和结合物(junction)以将细胞与细胞结合，将细胞与ecm结合以及将ecm与细胞骨架结合，来介导细胞粘附。细胞粘附提供必要的结构支撑，以在多细胞组织、器官或生物体中定位和组织细胞。这种多细胞实体的结构组织和完整性本质上是有序的管道，通过该管道传输用于组织功能、形态发生、分化、修复和稳态的生物化学和生物物理信号(frantz、stewart等人，2010)。然而，多细胞组织、器官或生物体的结构完整性不是静态的。为了适应生物体中活动的高度动态流，必须在空间和时间两方面协同调节细胞粘附性，以实现适当的细胞迁移、细胞形状的改变和重新定位。这种调节不可避免地会中断细胞粘附稳态，并且恢复或维持细胞粘附稳态对于多细胞组织或生物体的正常功能是至关重要的。通过ecm或cam的遗传缺陷或诱导损伤的缺陷未能实现这一点会严重危害多细胞组织的结构完整性、组织和组合排列，并且因此危害其正常功能。细胞外基质(ecm)ecm本质上是细胞分泌的复杂细胞产物。其基本上由水、蛋白质和多糖组成。ecm的确切组成和拓扑结构是组织特异性的，并且对于微环境的变化是高度敏感的。ecm以两种基本结构存在：向上皮细胞和内皮细胞提供锚固支持的基底膜或者填充细胞之间的空间的填隙基质。两种结构均具有结合粘附性糖蛋白和蛋白多糖的胶原蛋白支架，其中弹性蛋白和原纤蛋白的比例不同。ecm通过与细胞上存在的cam相互作用，为细胞提供结构支持。其还用作物理缓冲，以保护细胞免受微环境变化或损害。更重要的是，ecm成分将生长因子和信号受体结合在一起，并且在信号传导中起关键作用(kim、turnbull等人，2011)。主要的ecm成分是粘多糖(gag)和糖蛋白。最常见的gag是硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸。除了透明质酸以外，大多数的gag通常附着至ecm蛋白质或细胞表面蛋白质以形成蛋白多糖。硫酸乙酰肝素是一种线性多糖，其结合蛋白质以形成蛋白多糖。在ecm中，硫酸乙酰肝素主要结合基底膜和多结构域蛋白诸如基底膜聚糖(perlecan)、集聚蛋白和胶原蛋白xviii。硫酸软骨素在具有高抗张强度的组织诸如软骨、腱、韧带和主动脉壁中是重要的，而硫酸角质素存在于角膜、软骨、骨骼中。透明质酸是自然中已知的最亲水的分子之一，并且其主要功能是调节组织水合作用和水运输。其存在于大多数组织中，并且在液态结缔组织诸如关节滑膜和眼睛玻璃体液中最多。ecm中的主要糖蛋白包括两种功能类型：结构型(胶原蛋白、弹性蛋白)和粘附型(如，纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白等)。胶原蛋白是我们身体中最多的蛋白质，并且在ecm中也最多(patino、neiders等人2002；ricard-blum2011)。胶原蛋白超家族具有由43种基因编码的28种类型的胶原蛋白(chan、poon等人，2008)。替代启动子或剪接和翻译后修饰的使用进一步扩展了该超家族的多样性。胶原蛋白类型的组织分布同样多样，其中一些胶原蛋白诸如i型是广泛分布的，而vii型则局限于皮肤的基底膜。胶原蛋白是向组织构造和形状提供机械支持的结构蛋白质。胶原蛋白还通过其与细胞受体的相互作用对细胞功能诸如细胞增殖、迁移和分化发挥生物效应。由于一些胶原蛋白具有受限的组织分布，因此这些生物效应是组织特异性的。与提供机械支持的胶原蛋白不同，弹性蛋白向组织提供弹性，以使得能够实现拉伸并返回其原始状态。弹性蛋白以高丰度在血管、肺、皮肤和韧带中发现。弹性蛋白由eln基因编码并且作为弹性蛋白原沉积在原纤蛋白纤丝上，以形成能够在没有能量输入的情况下支撑长程变形和被动弹回的弹性纤维(kielty，sherratt等人，2002)。ecm的其他非结构成分是纤连蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原、原纤蛋白、腓骨蛋白(fibulin)、腱生蛋白(tenascin)和血小板反应蛋白(halper和kjaer，2014)。这些蛋白质中的大部分不仅有助于ecm的结构完整性，而且还调节细胞活性，诸如细胞信号传导、细胞运动性、形状和极性。细胞粘附分子(cam)cam是存在于细胞膜上的糖蛋白。它们与相邻细胞上的其他cam相互作用或者与细胞外基质的蛋白质相互作用，以将细胞与细胞结合，将细胞与ecm结合，或者将ecm与细胞骨架结合：(edelnian和crossin，1991)。如此，cam帮助增强组织结构，促进细胞间的细胞传输或者促进将微环境信号传输到细胞中(cavallaro和dejana，2011)。存在5种主要的cam家族：钙粘蛋白超家族、选择蛋白、免疫球蛋白(ig)超家族、多配体聚糖和整合蛋白。cam与ecm的相互作用对于多样的包括分化、形态发生、细胞生长、增殖等的生物过程是重要的。钙粘蛋白是钙依赖跨膜糖蛋白。钙粘蛋白是通常介导细胞-细胞粘附或细胞-细胞识别的钙依赖跨膜蛋白质。它们具有两个连续的钙粘蛋白重复子，带有保守性钙结合氨基酸残基(http://www.genenames.org/genefamily/cdhsf.php)。钙粘蛋白超家族在系统发生学上可以划分为三个主要的家族：主钙粘蛋白家族、原钙粘附蛋白家族和钙粘蛋白相关家族。(http://www.genenames.org/genefamily/cdhsf.php)。该家族的成员为n-钙粘蛋白、p-钙粘蛋白、e钙粘蛋白和l-cam。整合蛋白也是跨膜糖蛋白，与免疫球蛋白和钙粘蛋白超家族不同，整合蛋白结合ecm分子和其他细胞表面蛋白质。整合蛋白还将细胞骨架与ecm蛋白质链接在一起。多配体聚糖是跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)，其也可以结合至多种细胞内和细胞外蛋白质和生长因子(tkachenko，rhodes等人，2005)。然而整合蛋白主要与ecm分子相互作用，而选择蛋白和其他cam参与细胞-细胞相互作用，多配体聚糖可以与ecm、细胞表面分子和可溶性配体相互作用。选择蛋白是ca2+依赖的糖结合跨膜蛋白质的家族。存在三种选择蛋白，即，内皮细胞中的e-选择蛋白、白细胞中的l-选择蛋白以及血小板和内皮细胞中的p-选择蛋白。选择蛋白介导组织炎症分布，并且在许多病理生理过程中起重要作用。与其他cam不同，cam的ig超家族是不依赖钙的。它们通常结合整合蛋白或其他ig超家族cam。cams的一些实例为细胞间粘附分子(icam)、血管-细胞粘附分子(vcam-l)、血小板-内皮细胞粘附分子(pecam-1)和神经细胞粘附分子(ncam)。cam的ig超家族的主要作用通常被报告为介导免疫和炎症反应。细胞粘附稳态的重要性细胞粘附在多细胞生物体中是基础的生理功能，并且为活生物体中活动的动态流提供基础结构支持。为了有效地支持这些活动，细胞粘附的状态在ecm与cam相互作用的空间和时间构型方面必须是同等动态的，以实现细胞迁移、细胞形状改变以及细胞重新定位所需的不同粘附程度。然而，这种ecm与cam的动态而生理的相互作用必须伴随及时地回复至细胞粘附的稳态状态，以恢复组织稳态和正常的组织功能。未做到这一点会导致细胞粘附稳态的损失，这会损害组织功能。与ecm相关联的疾病由看似微小的ecm或cam变化引起的各种严重疾病最好地证明了ecm和cam在多细胞组织和生物体中的至关重要性(sainio等人，2009)。ecm相关疾病不仅包括遗传性疾病而且还包括后天性疾病。疾病的清单包括：阿尔兹茨海默氏病、心血管疾病(例如，腹主动脉瘤、动脉瘤、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化和再狭窄、遗传性血管病、高血压、高血压心脏病、主动脉瓣上狭窄)、眼病(例如，常染色体隐性遗传玻璃体视网膜营养不良、扁平角膜、角膜内皮营养不良、先天性角膜营养不良、福克斯内皮营养不良症近视、甲状腺相关性眼病、侵蚀性玻璃体视网膜病变和瓦格纳病、先天性静止性夜盲症、角膜综合征、knobloch综合征、黄斑变性疾病、i型和ii型stickler综合征、魏尔-马切桑尼(weill-marchesani)综合征)，骨骼、软骨和关节疾病(例如，软骨成长不全、骨性关节炎、骨生成不完善、耳脊椎骨骺发育不良、脊柱骨骺发育不良、椎间盘退变、特发性骨质疏松症、非节段性无汗发育不良、kniest发育不良、马凡氏综合征、马歇尔综合征、多发性骨骺发育不良、先天性挛缩细长指、休门病、shprintzen-goldberg综合征、i型、ii型和iii型斯蒂克勒综合征、并指(趾)、肌腱病、假性软骨发育不全、多骨骺发育不良、魏尔-马切桑尼综合征)，癌症和癌症演进(例如，肝细胞癌、结肠肿瘤发生、胃癌、肿瘤发生和转移、乳腺癌、t细胞白血病、前列腺癌)、皮肤松弛症、糖尿病并发症(例如，肾病、视网膜病)、埃勒斯-当洛(ehlers-danlos)综合征(典型的和血管的)，大疱性表皮松解症(例如，获得性大疱性表皮松解症、营养不良型大疱表皮松解症、非herlitz型交界型大疱性表皮松解症)，纤维化疾病(慢性肾脏疾病、肝纤维化、特发性肺纤维化、肝硬化)，肝炎、炎症性肠病、肌肉失调(例如，肌硬化、肌病、先天性肌营养不良症横纹肌肉瘤、schwartz-jampel综合征)，肺病(例如，肺气肿、闭塞性细支气管炎综合征)，肾病(例如，肾小球肾炎、肾小球硬化、alport综合征、胶原纤维化肾小球病)，威廉姆斯博伊伦(williams-beuren)综合征。cam相关疾病包括许多ecm相关疾病，诸如，阿尔茨海默病，多发性硬化和精神分裂症(gnanapavan和giovannoni，2013)，动脉粥样硬化冠状动脉，动脉血栓形成，病毒性心肌炎，心肌病，再灌注损伤，心肌梗死，同种异体移植血管病变，炎症性心脏病(jang，lincoff等人，1994；hillis和flapan，1998；golias，tsoutsi等人，2007)，炎症疾病，例如，ibd、克罗恩病、乳糜泻(mishra，mishra等人，1993；nakamura，ohtani等人，1993；schuermann，aber-bishop等人，1993；villanacci，facchetti等人，1993；schiller和elinder，1999)，纤维化皮肤病，诸如，瘢痕疙瘩和硬皮病(halper和kjaer，2014)，癌症和转移(johnson1991；johnson1992)，神经内分泌癌(deichmann，kurzen等人，2003)，牛皮癣(cagnoni、ghersetich等人，1994)，炎症性肌病和杜兴氏营养不良(debleecker和engel，1994)，多发性硬化(vora，kidd等人，1997；ukkonen，wu等人，2007)，肺部炎症(wegner，gundel等人1992；hellewell1993)。恢复细胞粘附稳态的治疗策略细胞粘附稳态由酶和酶抑制剂的复杂网络维持，该酶和酶抑制剂的活性取决于底物和产物的相对浓度(lu，takai等人，2011)。在可逆酶反应中，底物和产物的相对浓度的不平衡会朝有助于该微环境平衡的方向提高酶活性。一旦达到平衡，则酶活性停止。因此，在存在充足的底物的情况时，酶可以通过其恢复底物和产物的相对浓度平衡的固有能力来介导稳态。在因损伤或遗传缺陷而无法达到稳态或失去稳态的情况下，瞬间补充关键底物或酶可潜在地恢复稳态，尽管短暂但长度足以中断长期的不平衡状态，并为稳态的内源性恢复提供机会之窗。具有恢复细胞粘附稳态的潜力的候选治疗剂是间充质干细胞(msc)。已知msc产生或调节干细胞巢(干细胞壁龛，stemcellniches)，该干细胞巢促进干细胞诸如造血干细胞、神经前体细胞、心脏干细胞(心肌干细胞，cardiacstemcells)的移植(gotts和matthay2012综述)。干细胞巢本质上是物理和生物上描述的支撑干细胞的微环境(schofield1978)。巢的主要作用是将干细胞锚固在经调节的局部微环境中，在所述局部微环境中，将变量校准为达到稳定常数，即，稳态状态。随着msc被越来越多地报道为经由分泌旁分泌因子来发挥其生物效应，逻辑线性外插将是，msc还通过旁分泌因子调节干细胞巢的微环境。然而，没有已知的由msc分泌的候选分子可以囊括msc的巢调节效应。我的小组之前已经提出了msc旁分泌中的活性剂是外泌体，并且还提出了msc外泌体可以恢复细胞和免疫稳态。我们提供了msc外泌体还可以恢复细胞粘附稳态的证据。我们之前使用质谱分析法已经表明，msc外泌体的蛋白质组具有mmp家族的4个成员，mmp1、2、3和10，并且存在mmp的3个组织抑制因子，timp1、2和3。已经报道了msc外泌体的蛋白质组(国际专利公开号wo2012/108842并且存放在www.exocarta.com)。mmp1和2是明胶酶，而mmp3和10是胶原酶(胶原蛋白酶，collagenases)(clark，swingler等人，2008；bellayr，mu等人，2009)。通过酶测定和免疫印迹法已经证实了它们在msc外泌体中的存在和酶活性(如在国际专利公开号wo2012/108842中所描述的)。通过免疫印迹法也已经证实了timp1、2和3的存在。除此以外，msc外泌体还携带许多ecm蛋白质和cam、ecm修饰酶(表d1)。这些蛋白质共同表明，通过提供主要底物和酶来补充剩余稳态机构，msc外泌体具有恢复细胞粘附稳态的潜力。当巢内的酶过程达到平衡时实现了稳态。表d1.在msc外泌体的蛋白质组中检测到的ecm蛋白质、cam和ecm修饰酶的列表(国际专利公开号wo2012/108842)。移植物抗宿主病(gvhd)外泌体诸如间充质干细胞外泌体可以用于治疗或预防移植物抗宿主病(gvhd)，包括下述任何类型的移植物抗宿主病。[下文改编自2015年3月10日07:46分检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝graft-versus-host_disease&oldid＝649503786的维基百科，自由的百科全书(wikipedia，freeencyclopedia)中的graft-versus-hostdisease(2015年3月2日)]移植物抗宿主病(gvhd)，也称为移植物抗宿主疾病，是一种常见的同种异体组织移植后并发症。其通常与干细胞移植或骨髓移植相关联，但该术语也适用于其他形式的组织移植。组织(移植物)中的免疫细胞(白细胞)将受体(宿主)识别为“外来物”。然后，移植的免疫细胞攻击宿主的体细胞。如果所用的血液制品未进行辐射或用经批准的病原体灭活系统进行处理，则输血后也可能出现gvhd。移植物抗宿主病的起因根据billingham标准，为了出现gvhd必须符合3条标准(spiryda,l；laufer,mr；soiffer,rj；antin,ja(2003).“graft-versus-hostdiseaseofthevulvaand/orvagina:diagnosisandtreatment”.biologyofbloodandmarrowtransplantation9(12):760-5)。·施用具有活的且有功能的免疫细胞的免疫活性移植物。·受体对相异组织是免疫不相容的。·受体是免疫受损的，并且因此无法破坏移植细胞或使其失去活性。在骨髓移植后，移植物中存在的t细胞(或者作为污染物或者被有意引入到宿主中)在将宿主组织视为抗原性外来物后会攻击移植受体的组织。t细胞产生过量的细胞因子，包括tnf-α和干扰素γ(ifnγ)。许多宿主抗原都可以引发移植物抗宿主病，尤其是人类白细胞抗原(hla)。然而，即使hla相合同胞(hla-identicalsibling)是供体，仍然可能出现移植物抗宿主病。hla相合同胞或hla相合无关供体通常具有基因不同的蛋白质(称为次要组织相容性抗原)，其可被主要组织相容性复合物(mhc)分子呈现给供体的t细胞，t细胞将这些抗原视为外来物，因此建立免疫应答。尽管供体t细胞作为移植物抗宿主病的效应细胞是不期望的，但是通过防止受体的残留免疫系统排斥骨髓移植物(宿主抗移植物)，它们对于移植是重要的。另外，随着骨髓移植被频繁用于治疗癌症，主要是白血病，已经证明供体t细胞具有重要的移植物抗肿瘤效应。目前大量关于同种异体骨髓移植的研究都涉及尝试将t细胞生理的不期望的移植物抗宿主病方面与期望的移植物抗肿瘤效应分开。移植物抗宿主病的类型在临床环境中，移植物抗宿主病被分为急性和慢性形式。急性或爆发性形式的疾病(agvhd)通常在移植后前100天内观察到，并且由于相关联的发病率和死亡率，对于移植物是重大的挑战。(goker,h；haznedaroglu,ic；chao,nj(2001).“acutegraft-vs-hostdiseasepathobiologyandmanagement”.experimentalhematology29(3):259-77)。慢性形式的移植物抗宿主病(cgvhd)通常在100天后出现。出现中度至重度cgvhd情况会对长期存活造成不利影响(lee,stephaniej.；vogelsang,georgia；flowers,marye.d.(2003).“chronicgraft-versus-hostdisease”.biologyofbloodandmarrowtransplantation9(4):215-33)。移植物抗宿主病的临床表现在典型意义上，急性移植物抗宿主病的特征在于对肝脏、皮肤(皮疹)、粘膜以及胃肠道的选择性伤害。较新的研究表明，其他移植物抗宿主病靶器官包括免疫系统(造血系统，例如，骨髓和胸腺)本身以及处于免疫介导性肺炎形式的肺。可以使用生物标志物来确定gvhd的具体起因，诸如，皮肤中的弹性蛋白酶抑制剂(elafin)(paczesny,s.；levine,j.e.；hogan,j.；crawford,j.；braun,t.m.；wang,h.；faca,y.；zhang,q.etal.(2009).“elafinisabiomarkerofgraftversushostdiseaseoftheskin”.biologyofbloodandmarrowtransplantation15(2):13-4)。慢性移植物抗宿主病也攻击上述器官，但经长期过程，其还可以造成对结缔组织和外分泌腺的损伤。胃肠道的急性gvhd可以造成严重肠炎、粘膜脱落、严重腹泻、腹痛、恶心和呕吐。这通常通过肠道组织切片检查进行诊断。肝脏gvhd通过急性患者的胆红素水平来测量。皮肤gvhd造成弥散性斑状丘疹，有时以带状形式。阴道的粘膜损伤可以造成剧痛并留下疤痕，并且在急性和慢性gvhd中均会出现。这可以造成无法进行性交。[1]急性gvhd分期如下：整体分级(皮肤-肝脏-肠)，其中每个器官从低到高分别被分期为1期至4期。患有iv级gvhd的患者通常具有不良的预后。如果gvhd严重并且需要涉及类固醇和额外药剂的强免疫抑制才能控制住，则患者可能会由于免疫抑制而发展严重感染，并且可能死于感染。在口腔中，慢性移植物抗宿主病表现为具有比典型的口腔扁平苔癣更高的恶变为口腔鳞状细胞癌的风险的扁平苔癣。相比于非造血干细胞移植患者的口腔癌，移植物抗宿主病相关的口腔癌可能具有更具攻击性的行为，同时具有更差的预后(elad,sharon；zadik,yehuda；zeevi,itai；miyazaki,akihiro；defigueiredo,mariaa.z.；or,reuven(2010)."oralcancerinpatientsafterhematopoieticstem-celltransplantation:long-termfollow-upsuggestsanincreasedriskforrecurrence”.transplantation90(11):1243-4)。输血相关的移植物抗宿主病这种类型的gvhd与向免疫力低下的受体输注未辐射消毒的血液相关。还可以在下述情况中出现，其中，对于hla单倍型，供血者是纯合的，而受体是杂合的。由于涉及骨髓淋巴组织，其与较高的死亡率相关联(80-90％)，然而，临床表现与骨髓移植造成的gvhd类似。输血相关的gvhd在现代医学中是罕见的。通过对血液制品进行受控辐射消毒以使其中的白细胞(包括淋巴细胞)失活几乎就能完全防止输血相关的gvhd(moroff,g；leitman,sf；luban,nl(1997).“principlesofbloodirradiation,dosevalidation,andqualitycontrol”.transfusion37(10):1084-92)。胸腺移植中的移植物抗宿主病可以说胸腺移植能够引发特定类型的gvhd，这是因为当进行阴性选择以识别自体抗原时，受体胸腺细胞会使用供体胸腺细胞作为模型，并且因此仍然可能将身体其余部分中的自体结构误认为是非自体的。这是一种相当间接的gvhd，因为其不是移植物自身中的细胞直接引起的，而是移植物中使受体的t细胞像供体t细胞一样起作用的细胞引起的。可以将其视为不同物种之间胸腺的异种器官移植实验中的多器官自身免疫(xia,g；goebels，j；rutgeerts,o；vandeputte,m；waer,m(2001).“transplantationtoleranceandautoimmunityafterxenogeneicthymustransplantation”.journalofimmunology166(3):1843-54)。自身免疫疾病是人类同种异体胸腺移植后频发的并发症，见于移植后1年的42％的受试者中(markert,m.louise；devlin,blytheh.；mccarthy,elizabetha.；chinn,ivank.；hale,laurap.(2008).“thymustmnsplantation”.inlavini,corrado；moran,cesara.；morandi,ulianoetal.thymusglandpathology:clinical,diagnostic,andtherapeuticfeatures,pp.255-67)。然而，这部分由下述事实解释：适应症本身，即，完全迪格奥尔格(digeorge)综合征，增加了自身免疫疾病的风险(markert,m.l.；devlin,b.h.；alexieff,m.j.；li,j.；mccarthy,e.a.；gupton,s.e.；chinn,i.k.；hale,l.p.etal.(2007).“reviewof54patientswithcompletedigeorgeanomalyenrolledinprotocolsforthymustransplantation:outcomeof44consecutivetransplants”.blood109(10):4539-47)。移植物抗宿主病的预防基于dna的组织分型允许在供体和移植患者之间更精确的hla匹配，其已证明降低了gvhd的发病率和严重程度，并且提高了长期存活(morishima,y.；sasazuki,t；inoko,h；juji,t；akaza,t；yamamoto,k；ishikawa,y；kato,setal.(2002).“theclinicalsignificanceofhumanleukocyteantigen(hla)allelecompatibilityinpatientsreceivingamarrowtransplantfromserologicallyhla-a,hla-b,andhla-drmatchedunrelateddonors”.blood99(11):4200-6)。脐带血(ucb)的t细胞具有固有的免疫不成熟性(grewal,s.s.；barker,jn；davies,sm；wagner,je(2003).“unrelateddonorhematopoieticcelltransplantation:marroworumbilicalcordblood？”.blood101(11):4233-44)，并且使用无关供体移植物中的ucb干细胞会降低gvhd的发病率和严重程度(laughlin,maryj.；barker,juliet；bambach，barbara；koc,omern.；rizzieri,davida.；wagner,johne.；gerson,stantonl.；lazarus,hillardm.etal.(2001).“hematopoieticengraftmentandsurvivalinadultrecipientsofumbilical-cordbloodfromunrelateddonors”.newenglandjournalofmedicine344(24):1815-22)。根据最新研究，使用肝源性造血干细胞来重建骨髓具有最高的成功率。甲氨蝶呤、环孢素和他克莫司是用于gvhd预防的常用药物。通过进行体外t细胞去除的骨髓移植，可以在很大程度上避免移植物抗宿主病。然而，这些类型的移植物的代价是削弱的移植物抗肿瘤效果、移植失败的风险较大或者癌症复发(hale,g；waldmann,h(1994).“controlofgraft-versus-hostdiseaseandgraftrejectionbytcelldepletionofdonorandrecipientwithcampath-1antibodies.resultsofmatchedsiblingtransplantsformalignantdiseases”.bonemarrowtransplantation13(5):597-611)以及一般免疫缺陷，从而造成患者对病毒、细菌和真菌感染更易感。在多中心研究中，3年无病生存率对于t细胞体外去除和t细胞非体外去除的移植物没有区别(wagner,johne；thompson,johns；carter,shellyl；kernan,nancya；unrelateddonormarrowtransplantationtrial(2005).“effectofgraft-versus-hostdiseaseprophylaxison3-yeardisease-freesurvivalinrecipientsofunrelateddonorbonemarrow(t-celldepletiontrial):amulti-centre,randomisedphaseii-iiitrial”.thelancet366(9487):73341)。移植物抗宿主病的治疗静脉施用的糖皮质激素诸如强的松是急性gvhd和慢性gvhd的护理标准(menillo,sa；goldberg,sl；mckieman,p；pecora,al(2001).“intraoralpsoralenultravioletairmdiation(puva)treatmentofrefractoryoralchronicgraft-versus-hostdiseasefollowingallogeneicstemcelltransplantation”.bonemarrowtransplantation28(8):807-8)。这些糖皮质激素的使用被设计成抑制t细胞介导的对宿主组织的免疫攻击；然而，在高剂量下，这种免疫抑制会增加感染和癌症复发的风险。因此，期望的是将移植后高水平的类固醇剂量逐渐减少至较低的水平，此时可能欢迎轻微的gvhd出现，尤其是在hla错配的患者中，这是因为其通常与移植物抗肿瘤效果相关。患有gvhd引起的眼表疾病的个体通常可以接受prose(眼表生态系统的假体置换)治疗，以减少症状并改善视觉功能。(takahidek,parkerpm,wum,etal.(2007年9月).“useoffluid-ventilated,gas-permeablesclerallensformanagementofseverekeratoconjunctivitissiccasecondarytochronicgraft-versus-hostdisease”.biologyofbloodandmarrowtransplantation13(9):1016-21.doi；10.1016/j.bbmt.2007.05.006.pmc2168033.pmid17697963；jacobsds,rosenthalp(2007年12月).“bostonsclerallensprostheticdevicefortreatmentofseveredryeyeinchronicgraft-versus-hostdisease”.cornea26(10):1195-9)(prostheticdevicesusedinprosetreatmentwereformerlyknownasthebostonsclerallensandbostonocularsurfaceprosthesis)。用于移植物抗宿主病的试验疗法在移植物抗宿主病治疗和预防的调查研究方面存在大量正在进行或近期完成的临床试验。2012年5月17日，osiristherapeutics宣布加拿大卫生监管机构批准的prochymal，是用于对类固醇治疗无反应的儿童的急性移植物抗宿主病的药物。prochymal是批准用于治疗全身性疾病的第一种干细胞药物(world’sfirststem-celldrugapprovalachievedincanada,thenationallawreview.drinkerbiddle&reathllp.2012-06-12)。输血相关的移植物抗宿主病[下文改编自从2015年3月10日08:04分检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝transiusion-associated_graft_versus_host_disease&oldid＝599310890的维基百科，自由的百科全书中的transfusion-associatedgraftversushostdisease(输血相关的移植物抗宿主病)(2014年3月12日)]输血相关的移植物抗宿主病(ta-gvhd)是一种罕见的输血并发症，其中，供体t淋巴细胞对受体的淋巴组织建立免疫应答(“complicationsoftransfusion:transfusionmedicine:merckmanualprofessional”，在http://www.merckmanuals.com/professional/hematology_and_oncology/transfusion_medicine/complications_of_transfusion.html)。受体的免疫系统通常将供体淋巴细胞识别为外来物并将其杀死。然而，在受体免疫力受损(天生性免疫缺陷、获得性免疫缺陷、恶性肿瘤)的情况下，或者当供体的hla单倍型是纯合的，而受体的hla单倍型是杂合的(可以在一级亲属定向捐献时出现)时，受体的免疫系统不能杀死供体淋巴细胞。这可以导致移植物抗宿主病。输血相关的移植物抗宿主病的流行病学和发病机理接受输血的免疫力受损的患者的ta-gvhd的发病率估计为0.1-1.0％，以及死亡率为约80-90％。涉及到骨髓移植时，ta-gvhd的死亡率比gvhd高，在骨髓移植中，骨髓中的移植淋巴细胞来自供体，因此免疫反应不针对它们。ta-gvhd致死的最常见原因是感染和出血，仅次于全血细胞减少和肝功能异常。输血相关的移植物抗宿主病的表现和诊断输血相关的移植物抗宿主病的临床表现临床表现与在其他环境诸如骨髓移植中出现的gvhd相同。ta-gvhd可以在输血四天至三十天后显现。典型的症状包括：·发烧·红斑状斑丘疹，其可以发展为全身性红皮病·极端情况下的中毒性表皮坏死松解症其他症状可以包括咳嗽、腹痛、呕吐和严重腹泻(profusediarrhea)(最高达8升/天)。输血相关的移植物抗宿主病的实验室表现实验室发现包括全血细胞减少、肝酶异常和电解质紊乱(当存在腹泻时)。输血相关的移植物抗宿主病的诊断ta-gvhd可以通过病变皮肤的活组织检查来推测并通过循环淋巴细胞的hla分析来确定。这种测试可以识别具有与宿主的组织细胞不同的hla类型的循环淋巴细胞。输血相关的移植物抗宿主病的治疗和预防治疗仅是支持性的，这是因为尚无可用形式的治疗被证明在治疗ta-gvhd方面是有效的。预防包括对含淋巴细胞的血液制品进行伽马辐射。该程序应在以下情况下在输血时进行：·受体是免疫力受损的。·血液成分来自家属供体。·hla匹配的血小板转移。预防的另一种方式是使用第三代或第四代去白细胞过滤器(leukoreductionfilter)，虽然尚无这种程序的功效的记录。大疱性表皮松解症(eb)外泌体诸如间充质干细胞外泌体可以被用于治疗或预防大疱性表皮松解症(eb)，包括下述任何类型的大疱性表皮松解症。大疱性表皮松解症(eb)是指一组罕见的遗传性皮肤病，其特征在于皮肤不粘附以及不良的伤口上皮形成(kopecki等人，2009年)。其具有与潜在的遗传病相关的广泛的临床严重度范围。eb中的主要遗传病主要涉及在真皮-表皮界(dej)处将皮肤层结合在一起的结构蛋白质。eb最严重的形式是交界型eb(jeb)或营养不良型eb(deb)。在这些eb中突变的基因已被识别并且包括层粘连蛋白-5、xvii型胶原蛋白、整合蛋白α6β4、vii型胶原蛋白(下文表d2)。表d2.主要eb类型中涉及的基因列表以及受影响的基因和蛋白(转载自kopecki等人，2009年)。下文以及本文件中列出的大疱性表皮松解症的各种类型中的任何一种均可以用根据本文所述的方法和组合物的外泌体治疗。大疱性表皮松解症(eb)[下文改编自从2014年9月11日11:50分检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝epidermolysis_bullosa&oldid＝615914312的维基百科，自由的百科全书中的epidermolysisbullosa(2014年7月7日)]大疱性表皮松解症(eb)是一种使皮肤和黏膜起水疱的遗传性结缔组织疾病，其中发病率为1/50,000。这是表皮和真皮之间的锚固缺陷的结果，从而造成摩擦和皮肤脆弱。其严重程度从轻微到致死。大疱性表皮松解症的分类大疱性表皮松解症是指涉及在轻微创伤后形成水疱的一组遗传病。在该病症中已识别出超过300种突变。将它们分为以下类型：·单纯型大疱性表皮松解症·交界型大疱性表皮松解症·营养不良型大疱性表皮松解症·致死性棘层松懈型大庖性表皮松解症·获得性大疱性表皮松解症大疱性表皮松解症的病理生理学人体皮肤包括两层：称为表皮的最外层和称为真皮的下面的一层。在具有健康皮肤的个体中，在这两层之间存在防止它们独立于彼此移动(切变)的蛋白锚定。在出生患有eb的人中，这两层皮肤层缺少将它们结合在一起的蛋白锚定，从而造成皮肤极度脆弱—甚至仅轻微的机械摩擦(如揉搓或按压)或创伤都会使这些皮肤层分离，并形成水疱和疼痛。eb患者将这种疼痛比作具有三级烧伤的得分。此外，作为慢性皮肤损伤的并发症，患有eb的人具有增加的皮肤恶性肿瘤(癌症)的风险。大疱性表皮松解症的治疗最近的研究集中于改变在皮肤中产生的角蛋白的混合物。存在54种已知的角蛋白基因，其中28种属于i型中间丝状体基因，以及26种属于ii型—其用作异二聚体。这些基因中的许多都具有大量的结构和功能相似性，但它们对细胞类型和/或正常产生它们的条件专一。如果产生的平衡可以从突变的、功能失调的角蛋白基因转变为完整角蛋白基因，则可以减轻症状。例如，莱菔硫烷(sulforaphane)—一种西兰花中发现的化合物当注入到孕小鼠(5μmol/天＝0.9mg)并向初生幼崽局部应用(1μmol/天＝0.2mg于荷荷巴油中)时，发现其将小鼠模型中的发疱减轻至无法肉眼识别病变幼崽的程度。明尼苏达大学的最新临床研究包括对患有eb的2名兄弟中的一名2岁儿童进行了骨髓移植。手术是成功的，这强烈表明可能已找到了疗法。随后，对上述儿童中的哥哥也进行了另一移植，并且接下来计划对加利福尼亚的婴儿进行第三移植。临床试验最终将包括对30名受试者的移植。然而，骨髓移植要求的极度免疫抑制会造成患有大规模水疱和皮肤糜烂的患者被严重感染的重大风险。实际上，在目前接受治疗的仅一小组患者中，至少四名患者已在用于大疱性表皮松解症的骨髓移植的准备或实行过程中死亡。大疱性表皮松解症的流行病学估计1百万初生婴儿中就有50名被诊断患有eb，并且1百万患者中有9名是普通群体。在这些病例中，大约92％是单纯型大疱性表皮松解症(ebs)，5％是营养不良型大疱性表皮松解症(deb)、1％是交界型大疱性表皮松解症(jeb)，以及2％未分类。携带者频率从jeb的1/333到deb的1/450；推测ebs的携带者频率远高于jeb或deb。全世界每个种族和民族都会出现这种病症，并且对两种性别都有影响。大疱性表皮松解症的监测大疱性表皮松解症活性和疤痕指数(ebdasi)是一种对大疱性表皮松解症(eb)的严重程度进行客观量化的评分系统。ebdasi是临床医生和患者监测疾病的严重程度的工具。其也已经被设计成用于评价对治疗eb的新疗法的响应。ebdasi由澳大利亚悉尼新南威尔士大学圣乔治医院的dedeemurrell教授及其团队的学生和同事开发和验证。其在2013年在爱丁堡国际研究性皮肤病学会议上提出，并且在美国皮肤病学会杂志(journalofamericanacademyofdermatology)出版了纸质版本。单纯型大疱性表皮松解症[下文改编自从2014年9月11日11:54分检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝epidermolysis_bullosa_simplex&oldid＝600649962的维基百科，自由的百科全书中的epidermolysisbullosasimplex(2014年3月21日)]单纯型大疱性表皮松解症是大疱性表皮松解症的一种形式，其在揉搓部位造成水疱。其通常影响手部和脚部，并且通常以常染色体显性方式遗传，从而影响角蛋白基因krt5和krt14。单纯型大疱性表皮松解症的分类单纯型大疱性表皮松解症可以分为多种类型：在omim检录号609352(基因座和基因12q13(krt5))中描述了具有游走环形红斑的单纯型大疱性表皮松解症。在omim检录号131960(基因座和基因12q13(krt5))中描述了具有斑状色素沉着的单纯型大疱性表皮松解症。其与krt14中的频发突变相关。在omim检录号601001(基因座和基因17q12-q21(krt14))中描述了常染色体隐性的单纯型大疱性表皮松解症。在omim检录号131900(基因座和基因17q12-q21(krt5)、12q13(krt14))中描述了全身性单纯型大疱性表皮松解症。全身性单纯型大疱性表皮松解症也称为“koebner变体型全身性单纯型大疱性表皮松解症(koebnervariantofgeneralizedepidermolysisbullosasimplex)”。其在出生至幼儿早期出现，好发于手部、脚部和四肢，并且可能出现手足角化过度和糜烂。在omim检录号131800(基因座和基因17q12-q21(krt5)、17q11-qter、12q13(krt14))中描述了局限性单纯型大疱性表皮松解症。局限性单纯型大疱性表皮松解症也称为“weber-cockaynez综合征”和“weber-cockayne变体型全身性单纯型大疱性表皮松解症”。其特征在于开始于童年或一生中的以后，并且是单纯型大疱性表皮松解症的最常见变体。在omim检录号131760(基因座和基因17q12-q21(krt5)、12q13(krt14))中描述了疱疹样大疱性表皮松解症。疱疹样大疱性表皮松解症也称为“dowling-meara型单纯型大疱性表皮松解症”。其在出生时出现，遍布全身，通常在婴儿期累及到口腔黏膜，并造成各种损伤。在omim检录号226670(基因座和基因8q24(plec1))中描述了具有肌肉萎缩的单纯型大疱性表皮松解症。作为一种罕见的临床实体，单纯型大疱性表皮松解症是不由角蛋白突变引起、表现为与koebner变体型全身性单纯型大疱性表皮松解症类似的全身表皮内发疱、但还伴随成年开始肌肉萎缩的描述的唯一一种大疱性表皮松解症。在omim检录号612138(基因座和基因8q24(plec1))中描述了单纯型大疱性表皮松解症伴幽门闭锁。在omim检录号131950(基因座和基因8q24(plec1))中描述了ogna氏单纯型大疱性表皮松解症。开始于婴儿期，表现为在夏季肢端区域季节性发疱。交界型大疱性表皮松解症[下文改编自从2014年9月11日11:50分检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝junctional_epidermolysis_bullosa_(medicine)&oldid＝591972576]的维基百科，自由的百科全书中的junctionalepidermolysisbullosa(medicine)(2014年1月23日)]交界型大疱性表皮松解症是一种影响层粘连蛋白和胶原蛋白的遗传病。这种疾病的特征在于在基底膜带的透明板内形成水疱，并且是以常染色体隐性方式遗传。其还在摩擦部位呈现水疱，尤其是在手部和脚部呈现水疱，并且具有可能发生于儿童和成人的多种变体。估计少于百万分之一的人患有这种形式的大疱性表皮松解症。交界型大疱性表皮松解症的分类交界型大疱性表皮松解症可以分为多种类型：在omim检录号226730(基因座和基因17q11-qter、2q31.1itgb4、itga6)中描述了交界型大疱性表皮松解症伴幽门闭锁。在omim检录号226700(基因座和基因18q11.2、1q32、1q25-q31lama3、lamb3、lamc2)中描述了herlitz型交界型大疱性表皮松解症。在omim检录号226650(基因座和基因18q11.2、1q32、17q11-qter、1q25-q31、10q24.3lama3、lamb3、lamc2、col17a1、itgb4)中描述了非herlitz型交界型大疱性表皮松解症(全身性萎缩性良性大疱性表皮松解症、轻型交界型大疱性表皮松解症)。具有幽门闭锁的交界型大疱性表皮松解症具有幽门闭锁的交界型大疱性表皮松解症是交界型大疱性表皮松解症的一种罕见常染色体隐性形式，在出生时出现，伴有极其脆弱的皮肤黏膜和胃出口梗阻。其可以与itgb4或itga6相关。重型交界型大疱性表皮松解症(herlitz型)重型交界型大疱性表皮松解症(也称为“herlitz病”、“herlitz综合征”和“致死性交界型大疱性表皮松解症”)是大疱性表皮松解症最致命的类型，一种其中大多数患者都无法活过婴儿期的皮肤病，其特征在于在出生时发疱，同时伴有严重的且临床显著的口周肉芽组织。非herlitz型这些包括：全身性萎缩性良性大疱性表皮松解症是一种特征在于在出生时开始、全身发疱并萎缩、累及黏膜、以及指甲增厚、营养不良或缺少的皮肤病。轻型交界型大疱性表皮松解症(也称为“非致死性交界型大疱性表皮松解症”)是一种特征在于头皮和指甲损伤、还伴有口周难愈性糜烂的皮肤病。轻型交界型大疱性表皮松解症最常见于4岁至10岁年龄的儿童。瘢痕性交界型大疱性表皮松解症是一种特征在于愈合后留下疤痕的水疱的皮肤病。其于1985年被鉴定。交界型大疱性表皮松解症的病理生理学α6β4整合蛋白是存在于半桥粒中的一种跨膜蛋白。作为包含两条多肽链的异二聚体分子，其胞外域进入基底板层并且与包含层粘连蛋白(层粘连蛋白-5)、巢蛋白(entactin)/巢蛋白(nidongen)或者半桥粒的胞外表面上的基底膜聚糖的iv型胶原蛋白超结构相互作用，层粘连蛋白-5分子形成丝状锚定细丝，所述丝状锚定细丝从整合蛋白分子延伸至上皮粘附的基底膜的结构。编码层粘连蛋白-5链的基因的突变造成交界型大疱性表皮松解症。营养不良型大疱性表皮松解症[下文改编自从2014年9月11日11:50分检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝epidermolysis_bullosa_dystrophica&oldid＝591217345的维基百科，自由的百科全书中的epidermolysisbullosadystrophica(2014年1月18日)]营养不良型大疱性表皮松解症是一种影响皮肤和其他器官的遗传性变体。“蝴蝶孩子”是为出生即患有这种疾病的人取的术语，因为他们的皮肤看上去像蝴蝶的翅膀一样纤弱和脆弱。营养不良型大疱性表皮松解症由编码蛋白vii型胶原蛋白(胶原蛋白vii)的人col7a1基因内的基因缺陷(或突变)引起。引起deb的突变可以是常染色体显性的或常染色体隐性的。营养不良型大疱性表皮松解症的分类营养不良型大疱性表皮松解症可以分为多种类型：在ohim检录号131750(基因座和基因3p21.3(col7a1))中描述了显性营养不良型大疱性表皮松解症(ddeb)。这种变体也被称为“cockayne-tonraine病”，其特征在于四肢的伸面上的水疱和大疱，在ohim检录号中描述。在ohim检录号226600(基因座和基因11q22-q23(col7a1)、3p21.3(mmp1))中描述了隐性营养不良型大疱性表皮松解症(rdeb)。这种变体也称为“hallopeau-siemens变体型大疱性表皮松解症”和“hallopeau-siemens病”，其由编码vii型胶原蛋白的基因col7a1的突变造成，特征在于产生疼痛、疤痕和小口的使人衰弱的口腔损伤。其以franfoishenrihallopeau和hermannwernersiemens命名，在ohim检录号中描述。在ohim检录号131850((基因座和基因3p21.3(col7a1))中描述了胫骨前营养不良型大疱性表皮松解症。在ohim检录号604129((基因座和基因3p21.3(col7a1))中描述了痒疹样大疱性表皮松解症。在ohim检录号132000(基因座和基因3p21.3(col7a1))中描述了大疱性表皮松解症伴先天性局部皮肤缺损和指甲变形。在ohim检录号131705(基因座和基因3p21.3(col7a1))中描述了新生儿暂时性大疱性皮肤松解症(tbdn)。营养不良型大疱性表皮松解症的原因deb由编码蛋白vii型胶原蛋白(胶原蛋白vii)的人col7a1基因内的基因缺陷(或突变)引起。引起deb的突变可以是显性的或隐性的。家庭成员具有这种病症的大多数家庭都有明显的突变。胶原蛋白vii是非常大的分子(300kda)，其二聚化以形成半圆形环状结构：锚固原纤维。认为锚固原纤维会在表皮基底膜与上真皮中的纤维状胶原蛋白之间形成结构连接。营养不良型大疱性表皮松解症的体征和症状锚固原纤维的缺陷会损害表皮与下面的真皮之间的粘附。因此，deb患者的皮肤非常容易严重发疱。胶原蛋白vii还与食管内壁的上皮相关，且deb患者可能患有慢性疤痕、结蹼和食管的阻塞。由于口腔黏膜和食管黏膜的创伤，受影响的个体通常严重营养不良，并需要饲管补充营养。他们还患有原因不明的缺铁性贫血，这会导致慢性疲劳。皮肤上的开放性伤口愈合缓慢或者完全不愈合，通常形成大面积疤痕，而且特别容易感染。许多个体用漂白剂和水的混合物浸洗以极力防止这些感染。慢性炎症导致感染皮肤细胞中的dna错误，这进而造成鳞状细胞癌(scc)。大部分这些患者会在30岁之前死于scc或与deb相关的并发症。营养不良型大疱性表皮松解症的病理生理学在不存在col7a1基因的突变的情况下，对vii型胶原蛋白的自身免疫应答可以造成获得形式的大疱性表皮松解症，其称为获得性大疱性表皮松解症。存在其他类型的遗传性大疱性表皮松解症、交界型大疱性表皮松解症和单纯型大疱性表皮松解症，它们与vii型胶原蛋白缺陷无关。这些是由编码表皮或表皮与真皮之间交界处的基底膜的其他蛋白质的基因的突变造成的。外泌体外泌体是在后期内吞小泡(多泡体)中形成的小膜囊泡，1983年第一次描述为由网状细胞分泌，并且随后发现由许多类型的细胞分泌，包括各种造血细胞、造血来源或非造血来源的肿瘤和上皮细胞。它们是不同于最近描述的又称为外泌体的‘核糖核酸酶复合物’的实体。可以通过许多形态参数和生化参数来限定外泌体。因此，本文描述的外泌体可以包括这些形态参数或生化参数中的一个或多个。外泌体通常被定义为直径40-100nm的“碟状”囊泡或受脂质二层限制的扁平球体，通过内体膜(内质膜，endosomalmembrane)向内出芽而形成。与所有脂囊泡类似，但是与凋亡细胞释放的蛋白质聚集体或核小体碎片不同，外泌体具有～1.13-1.19g/ml的密度，并且以焦糖梯度漂浮。外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，以及脂筏标志，诸如gm1、gm3、脂筏标志蛋白(flotillin)和src蛋白激酶lyn，这表明它们的膜富含脂筏。已经检查了来自不同细胞类型和不同物种的外泌体的分子组成。通常，外泌体包含对于所有外泌体常见的遍在的蛋白质和细胞类型特定的蛋白质。另外，来自相同细胞类型但不同物种的外泌体中的蛋白质是高度保守的。与外泌体相关的遍在的蛋白质包括：存在于细胞骨架中的胞质蛋白，例如，微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白；存在于细胞内膜融合和运输中的蛋白质，例如，膜联蛋白和rab蛋白；信号转导蛋白，例如，蛋白激酶、14-3-3和异三聚体g蛋白；代谢酶，例如，过氧物酶、丙酮酸激酶和脂质激酶；以及烯醇酶-1和跨膜四蛋白家族，例如cd9、cd63、cd81和cd82。跨膜四蛋白高度富集于外泌体中，并且已知涉及大分子复合物和膜亚域的组织。外泌体中细胞类型特定的蛋白质的实例为来自mhcii类表达细胞的外泌体中的mhcii类分子、树突细胞源性外泌体中的cd86、t细胞源性外泌体上的t细胞受体等。要注意，外泌体不包含细胞核、线粒体、内质网或高尔基体来源的蛋白质。另外，在外泌体中没有非常丰富的质膜蛋白质，这表明它们不仅是质膜的片段。许多报道的与外泌体相关的遍在的蛋白质还存在于hesc-msc分泌物的蛋白质组谱中。还已知外泌体包含mrna和微rna，该mrna和微rna可以被递送至另一细胞，并且可以在该新地点发挥作用。外泌体的生理功能仍然定义不清。认为其帮助根除退化蛋白质、循环蛋白质、介导传染性颗粒诸如朊病毒和病毒的传播、引发补体耐受性、促进免疫细胞-细胞通信以及传输细胞信号传导。已经在免疫疗法中使用外泌体来治疗癌症。用于促进、恢复或加强稳态的组合物我们提供用于促进、恢复或加强稳态的组合物。这种组合物可以包括外泌体，诸如，来自间充质干细胞的外泌体。它们可以包括间充质干细胞条件培养基(或者甚至是间充质干细胞本身)。例如，外泌体、条件培养基和/或间充质干细胞可以是哺乳动物外泌体、条件培养基和/或间充质干细胞，诸如，人类外泌体、条件培养基和/或间充质干细胞。外泌体组合物可以由外泌体制备。外泌体可以来源于干细胞性，诸如间充质干细胞(msc)，如下文和wo2009/105044所描述的。可以通过若干方式从间充质干细胞获得外泌体，例如，通过分泌、出芽或从间充质干细胞分散。例如，可以从间充质干细胞产生、渗出、发出或流出外泌体。在细胞培养基中有间充质干细胞的情况下，外泌体可以分泌到细胞培养基中。外泌体特别地可以包括囊泡。外泌体可以包括受脂质双层限制的囊泡或扁平化球体。外泌体可以具有40-100nm的直径。外泌体可以通过内体膜的向内出芽而形成。外泌体可以具有～1.13-1.19g/ml的密度，并且可以以焦糖梯度漂浮。外泌体可以富含胆固醇和鞘磷脂，以及脂筏标志，诸如gm1、gm3、脂筏标志蛋白和src蛋白激酶lyn。外泌体可以包括存在于间充质干细胞或间充质干细胞条件培养基(msc-cm)中的一种或多种蛋白质，诸如对msc或msc-cm特有或特异性的蛋白质。它们可以包括rna，例如mirna。我们提供包括见于间充质干细胞或以间充质干细胞的培养为条件的培养基中的一种或多种基因或基因产物的外泌体，用于促进、恢复或加强稳态。外泌体可以包括间充质干细胞分泌的分子。这种外泌体以及其中包括的分子(特别地包括蛋白质或多肽)的任意组合可以用于本文件中描述的任何方法。外泌体可以包括存在于细胞骨架中的胞质蛋白，如，微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白；存在于细胞内膜融合和运输中的蛋白质，如，膜联蛋白和rab蛋白；信号转导蛋白，如，蛋白激酶、14-3-3和异三聚体g蛋白；代谢酶，如，过氧化物酶、丙酮酸激酶和脂质激酶；以及烯醇酶-1和跨膜四蛋白家族，如cd9、cd63、cd81和cd82。特别地，外泌体可以包括一种或多种跨膜四蛋白。外泌体可以包括mrna和/或微rna。外泌体可以是能与间充质干细胞(msc)或间充质干细胞条件培养基(msc-cm)分离的事物。外泌体可以进行msc或msc-cm的至少一种活性。外泌体可以进行或执行msc或msc-cm的基本上大部分或所有功能。例如，外泌体可以是msc或msc-cm的替代物(或生物替代物)。外泌体优选地具有间充质干细胞的至少一种性质。外泌体可以具有生物性质，诸如，生物活性。外泌体可以具有间充质干细胞的任何生物活性。外泌体可以例如具有间充质干细胞的治疗或恢复活性，诸如，促进、恢复或加强稳态的活性。外泌体可以与间充质干细胞条件培养基(msc-cm)分离。间充质干细胞条件培养基(msc-cm)通过在细胞培养基中培养间充质干细胞(msc)、其后代或其衍生出的细胞系并分离细胞培养基，可以获得条件细胞培养基，诸如间充质干细胞条件培养基(msc-cm)。通过包括通过分散胚胎干(es)细胞集落获得细胞的过程可以产生间充质干细胞。可以在没有共培养物的情况下在包含fgf2的无血清培养基中增殖细胞或其后代。间充质干细胞外泌体在国际专利公开号wo2009/105044中详细地描述了间充质干细胞外泌体。可以以许多方式来产生或分离外泌体。这种方法可以包括将外泌体与间充质干细胞(msc)分离。这种方法可以包括将外泌体与间充质干细胞条件培养基(msc-cm)分离。可以例如根据外泌体的任何性质将外泌体与不相关的成分分离开来分离外泌体。例如，可以根据分子量、大小、形状、组成或生物活性来分离外泌体。在分离期间、之前或之后可以过滤或浓缩或过滤并浓缩条件培养基。例如，条件培养基可以通过膜过滤，例如通过大小或分子量截留的膜过滤。条件培养基可以经受切向力过滤或超滤。例如，可以使用本文件其他部分的分子量测定中所述的用适当分子量或大小截留的膜进行过滤。条件培养基，可选地经过过滤或浓缩或经过过滤和浓缩，可以经受其他分离方式，诸如柱层析法。例如，可以使用具有各种柱的高效液相层析(hplc)。柱可以是尺寸排阻柱或结合柱。外泌体的一种或多种性质或生物活性可以用来追踪其在间充质干细胞条件培养基(msc-cm)的分级(分离，fractionation)期间的活性。作为一个实例，可以使用光散射、折射率、动态光散射或uv可见检测器来追踪外泌体。例如，可以使用治疗活性诸如心肌保护活性来追踪在分级期间的活性。下面的段落提供了可如何获得间充质干细胞外泌体的具体实例。通过在以间充质干细胞为条件的培养基中培养间充质干细胞可以产生间充质干细胞外泌体。间充质干细胞可以包括hues9.e1细胞。培养基可以包括dmem。dmem可以使得其不包括酚红。可以用胰岛素、转铁蛋白或硒蛋白(its)或其任意组合来补充培养基。培养基可以包含fgf2。培养基可以包含pdgfab。fgf2的浓度可以为约5ng/mlfgf2。pdgfab的浓度可以为约5ng/ml。培养基可以包括谷氨酰胺-青霉素-链霉素或b-巯基乙醇或其任意组合。细胞可以培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或以上，例如3天。可以通过将细胞与培养基分离来获得条件培养基。可以例如以500g对条件培养基进行离心。条件培养基可以通过膜的过滤来浓缩。膜可以包括>1000kda的膜。条件培养基可以被浓缩约50次或以上。条件培养基可以经受液相层析，诸如hplc。条件培养基可以通过尺寸排阻来分离。可以使用任何尺寸排阻基质，诸如sepharose。例如，可以采用6x40mm的tskguard柱swxl或7.8x300mm的tsk凝胶g4000swxl。洗脱液缓冲液可以包含任何生理介质，诸如盐水。其可以包含ph7.2的具有150mmnacl的20mm磷酸盐缓冲液。层析系统可以以0.5ml/min的流速来平衡。洗脱模式可以是等度的。在220nm的uv吸收度可以用于追踪洗脱的进程。可以使用准弹性光散射(qels)检测器来检验级分的动态光散射(dls)。可以保留被发现呈现动态光散射的级分。例如，发现通过上述一般方法产生的并以11-13分钟诸如12分钟的保留时间洗脱的级分呈现动态光散射。在该峰处的外泌体的rh为约45-55nm。这些级分包括间充质干细胞外泌体。外泌体分子量外泌体可以具有大于100kda的分子量。外泌体可以具有大于500kda的分子量。例如，外泌体可以具有大于1000kda的分子量。可以通过各种方式来确定分子量。原则上，可以通过大小分级并且滤过具有相关分子量截留的膜来确定分子量。然后可以通过用sds-page追踪组分蛋白质的分离或通过生物测定来确定外泌体大小。通过sds-page测定分子量外泌体可以具有大于100kda的分子量。例如，外泌体可以在经受过滤时使得分子量小于100kda的外泌体的大部分蛋白质分离成分子量大于100kda的滞留物级分。类似地，当经受具有500kda截留的膜过滤时，分子量小于500kda的外泌体的大部分蛋白质可以分离成分子量大于500kda的滞留物级分。这表明外泌体可能具有大于500kda的分子量。通过生物活性测定分子量外泌体可以具有大于1000kda的分子量。例如，外泌体可以使得当经受具有1000kda的分子量截留的膜过滤时相关生物活性基本上或主要保留在滞留物级分中。替代地或另外地，在过滤物级分中可能不存在生物活性。生物活性可以包括本文件其他部分描述的外泌体的任何生物活性。通过梗死尺寸测定分子量例如，生物活性可以包括梗死面积的减小，如在心肌缺血和再灌注损伤的任何适合模型中测定的。例如，可以测定小鼠或猪模型中的生物活性，如wo2009/105044中所述。总的说来，通过缝合结扎左冠状动脉(lca)使其闭塞30分钟会引起心肌缺血，并且通过移除缝合开始再灌注。再灌注之前5分钟，经由尾动脉向静脉注射含外泌体(诸如未分级的msc-cm)、过滤物(诸如<100或1,000kd的级分)、滞留物(诸如>1000kd的滞留物)或盐水的液体来处理小鼠。24小时后，切除心脏。在切除前，通过再结扎lca然后通过主动脉灌注伊文思蓝来确定缺血区面积(aar)。aar被定义为未被染剂着色的面积，并且被表达为左心室壁面积的百分比。24小时后使用伊文思蓝和ttc来评估梗死面积。与盐水相比，用间充质干细胞条件培养基(msc-cm)和滞留物(诸如>1000kd)级分处理的动物中相对梗死面积显著减少，这表明外泌体具有比膜的相关截留高的分子量(如，大于1000kda)。外泌体大小外泌体可以具有大于2nm的大小。外泌体可以具有大于5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm的大小。外泌体可以具有大于100nm诸如大于150nm的大小。外泌体可以具有基本上200nm或更大的大小。外泌体可以具有大小范围，诸如在2nm至20nm之间，在2nm至50nm之间，在2nm至100nm之间，在2nm至150nm之间或在2nm至200nm之间。外泌体可以具有在20nm至50nm之间、在20nm至100nm之间、在20nm至150nm之间或在20nm至200nm之间的大小。外泌体可以具有在50nm至100nm之间、在50nm至150nm之间或在50nm至200nm之间的大小。外泌体可以具有在100nm至150nm之间或在100nm至200nm之间的大小。外泌体可以具有在150nm至200nm之间的大小。可以通过各种方式来确定大小。原则上，可以通过大小分级并滤过具有相关大小截留的膜来确定大小。然后可以通过用sds-page追踪组分蛋白质的分离或通过生物测定来确定外泌体大小。还可以通过电子显微镜来确定大小。大小可以包括流体动力学半径。外泌体的流体动力学半径可以在100nm之下。其可以在约30nm至约70nm之间。流体动力学半径可以在约40nm至约60nm之间，诸如在约45nm至约55nm之间。流体动力学半径可以为约50nm。可以通过任何适合的方式(例如，激光衍射或动态光散射)来确定外泌体的流体动力学半径。在wo2009/105044中描述了确定流体动力学半径的动态光衍射方法的实例。获得外泌体可以通过本领域中描述的各种方式中的任何方式来获得外泌体。可以例如从间充质干细胞中获得外泌体，诸如从间充质干细胞条件培养基中获得。从间充质干细胞(msc)条件培养基中获得外泌体使用本文描述的方法可以从间充质干细胞条件培养基(msc-cm)中分离或产生间充质干细胞颗粒，诸如外泌体。可以通过本领域已知的任何方法来制备适用于产生条件培养基和外泌体的msc。特别地，可以在没有共培养物的情况下在包含fgf2的无血清培养基中通过增殖由分散胚胎干(es)细胞集落获得的细胞或其后代来制备msc。在下面的章节中详细地描述这一点。由hesc获得间充质干细胞(msc)或msc样细胞的方法可能涉及将人类端粒酶逆转录酶(htert)基因转染到分化的hesc中(xu等人,2004)或与小鼠op9细胞系共培养(barberi等人,2005)。在这些获得方案中使用外源遗传物质和小鼠细胞引入异生物质(xenozootic)传染因子的致肿瘤性或感染的不可接受的风险。因此可以通过由使用用于将类似或相同(诸如同源)msc群与分化的hesc分离的临床相关且可重复的方案得到的msc来制备外泌体。一般来说，该方法包括将胚胎干(es)细胞集落分散成细胞。然后将细胞铺板并增殖。在没有共培养物的情况下在包含成纤维细胞生长因子2(fgf2)的无血清培养基中增殖细胞，以便获得间充质干细胞(msc)。因此，该方案不需要血清，使用小鼠细胞或基因操作，并且需要较少的操作和时间，因此是可高度规模化的。该方案可以用于将msc与两个不同的hesc系、hues9和h-l以及还有第三系hes-3分离。通过本文描述的方法和组合物获得的人类es细胞源性的msc(hesc-msc)与骨髓源性msc(bm-msc)非常相似。胚胎干细胞培养基可以包括人类胚胎干细胞(hesc)培养基。在一种实施方式中，生成间充质干细胞(msc)的方法包括在补充fgf2和可选地pdgfab的培养基中在无饲养层支持的情况下用胰蛋白酶消化并增殖hesc，然后分选cd105+cd24-细胞。该方法可以包括在补充fgf2和可选地pdgfab的培养基中无饲养层增殖后一周从胰酶消化的hesc中分选cd105+、cd24-细胞，以生成其中至少一些例如基本全部或全部细胞彼此相似或相同(例如同源)的hesc-msc细胞培养物。通过该方法产生的msc可以用于产生间充质干细胞条件培养基(msc-gm)，从所述间充质干细胞条件培养基中可以分离出外泌体。解聚胚胎干细胞集落产生间充质干细胞的一种方法可以包括将胚胎干细胞集落分散或解聚成细胞。胚胎干细胞集落可以包括hues9集落(cowanca,klimanskayai,mcmahonj,atienzaj,witmyerj,等人(2004)derivationofembryonicstem-celllinesfromhumanblastocysts.nengljmed350:1353-1356)或h1esc集落(thomsonja,itskovitz-eldorj,shapiross,waknitzma,swiergieljj,等人(1998)embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.science282:1145-1147.)。集落中的细胞可以解聚或分散至很大程度，即至少成丛(clumps)。集落可以解聚或分散至集落中的所有细胞均为单个的程度，即，集落完全解聚。可以利用分散剂来实现解聚。该分散剂可以是能够使集落中的至少一些胚胎干细胞彼此分开的任何物质。该分散剂可以包括破坏集落中细胞之间或细胞与基质之间或者细胞之间和细胞与基质之间的粘附的试剂。该分散剂可以包括蛋白酶。该分散剂可以包括胰蛋白酶。用胰蛋白酶进行处理可以例如在37摄氏度下持续大约3分钟。然后可以在培养基中将细胞中和、离心并重悬，然后进行铺板。该方法可以包括用胰蛋白酶分散人类胚胎干细胞的汇合板，并且将细胞铺板。解聚可以包括以下步骤顺序中的至少一些：抽吸、冲洗、胰酶消化、培育、取出、猝灭、再接种和取等分试样(aliquoting)。以下方案改编自加州大学圣地亚哥分校的hedrick实验室(http://hedricklab.ucsd.edu/protocol/coscell.html)。在抽吸步骤中，将培养基吸出或轻轻地从容器诸如烧瓶中移除。在冲洗步骤中，用体积例如为5-10ml的缓冲培养基来冲洗细胞，该缓冲培养基可以不含ga2+和mg2+。例如，可以用不含钙和镁的pbs冲洗细胞。在胰酶消化步骤中，向容器中加入一定量的在缓冲液中的分散剂，并将容器滚动，以用分散剂溶液覆盖生长表面。例如，可以向烧瓶中加入1ml的在hank’sbss中的胰蛋白酶。在培育步骤中，在维持温度下将细胞放置一定时间。例如，可以在37℃下将细胞放置数分钟(如，2分钟至5分钟)。在取出步骤中，可以通过机械作用(例如通过刮除或通过用手敲打容器的侧面)取出细胞。细胞应以片状物脱离并滑下表面。在猝灭步骤中，向烧瓶中加入一定体积的培养基。该培养基可以包括用于停止分散剂的作用的中和剂。例如，如果分散剂是蛋白酶例如胰蛋白酶，则培养基可以包含蛋白质，诸如血清蛋白，其将清除蛋白酶的活性。在特别的实例中，向烧瓶中加入3ml的含血清的细胞培养基，以构成总共4ml。可以用吸液管吸出细胞以取出或分散细胞。在再接种步骤中，将细胞再接种到新鲜培养容器和加入的新鲜培养基中。可以以不同的分流比进行多次再接种。例如，可以以1/15的稀释液和1/5的稀释液再接种细胞。在具体实例中，可以通过向25cm2的烧瓶中加入1滴细胞并向另一烧瓶加入3滴以再接种培养物从而再接种细胞，然后向每个烧瓶加入7-8ml的培养基，以从例如75cm2的烧瓶中提供1/15的稀释液和1/5的稀释液。在取等分试样的步骤中，取细胞的等分试样，放入新皿中，或者取至所需分流比，并加入培养基。在具体实施方式中，该方法包括下述步骤：首先以非粘附的方式将人类es细胞悬浮培养，以形成拟胚体(eb)。然后对5-10日龄的eb进行胰酶消化，之后作为粘附细胞铺在明胶涂覆的组织培养板上。维持作为细胞培养物可以将解聚的细胞铺板并维持为细胞培养物。可以将细胞铺在培养容器或基质(底物)诸如明胶板上。至关重要的是，在没有共培养物的情况下，例如，在没有饲养细胞(feedercells)的情况下，对细胞进行培养和增殖。细胞培养物中的细胞可以在无血清培养基中生长，该无血清培养基补充有例如5ng/ml的一种或多种生长因子，诸如成纤维细胞生长因子2(fgf2)和可选地血小板源生长因子ab(pdgfab)。当汇合时，可以通过用胰蛋白酶进行处理、洗涤和再铺板将细胞培养物中的细胞分离或继代培养1:4。无共培养物可以在没有共培养物的情况下培养细胞。术语“共培养物”是指一起生长的两种或多种不同种类的细胞的混合物，例如间质饲养细胞。因此，在典型的es细胞培养物中，通常用经过处理因此不会分开的小鼠胚胎皮肤细胞饲养层涂覆培养皿的内表面。该饲养层提供粘附表面，以使得es细胞能粘附和生长。此外，饲养细胞向培养基中释放es细胞生长所需的营养物。在本文描述的方法和组合物中，es和msc细胞可以在没有这种共培养物的情况下培养。可以将细胞培养为单层或在没有饲养细胞的情况下培养细胞。可以在没有饲养细胞的情况下培养胚胎干细胞，以建立间充质干细胞(msc)。可以将分离或解聚的胚胎干细胞直接铺到培养基质上。培养基质可以包括组织培养容器，诸如有盖培养皿。可以对容器进行预处理。可以将细胞铺在明胶组织培养板上并使细胞在该培养板上生长。以下是对皿进行明胶涂覆的实例方案。制备在蒸馏水中的0.1％明胶的溶液并对该溶液进行高压灭菌。其可以在室温下保存。用明胶溶液覆盖组织培养皿的底部并培育5-15分钟。移除明胶，并且板备用。应在加入细胞之前加入培养基，以防止低张度裂解。无血清培养基可以在包括无血清培养基的培养基中培养分离或解聚的胚胎干细胞。术语“无血清培养基”可以包括不含血清蛋白如胎牛血清的细胞培养基。无血清培养基是本领域公知的，并且在例如美国专利5,631,159和5,661,034中描述。无血清培养基可从市场上购得，例如，gibco-brl(invitrogen)。无血清培养基可以不含蛋白质，因为其可以缺少蛋白质、水解产物和未知组成的组分。无血清培养基可以包括其中所有组分均具有已知化学结构的化学限定培养基。化学限定无血清培养基是有利的，因为其提供完全限定的系统，该系统消除变异性，允许改进的再现性以及更一致的性能，并降低被偶然试剂污染的可能性。无血清培养基可以包括knockoutdmem培养基(invitrogen-gibco，grandisland,newyork)。可以用浓度例如为5％、10％、15％等的一种或多种组分诸如血清替代培养基来补充无血清培养基。无血清培养基可以包括invitrogen-gibco(15grandisland,newyork)的10％的血清替代培养基或者可以用其补充。生长因子其中培养了分离或解聚的胚胎干细胞的无血清培养基可以包括一种或多种生长因子。本领域中已知多种生长因子，包括pdgf、egf、tgf-a、fgf、ngf、红细胞生成素、tgf-b、igf-i和igf-ii。生长因子可以包括成纤维细胞生长因子2(fgf2)。培养基还可以包含其他生长因子，诸如血小板源生长因子ab(pdgfab)。这两种生长因子均是本领域已知的。该方法还包括在包含fgf2和pdgfab的培养基中培养细胞。替代地或另外地，培养基可以包含或还包含表皮生长因子(egf)。使用egf可以促进msc的生长。可以使用任何适合浓度的egf，例如5-10ng/mlegf。egf可以用于代替pdgf。egf是本领域熟知的蛋白质，并且称为标志egf，别名标志urg、entrez1950、hugo3229、omim131530、refseqnm_001963、uniprotp01133。因此，我们公开了包含(i)fgf2、(ii)fgf2和pdgf以及(iii)fgf2和egf和其他组合物的培养基的使用。fgf2是一种以低水平在许多组织和细胞类型中表达并在大脑和脑垂体中达到高浓度的广谱促有丝分裂、血管生成和神经营养因子。fgf2已涉及多种生理和病理过程，包括肢体发育、血管生成、伤口愈合和肿瘤生长。fgf2可以从市场购得，例如从invitrogen-gibco(grandisland,newyork)购得。血小板源生长因子(血小板衍生生长因子)(pdgf)是一种用于宽范围的细胞类型包括成纤维细胞、平滑肌和结缔组织的有效丝裂原。由称为a链和b链的两条链的二聚体组成的pdgf可以以aa或bb同二聚体或ab异二聚体的形式存在。人类pdgf-ab是包含13.3kdaa链和12.2b链的25.5kda同二聚体蛋白质。pdgfab可以从市场购得，例如从peprotech(rockyhill,newjersey)购得。一种或多种生长因子诸如fgf2和可选的pdgfab可以以约100pg/ml的浓度存在于培养基中，诸如约500pg/ml，诸如约1ng/ml，诸如约2ng/ml，诸如约3ng/ml，诸如约4ng/ml，诸如约5ng/ml。在一些实施方式中，培养基包含约5ng/ml的fgf2。培养基还可以包含诸如约5ng/ml的pdgfab。分开细胞培养物中的细胞通常将继续生长直至汇合，此时接触抑制导致细胞分裂和生长的停止。然后可以将这些细胞从基质或烧瓶中分离，并通过稀释到组织培养基中并再铺板而“分开”、继代培养或传代。本文描述的方法和组合物因此可以包括在培养过程中传代或分开。细胞培养物中的细胞可以以1:2或以上的比例分开，诸如1:3，诸如1:4、1:5或以上。术语“传代”指在于取细胞系的汇合培养物的等分试样、在于接种于新鲜培养基中并在于培养该系直到获得汇合或饱和的过程。选择、筛选或分选步骤该方法还可以包括选择或分选步骤，以进一步分离或选择间充质干细胞。该选择或分选步骤可以包括通过一种或多种表面抗原标志物从细胞培养物中选择间充质干细胞(msc)。使用选择或分选步骤还增强msc分选和选择特异性的严格性，而且还可能降低起始物料中来自胚胎干细胞诸如hesc和其他hesc衍生物的可能污染。这将会进一步降低畸胎瘤形成的风险，并进一步增加我们描述的方案的临床相关性。已知许多方法用于根据抗原表达进行选择或分选，且这些方法中的任何方法均可以用于本文描述的选择或分选步骤。可以通过荧光激活细胞分选(facs)来实现选择或分选。因此，如本领域已知的，facs涉及将细胞暴露于报告物，诸如标记抗体，该标记抗体结合并标记由细胞表达的抗原。产生抗体并标记抗体以形成报告物的方法是本领域已知的，并且例如记载于harlow和lane中。然后使细胞通过facs机器，该机器根据标记将细胞彼此分选开。替代地或另外地，可以采用磁性细胞分选(macs)来分选细胞。我们已意识到，虽然已知大量候选表面抗原与msc相关，例如cd105、cd73、anpep、itga4(cd49d)、pdgfra，但msc相关表面抗原中的一些，例如cd29和cd49e在es细胞诸如hesc中也高度表达，并且它们的表达通过facs分析来验证。表面抗原与msc的关联可能不足以使抗原具有作为用于将msc从es细胞诸如hesc中分离的选择性标志物的资格。因此，选择或分选步骤可以采用在msc和es细胞之间被不同表达的抗原。我们的方法的选择或分选步骤可以根据抗原的表达正向地选择间充质干细胞。可以通过例如比较hesc和hescmsc的基因表达谱来识别这些抗原。我们的方法的选择或分选步骤可以根据被鉴定为在msc上表达但不在es细胞诸如hesc上表达的抗原的表达来正向地选择间充质干细胞。cd73在msc上被高度表达，但在hesc上不被高度表达。cd73和cd105均是msc中高度表达的表面抗原，并且相对于hesc排在hesc-msc的前20种高度表达表面抗原内，使用cd73或cd105(或使用二者)作为推定msc的选择性标志物在分选由分化的hesc生成的推定msc时是等效的。替代地或另外地，选择或分选步骤可以根据在胚胎干细胞(es细胞)诸如hesc上作为表面抗原高度表达但在间充质干细胞如hesc-msc上不作为表面抗原高度表达的表面抗原负向地针对抗原进行选择。可以根据已知或之前识别的hesc特异性表面抗原诸如mibp、itgb1bp3和podxl以及cd24进行选择或分选。facs分析证实cd24在hesc上表达但不在hesc-msc上表达。因此，cd24可以被单独用作负向选择或分选标记，或者与cd105结合被用作用于将推定msc与分化的hesc培养物分离的正向选择性标志物。间充质干细胞条件培养基产生间充质干细胞条件培养基的方法是本领域已知的，并例如在国际专利公开号wo2008/020815中描述。可以通过在培养基诸如细胞培养基中将间充质干细胞培养预定时间长度来制备条件培养基。间充质干细胞可以特别地包括通过本文件中描述的方法中的任何方法或本领域已知的方法产生的那些物质。条件培养基可以在治疗中按原样使用或在一个或多个处理步骤之后使用。例如，条件培养基可以进行uv处理、过滤消毒等。可以采用一个或多个纯化步骤。可以从用于治疗的条件培养基中获得外泌体。特别地，可以例如通过透析或超滤来浓缩条件培养基。例如，可以使用标称分子量极限(nmwl)为例如3k的膜超滤来浓缩培养基。外泌体的纯化通过本领域已知的各种方法例如国际专利公开号wo2009/105044(大小排阻层析)和wo2012/087241(离子交换层析)中的方法对来自间充质干细胞的外泌体进行纯化。外泌体的递送如本文件中描述的外泌体可以通过任何适当的方式递送至人体或动物体。因此，我们描述了用于将颗粒诸如本文件描述的外泌体递送至靶细胞、组织、器官、动物体或人体的递送系统，以及使用该递送系统将颗粒递送至靶标以用于促进、恢复或加强生物环境的稳态的方法。递送系统可以包括颗粒诸如外泌体的来源，诸如包含颗粒的容器。递送系统可以包括用于将颗粒分配至靶标的分配器。因此，我们提供了用于将颗粒诸如本文描述的外泌体递送至靶标用于促进、恢复或加强生物环境的稳态的递送系统，该系统包括本文件所述的颗粒来源以及可操作用以将颗粒递送至靶标的分配器。我们还提供了这种递送系统在将颗粒递送至靶标用于促进、恢复或加强生物环境的稳态的方法中的用途。用于将流体递送到体内的递送系统是本领域已知的，并且包括注射、外科滴注、导管(包括灌注导管)，诸如在美国专利6,139,524中描述的那些，例如药物递送导管，诸如在美国专利7,122,019中描述的那些。可以使用例如本领域已知的鼻用喷雾、喷气器(puffer)、吸入器等例如美国设计专利d544,957中所示来实现递送至肺部或鼻腔通道，包括鼻内递送。可以使用主动脉内肾脏递送导管诸如美国专利7,241,273中描述的递送导管来实现递送至肾脏。很明显，特别递送应能配置成以适当的间隔递送所需量的颗粒，以便实现最佳治疗。还明显的是，递送方法将取决于颗粒待递送至的具体器官，技术人员将能够确定相应地采用哪种方式。颗粒可以用于治疗或预防皮肤病，如大疱性表皮松解症。可以使用经皮显微注射针来采用长期颗粒递送，直到病症消退。治疗方法疑似需要或需要恢复、加强或促进稳态(包括患有或疑似患有本文件其他地方列出的任何相关疾病)的受试者可以口服、局部施用或肠胃外施用外泌体。疑似需要或需要恢复、增强或促进稳态的个体受试者可能患有或疑似患有移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)。因此，可以向疑似患有移植物抗宿主病(gvhd)或大疱性表皮松解症(eb)的受试者施用外泌体，用于治疗或保养受试者。本领域技术人员可以根据若干考虑事项诸如吸收、新陈代谢、递送方法、年龄、体重、疾病严重程度和对治疗的响应来确定待施用至受试者的组合物的治疗有效量。组合物的口服施用包括口服、颊给药、经肠给药或灌胃给药。还设想组合物可以被用作食品添加剂。例如，在摄入之前将组合物撒在食物上或加入液体中。组合物的局部施用包括局部施用、真皮施用、表皮施用或皮下施用。肠胃外施用包括但不限于肌肉内施用、静脉内施用、腹腔施用、眼内施用或关节内施用或施用至手术区域。外泌体可以以促进、恢复或加强稳态(或用以治疗或预防任何相关疾病)的有效量施用。治疗方案也可以变化，并且通常取决于患者的病症的严重程度、健康状况和年龄等。明显地，某些类型的病症需要更积极的治疗，而同时，某些患者无法忍受更繁重的方案。临床医师最适合根据治疗制剂的已知功效和毒性(如有)做出这种决定。组合物可以以单剂量或多剂量给予。单剂量可以每天施用一次，或一天施用多次，或一周施用多次，或每月施用一次或一个月施用多次。组合物可以以一系列剂量给予。系列剂量可以每天施用一次，或一天施用多次，每周施用一次，或一周施用多次，或每月施用一次或一个月施用多次。因此，本领域技术人员意识到，取决于受试者的病症、健康状况等，本文描述的外泌体组合物可以施用任何给定的时间段，直到治好疾病或缓解症状或稳态被加强、促进或恢复至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或其间的任何范围。对于局部施用，包含外泌体的凝胶制剂可以用于涂覆吸水纱布敷料的纤维，以形成治愈绷带，然后可以将治愈绷带放置在伤口或皮肤病诸如大疱性表皮松解症上。可以使用低粘度制剂。可以通过用包含具有伤口愈合活性的外泌体的凝胶水溶液浸渍纱布敷料来制备绷带。然后绷带可以被应用至伤口，使得纱布的涂覆纤维接触伤口并加快伤口愈合的速度。在将包含外泌体的凝胶应用于内部或切口位置的情况下，凝胶形成聚合物可以是生物可降解的。天然存在的聚合物通常是生物可降解的。这些聚合物的实例为胶原蛋白、糖胺聚糖、明胶和淀粉。纤维质材料不是生物降解的。合成聚合物诸如乙烯基聚合物不是可降解的。本文描述的聚合物的生物可降解性是本领域技术人员熟知的。我们还描述了一种促进、恢复或加强稳态(或治疗或预防任何相关疾病)的方法，该方法包括下述步骤：通过在体循环中增加外泌体的量来补充全身免疫系统。外泌体可以经由肠胃外途径施用，所述肠胃外途径包括但不限于肌肉内、静脉内、腹腔内、眼内、关节内或施用到手术区域中。我们还公开了一种促进、恢复或加强稳态(或治疗或预防任何相关疾病)的方法，该方法包括下述步骤：通过增加受试者的胃肠道内外泌体的量来补充黏膜免疫系统。我们描述了一种通过向患有相关病症的受试者施用外泌体组合物来加强受试者的免疫系统的方法。取决于施用方式，加强了免疫系统的不同部分。例如，组合物的局部施用造成加强局部免疫系统。组合物的肠胃外施用造成加强全身免疫系统。此外，组合物的口服施用造成加强黏膜免疫系统，这也可以造成全身效果。免疫系统，无论是局部、全身还是黏膜免疫系统，均可以通过刺激细胞因子和/或趋化因子的外泌体来加强。示例性的细胞因子包括胃肠道中的白介素-18和gm-csf，已知这两种用以加强免疫细胞或刺激免疫细胞的产生。例如，白介素-18加强自然杀伤细胞或t淋巴细胞。例如，白介素-18(il-18)加强cd4+、cd8+和cd3+细胞。本领域技术人员已知il-18是一种th1类细胞因子，其与白介素-12和白介素-2协同作用刺激淋巴细胞产生ifn-γ。其他细胞因子或趋化因子也可以加强，例如但不限于il-12、il-1b、mip-3α、mip-1α或ifn-γ。可以抑制其他细胞因子或酶，例如但不限于il-2、il-4、il-5、il-10、tnf-α或基质金属蛋白酶。还预期il-18或gm-csf刺激涉及修复的细胞的产生或活性，例如但不限于角化细胞、内皮细胞、树突细胞、成纤维细胞和成肌纤维细胞。此外，认为外泌体抑制tnf-α的产生，这会抑制涉及炎症的细胞。通过局部施用治疗有效量的外泌体组合物可以改善受试者的局部免疫系统。外泌体组合物的局部施用可以刺激细胞因子或趋化因子的产生。可以被外泌体刺激的示例性细胞因子可以包括但不限于白介素-18(il-18)、白介素-12(il-12)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和γ干扰素(ifn-γ)。示例性的趋化因子包括但不限于巨噬细胞炎症蛋白3α(mip-3α)、巨噬细胞炎症蛋白1α(mip-1α)或巨噬细胞炎症蛋白β(mip-10)。外泌体组合物还可以造成抑制细胞因子或趋化因子。细胞因子包括但不限于白介素-2(il-2)、白介素-4(il-4)、白介素-5(il-5)、白介素-10(il-10)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。此外，外泌体组合物还可以抑制基质金属蛋白酶(mmp)的产生。细胞因子例如白介素-18或粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子可以刺激免疫细胞的产生或活性。免疫细胞包括但不限于t淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突细胞和多形核细胞。更具体地，多形核细胞是嗜中性粒细胞，且t淋巴细胞选自由cd4+、cd8+和cd3+t细胞组成的组。细胞因子例如白介素-18或粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子还可以刺激参与修复的细胞的产生或活性。参与修复的细胞包括但不限于角化细胞、内皮细胞、成纤维细胞、树突细胞和成肌纤维细胞。抑制tnf-α还抑制树突细胞的迁移和成熟。树突细胞可以是朗格汉斯细胞。施用我们公开了促进、恢复或加强稳态(或治疗或预防任何相关疾病)的方法，该方法包括下述步骤，向受试者施用治疗有效量的外泌体，以导致症状的改善或补救。可以以任何适合的量施用外泌体。例如，可以向受试者施用含10μg或更少、诸如5μg或更少、诸如2μg或更少、诸如1μg或更少、诸如0.5μg或更少、诸如0.3μg的外泌体的组合物。药物组合物可以包括40μg/ml或更少、20μg/ml或更少、8μg/ml或更少、4μg/ml或更少、2μg/ml或更少或1.2μg/ml或更少的外泌体。组合物可以施用任何适当的时间长度，诸如至少一周至十二周。施用的外泌体的量可以包括任何适合的量，诸如约每天0.0001毫克至约每天100g。可以向动物诸如需要外泌体的哺乳动物施用外泌体。动物可以是农场动物，诸如山羊、马、猪或牛；宠物动物，诸如狗或猫；实验动物，诸如小鼠、大鼠或豚鼠；或灵长类动物，诸如猴、猩猩、猿、黑猩猩或人类。例如，哺乳动物可以是人类。外泌体可以被包括在适于用作人用或动物用药剂的药物组合物中。下文更详细地描述了药物组合物。可以通过许多熟知方法中的任何方法向有需要的人类或动物施用有效量的外泌体，诸如药物组合物中的外泌体。例如，外泌体可以全身或局部施用，例如通过注射。外泌体的全身施用可以通过静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内、囊内或口服施用。替代地，在适当情况下可以局部施用外泌体。本文描述的有效量的药物组合物可以包括有效实现其目的的任何量。本领域技术人员可以通过常规方法在临床前试验和临床试验期间确定通常以mg/kg表示的有效量。个体向个体递送外泌体。如本文所用的，术语“个体”指脊椎动物，特别是哺乳动物物种中的成员。该术语包括但不限于家养动物、运动类动物、灵长类动物和人类。其他方面现在，在下文编号的段落中阐述了本发明的其他方面和实施方式；要理解的是本发明涵盖这些方面：段落1.一种用于促进、恢复或加强需要稳态的生物环境中的稳态的方法的间充质干细胞，该方法包括将生物环境暴露于间充质干细胞。段落2.根据段落1所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，所述生物环境包括细胞、组织、器官、系统或生物体中的环境，或者细胞、组织、器官、系统或生物体的环境。段落3.根据段落1或段落2所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，所述生物环境包括生物体的心血管系统或免疫系统。段落4.根据段落1、段落2或段落3所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，所述稳态包括生物化学或生物物理参数或生物化学和生物物理参数的维持。段落5.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，稳态包括细胞稳态，例如选自由下述组成的组中的参数的维持：(a)细胞的数量；(b)细胞的状态；(c)细胞的类型；以及(d)细胞外环境例如细胞外基质的组成。段落6.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，稳态包括生理ph例如ph7.4的维持。段落7.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，稳态包括免疫稳态，例如免疫应答的维持。段落8.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的间充质干细胞，其中，生物环境包括患有下述疾病的个体：(a)自身免疫疾病，例如克罗恩病或肌肉萎缩症；(b)病理包括二次免疫反应性的疾病，例如慢性心力衰竭、动脉硬化、冠心病或脑动脉疾病；(c)神经变性疾病；(d)老年病；或(e)免疫紊乱，例如慢性炎症或自体与非自体的免疫辨识降低。段落9.一种用于促进、恢复或加强患有疾病或组织损伤的个体的稳态的方法的间充质干细胞，该方法包括向个体施用间充质干细胞。段落10.间充质干细胞在由单磷酸腺苷(amp)产生腺苷的方法中的用途。段落11.间充质干细胞在促进或加强磷酸化或促存活蛋白激酶例如akt、erk1或erk2的方法中的用途。段落12.一种促进、恢复或加强需要稳态的生物环境中的稳态的方法，该方法包括将生物环境暴露于间充质干细胞。段落13.根据段落12所述的方法，其中，所述生物环境包括细胞、组织、器官、系统例如心血管系统或免疫系统、或生物体中的环境，或者细胞、组织、器官、系统例如心血管系统或免疫系统或生物体的环境。段落14.根据段落12或段落13所述的方法，其中，稳态选自由下述组成的组：(a)生物化学参数的维持；(b)生物物理参数的维持；(c)细胞稳态；(d)细胞数量的维持；(e)细胞状态的维持；(f)细胞类型的维持；(g)细胞外环境的组成的维持；(h)细胞外基质的组成的维持；(i)生理ph例如ph7.4的维持；(j)免疫稳态；以及(k)免疫应答的维持。段落15.一种通过促进、恢复或加强患有疾病或组织损伤的个体的稳态来治疗个体的方法，该方法包括向个体施用间充质干细胞。段落16.根据段落16所述的方法，其中，所述个体患有选自由下述疾病组成的组中的病症：(a)自身免疫疾病，例如克罗恩病或肌肉萎缩症；(b)病理包括二次免疫反应性的疾病，例如慢性心力衰竭、动脉硬化、冠心病或脑动脉疾病；(c)神经变性疾病；(d)老年病；或(e)免疫紊乱，例如慢性炎症或自体与非自体的免疫辨识降低。段落a1.一种用于促进、恢复或加强需要稳态的生物环境的稳态的方法的外泌体。段落a2.根据段落a1所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，所述生物环境包括细胞、组织、器官、系统或生物体中的环境，或细胞、组织、器官、系统或生物体的环境，并且其中，所述方法包括将生物环境暴露于外泌体。段落a3.根据段落a1或段落a2所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，稳态包括生物化学或生物物理参数或者生物化学和生物物理参数两者的维持。段落a4.根据段落a1、段落a2或段落a3所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，所述稳态包括心血管稳态，且生物环境包括生物体的心血管系统，或者其中，所述稳态包括免疫稳态，且生物环境包括生物体的免疫系统。段落a5.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，稳态包括细胞稳态，例如选自由下述组成的组中的参数的维持：(a)细胞的数量；(b)细胞的状态；(c)细胞的类型；以及(d)细胞外环境例如细胞外基质的组成。段落a6.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，稳态包括生理ph例如ph7.4的维持。段落a7.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，稳态包括免疫稳态，例如免疫应答的维持。段落a8.一种用于促进、恢复或加强患有疾病或组织损伤的个体的稳态的方法中的外泌体，所述方法包括向个体施用外泌体。段落a9.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，所述生物环境包括患有下述疾病的个体，或者其中，疾病包括：(a)自身免疫疾病，例如克罗恩病或肌肉萎缩症；(b)病理包括二次免疫反应性的疾病，例如慢性心力衰竭、动脉硬化、冠心病或脑动脉疾病；(c)神经变性疾病；(d)老年病；(e)免疫紊乱，例如慢性炎症或自体与非自体的免疫辨识降低；(f)杜氏肌营养不良(dmd)；(g)移植物抗宿主病(gvhd)；或(h)大疱性表皮松解症(eb)。段落a10.根据任一前述段落所述的用于其中规定的用途的外泌体，其中，外泌体包括间充质干细胞外泌体。段落a11.外泌体在由单磷酸腺苷(amp)产生腺苷的方法中的用途。段落a12.外泌体在促进或加强磷酸化或促存活蛋白激酶例如akt、erk1或erk2的方法中的用途。段落a13.一种促进、恢复或加强需要稳态的生物环境中的稳态的方法，该方法包括将生物环境暴露于外泌体。段落a14.根据段落a13所述的方法，其中，所述生物环境包括细胞、组织、器官、系统例如心血管系统或免疫系统、或生物体中的环境，或者细胞、组织、器官、系统例如心血管系统或免疫系统或生物体的环境。段落a15.根据段落a13或段落a14所述的方法，其中，稳态选自由下述组成的组：(a)生物化学参数的维持；(b)生物物理参数的维持；(c)细胞稳态；(d)细胞数量的维持；(e)细胞状态的维持；(f)细胞类型的维持；(g)细胞外环境的组成的维持；(h)细胞外基质的组成的维持；(i)生理ph例如ph7.4的维持；(j)免疫稳态；以及(k)免疫应答的维持。段落a16.一种通过促进、恢复或加强患有疾病或组织损伤的个体的稳态来治疗个体的方法，该方法包括向个体施用外泌体。段落a17.根据段落a16所述的方法，其中，个体患有选自由下述疾病组成的组中的病症：(a)自身免疫疾病，例如克罗恩病或肌肉萎缩症；(b)病理包括二次免疫反应性的疾病，例如慢性心力衰竭、动脉硬化、冠心病或脑动脉疾病；(c)神经变性疾病；(d)老年病；或(e)免疫紊乱，例如慢性炎症或自体与非自体的免疫辨识降低。实施例实施例1.msc外泌体经过cb73介导的amp水解诱导通过腺苷的erk和akt促存活信号传导-增加amp浓度将h9c2心肌细胞(atcc)在包含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺-青霉素-链霉素以及1％丙酮酸钠(均来自invitrogen)的高糖达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(dmem)中，以每孔200,000个细胞铺在6孔板上，并在高糖达尔伯克氏改良的伊格尔培养基、1％谷氨酰胺-青霉素-链霉素和1％丙酮酸钠(均来自invitrogen)中血清饥饿过夜。然后用新鲜的无血清培养基(高糖达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(dmem)、1％谷氨酰胺-青霉素-链霉素和1％丙酮酸钠(均来自invitrogen))将细胞培育另一小时。然后，用新鲜的无血清培养基替换该培养基，培养基包含0.1μg/ml外泌体以及100μm、10μm、1μm或0.1μmamp，外泌体按前文lai,r.c.,arslan,f.,lee,m.m.,szes.k.,choo,a.,chen,t.s.,salto-tellez,m.,timmers,l.,lee,c.n.,eloakley,r.m.,pasterkamp,g.,dekleijn,d.p.v.,lims.-k.+(2010)exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellresearch4:214-222.中描述的制备。5分钟后，收集、溶解细胞并且通过蛋白质印迹杂交对细胞进行分析。使用兔抗perk的1:2000稀释液(santacruzbiotechnologyinc)l/2、兔抗erk1/2的1:2000稀释液(santacruzbiotechnologyinc)和兔抗pakt的1:500稀释液(santacruzbiotechnologyinc)或兔抗akt的1:500稀释液(santacrazbiotechnologyinc)对10μg的总蛋白质进行免疫印迹。结果结果在图1中示出。如图1所示，msc外泌体经过cd73bc065937.1介导的amp水解诱导通过腺苷的erk(erk1-nm_001040056.2；erk2-nm_138957.2)和aktnm_005163.2促存活信号传导。此外，这种诱导与amp的3-log浓度范围内的amp浓度成比例。实施例2.msc外泌体经过cd73介导的amp水解诱导通过腺苷的erk和akt促存活信号传导-增加msc外泌体浓度材料和方法以每孔200,000个细胞将h9c2心肌细胞(atcc)铺在6孔板上，并血清饥饿过夜。然后用新鲜的无血清培养基将细胞培育另一个小时。然后，用新鲜的无血清培养基替换该培养基，培养基包含100μmamp(sigmaaldrich)以及1.0μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml的外泌体，外泌体按前文lai,r.c.,arslan,f.,lee,m.m.,szes.k.,choo,a.,chen,t.s.,salto-tellez,m.,timmers,l.,lee,c.n.,eloakley,r.m.,pasterkamp,g.,dekleijn,d.p.v.,lims.-k.+(2010)exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellresearch4:214-222.中所描述的进行制备。5分钟后，收集、溶解细胞并通过蛋白质印迹杂交对细胞进行分析。使用兔抗perk的1:2000稀释液(santacruzbiotechnologyinc)l/2、兔抗erk1/2的1:2000稀释液(santacruzbiotechnologyinc)和兔抗pakt的1:500稀释液(santacruzbiotechnologyinc)或兔抗akt的1:500稀释液(santacrazbiotechnologyinc)对10μg的总蛋白质进行免疫印迹。结果结果在图2中示出。图2示出了在存在恒定amp浓度的情况下，msc外泌体浓度在3-log浓度范围内的增加不会造成erk和akt促存活信号传导的诱导的显著变化。实施例3.对实施例1和实施例2的讨论-细胞-死亡稳态观察到msc外泌体可以诱导在amp的3-log浓度范围内而不是在外泌体的3-log浓度范围内的成比例的腺苷介导的响应，这表明该活性取决于损伤的严重程度，并且在广泛的损伤范围内都是有效的。重要的是，由降低的amp浓度代表的损伤消退导致不依赖于外泌体浓度的成比例减少的腺苷信号传导。在实践中，这会大大降低剂量给药不足或剂量给药过量的风险。该系统在缓解促死亡微环境方面的其他优点是将atp水解为amp然后将amp水解为腺苷花费的时间而造成通过atp的促死亡信号传导与通过腺苷的促存活信号传导之间的时间滞后。由于这种时间滞后，msc外泌体不干扰生物体的攻击和防御机制所需的细胞外atp的促死亡活性，而是定位其活性以最小化任何随后发生的附带伤害或加快细胞稳态的恢复。总之，msc外泌体可以建立被延迟但与atp介导的促死亡信号成比例的腺苷促存活响应，以促进细胞增殖和死亡的稳态平衡的恢复。实施例4.msc外泌体和同种异体皮肤移植物的存活材料和方法将来自c57bl/6小鼠(a*starbiologicalresourcecenter)的尾部皮肤移植到balb/c小鼠(a*starbiologicalresourcecenter)上。每天向每个受体小鼠皮下注射50μlpbs中的0.3μg外泌体或50μlpbs，持续4天，然后每隔一天注射一次，持续15天，外泌体如之前在lai,r.c.,arslan,f.,lee,m.m.,szes.k.,choo,a.,chen,t.s.,salto-tellez,m.,timmers,l.,lee,c.n.,eloakley,r.m.,pasterkamp,g.,dekleijn,d.p.v.,lims.-k.+(2010)exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellresearch4:214-222中所描述的。在第7天移除敷料时，每两天为移植物的排异评分，并每隔一天拍一次照。进行了两组独立的实验，每个实验包括在外泌体处理组中的十只经移植小鼠和十只未经移植的小鼠以及在pbs处理组中的十只经移植小鼠和十只未经移植的小鼠。确定了随时间的平均排斥分数。每个数据点表示具有sem的平均值。通过anova确定p值。结果结果在图3a、图3b、图3c和图3d中示出。图3b示出了在移植后第9天、第11天和第15天经pbs或msc外泌体处理的小鼠中的代表性皮肤同种异体移植物。图3c示出了经pbs或msc外泌体处理的小鼠的脾脏中的treg。移植十五天后，从经pbs或msc外泌体处理的小鼠中提取脾细胞，并进行cd4、cd25和foxp3染色。将treg水平对pbs载体对照的水平标准化，并表示为三份重复样品的平均值(±sd)。图3d示出了脾内注射实验。msc外泌体以0.3μg/小鼠的剂量直接注入脾脏，且pbs作为载体对照。在3天、6天和9天后，将脾脏分别从施用的pbs或msc外泌体的小鼠分离，用于cd4+cd25+foxp3+treg分化的进一步facs分析。将数据对未经处理的对照标准化并表示为三份重复样品的平均值(±sd)。实施例5.对实施例4的讨论-免疫稳态免疫稳态是指在针对病原体、外来组织或病变组织的“攻击和防御”机制与对自体的“耐受性”之间的生理平衡。这种平衡由涉及许多免疫细胞类型和可溶性中介物(mediators)的检查和平衡来维持。免疫稳态的调节异常会损害身体的防御以及自体-非自体识别，从而导致疾病或自身免疫。我们之前已经证明了在体外，msc外泌体通过激活单核细胞诱导treg极化(国际专利公开wo2012/108842)。当balb/cj小鼠移植有来自c57bl/6j小鼠的小鼠尾部皮肤并且通过皮下注射50μlpbs中的0.3μg外泌体或50μlpbs进行处理时，经外泌体处理的小鼠和pbs处理的小鼠分别花费13天和11天来排斥移植物(图3a和图3b)。treg的水平在经外泌体处理的移植物受体动物的脾脏内显著高于经盐水处理的动物(p＝0.002，图3c)。有趣的是，在用外泌体进行相同外泌体处理方案的非移植物受体小鼠的脾脏内并未观察到treg诱导(p>0.5；图3c)。将外泌体或pbs脾内注射到小鼠中也没有在经外泌体处理的动物中诱导较高的treg水平(p>0.5；图3d)。因此，msc外泌体仅在免疫系统被激活时诱导treg。由于treg是免疫抑制性的，因此msc外泌体在激活的免疫系统中对treg的诱导表明msc外泌体可以减弱免疫活性并加强免疫稳态的恢复。相反，由于msc外泌体并没有在未受免疫刺激的小鼠内引起treg的诱导，因此msc外泌体不会诱导免疫抑制并中断免疫稳态。总之，msc外泌体诱导免疫活性被刺激的动物内的treg扩增。在没有免疫刺激的动物中，msc外泌体对treg扩增没有影响。因此，msc外泌体可通过treg扩增减弱反应性来促进免疫稳态，并且当恢复免疫稳态时，对treg扩增的这种影响消失。实施例6.细胞粘附稳态为了证明恢复细胞粘附稳态的能力，对汇合msc培养物进行胰酶消化，以形成单细胞悬浮液。在中和和离心后，将胰酶消化的细胞重悬在生长培养基中。将等体积的细胞悬浮液铺在用等体积的涂覆介质预涂覆的组织培养板上，涂覆介质即pbs，具有6.25μg/ml、25μg/ml和200μg/mlmsc外泌体或1mg/ml明胶溶液的pbs。在第2小时和第24小时，在显微镜下观察培养物。更详细地，msc中的细胞粘附稳态被胰酶消化中断，如前所述(lian，lye等人，2007)。将胰酶消化的单细胞msc悬浮液铺在明胶涂覆的板或msc外泌体涂覆的板上。在第2小时和第24小时监测细胞培养物以确立细胞对板的粘附。在两小时内，铺在外泌体涂覆的板上的细胞的>90％都粘附至板上，但明胶涂覆的板上没有，这表明msc外泌体帮助将细胞的细胞粘附状态恢复至胰酶消化之前的状态(图4)。实施例7.间充质干细胞外泌体对小鼠模型中杜氏肌营养不良(dmd)的治疗功效背景根据msc外泌体恢复细胞、免疫稳态和细胞粘附稳态稳态的能力，间充质干细胞(msc)外泌体可以用于治疗其中病理包括二次免疫反应性的疾病。这些疾病包括慢性心力衰竭(fildes等人，2009)、动脉硬化(koltsova等人，2012)、冠状动脉和大脑动脉疾病(和finsterer，2002)、神经变性疾病(amor等人，2010)、dmd(杜氏肌营养不良)(evans等人，2009)以及被免疫紊乱(诸如慢性炎症和自体与非自体的免疫辨识降低)加剧的老年病(agrawal等人，2011，vasto和caruso，2004)。方法评估了msc外泌体在杜氏肌营养不良小鼠模型中的功效。简要的来说，将十六(16)只4周大的半合子c57bl/10scsn-dmdmdx/j雄性小鼠按体重随机分为两个处理组，每组8只小鼠，并以腹腔内给药方式每两天施用载体或外泌体(4μg)，持续三十二天。每周完成两次临床观察和体重。每周进行一次前臂握力测试，总共进行5次。在研究的第35天，将小鼠进行安乐死，制备血浆，并收集肌肉组织，包括趾长伸肌、胫骨前肌、膈肌和比目鱼肌，并将其固定在中性缓冲福尔马林中。使用多重珠技术(multiplexbeadtechnology)对每只小鼠的血浆来测定32种小鼠细胞因子或趋化因子(嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、g-csf、gm-csf、ifnγ、il-1α、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-9、il-10、il-12(p40)，il-12(p70)、il-13、il-15、il-17a、ip-10、kc、lif、lix、mcp-1、m-csf、mig、mip-1α、mip-1β、mip-2、rantes、tnfα、vegf)。http://www.evetechnologies.com/discoveryassaylistmouse.php.结果在经载体处理的动物和经外泌体处理的动物的体重和握力方面没有观察到显著差异。然而，相对于经外泌体处理的动物，经载体处理的动物的握力呈现出握力的增加随时间变缓的趋势(图5)。对小鼠的左和右肌肉样品(趾长伸肌、胫骨前肌、膈肌和比目鱼肌)进行组织病理检查，检查营养不良病理(dystropathology)的迹象，包括萎缩、内化核(internalizednuclei)、肥大、退化/坏死和矿化。对显微观察结果定级，其中“0”为正常，以及“6”为严重病理。总的来说，当与经外泌体处理的动物相比时，经载体处理的动物具有略高的组织学总分数(下文表e1)。组别：12萎缩1.001.04内化核2.592.39肥大0.470.46退化/坏死1.441.32矿化0.000.11表e1.第1组(经载体处理的)小鼠和第2组(经外泌体处理的)小鼠中营养不良病理的平均组织学分数。在分析的细胞因子中，gm-csf和ip10在经外泌体处理的动物中显著提高(下文表e2)表e2.使用多重珠技术(http://www.evetechnologies.com/discoveryassaylistmouse.php)对来自每只小鼠的血浆测定如下文列出的32种小鼠细胞因子或趋化因子。每种细胞因子或趋化因子的值被表示为pg/ml血清。(veh.：经载体处理的小鼠；exo：经外泌体处理的小鼠；avg：平均值；stdev：标准偏差；ttest：学生t检验)已经表明gm-csf会促进损伤后的组织愈合，诸如在结肠黏膜愈合、伤口愈合(bernasconi等人，2010)(mann等人，2001，lim等人，2013，hu等人，2011，groves和schmidt-lucke，1999，jorgensen等人，2002)以及细菌感染(steinwede等人，2011)中。ip10对在伤口愈合的再生阶段期间产生的新血管的分离中很重要(bodnar等人，2009)。这种分离对于形成无血管成熟皮肤是必要的。还已经表明ip-10减弱博来霉素引起的肺纤维化(keane等人，1999)。结论msc外泌体改善了dmd(杜氏肌营养不良)小鼠中的肌肉组织病理并且诱导产生已知加强组织修复的细胞因子。实施例8.间充质干细胞外泌体在gvhd(移植物抗宿主病)的小鼠模型中的治疗功效背景根据msc外泌体恢复细胞、免疫稳态和细胞粘附稳态稳态的能力，间充质干细胞(msc)外泌体可以用于治疗其中病理包括二次免疫反应性的疾病。这样的疾病包括慢性心力衰竭(fildes等人，2009)、动脉硬化(koltsova等人，2012)、冠状动脉和大脑动脉疾病(和finsterer，2002)、神经变性疾病(amor等人，2010)、dmd(杜氏肌营养不良)(evans等人，2009)以及被免疫紊乱(诸如慢性炎症和自体与非自体的免疫辨识降低)加剧的老年病(agrawal等人，2011，vasto和caruso，2004)。方法在gvhd(移植物抗宿主病)的小鼠模型中评估了msc外泌体的功效。简要地说，对三十(30)只6-8周大的雌性nsg(jaxstock#005557；jaxlaboratory)小鼠进行耳刻，以用于识别，并将小鼠放在具有hepa过滤空气的单独且积极通风的聚砜笼子中，密度为每个笼子最多5只小鼠。每两周更换一次笼子。用人工荧光灯以受控的12h照明/黑暗循环(6am至6pm照明)对动物房进行整体照明。动物房中的正常温度和相对湿度范围分别为22±4℃和50±15％。动物房设置为每小时进行15次换气。随意提供酸化至2.5至3.0的ph的过滤自来水和标准实验室食物。在适应环境3-7天后，按体重对小鼠进行分组，并在研究的第0天用具有x射线辐照器源的100rads进行辐照。在辐照后4小时，小鼠接收10x106经腹腔内注射的人类pbmc。在第1天、第4天、第7天、第10天……最高达第55天经腹腔内注射向小鼠剂量给予载体、外泌体(10μg)和enbrel(100μg)。每周进行三次临床观察和体重测量。如果小鼠显示出下述中的任何一种，则在第50天记下最终研究前用co2窒息对小鼠进行安乐死：a)相比于其初始体重，体重减轻>20％b)摸起来较冷，c)昏睡、弓背姿势以及皮毛肮脏结果在第55天，在载体组中有三只存活，在外泌体组中6只存活，而在enbrel组中4只存活。结论msc外泌体加强患有gvhd(移植物抗宿主病)的小鼠的存活。实施例9.间充质干细胞外泌体在大疱性表皮松解症(eb)中的治疗功效大疱性表皮松解症最严重的形式是交界型eb(jeb)或营养不良型eb(deb)。营养不良型大疱性表皮松解症(deb)由col7a1基因的突变引起，其造成c7胶原蛋白的减少或缺乏或者造成c7胶原蛋白的截短。因此，治疗deb的治疗靶标在于通过基因疗法替换或递送功能col7a1基因或者通过施用c7胶原蛋白来修正这种基因缺陷(vandenoever等人，2014)。虽然基因疗法的有利之处在于，其可能可以永久解决c7胶原蛋白缺陷，但将基因递送至足够的靶细胞的适当策略仍然面临挑战。相比之下，施用c7胶原蛋白相对简单，并且可以修正小鼠的疾病表现型(remington等人，2009)。已表明间充质干细胞通过分泌胶原蛋白7来缓解col7a1缺失小鼠的rdeb疾病表现型，胶原蛋白7沉积在真皮表皮界处(alexeev等人，2011)。结合这些研究，表明来自间充质干细胞的含胶原蛋白7的分泌可以缓解rdeb疾病表现型。方案我们对细胞或外泌体溶解产物进行了胶原蛋白7的蛋白质印迹分析，如图6a所示。泳道从左至右示出了分子量标准、过量表达胶原蛋白7的rdeb人真皮成纤维细胞、rdeb人真皮成纤维细胞、正常人真皮成纤维细胞和人间充质干细胞(msc)外泌体。通过将培养基从原代人真皮成纤维细胞的汇合皿中移除并向皿中添加细胞溶解缓冲液来制备成纤维细胞溶解产物。根据前文所述来制备msc外泌体。使用来自abeam的anti-collagenvii抗体[lh7.2](ab6312)通过标准免疫印迹测定来分析成纤维细胞和外泌体溶解产物w200。*表示胶原蛋白7。我们还估计了msc外泌体中的胶原蛋白7相对于正常人真皮成纤维细胞中的胶原蛋白7的浓度。结果在图6b中示出。制备了起始具有20μg蛋白质的msc外泌体溶解产物的二倍连续稀释液并平行上样200μg成纤维细胞溶解产物。还对cd81探测了印迹，作为上样对照。结果结果在图6a和图6b中示出。我们观察到由间充质干细胞分泌的大部分胶原蛋白7与外泌体相关(图6a和图6b)。每μg外泌体蛋白质的胶原蛋白量是1μg正常人成纤维细胞溶解产物产生的胶原蛋白量的100倍大。由于已经表明真皮注射同种异体成纤维细胞是安全的，并且可能通过增加真皮表皮界处胶原蛋白7的沉积来提高皮肤强度并减少发疱(wong等人，2008)，而仅注射胶原蛋白7可以缓解rdeb(woodley等人，2004，remington等人，2008)，因此施用高度富含胶原蛋白7的外泌体将缓解rdeb表现型。实施例10.通过间充质干细胞外泌体恢复移植物抗宿主病(gvhd)的免疫稳态该实施例证明了间充质干细胞外泌体在恢复免疫稳态方面的用途是用于移植物抗宿主病(gvhd)。我们使用了choi,j.,等人ifngammarsignalingmediatesalloreactivet-celltraffickingandgvhd.blood120,4093-4103(2012)和rettig,m.p.,等人kineticsofinvivoeliminationofsuicidegene-expressingtcellsaffectsengraftment,graft-versus-hostdisease,andgraft-versus-leukemiaafterallogeneicbonemarrowtransplantation.jimmunol173,3620-3630(2004)中描述的滞后淋巴细胞输注(dli)模型的完善小鼠模型。在第-1天用900cgy辐照受体balb/c小鼠，并在第0天移植来自供体b6cd45.1+小鼠的5x106tcd-bm。在第11天，向它们输注2x106供体b6cd45.2+t细胞。在移植后第12天(即，dli后一天)直到第32天，每隔一天向小鼠施用0.8μg外泌体或pbs。在第60天，将所有存活的小鼠杀死。结果结果在图7中示出，该图示出了dli小鼠的存活曲线。图7表明经外泌体处理的小鼠的存活率显著高于经pbs处理的动物(p＝0.0368)。实施例11.间充质干细胞外泌体在大疱性表皮松解症(eb)中的细胞粘附和治疗效果的加强该实施例证明了间充质干细胞外泌体在加强大疱性表皮松解症(eb)的体内细胞粘附和发挥治疗效果的用途。向营养不良型大疱性表皮松解症的亚等位基因小鼠模型经腹腔内施用间充质干细胞源性外泌体(描述在fritsch,a.,s.loeckermann,等人(2008)."ahypomorphicmousemodelofdystrophicepidermolysisbullosarevealsmechanismsofdiseaseandresponsetofibroblasttherapy.”thejournalofclinicalinvestigation118(5):1669-1679中)。在出生后不久每两天以25微克或50微克/幼崽剂量给予小鼠。结果结果在图8中示出，该图是外泌体处理的营养不良性大疱性表皮松解症的亚等位基因小鼠模型的存活曲线。如图8所示，根据对数秩检验p＝0.0333，给予25微克或50微克的小鼠之间的存活曲线显著不同。参考文献1.arslan,f.,etal.mesenchymalstemcell-derivedexosomesincreaseatplevels,decreaseoxidativestressandactivatepi3k/aktpathwaytoenhancemyocardialviabilityandpreventadverseremodelingaftermyocardialischemia/reperfiisioninjury.stemcellres10,301-312(2013).2.lai,r.,etal.mesenchymalstemcellexosomes:thefuturemsc-basedtherapy？inmesenchymalstemcellthempy(ed.chase,l.g.v.,mohanc.)39-62(humanapress,2013).3.lai,r.c.,chen,t.s.&lim,s.k.mesenchymalstemcellexosome:anovelstemcell-basedtherapyforcardiovasculardisease.regenerativemedicine6,481-492(2011).4.lai,r.c.,etal.proteolyticpotentialofthemscexosomeproteome:implicationsforanexosome-mediateddeliveryoftherapeuticproteasome.intjproteomics2012,971907(2012).5.lai,r.c.,yeo,r.w.,tan,k.h.&lim,s.k.mesenchymalstemcellexosomeamelioratesreperfusioninjurythroughproteomiccomplementation.regenerativemedicine8,197-209(2013).6.lai,r.c.,etal.mesenchymalstemcellexosomes:thefuturemsc-basedtherapy？inmesenchymalstemcelltherapy(eds.chase，l.g.&vemuri,m.c.)(humanapress,2012).7.luthje,j.origin,metabolismandfunctionofextracellularadeninenucleotidesintheblood.klinwochenschr67,317-327(1989).8.divirgilio,e.purines,purinergicreceptors,andcance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zek,g.,landau,m.,mcardle,s.,scott,s.r.,vonvietinghoff,s.,galkina,e.,miller,y.i.,acton,s.t.&ley,k.2012.dynamictcell—apcinteractionssustainchronicinflammationinatherosclerosis.thejournalofclinicalinvestigation,122,3114-3126.lim,j.-y.,choi,b.h.,lee,s.,jang,y.h.,choi,j.-s.&kim,y.-m.2013.regulationofwoundhealingbygranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactoraftervocalfoldinjury.plosone,8,e54256.mann,a.,breuhahn,k.,schirmacher,p.&blessing,m.2001.keratinocyte-derivedgranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactoraccelerateswoundhealing:stimulationofkeratinocyteproliferation,granulationtissueformation,andvascularization.jinvestigdermatol,117,1382-1390.steinwede,k.,tempelhof,o.,bolte,k.,maus,r.,bohling,j.,ueberberg,b.,f.,christman,j.w.,paton,j.c.&ask,k.2011.localdeliveryofgm-csfprotectsmicefromlethalpneumococcalpneumonia.thejournalofimmunology,187,5346-5356.c.&finsterer,j.2002.roleofinfectiousandimmunefactorsincoronaryandcerebrovasculararteriosclerosis.clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology,9,207-215.vasto,s.&caruso,c.2004.immunity&ageing:anewjournallookingatageingfromanimmunologicalpointofview.immunageing,1,1.1.arslan,f.,etal.mesenchymalstemcell-derivedexosomesincreaseatplevels,decreaseoxidativestressandactivatepi3k/aktpathwaytoenhancemyocardialviabilityandpreventadverseremodelingaftermyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellres10,301-312(2013).2.lai,r.,etal.mesenchymalstemcellexosomes:thefuturemsc-basedtherapy？inmesenchymalstemcelltherapy(ed.chase,l.g.v.,mohanc.)39-62(humanapress,2013).3.lai,r.c.,chen,t.s.&lim,s.k.mesenchymalstemcellexosome:anovelstemcell-basedtherapyforcardiovasculardisease.regenerativemedicine6,481-492(2011).4.lai,r.c.,etal.proteolyticpotentialofthemscexosomeproteome:tmnlicationsforanrxosome-mediateddeliveryoftheraneuticproteasome.intjproteomics2012,971907(2012).5.lai,r.c.,yeo,r.w.,tan,k.h.&lim,s.k.mesenchymalstemcellexosomeamelioratesreperfusioninjurythroughproteomiccomplementation.regenerativemedicine8197-209(2013).6.lai,r.c.,etal.mesenchymalstemcellexosomes:thefuturemsc-basedtherapy？inmesenchymalstemcelltherapy(eds.chase,l.g.&vemuri,m.c.)(humanapress,2012).7.luthje,j.origin,metabolismandflinctionofextracellularadeninenucleotidesintheblood.klinwochenschr67,317-327(1989).8.divirgilio,f.purines,purinergicreceptors,andcancer.cancerresearch72,5441-5447(2012).9.aymeric,l.,etal.tumorcelldeathandatpreleaseprimedendriticcellsandefficientanticancerimmunity.cancerresearch70,855-858(2010).10.vitiello,l.,gorini,s.,rosano,g.&lasala,a,immunoregulationthroughextracellularnucleotides.blood120,511-518(2012).11.wan,j.,ristenpart,w.d.&stone,h.a.dynamicsofshear-inducedatpreleasefromredbloodcells.proceedingsofthenationalacademyofsciences(2008).12.boudreault,f.&grygorczyk,r.cellswelling-inducedatpreleaseistightlydependentonintracellularcalciumelevations.thejournalofphysiology561,499-513(2004).13.ayna,g.,etal.atpreleasefromdyingautophagiccellsandtheirphagocytosisarecrucialforinflammasomeactivationinmacrophages.plosone7,e40069(2012).14.chekeni,f.b.,etalpannexin1channelsmediate/'find-me/'signalreleaseandmembranepermeabilityduringapoptosis.nature467,863-867(2010).15.luthje,j.&ogilvie,a.catabolismofap4aandap3ainwholeblood.thedinucleotidesarelong-livedsignalmoleculesinthebloodendingupasintracellularatpintheerythrocytes.eurjbiochem173,241-245(1988).16.colgan,s.p.,eltzschig,h.k.,eckle,t.&thompson,l.f.physiologicalrolesforecto-5'-nucleotidase(cd73).purinergicsignal2,351-360(2006).17.yellon,d.m.&baxter,g.f.reperfusioninjuryrevisited:istherearoleforgrowthfactorsignalinginlimitinglethalreperfusioninjury？trendsincardiovascularmedicine9,245-249(1999).18.hausenloy,d.j.&yellon,d.m.newdirectionsforprotectingtheheartagainstischaemia-reperfusioninjury:targetingthereperfusioninjurysalvagekinase(risk)-pathway.cardiovascres61,448-460(2004).19.choi,j.,etal.ifngammarsignalingmediatesalloreactivet-celltraffickingandgvhd.blood120,4093-4103(2012).20.rettig,m.p.,etal.kineticsofinvivoeliminationofsuicidegene-expressingtcellsaffectsengraftment,graft-versus-hostdisease，andgraft-versus-leukemiaafterallogeneicbonemarrowtransplantation.jimmunol173,3620-3630(2004).21.fildes,j.e.,shaw,s.m.,yonan,n.&williams,s.g.theimmunesystemandchronicheartfailure:istheheartincontrol？journaloftheamericancollegeofcardiology53,1013-1020(2009).22.koltsova,e.k.,etal.dynamictcell-apcinteractionssustainchronicinflammationinatherosclerosis.thejournalofclinicalinvestigation122,3114-3126(2012).23.c.&finsterer,j.roleofinfectiousandimmunefactorsincoronaryandcerebrovasculararteriosclerosis.clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology9,207-215(2002).24.amor,s.3puentes,f.,baker,d.&vandervalk,p.inflammationinneurodegenerativediseases.immunology129,154-169(2010).25.evans,n.p.,misyak,s.a.,robertson,j.l.,bassaganya-riera,j.&grange,r.w.immune-mediatedmechanismspotentiallyregulatethediseasetime-courseofduchennemusculardystrophyandprovidetargetsfortherapeuticintervention,pm&r1,755-768(2009).26.agrawal,a.,sridharan,a.,prakash,s.&agrawal,h.dendriticcellsandaging:consequencesforautoimmu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34s-39s.在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其结合项以其非限制含义用来指代包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，用不定冠词“a(一)”或“an(一)”提及要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文清楚要求存在且仅存在一个要素。因此，不定冠词“a”或“an”通常指“至少一个”。本文件提及的每个申请和专利，以及上述申请和专利每一篇中引用或参考的每个文件，包括在每个申请和专利(“申请引用文件”)的进行过程中，以及申请和专利的每一篇以及申请引用文件中的任一篇中引用或提及的任何产品的任何制造商说明书或目录均通过引用并入本文中。此外，本文中引用的所有文件，以及本文中引用的文件中所引用或参考的所有文件，以及本文中引用或提及的任何产品的任何制造商说明书或目录均通过引用并入到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，本发明描述的方法和系统的各种修改和变型对于本领域技术人员是明显的。虽然已经结合具体的优选实施方式对本发明进行了描述，但是应理解的是如要求保护的本发明不应被不适当地限制于这样的具体实施方式。实际上，对于分子生物学或相关领域技术人员明显的用于实施本发明的所述模式的各种修改均旨在落入权利要求的范围内。当前第1页12当前第1页12