用于提高过继细胞免疫疗法效力的组合物和方法与流程

对相关申请的交叉引用

本申请要求在35u.s.c.§119(e)下的对2014年10月27日提交的美国临时申请62/069,168的利益，所述申请通过引用完整地结合于此。

政府利益声明

本发明的进行得到了由国立健康研究院(nationalinstitutesofhealth)给予的资助号ca114536，ai053193和p51-od010425的政府支持。美国政府对此发明享有某些权力。

背景

本公开总体涉及用于增强或提高免疫疗法效力的组合物和方法。更具体地，本公开涉及联合使用表达抗原结合蛋白(例如，嵌合抗原受体)的t细胞和被修饰成表达与修饰的t细胞的抗原结合蛋白特异性结合的抗原的细胞(如造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合)以促进用于治疗与靶抗原的表达相关的疾病或病症，如癌症的过继细胞免疫疗法。

相关技术描述

通过基因转移将肿瘤靶向受体引入t细胞中允许快速产生来自任何癌症患者的肿瘤特异性t细胞以用于过继t-细胞治疗。一种有希望的策略包括用由对肿瘤细胞表面分子具有特异性并且与一种或多种t-细胞信号转导分子相连的单链抗体或其他结合结构域组成的合成嵌合抗原受体(car)改造t细胞(turtle等，curr.opin.immunol.24：633，2012；barrett等，annu.rev.med.65：10.1，2014；sadelain等，cancerdiscovery3：388，2013)。最近使用对b细胞恶性肿瘤上的cd19分子具有特异性的car-修饰的t细胞(car-t细胞)的试验显示在患有晚期疾病的患者的亚组中的显著的肿瘤消退(barrett等，2014；sadelain等，2013；kalos等，sci.transl.med.3：95ra73，2011；kochenderfer和rosenberg，nat.rev.clin.oncol.10：267，2013)。将该疗法扩展至常见的上皮癌症提出若干挑战，包括鉴定可以被t细胞安全地靶向的肿瘤细胞上表达的分子。这被严重和甚至是致命的毒性所强调，据观察所述毒性是由于car疗法对表达靶分子的正常细胞的上靶/脱肿瘤作用所致(lamers等，mol.ther.21：904，2013；morgan等，mol.ther.18：843，2010)。此外，能够鉴定指示其在体内存活和发挥功能的能力的t细胞的性质仍然是重要的研究领域。

显然需要备选的组合物和方法用于增强或促进针对各种癌症(如白血病和肿瘤)的过继细胞免疫疗法。本文公开的实施方案解决了该需求并且提供了其他相关优点。

附图简述

图1a-1d显示猕猴(rhesusmacaque)ror1的功能和表征。(a)被修饰成表达具有人或猕猴4-1bb和cd3ζ结构域的r12-ror1car的猕猴t细胞的功能。(b)使用tcd19标志物的ror1car-修饰的cd4⁺和cd8⁺t细胞的纯度和表型的流式细胞分析。数据显示对tcd19的选择前后和对cd4(上图)或cd8(下图)的选择后的未转导的t细胞(模拟)，转导的t细胞的表型。所有样品对cd3⁺细胞门控(gated)。(c)4小时细胞毒性测定中cd4⁺和cd8⁺ror1car-t细胞针对⁵¹cr标记的k562/ror1或k562细胞的细胞溶解活性。(d)如方法中所述一式三份地将5x10⁴ror1car-t细胞与k562/ror1细胞或pma/离子霉素或单独的培养基共培养24小时后获得的上清的luminex细胞因子测定。培养基对照样品中的细胞因子水平在检测水平以下。b-d，显示来自猕猴a13002的数据，其代表3只动物中的独立实验。

图2a-2e显示ror1car-t细胞的毒性和体内持久性的监测。(a)在t-细胞灌输前以及在t-细胞灌输后指定的日子的体重和血清化学。灰色阴影区表示猕猴特有的各参数的正常范围。(b)使用猕猴特异性多路细胞因子测定在灌输前后测量血浆细胞因子水平。(c)在ror1car-和对照egfrt⁺t细胞的灌输之前及之后指定的日子获得pbmc。在用对cd3，cd4，cd8，和cd19或对egfrt具有特异性的mab染色后通过流式细胞术确定cd3⁺cd4⁺亚组和cd3⁺cd8⁺亚组内转移的t细胞的频率(％)。(d)在可信任的临床实验室中，在指定的日子，通过流式细胞术测量并且基于cbc的结果计算的外周血中r12-ror1car⁺和egfrt⁺t细胞的绝对数目。(e)自在指定的日子获得的pbmc样品分离dna并且通过实时qpcr(taqman)检测转基因载体特异性序列的存在。

图3a-3d显示r12-ror1car-t细胞的体内迁移和功能。(a)将在t-细胞灌输前和在t-细胞灌输后的第5天获得的bm和ln样品用对cd3，cd4，cd8，和cd19或对egfrt特异的mab染色，并且在对cd3⁺cd4⁺或cd3⁺cd8⁺t细胞门控后通过流式细胞术检查。(b)检测bm中的ror1⁺b-细胞前体。在灌输前以及在灌输后第5天获得bm样品并且通过流式细胞术检测表达ror1的cd19⁺cd45^intermediateb细胞亚组的存在。(c)通过用对cd19，cd3，cd4，和cd8特异的mab染色以及用以检测cd19⁺cd3^-b细胞的流式细胞术确定的t-细胞灌输前后获得的外周血样品中的cd19⁺b细胞的绝对数目。基于同时获得的并且在可信任的临床实验室中测定的cbc上的淋巴细胞计数确定绝对数目。(d)cd107a脱粒测定。在灌输前以及在灌输后的第7天获得pbmc，用k562/rori细胞，培养基，或pma和离子霉素体外刺激，并且通过流式细胞术检测cd107a的表达，如方法中所述。培养的ror1car-t细胞充当阳性对照。

图4a-4e显示以高细胞剂量提供的ror1car-t细胞的持久性，迁移，和安全性。(a)t细胞灌输的示意图。以5x10⁸/kg的总剂量过继转移自体ror1car-t细胞。以相等的剂量施用对照tcd34⁺基因标记的t细胞。在t-细胞灌输前和t-细胞灌输后第3天获得bm和ln样品。(b)在t-细胞灌输前和t-细胞灌输后第1天自猕猴a13011和a13002获得的pbmc的流式细胞分析。(c)在用对cd3，cd4，cd8，和cd19或tcd34特异的mab染色后确定cd3⁺cd4⁺亚组和cd3⁺cd8⁺亚组内的转移的t细胞的频率(％)。c，pbmc，bm，和ln样品在t-细胞灌输后第3天自两种猕猴获得，用对cd3，cd4，cd8，和cd19或tcd34特异的mab染色，并且在对cd3⁺cd4⁺或cd3⁺cd8⁺细胞门控后通过流式细胞术检测。各动物的各亚组中的ror1car和对照tcd34标记的t细胞的频率显示在柱状图中。(d)在ror1car-t细胞前后的bm中的ror1⁺b-细胞前体的频率。在ror1car-t细胞转移前以及在ror1car-t细胞转移后3天获得的bm样品通过流式细胞术检测表达ror1的cd19⁺cd45^intermediateb-细胞的存在。显示的是对cd19⁺细胞门控的猕猴a13011的代表性染色。(e)ln中ror1⁺b细胞的频率。在t-细胞灌输前以及在t-细胞灌输后3天获得ln样品，用对cd19，cd45，和ror1或同种型特异的mab染色，并且通过流式细胞术检测ror1⁺cd45⁺细胞在cd19⁺亚组内的存在。显示的是来自猕猴a13011的数据。

图5a-5d显示体内ror1+t细胞(t-apc)激发对转移的ror1car-t细胞的作用。(a)pbmc样品在指定的日子获得自a13011和a13002并且在用对cd3，cd4，cd8，和cd19或cd34特异的mab染色后通过流式细胞术检测。在可信任的临床实验室中确定cbc。显示的是cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺亚组中的外周血中的ror1car⁺和tcd34⁺t细胞的绝对数目。(b)t-apc激发后血液中ror1car-t细胞绝对数目的倍数变化。血液的cd3⁺cd8⁺t细胞和cd19⁺cd8⁺t细胞数目/μl通过流式细胞术在t-apc施用之前并且在t-apc施用之后指定的日子测量。数据显示在t-apc施用后内源未标记的cd4⁺和cd8⁺t细胞，r12ror1carcd4⁺和cd8⁺t细胞，和tcd34标记的cd4⁺和cd8⁺t细胞的绝对数目相对基线的倍数增加。(c)自具有持续性ror1car-t细胞的动物(a13011)在第1，5和7天获得的pbmc样品中t-apc灌输前后tror1⁺t细胞的存在。将pbmc用抗-cd3和抗-ror1mab染色。(d)自没有ror1car-t细胞的动物(a12022)在第1，5和7天获得的pbmc样品中t-apc灌输前后tror1⁺t细胞的存在。

发明详述

在一方面，本公开提供用于提高，增大或增强过继细胞免疫疗法效力或治疗过增生疾病的组合物和方法，其是通过向人受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含修饰的人t细胞的群体，所述修饰的人t细胞包含编码抗原结合蛋白(例如，嵌合抗原受体，car)的核酸分子，其中所述抗原结合蛋白包含被布置在胞外结合组分和胞内效应器组分之间的疏水部分；和修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合的群体，所述修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合包含编码被抗原结合蛋白的胞外结合组分特异性识别的抗原的核酸分子。

在详述本公开之前，有助于对其理解的是提供本文中所用的某些术语的定义。另外的定义被陈述于本公开的全文中。

除非另外说明，在本说明书中，任何浓度范围，百分比范围，比率范围，或整数范围被理解为包括所述范围内的任意整数值，并且合适时，包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另外说明，本文中述及的涉及任何物理特征，如聚合物亚基，大小或厚度的任何数目范围被理解为包括所述范围内的任意整数。除非另外说明，当在本文中使用时，术语″约″表示指定范围，值或结构的±20％。应当理解本文中使用的术语″一个″和″一种″是指″一个或多个″所列举的组分。备选方案的使用(例如，″或″)应当被理解为是指备选项中的一个，两个或其任意组合。当在本文中使用时，术语″包括″，″具有″和″包含″被同义使用，所述术语及其变体意在被视为是非限制性的。

此外，应当理解衍生自本文中所述的结构和取代基的个体化合物，或多种组合的化合物的组，被本申请公开至与单独陈述各化合物或化合物的组相同的程度。因此，选择特定的结构或特定的取代基在本公开的范围内。

术语″基本上由……组成″将权利要求的范围限制到特定的材料或步骤，或限制到不实质影响本发明的基本特征的那些。例如，当结构域，区域，组件，或蛋白的氨基酸序列所包括的延长，缺失，突变，或其组合(例如，氨基端或羧基端或结构域之间的氨基酸)合并起来占所述结构域，区域，组件，或蛋白的长度的最多20％(例如，最多15％，10％，8％，6％，5％，4％，3％，2％或1％)并且基本上不影响(即，减小的活性不超过50％，如不超过40％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，或1％)所述结构域，区域，组件，或蛋白的活性(例如，结合蛋白的靶结合亲和性)时，蛋白结构域，区域或组件(例如，结合结构域，铰链区，接头组件)或蛋白(其可以具有一个或多个结构域，区域，或组件)″基本上由″特定的氨基酸序列″组成″。

当在本文中使用时，″造血祖先细胞″是这样的细胞，其来源于造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟的细胞类型(例如，免疫系统细胞)。示例性的造血祖先细胞包括具有cd24^lolin^-cd117⁺表型的那些或在胸腺中发现的那些(被称为祖先胸腺细胞)。

″造血干细胞″是指未分化的造血细胞，其能够在体内自我更新，在体外基本上无限地增殖，并且能够分化成其他细胞类型，包括t细胞系的细胞。造血干细胞可以例如分离自胎儿肝，骨髓，脐带血。

″胚胎干细胞″或″es细胞″或″esc″是指未分化的胚胎干细胞，其能够整合到发育的胚胎的生殖系中并且成为其部分。胚胎干细胞能够分化成造血祖先细胞，和任何组织或器官。适用于本文中的用途的胚胎干细胞包括来自以下的细胞：j1es细胞系，129jes细胞系，鼠干细胞系d3(美国模式生物保藏中心)，来源于129/sv小鼠的r1或e14k细胞系，来源于balb/c和c57b1/6小鼠的细胞系，和人胚胎干细胞(例如，来自wicellresearchinstitute，wi；或escellinternational，melbourne，australia)。

当在本文中使用时，″免疫系统细胞″表示源自骨髓中的造血干细胞的任何免疫系统细胞，其产生两种主要种系，骨髓祖先细胞(其产生骨髓细胞如单核细胞，巨噬细胞，树突细胞，巨核细胞和粒细胞)和淋巴祖先细胞(其产生淋巴细胞如t细胞，b细胞和自然杀伤(nk)细胞)。示例性的免疫系统细胞包括cd4+t细胞，cd8+t细胞，cd4-cd8-双阴性t细胞，γδt细胞，调节性t细胞，天然杀伤细胞，和树突细胞。巨噬细胞和树突细胞可被称为″抗原递呈细胞″或″apc″，其是在apc表面上的主要组织相容性复合体(mhc)受体与t细胞表面上的tcr相互作用时，可以激活t细胞的专门细胞。备选地，任何造血干细胞或免疫系统细胞都可以通过引入表达被tcr或另一种抗原结合蛋白(例如，car)识别的抗原的核酸分子而被转化为apc。

当在本文中使用时，术语″宿主″是指为了利用异源或外源核酸分子进行遗传修饰以制备目的多肽(例如，癌症抗原特异性car)而被靶向的细胞(例如，t细胞，造血祖先细胞)或微生物。在某些实施方案中，宿主细胞可以任选地已经具有或被修饰成包括给予与异源或外源蛋白的生物合成相关或不相关的所需性质的其他遗传修饰(例如，包括可检测的标志物；缺失的，改变的或截短的cd34；增加的共刺激因子表达)。在某些实施方案中，宿主细胞是转导有异源或外源核酸分子的人造血祖先细胞，所述异源或外源核酸分子编码与疾病相关并且被抗原结合蛋白(例如，car)特异性结合的抗原。

″t细胞″是在胸腺中成熟并且产生t细胞受体(tcr)的免疫系统细胞。t细胞可以是幼稚(不暴露于抗原；与tcm相比，cd62l，ccr7，cd28，cd3，cd127和cd45ra表达增加，并且cd45ro表达减少)，记忆型t细胞(tm)(经历并且长时间存在的抗原)，和效应器细胞(经历的抗原，细胞毒性的)。tm可被进一步分成亚组：中央记忆型t细胞(tcm，与幼稚t细胞相比，cd62l，ccr7，cd28，cd127，cd45ro和cd95表达增加，并且cd54ra表达减少)和效应器记忆型t细胞(tem，与幼稚t细胞或tcm相比，cd62l，ccr7，cd28，cd45ra表达减少，并且cd127表达增加)。效应器t细胞(te)是指经历抗原的cd8+细胞毒性t淋巴细胞，其与tcm相比，cd62l，ccr7，cd28的表达减少，并且对粒酶和穿孔素是阳性的。

″结合组分″(也被称为″结合区″或″结合部分″)，当在本文中使用时，是指能够特异性且非共价地关联，联合或结合靶分子(例如，cd19，cd20，egfrviii，gd2，muc16，ror1，间皮素，pd-l1，pd-l2，psma，癌症相关新抗原)的肽，寡肽，多肽或蛋白。结合结构域包括对于生物分子，分子复合体(即，包含两种以上生物分子的复合体)或其他目的靶标的任何天然存在的，合成的，半合成的或重组制备的结合配偶体。示例性的结合结构域包括单链免疫球蛋白可变区(例如，sctcr，scfv)，受体胞外结构域，配体(例如，细胞因子，趋化因子)或针对结合生物分子，分子复合体或其他目的靶标的具体能力选择的合成的多肽。

当在本文中使用时，″特异性结合″或″具有特异性″是指结合蛋白(例如，car或tcr)或结合组分(或其融合蛋白)与靶分子结合或联合，亲和力或ka(即，特定结合相互作用的平衡结合常数，单位为1/m)等于或大于10⁵m^-1(对于该结合反应，等于结合速率(on-rate)[kon]与解离速率(off-rate)[koff]之比)，同时不显著地与样品中的任何其他分子或组分相结合或联合。结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)可以被分类为″高亲和性″结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)或″低亲和性″结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)。″高亲和性″结合蛋白或结合结构域是指ka为至少10⁷m^-1，至少10⁸m^-1，至少10⁹m^-1，至少10¹⁰m^-1，至少10¹¹m^-1，至少10¹²m^-1或至少10¹³m^-1的那些结合蛋白或结合结构域。″低亲和性″结合蛋白或结合结构域是指ka高达10⁷m^-1，高达10⁶m^-1，高达10⁵m^-1的那些结合蛋白或结合结构域。备选地，亲和性可以被定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)，其单位为m(例如，10^-5m至10^-13m)。

已知多种测定用于鉴定特异性结合特定靶标的本公开的结合结构域，以及确定结合结构域或融合蛋白亲和力，如蛋白质印迹法，elisa，分析超速离心，光谱法和表面等离子共振分析(参见，例如，scatchard等，ann.n.y.acad.sci.51：660，1949；wilson，science295：2103，2002；wolff等，cancerres.53：2560，1993；和美国专利号5,283,173，5,468,614，或对应申请)。

当在本文中使用时，″铰链区″或″铰链″是指(a)免疫球蛋白铰链序列(其由例如上部或核心区组成)或其功能变体，(b)ii型c-凝集素结构域间(茎)区或其功能变体，或(c)分化簇(cd)分子茎区或其功能变体。当在本文中使用时，″野生型免疫球蛋白铰链区″是指在抗体重链中发现的天然存在的被插入ch1和ch2结构域(对应igg，iga和igd)之间并将两者连接或被插入ch1和ch3结构域(对于ige和igm)之间并将两者连接的上部和中间铰链氨基酸序列。在某些实施方案中，铰链区是人铰链区，并且在特别的实施方案中，包含人igg铰链区。

当在本文中使用时，″疏水部分″表示在细胞膜中热稳定并且长度通常为约15个氨基酸至约30个氨基酸的具有三维结构的任何氨基酸序列。疏水结构域的结构可以包括α螺旋，β桶，β片层，β螺旋，或其任意组合。

当在本文中使用时，″效应器组分″或″效应器结构域″是在收到合适的信号时，融合蛋白或受体的可以直接或间接促进细胞中的生物学或生理学反应的胞内部分。在某些实施方案中，效应器组分是蛋白，融合蛋白或蛋白复合体的接收结合时的信号的部分，或其直接结合靶分子，这触发来自效应器结构域的信号。当效应器结构域含有一个或多个信号转导结构域或基序(如基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam))时，其可以直接促进细胞响应。在其他实施方案中，效应器组分通过结合一种或多种另外的直接促进细胞响应的蛋白而间接促进细胞响应。

″接头″是指这样的氨基酸序列，其连接两个蛋白，多肽，肽，结构域，区域或基序，并且可以提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔功能以使所得的多肽保持与靶分子的特异性结合亲和性(例如，sctcr)或保持信号转导活性(例如，tcr复合体)。在某些实施方案中，接头由约两个至约35个氨基酸，例如，或约四个至约20个氨基酸或约八个至约15个氨基酸或约15个至约25个氨基酸组成。在另外的实施方案中，接头是将重链免疫球蛋白可变区连接至轻链免疫球蛋白可变区或连接t细胞受体vα/β和cα/β链(例如，vα-cα，vβ-cβ，vα-vβ)或将各vα-cα，vβ-cβ，vα-vβ对连接至铰链或疏水结构域的可变区接头。

″连接氨基酸″或″连接氨基酸残基″是指多肽的两个相邻的基序，区域或结构域之间如结合结构域和相邻的恒定结构域之间或tcr链和相邻的自切割肽之间的一个或多个(例如，约2-10个)氨基酸残基。连接氨基酸可以产生自融合蛋白的构建体设计(例如，编码融合蛋白的核酸分子的构建期间使用限制性酶位点产生的氨基酸残基)。

″改变的组分″或″改变的结构域″或″改变的蛋白″是指与野生型基序，区域，结构域，肽，多肽或蛋白(例如，野生型胞内结构域cd3ζ，cd134，cd137)的序列同一性为至少85％(例如，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％)的基序，区域，结构域，肽，多肽或蛋白。

当在本文中使用时，修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合中包含的核酸分子编码的″抗原″是指与疾病或病症(例如，癌症)相关并且作为免疫疗法靶标的任何生物学分子(例如，蛋白，碳水化合物)。在某些实施方案中，抗原可以是抗-独特型抗体或其抗-独特型抗体结合片段，或对修饰的t细胞表达的抗原结合蛋白(例如，car)具有特异性的抗体或其抗体结合片段。示例性的抗原包括α-甲胎蛋白(afp)，b7h4，btla，cd3，cd19，cd20，cd25，cd22，cd28，cd30，cd40，cd44v6，cd52，cd56，cd79b，cd80，cd81，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，cd151，cd276，ca125，cea，ceacam6，c-met，ct-7，ctla-4，egfr，egfrviii，erbb2，erbb3，erbb4，epha2，flt1，flt4，frizzled，o-乙酰基-gd2，gd2，ghrhr，ghr，gitr，gp130，hvem，igf1r，il6r，kdr，l1cam，lewisa，lewisy，ltβr，lifrβ，lrp5，mage，间皮素，muc1，ny-eso-1，癌症特异性新抗原，osmrβ，pd1，pd-l1，pd-l2，psma，ptch1，rank，robo1，ror1，tert，tgfbr2，tgfbr1，tlr7，tlr9，tnfrsf4，tnfr1，tnfr2，酪氨酸酶，tweak-r，或wt-1。

″t细胞受体″(tcr)是指能够特异性结合与mhc受体结合的抗原肽的免疫球蛋白超家族成员(具有可变结合结构域，恒定结构域，跨膜区域，和短胞质尾部；参见，例如，janeway等，immunobiology：theimmunesysteminhealthanddisease，3^rded.，currentbiologypublications，p.4：33，1997)。tcr可以在细胞表面上或以可溶形式发现并且通常由具有α和β链(也被分别称为tcrα和tcrβ)或γ和δ链(也被分别称为tcrγ和tcrδ)的异源二聚体组成。与免疫球蛋白一样，tcr链(例如，α-链，β-链)的胞外部分含有两个免疫球蛋白结构域，n-端的可变结构域(例如，α-链可变结构域或vα，β-链可变结构域或vβ；典型地是基于kabat编号的氨基酸1至116(kabat等，″sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，usdept.healthandhumanservices，publichealthservicenationalinstitutesofhealth，1991，5^thed.))，和邻近细胞膜的一个恒定结构域(例如，α-链恒定结构域或cα，典型地是基于kabat的氨基酸117至259，β-链恒定结构域或cβ，典型地是基于kabat的氨基酸117至295)。同样与免疫球蛋白一样，所述可变结构域含被框架区(fr)分隔的互补决定区(cdr)(参见，例如，jores等，proc.nat′lacad.sci.u.s.a.87：9138，1990；chothia等，emboj.7：3745，1988；还参见lefranc等，dev.comp.immunol.27：55，2003)。在某些实施方案中，tcr在t细胞(或t淋巴细胞)上被发现并且与cd3复合体相结合。本公开中的tcr的来源可以来自各种动物物种，如人，小鼠，大鼠，兔或其他哺乳动物。

在本领域中，已知″cd3″是六条链的多蛋白复合体(参见，abbas和lichtman，2003；janeway等，p172和178，1999)。在哺乳动物中，所述复合体包含cd3γ链，cd3δ链，两条cd3ε链，和cd3ζ链的同源二聚体。cd3γ，cd3δ和cd3ε链是含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。cd3γ，cd3δ和cd3ε链的跨膜区域带负电，该特征允许这些链与带正电的t细胞受体链结合。cd3γ，cd3δ和cd3ε链的胞内尾部各自含有单个保守的基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam，而各cd3ζ链具有三个。不希望受制于理论，据信，itam对于tcr复合体的信号转导能力是重要的。当在本文中使用时，cd3可以来自各种动物物种，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物。

当在本文中使用时，″tcr复合体″是指通过cd3与tcr的结合形成的复合体。例如，tcr复合体可以由一个cd3γ链，一个cd3δ链，两个cd3ε链，cd3ζ链的同源二聚体，一个tcrα链，和一个tcrβ链组成。备选地，tcr复合体可以由一个cd3γ链，一个cd3δ链，两个cd3ε链，cd3ζ链的同源二聚体，一个tcrγ链，和一个tcrδ链组成。

当在本文中使用时，″tcr复合体的组分″是指tcr链(即，tcrα，tcrβ，tcrγ或tcrδ)，cd3链(即，cd3γ，cd3δ，cd3ε或cd3ζ)，或由两个以上tcr链或cd3链形成的复合体(例如，tcrα和tcrβ的复合体，tcrγ和tcrδ的复合体，cd3ε和cd3δ的复合体，cd3γ和cd3ε的复合体，或tcrα，tcrβ，cd3γ，cd3δ，和两个cd3ε链的亚tcr复合体)。

当在本文中使用时，″核酸″或″核酸分子″是指以下任一：脱氧核糖核酸(dna)，核糖核酸(rna)，寡核苷酸，例如通过聚合酶链反应(pcr)或通过体外翻译产生的片段，和通过连接，剪切，核酸内切酶作用或核酸外切酶作用中任一产生的片段。在某些实施方案中，本公开的核酸通过pcr产生。核酸可以由作为天然存在的核苷酸(如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)，天然存在的核苷酸的类似物(例如，α-对映体形式的天然存在的核苷酸)或两者的组合的单体组成。修饰的核苷酸可以具有在糖部分，或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有修饰或代替糖部分，或嘧啶或嘌呤碱基部分。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此种连接的类似物相连。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，苯胺基硫代磷酸酯，苯胺基磷酸酯，氨基磷酸酯等。核酸分子可以是单链或双链的。

术语″分离的″表示物质离开其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然存在的)。例如，存在于活体动物中的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中共存的物质中的一些或全部分离的相同的核酸或多肽是分离的。此种核酸可以是载体的部分和/或此种核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞溶菌产物)的部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是所述核酸或多肽的天然环境的部分。术语″基因″表示参与制备多肽链的dna区段；其包括在编码区之前和之后的区域″前导和尾部″以及个体编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

当在本文中使用时，术语″重组″是指通过引入外源核酸分子而被修饰的细胞，微生物，核酸分子或载体，或是指被改变以致内源核酸分子或基因的表达受控，去调或成为组成型的细胞或微生物，其中此种改变或修饰可以通过基因工程引入。基因改变可以包括，例如，引入编码一种或多种蛋白或酶的核酸分子(其可以包括表达控制元件，如启动子)，或其他核酸分子添加，缺失，置换，或对细胞遗传物质的其他功能破坏或增加的修饰。示例性的修饰包括来自参比或亲本分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的那些。

当在本文中使用时，″突变″是指分别与参比或野生型核酸分子或多肽分子相比的核酸分子或多肽分子的序列变化。突变可能导致若干不同类型的序列变化，包括核苷酸或氨基酸的置换，插入或缺失。在某些实施方案中，突变是一个或三个密码子或氨基酸的置换，1至约5个密码子或氨基酸的缺失，或其组合。

在本领域中，认为″保守性置换″是一种氨基酸置换成具有类似性质的另一种氨基酸。示例性的保守性置换是本领域中共知的(参见，例如，wo97/09433，第10页；lehninger，biochemistry，2^ndedition；worthpublishers，inc.ny，ny，pp.71-77，1975；lewin，genesiv，oxforduniversitypress，nyandcellpress，cambridge，ma，p.8，1990)。

术语″构建体″是指含有重组核酸的任意多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如，细菌载体，病毒载体)中或可以整合到基因组中。″载体″是能够转运另一种核酸的核酸分子。载体可以是，例如，质粒，黏粒，病毒，rna载体或直链或环形dna或rna分子，其可以包括染色体，非染色体，半合成或合成的核酸。示例性的载体是能够自复制(游离型载体)或表达与其相连的核酸的载体(表达载体)。

病毒载体包括反转录病毒，腺病毒，细小病毒(例如，腺相关病毒)，冠状病毒，负链rna病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)，弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(例如，麻疹和sendai)，正链rna病毒如微小核糖核酸病毒和α病毒，和双链dna病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1和2型，epstein-barr病毒，巨细胞病毒)，和痘病毒(例如，牛痘，鸟痘和金丝雀痘)。其他病毒包括例如norwalk病毒，囊膜病毒，黄病毒，呼肠孤病毒，乳多泡病毒，嗜肝性dna病毒，和肝炎病毒。反转录病毒的实例包括鸟造白细胞组织增生肉瘤，哺乳动物c-型，b-型病毒，d型病毒，htlv-blv组，慢病毒，泡沫病毒(coffin，j.m.，retroviridae：thevirusesandtheirreplication，infundamentalvirology，thirdedition，b.n.fields等，eds.，lippincott-ravenpublishers，philadelphia，1996)。

当在本文中使用时，″慢病毒载体″表示用于基因递送的基于hiv的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的，具有较大的包封能力，并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常在将三种(包封，包膜和转移)以上的质粒瞬时转染到生产细胞中后产生。与hiv一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。在进入后，病毒rna进行反转录，其由病毒反转录酶复合体介导。反转录的产物是双链线性病毒dna，其是病毒整合到受感染细胞的dna中的底物。

术语″可操作相连″是指单个核酸片断上的两个以上的核酸分子结合以致功能受彼此影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列是可操作相连的。″不相连″表示相关的遗传元件彼此不紧密结合并且功能互不影响。

当在本文中使用时，″表达载体″是指dna构建体，所述dna构建体包含与合适的控制序列可操作相连的核酸分子，所述控制序列能够影响所述核酸分子在合适宿主中的表达。此种控制序列包括影响转录的启动子，任选的控制此种转录的操纵子序列，编码合适的mrna核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。所述载体可以是质粒，噬菌体颗粒，病毒，或仅是可能的基因组插入物。在转化到合适的宿主中后，所述载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥功能，或在一些情况中可以整合到基因组本身中。在本说明书中，″质粒″，″表达质粒″，″病毒″和″载体″通常被可互换地使用。

当在本文中使用时，术语″表达″是指基于基因的核酸序列制备多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。

在将核酸序列插入细胞中的语境中，术语″引入″表示″转染″或‘转化″或″转导″并且包括对将核酸序列整合到真核或原核细胞中的提及，其中所述核酸分子可以被整合到细胞的基因组中(例如，染色体，质粒，质体，或线粒体dna)，转化成自复制子，或被瞬时表达(例如，转染的mrna)。

当在本文中使用时，″异源″或″外源″核酸分子，构建体或序列是指这样的核酸分子或核酸分子的部分，其对于宿主细胞来说并不是自然的，但是可以与来自宿主细胞的核酸分子或核酸分子的部分具有同源性。异源或外源核酸分子，构建体或序列的来源可以来自不同种属或物种。在某些实施方案中，通过例如缀合，转化，转染，电穿孔等将异源或外源核酸分子添加(即，非内源或天然)至宿主细胞或宿主基因组中，其中所添加的分子可以整合到宿主基因组中或作为染色体外遗传物质存在(例如，作为质粒或其他形式的自复制载体)，并且可以以多个拷贝存在。此外，″异源″是指由引入到宿主细胞中的外源核酸分子编码的非天然酶，蛋白或其他活性，即使宿主细胞编码同源蛋白或活性。

如本文中所述，可以将超过一种异源或外源核酸分子引入宿主细胞中，作为分开的核酸分子，作为多个分别受控的基因，作为多顺反子核酸分子，作为编码融合蛋白的单个核酸分子，或其任意组合。例如，如本文中公开的，宿主细胞可以被修饰成表达编码所需的抗原特异性结合蛋白(例如，car，tcrα和tcrβ)的两种以上的异源或外源核酸分子。当将两种以上的外源核酸分子引入宿主细胞中时，要理解的是，两种以上的外源核酸分子可以被引入作为单个的核酸分子(例如，在单个载体上)，在分开的载体上，在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中。提及的异源核酸分子或蛋白活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白活性的数目，而不是引入到宿主细胞中的分开的核酸分子的数目。

当在本文中使用时，术语″内源″或″天然″是指通常存在于宿主细胞中的基因，蛋白，或活性。此外，与亲本基因，蛋白或活性相比突变，过表达，改组(shuffled)，复制或以其他方式改变的基因，蛋白或活性仍被认为对所述特定的宿主细胞是内源的或天然的。例如，来自第一基因的内源控制序列(例如，启动子，翻译减弱序列)可以用于改变或调节第二天然基因或核酸分子的表达，其中第二天然基因或核酸分子的表达或调节不同于亲本细胞中的正常表达或调节。

术语″同源″或″同源物″是指在宿主细胞，物种或株系中发现或来源于其的分子或活性。例如，异源或外源核酸分子可以与天然的宿主细胞基因具有同源性，并且可以任选地具有改变的表达水平，不同的序列，改变的活性，或其任意组合。

当在本文中使用时，″序列同一性″是指在进行序列比对并且在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性，并且不认为任何保守置换是序列同一性的部分后，一条序列中与另一参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。百分比序列同一性值可以使用altschul等(1997)″gappedblastandpsi-blast：anewgenerationofproteindatabasesearchprograms″，nucleicacidsres.25：3389-3402所限定的ncbiblast2.0软件来产生，其中参数设定为缺省值。

当在本文中使用时，″过增生病症″是指与正常或没有病的细胞相比的过度生长或增殖。示例性的过增生病症包括肿瘤，癌症，肿瘤组织，癌，前恶性细胞，以及非肿瘤或非恶性过增生性病症(例如，腺瘤，纤维瘤，脂肪瘤，平滑肌瘤，血管瘤，再狭窄，以及自体免疫病如类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病，炎性肠病等)。

表达抗原结合蛋白或抗原的修饰的细胞

在某些方面，本公开提供过继细胞免疫疗法组合物，其包含修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合的群体，其中修饰的细胞的第一群体是包含编码抗原结合蛋白(例如，car)的核酸分子的t细胞，并且修饰的细胞的第二群体包含编码抗原(例如，癌症特异性抗原，抗-独特型抗体或其结合片段)的核酸分子。在这些实施方案中，抗原结合蛋白包含被布置在胞外结合组分和胞内效应器组分之间的疏水部分，并且胞外结合组分对由修饰的细胞的第二群体编码的抗原具有特异性。例如，抗原结合蛋白可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体。

这些组合物的一个优点在于可以将较低剂量的例如抗原特异性cart细胞施用于患者，然后施用(例如，同时或相继)表达被car识别的抗原的细胞的第二群体将加强过继免疫疗法的效果。另一个优点在于，加强效果也可以改善归巢以致细胞迁移至目标组织。表达car的t细胞和人工apc的组合的另一个优点是系统性加强过继免疫疗法的效果从而使更多的活性细胞在肿瘤位点处。

在某些其他方面，将包含编码抗原的核酸分子的修饰的造血祖先细胞施用于受试者，其中编码的抗原在调节启动子的控制下。修饰的造血祖先细胞将定位于目标组织并复制(例如，骨髓或淋巴结)。然后，在给受试者施用包含编码抗原结合蛋白(例如，car)的核酸分子的修饰的t细胞的第一群体后或与其同时，可以诱导扩大的修饰的造血祖先细胞中抗原的表达，其中引入的″apc″的数目远大于通过体外扩增和施用可获得的。在某些实施方案中，在施用前，被施用的细胞的第二群体被辐照。

在任意前述实施方案中，抗原结合蛋白包含结合组分，疏水部分和胞内效应器组分。例如，结合组分可以是抗体可变片段(fv)，tcr可变结构域，受体胞外结构域，或配体。在另外的实施方案中，结合组分是包含可变区接头的scfv或sctcr，如接头包含(glyxsery)n，其中x和y独立地是1至5的整数，并且n是1至10的整数。在另外的实施方案中，结合组分对以下各项具有特异性：α-甲胎蛋白(afp)，b7h4，btla，cd3，cd19，cd20，cd25，cd22，cd28，cd30，cd40，cd44v6，cd52，cd56，cd79b，cd80，cd81，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，cd151，cd276，ca125，cea，ceacam6，c-met，ct-7，ctla-4，egfr，egfrviii，erbb2，erbb3，erbb4，epha2，flt1，flt4，frizzled，o-乙酰基-gd2，gd2，ghrhr，ghr，gitr，gp130，hvem，igf1r，il6r，kdr，l1cam，lewisa，lewisy，ltβr，lifrβ，lrp5，mage，间皮素，muc1，ny-eso-1，癌症特异性新抗原，osmrβ，pd1，pd-l1，pd-l2，psma，ptch1，rank，robo1，ror1，tert，tgfbr2，tgfbr1，tlr7，tlr9，tnfrsf4，tnfr1，tnfr2，酪氨酸酶，tweak-r，或wt-1。

在另外的实施方案中，疏水部分是跨膜结构域，如cd4，cd8，cd28或cd27跨膜结构域。

在某些实施方案中，胞内效应器组分包含以下各项的胞内区：cd3ε，cd3δ，cd3ζ，cd25，cd27，cd28，cd79a，cd79b，cd134，cd137，card11，dap10，fcrα，fcrβ，fcrγ，fyn，hvem，icos，lck，lag3，lat，lrp，nkg2d，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2，ryk，slamf1，slp76，ptα，tcrα，tcrβ，trim，zap70，ptch2，或其任意组合。在特别的实施方案中，胞内效应器组分包含cd3ζ以及cd27，cd28，cd134和cd137中的一个或多个，或胞内效应器组分包含lrp，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2，或ryk。

在任意前述实施方案中，修饰的细胞是免疫系统细胞，如cd4+t细胞，cd8+t细胞，cd4-cd8-双阴性t细胞，γδt细胞，调节性t细胞，天然杀伤细胞，树突细胞，或其任意组合。在某些实施方案中，t细胞是幼稚t细胞，中央记忆型t细胞，效应器记忆型t细胞，或其任意组合。例如，修饰的t细胞的第一群体可以基本上由cd4+t细胞，cd8+t细胞，或cd4+和cd8+t细胞两者组成，并且修饰的细胞的第二群体包含修饰的人造血祖先细胞。在其他实例中，修饰的t细胞的第一群体可以基本上由cd4+t细胞，cd8+t细胞，或cd4+和cd8+t细胞两者组成，并且修饰的细胞的第二群体包含修饰的人免疫系统细胞，如基本上由cd4+t细胞，cd8+t细胞，或cd4+和cd8+t细胞两者组成的细胞。

在任意前述实施方案中，修饰的细胞群体通过使用例如病毒载体，如慢病毒载体或γ-反转录病毒载体被离体重组修饰。在另外的实施方案中，被修饰的细胞群体是同基因的，同种异基因的，或自体的细胞。在任意前述实施方案中，修饰的细胞群体被进一步与药用载体，稀释剂，或赋形剂配制在一起，如本文中所述。

本领域技术人员已知的多种标准指示在肽或多肽中的特定位置处被置换的氨基酸是否是保守的(或类似的)。例如，类似氨基酸或保守氨基酸置换是这样的一种，其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基代替。类似的氨基酸可以包括在以下分类中：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)；具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)；具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)，和具有芳香性侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸)。脯氨酸，被认为更难以分类，与具有脂肪族侧链的氨基酸(例如，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，和丙氨酸)共享性质。在某些情况中，将谷氨酰胺置换成谷氨酸或将天冬酰胺置换成天冬氨酸可以被认为是类似的置换，原因在于谷氨酰胺和天冬酰胺分别是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺衍生物。如本领域中理解的，两个多肽之间的″相似性″通过将一个多肽的氨基酸序列和置换其的保守氨基酸与第二多肽的序列比较来确定(例如，使用geneworks，align，blast算法，或本文中描述以及本领域中实施的其他算法)。

在某些实施方案中，抗原特异性结合蛋白结合组分的氨基酸序列与原野生型序列具有至少约90％或至少约95％同一性，前提是(a)至少三或四个cdr没有突变并且(b)具有突变的cdr仅有多至两个或三个氨基酸置换，多达连续的五个氨基酸缺失，或其组合。

在某些实施方案中，将编码抗原结合蛋白或抗原的核酸分子用于转染/转导宿主细胞(例如，造血干细胞，t细胞)以用于过继转移治疗。目前用所需核酸转染/转导t细胞的方法的进展已被描述(例如，us2004/0087025)为具有使用所需抗原特异性的t-细胞的过继转移方法(例如，schmitt等，hum.gen.20：1240，2009；dossett等，mol.ther.17：742，2009；till等，blood112：2261，2008；wang等，hum.genether.18：712，2007；kuball等，blood109：2331，2007；us2011/0243972；us2011/0189141；leen等，ann.rev.immunol.25：243，2007)，以致基于本文中的教导，考虑这些方法适用于本文公开的实施方案。

如本文中所述的抗原结合蛋白或组分可以根据用于测定t细胞活性的本领域接收的多种方法中的任一种在功能上被表征，所述方法包括测定t细胞结合，激活或诱导并且还包括测定抗原特异性的t细胞响应。实例包括测定t细胞增殖，t细胞细胞因子释放，抗原特异性t细胞刺激，mhc限制的t细胞刺激，ctl活性(例如，通过检测自预载靶细胞的⁵¹cr释放)，t细胞表型标志物表达的变化，和t-细胞功能的其他量度。用于进行这些和类似测定的方法可以被发现于例如lefkovits(immunologymethodsmanual：thecomprehensivesourcebookoftechniques，1998)。还参见currentprotocolsinimmunology；weir，handbookofexperimentalimmunology，blackwellscientific，boston，ma(1986)；mishell和shigii(eds.)selectedmethodsincellularimmunology，freemanpublishing，sanfrancisco，ca(1979)；green和reed，science281：1309(1998)及其中引用的参考文献)。

细胞因子水平可以根据本文中所述的和本领域中实施的方法确定，所述方法包括例如，elisa，elispot，胞内细胞因子染色，和流式细胞术及其组合(例如，胞内细胞因子染色和流式细胞术)。免疫应答的抗原特异性引发或刺激所产生的免疫细胞增殖和克隆扩大可以通过以下方式确定：分离淋巴细胞，如外周血细胞或来自淋巴结的细胞的样品中的循环淋巴细胞，用抗原刺激所述细胞，并且测量细胞因子生产，细胞增殖和/或细胞生存力，如通过整合氚化胸苷或非放射性测定，如mtt测定等。本文中所述的免疫原对th1免疫应答和th2免疫应答之间的平衡的作用可以例如通过确定th1细胞因子如ifn-γ，il-12，il-2和tnf-β，和type2细胞因子如il-4，il-5，il-9，il-10和il-13的水平来检测。

编码抗原结合蛋白或抗原的多核苷酸

如本文中所述的分离的或重组的编码抗原结合蛋白如car，对抗原特异的高亲和性重组tcr，或针对抗原特异性结合组分的抗原或抗-独特型抗体的核酸分子可以根据分子生物学或多肽纯化领域的多种方法和技术生产和制备。用于重组制备抗原结合蛋白如car，对抗原特异的高亲和性重组tcr，或针对目的抗原特异性结合组分的抗原或抗-独特型抗体的表达载体的构建可以通过使用本领域中已知的任何合适的分子生物学工程改造技术实现，包括使用限制性核酸内切酶消化，连接，转化，质粒纯化，和dna测序，例如sambrook等(1989和2001版本；molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，ny)和ausubel等(currentprotocolsinmolecularbiology(2003))中所述。为了获得有效转录和翻译，各重组表达构建体中的多核苷酸包括至少一个合适的表达控制序列(也被称为调节性序列)，如前导序列并且特别是与编码免疫原的核苷酸序列可操作相连的启动子。在某些实施方案中，多核苷酸被进行密码子优化以用于在靶宿主细胞中的有效表达。

某些实施方案涉及编码本文中考虑的多肽(例如，嵌合抗原受体，高亲和重组tcr，对抗原结合蛋白特异的目的抗原和抗-独特型抗体)的核酸。本领域技术人员将理解，核酸可以是指任意形式的单链或双链dna，cdna或rna，并且可以包括核酸的彼此互补的正链和负链，包括反义dna，cdna和rna。还包括的是sirna，microrna，rna-dna杂合体，核酶，和dna或rna的其他各种天然存在的或合成的形式。

标准技术可以用于重组dna，肽和寡核苷酸合成，免疫测定和组织培养和转化(例如，电穿孔，脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据生产商的说明或如本领域中通常完成的或如本文中所述的进行。这些和相关技术和方法通常可以根据本领域中已知的和本文通篇引用和讨论的微生物学，分子生物学，生物化学，分子遗传学，细胞生物学，病毒学和免疫学技术中的各种总体和更具体的参考文献中所述的常规方法。参见，例如，sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，3ded.，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.；currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley和sons，2008年7月更新)；shortprotocolsinmolecularbiology：acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology，greenepub.associatesandwiley-interscience；glover，dnacloning：apracticalapproach，vol.i&ii(irlpress，oxforduniv.pressusa，1985)；currentprotocolsinimmunology(编辑：johne.coligan，adam.kruisbeek，davidh.margulies，ethanm.shevach，warrenstrober2001johnwiley&sons，ny，ny)；real-timepcr：currenttechnologyandapplications，编辑：julielogan，kirstinedwards和nicksaunders，2009，caisteracademicpress，norfolk，uk；anand，techniquesfortheanalysisofcomplexgenomes，(academicpress，newyork，1992)；guthrie和fink，guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology(academicpress，newyork，1991)；oligonucleotidesynthesis(n.gait，ed.，1984)；nucleicacidhybridization(b.hames&s.higgins，eds.，1985)；transcriptionandtranslation(b.hames&s.higgins，编辑，1984)；animalcellculture(r.freshney，编辑，1986)；perbal，apracticalguidetomolecularcloning(1984)；next-generationgenomesequencing(janitz，2008wiley-vch)；pcrprotocols(methodsinmolecularbiology)(park，编辑，3^rdedition，2010humanapress)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress，1986)；thetreatise，methodsinenzymology(academicpress，inc.，n.y.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.miller和m.p.calos编辑，1987，coldspringharborlaboratory)；harlow和lane，antibodies，(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1998)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayer和walker，编辑，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesi-iv(d.m.weir和ccblackwell，编辑，1986)；roitt，essentialimmunology，6thedition，(blackwellscientificpublications，oxford，1988)；embryonicstemcells：methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology)(kurstadturksen，编辑，2002)；embryonicstemcellprotocols：volumei：isolationandcharacterization(methodsinmolecularbiology)(kurstadturksen，编辑，2006)；embryonicstemcellprotocols：volumeii：differentiationmodels(methodsinmolecularbiology)(kurstadturksen，编辑，2006)；humanembryonicstemcellprotocols(methodsinmolecularbiology)(kursadturksen编辑，2006)；mesenchymalstemcells：methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology)(darwinj.prockop，donaldg.phinney，和brucea.bunnell编辑，2008)；hematopoieticstemcellprotocols(methodsinmolecularmedicine)(christophera.klug和craigt.jordan编辑，2001)；hematopoieticstemcellprotocols(methodsinmolecularbiology)(kevind.bunting编辑，2008)neuralstemcells：methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology)(lesliep.weiner编辑，2008)。

某些实施方案包括包含在载体中的核酸。本领域技术人员可以容易地确定适用于本文中公开的特定事实方案的载体。典型的载体可以包含能够转运与其相连的另一个核酸或能够在宿主生物体中复制的核酸分子。载体的一些实例包括质粒，病毒载体，黏粒等。一些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)，而其他载体可以在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中并且由此随宿主基因组一起复制。此外，一些载体能够指引与其可操作相连的基因的表达(这些载体可被称为″表达载体″)。根据相关的实施方案，要进一步理解的是，如果一种或多种试剂(例如，编码抗原结合蛋白如car，对抗原特异的高亲和重组tcr，或针对抗原特异性结合组分的抗原或抗-独特型抗体的多核苷酸，如本文中所述)被共同施用于受试者，各试剂可以位于分开的或相同的载体中，并且可以将多个载体(各自含有不同试剂相同试剂)引入至细胞或细胞群体或施用于受试者。

在某些实施方案中，本公开的编码抗原结合蛋白或抗原的核酸可以与载体的某些元件可操作相连。例如，影响其所连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列可以被可操作相连。表达控制序列可以包括合适的转录起始，终止，启动子和增强子序列；有效的rna加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和可能地增强蛋白分泌的序列。如果表达控制序列与目的基因是连续的，则其可以被可操作相连，并且表达控制序列反式或远距离作用从而控制目的基因。

在特别的实施方案中，重组表达载体被递送至合适的细胞，例如，造血干细胞，t细胞，抗原递呈细胞(例如，树突细胞)等。重组表达载体可以因此还包括，例如，淋巴组织特异性转录调节元件(tre)如b淋巴细胞，t淋巴细胞，或树突细胞特异性tre。淋巴组织特异性tre是本领域中已知的(参见，例如，thompson等，mol.cell.biol.12：1043，1992)；todd等，j.exp.med.177：1663，1993)；penix等，j.exp.med.178：1483，1993)。

除了载体以外，某些实施方案涉及包含本文中公开的载体的宿主细胞。本领域技术人员容易理解，本领域中可获得许多合适的宿主细胞。宿主细胞可以包括可以接收载体或核酸和/或蛋白整合的任何个体细胞或细胞培养物，以及任何后代细胞。该术语还涵盖宿主细胞的后代，不论在基因或表型上是相同还是不同。合适的宿主细胞可以取决于载体并且可以包括哺乳动物细胞，动物细胞，人细胞，猿细胞，昆虫细胞，酵母细胞和细菌细胞。通过使用病毒载体，经由磷酸钙沉淀的转化，deae-葡聚糖，电穿孔，显微注射或其他方法，可以诱导这些细胞整合载体或其他材料。例如，参见sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual2ded.(coldspringharborlaboratory，1989)。

治疗方法

在某些方面，本公开涉及用于治疗过增生疾病或病症(例如，表征为抗原过表达)的方法，所述方法是通过向人受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含修饰的人t细胞的群体，所述修饰的人t细胞包含编码抗原结合蛋白的核酸分子，其中所述抗原结合蛋白包含被布置在胞外结合组分和胞内效应器组分之间的疏水部分；和修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合的群体，所述修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合包含编码被抗原结合蛋白的胞外结合组分特异性识别的抗原的核酸分子。在某些实施方案中，施用步骤可以重复多次并且持续数周，数月或多达两年以上的时间。

在某些实施方案中，过增生疾病是血液学恶性肿瘤或实体癌。示例性的血液学恶性肿瘤包括急性成淋巴细胞白血病(all)，急性髓细胞白血病(aml)，慢性髓细胞白血病(cml)，慢性嗜曙红细胞白血病(cel)，骨髓增生异常综合征(mds)，非霍奇金淋巴瘤(nhl)，或多发性骨髓瘤(mm)。示例性的实体癌包括胆管癌，膀胱癌，骨和软组织癌，脑瘤，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，结直肠腺癌，结直肠癌，硬纤维瘤，胚胎癌，子宫内膜癌，食道癌，胃癌，胃腺癌，多形性成胶质细胞瘤，妇科肿瘤，头颈鳞状细胞癌，肝癌，肺癌，恶性黑素瘤，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，胰腺导管腺癌，原发性星形细胞瘤，原发性甲状腺癌，前列腺癌，肾癌，肾细胞癌，横纹肌肉瘤，皮肤癌，软组织肉瘤，睾丸生殖细胞瘤，尿道上皮癌，子宫肉瘤，或子宫癌。

在另外的方面，本公开涉及用于治疗受试者中的疾病的方法，所述方法是通过(a)向受试者施用有效量的修饰的人t细胞的群体，所述修饰的人t细胞包含核酸分子，所述核酸分子编码抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含被布置在胞外结合组分和胞内效应器组分之间的疏水部分；(b)向所述受试者施用有效量的修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合的群体，所述修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合包含编码所述抗原的核酸分子，其中来自步骤(a)的修饰的人t细胞的抗原结合蛋白的胞外结合组分对由该步骤(b)的修饰的细胞的群体编码的抗原具有特异性；和(c)任选地重复步骤(a)，步骤(b)或步骤(a)和(b)两者；从而通过过继细胞免疫疗法治疗疾病。

在另外的方面，本公开涉及用于改善过继细胞免疫疗法的方法，所述方法是通过(a)向受试者施用有效量的修饰的人t细胞的群体，所述修饰的人t细胞包含核酸分子，所述核酸分子编码抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含被布置在胞外结合组分和胞内效应器组分之间的疏水部分；和(b)向所述受试者施用有效量的修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合的群体，所述修饰的人造血祖先细胞，修饰的人免疫系统细胞或其组合包含编码所述抗原的核酸分子，其中来自步骤(a)的修饰的人t细胞的抗原结合蛋白的胞外结合组分对由该步骤(b)的修饰的细胞的群体编码的抗原具有特异性。这些施用(如本文所述，可以重复)由此提高，增大或增强过继细胞免疫疗法的效力。

在任意前述实施方案中，所述方法被用于治疗病毒疾病，细菌疾病，癌症，炎性疾病，免疫疾病，或年龄相关性疾病。

在任意前述实施方案中，将所述方法与编码包含结合组分，疏水部分和胞内效应器组分的抗原结合蛋白的细胞一起使用。例如，结合组分可以是抗体可变片段(fv)，tcr可变结构域，受体胞外结构域，或配体。在另外的实施方案中，结合组分是包含可变区接头的scfv或sctcr，如接头包含(glyxsery)n，其中x和y独立地是1至5的整数，并且n是1至10的整数。在另外的实施方案中，结合组分对以下各项具有特异性：α-甲胎蛋白(afp)，b7h4，btla，cd3，cd19，cd20，cd25，cd22，cd28，cd30，cd40，cd44v6，cd52，cd56，cd79b，cd80，cd81，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，cd151，cd276，ca125，cea，ceacam6，c-met，ct-7，ctla-4，egfr，egfrviii，erbb2，erbb3，erbb4，epha2，flt1，flt4，frizzled，o-乙酰基-gd2，gd2，ghrhr，ghr，gitr，gp130，hvem，igf1r，il6r，kdr，l1cam，lewisa，lewisy，ltβr，lifrβ，lrp5，mage，间皮素，muc1，ny-eso-1，癌症特异性新抗原，osmrβ，pd1，pd-l1，pd-l2，psma，ptch1，rank，robol，ror1，tert，tgfbr2，tgfbr1，tlr7，tlr9，tnfrsf4，tnfr1，tnfr2，酪氨酸酶，tweak-r，或wt-1。在这些实施方案的任一个中，来自修饰的人t细胞的抗原结合蛋白的胞外结合组分针对过表达抗原的疾病细胞。

在另外的实施方案中，疏水部分是跨膜结构域，如cd4，cd8，cd28或cd27跨膜结构域。

在某些实施方案中，胞内效应器组分包含以下各项的胞内区：cd3ε，cd3δ，cd3ζ，cd25，cd27，cd28，cd79a，cd79b，cd134，cd137，card11，dap10，fcrα，fcrβ，fcrγ，fyn，hvem，icos，lck，lag3，lat，lrp，nkg2d，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2，ryk，slamf1，slp76，ptα，tcrα，tcrβ，trim，zap70，ptch2，或其任意组合。在特别的实施方案中，胞内效应器组分包含cd3ζ以及cd27，cd28，cd134和cd137中的一个或多个，或胞内效应器组分包含lrp，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2或ryk。

在任意前述实施方案中，所述方法提供修饰的免疫系统细胞，如cd4+t细胞，cd8+t细胞，cd4-cd8-双阴性t细胞，γδt细胞，调节性t细胞，天然杀伤细胞，树突细胞，或其任意组合的用途。在某些实施方案中，t细胞是幼稚t细胞，中央记忆型t细胞，效应器记忆型t细胞，或其任意组合。例如，修饰的t细胞的第一群体可以基本上由cd4+t细胞，cd8+t细胞，或cd4+和cd8+t细胞两者组成，并且修饰的细胞的第二群体包含修饰的人造血祖先细胞。在其他实例中，修饰的t细胞的第一群体可以基本上由cd4+t细胞，cd8+t细胞，或cd4+和cd8+t细胞两者组成，并且修饰的细胞的第二群体包含修饰的人免疫系统细胞，如基本上由cd4+t细胞，cd8+t细胞，或cd4+和cd8+t细胞两者组成的细胞。

在任意前述实施方案中，所述方法提供修饰的细胞群体的用途，所述修饰的细胞群体经由例如病毒载体如慢病毒载体或γ-反转录病毒载体而被在离体重组修饰。在另外的实施方案中，被修饰的细胞群体是同基因的，同种异基因的，或自体的细胞。在任意前述实施方案中，修饰的细胞群体被进一步与如本文中所述的药用载体，稀释剂，或赋形剂配制在一起。

在任意前述实施方案中，所述方法包括静脉内施用所述修饰的细胞群体。

在任意前述实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用多个剂量的来自步骤(a)的修饰的t细胞，多个剂量的来自步骤(b)的修饰的细胞，或其组合。例如，多个剂量的来自步骤(a)的修饰的t细胞以约一周至约四周的施用间隔施用。在某些实施方案中，将来自步骤(a)的修饰的t细胞与来自步骤(b)的修饰的细胞同时或相继施用。在另外的实施方案中，在施用来自步骤(a)的修饰的t细胞后的约1天至约28天施用来自步骤(b)的修饰的细胞的初始剂量。

在任意前述实施方案中，所述方法包括在施用来自步骤(a)的修饰的t细胞的约24小时内相继地施用来自步骤(b)的修饰的细胞，或在施用来自步骤(b)的修饰的细胞的约24小时内相继地施用来自步骤(a)的修饰的t细胞。在具体的实施方案中，初始施用包括施用包含来自步骤(a)的修饰的t细胞和来自步骤(b)的修饰的细胞的混合物的组合物，前提是在将所述混合物施用于受试者之前，来自步骤(b)的细胞不激活来自步骤(a)的细胞。在另外的实施方案中，在施用来自步骤(a)的修饰的t细胞后的多至约365天，以一个或多个间隔以一个或多个剂量进一步施用来自步骤(b)的修饰的细胞。在任意前述实施方案中，来自步骤(b)的修饰的细胞包含修饰的造血祖先细胞或基本上由其组成，或包含t细胞或基本上由其组成。

在任意前述实施方案中，来自步骤(a)的修饰的t细胞以约10⁶个细胞/m²至约10¹¹个细胞/m²的剂量被施用于受试者并且来自步骤(b)的修饰的t细胞被以约10⁶个细胞/m²至约10¹¹个细胞/m²的剂量施用于受试者，其中任一或两种修饰的细胞群体的剂量可以重复，如本文中所述。

受试者中存在过增生疾病或恶性病症是指在受试者中存在发育异常，癌性和/或转化的细胞，包括例如瘤形成，肿瘤，非接触抑制的或致癌转化的细胞等(例如，实体癌；血液癌症，包括淋巴瘤和白血病，如急性髓细胞白血病，慢性髓细胞白血病等)，其是本领域中已知的并且其诊断和分类标准是已确定的(例如，hanahan和weinberg，2011cell144：646；hanahan和weinberg2000cell100：57；cavallo等，2011canc.immunol.immunother.60：319；kyrigideis等，2010j.carcinog.9：3)。在某些实施方案中，此种癌细胞可以是急性髓细胞白血病，b-细胞成淋巴细胞白血病，t-细胞成淋巴细胞白血病或骨髓瘤的细胞，包括能够起始和连续移植任何所述类型的癌症的癌症干细胞(参见，例如，park等，molec.therap.17：219，2009)。

在另一个方面，本公开提供用于抑制恶性肿瘤(例如，实体恶性肿瘤或血液恶性肿瘤)的生长，转移或转移生长的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的编码本文中提供的多肽复合体的细胞或其组合物。

本文中公开的组合物和方法适用于多种癌症，包括实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤。可治疗的癌症类型包括乳腺，前列腺，胰腺，结肠和直肠的腺癌；所有形式的支气管原肺癌(包括扁平细胞癌，腺癌，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；骨髓的；黑素瘤；肝细胞瘤；成神经细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取脱羧细胞瘤(apudoma)；迷芽瘤；鳃原瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；和癌(例如，walker，基底细胞，基底扁平(basosquamous)，brown-pearce，导管，ehrlich肿瘤，krebs2，默克尔(merkel)细胞，粘蛋白，非小细胞肺，燕麦细胞，乳头状，硬癌，细支气管，支气管原，扁平细胞，和过渡细胞)。可治疗的其他类型的癌症包括：组织细胞病；白血病；恶性组织细胞增多症；霍奇金病；非霍奇金淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑素瘤；肾细胞癌；软骨母细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养细胞瘤。

此外，还考虑可适用于治疗以下类型的癌症：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤(cyclindroma)；囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝瘤；汗腺腺瘤；胰岛细胞瘤；莱迪希细胞瘤；乳头状瘤；塞尔托利细胞瘤；黄瘤样泡膜细胞性纤维瘤；平滑肌瘤(leimyoma)；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤(myomma)；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；胶质瘤；髓母细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；神经细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；神经节细胞瘤；非嗜铬神经节细胞瘤；和多形性胶质母细胞瘤。可治疗的癌症类型还包括血管角化瘤；血管淋巴样增生伴嗜酸细胞增多(angiolymphoidhyperplasiawitheosinophilia)；致硬化血管瘤(angiomasclerosing)；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤(hemangioma)；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；肿瘤；新生纤维瘤病(neurofibromatosis)；和宫颈发育不良。

同样可适用于本文中公开的组合物和方法的另外的示例性癌症是b-细胞癌症，包括b-细胞淋巴瘤[如多种形式的霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(nhl)或中枢神经系统淋巴瘤]，白血病[如急性成淋巴细胞白血病(all)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，多毛细胞白血病和慢性成肌细胞白血病]和骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)。另外的b细胞癌症包括小淋巴细胞淋巴瘤，b-细胞前淋巴细胞白血病，淋巴质浆细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，血浆细胞骨髓瘤，孤立性骨浆细胞瘤，骨外浆细胞瘤，黏膜相关淋巴组织(malt)的结外边缘区b-细胞淋巴瘤，结边缘区b-细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，弥漫性大b-细胞淋巴瘤，纵隔(胸腺)大b-细胞淋巴瘤，血管内大b-细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤/白血病，不确定恶性潜能的b-细胞增殖，淋巴瘤样肉芽肿病，和移植后淋巴增生性疾病。

在某些实施方案中，可用于抑制实体恶性肿瘤的生长或实体恶性肿瘤或血液恶性肿瘤的转移或转移生长的编码抗原结合蛋白的细胞包括特异性结合肿瘤或癌细胞上的癌症抗原和第二靶抗原的那些。

如医药领域技术人员所理解的，术语″治疗(treat)″和“治疗(treatment)”是指受试者(即，患者，宿主，其可以是人或非人动物)的疾病，病症或症状的医疗处理(参见，例如，stedman’smedicaldictionary)。通常，合适的剂量和治疗方案提供一种或多种抗原结合蛋白(例如，car)或对人靶抗原具有特异性的高亲和性重组tcr，表达其的宿主t细胞，和任选地辅助治疗(例如，细胞因子如il-2，il-15，il-21或其任意组合)，其量足以提供治疗或预防益处。治疗性治疗或预防性或防止性方法所产生的治疗或预防益处包括，例如改善的临床结果，其中目的是防止或延迟或以其他方式减弱(例如，相对于未治疗的对照以具有统计学显著性的方式降低)非所需的生理学改变或病症，或防止或延迟或以其他方式减弱此种疾病或病症的扩张或严重度。治疗受试者产生的有益的或所需的临床结果包括消除，减轻或缓解所治疗的疾病或病症产生的或与其相关的症状；减少症状的出现；提高生活质量；更长的无病状态(即，降低受试者呈现作为进行疾病诊断基础的症状的可能性或倾向)；减弱疾病的程度；稳定(即，不恶化)疾病的状态；延迟或减慢疾病进展；改善或减轻疾病状态；和消退(部分或全部)，不管是可检测的还是不可检测的；或总体存活。

″治疗″也可以表示：与受试者不接受治疗的情况下的预期存活相比，存活延长。需要本文中所述方法和组合物的受试者包括已经患有疾病或病症的那些，以及倾向于发展疾病或病症或具有其风险的受试者。需要预防治疗的受试者包括要在其中预防疾病，病症或症状(即，减小疾病或病症发生或复发的可能性)的受试者。本文中所述的组合物(及包含所述组合物的制剂)和方法提供的临床益处可以通过以下方式评估：设计和进行体外测定，临床前研究，和意在受益于组合物施用的受试者中的临床研究，如实施例中所述。

表达对人疾病相关抗原具有特异性的抗原结合蛋白或高亲和性重组tcr的细胞，以及表达靶抗原的细胞，如本文中所述，可以以在药物或生理学可用或适当的赋形剂或载体中的形式被施用于受试者。药物可用赋形剂是生物学相容性载体，例如，生理盐水，其在本文中被详细描述，其适用于向人或其他非人哺乳动物对象施用。

治疗有效剂量是能够在治疗的人或非人哺乳动物中产生临床上所需的结果的用于过继转移的宿主t细胞(表达对人疾病相关抗原具有特异性的抗原结合蛋白或高亲和性重组tcr)和表达靶抗原的细胞的量(即，足以以在统计学上显著的方式引起或增强针对过表达抗原的细胞的特异性t细胞免疫应答(例如，细胞毒性t细胞反应)的量)。如医药领域中已知的，任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者大小，重量，体表面积，年龄，施用的具体治疗，性别，给药时间和途径，总体健康和同时施用的其他药物。剂量可以变化，但是施用如本文中所述的包含重组表达载体的宿主细胞的优选剂量为约10⁶个细胞/m²，约5x10⁶个细胞/m²，约10⁷个细胞/m²，约5x10⁷个细胞/m²，约10⁸个细胞/m²，约5x10⁸个细胞/m²，约10⁹个细胞/m²，约5x10⁹个细胞/m²，约10¹⁰个细胞/m²，约5x10¹⁰个细胞/m²，或约10¹¹个细胞/m²。

药物组合物可以以如由医药领域技术人员确定的适合于要治疗(或预防)的疾病或病症的方式施用。组合物施用的适当剂量和合适的持续时间和频率将由以下因素决定：患者的健康状况，患者的大小(即，重量，质量或体面积)，患者疾病的类型和严重度，活性成分的特定形式，和给药方法。通常，适当的剂量和治疗方案提供的组合物的量足以提供治疗和/或预防益处(如本文中所述的，包括改善的临床结果，如更高频率的完全或部分消退，或更长的无病和/或总体存活，或减轻症状严重度)。对于预防性用途，剂量应当足以预防与疾病或病症相关的疾病，延迟其发作，或减轻其严重度。根据本文中所述方法施用的免疫原性组合物的预防性益处可以通过进行临床前(包括体外和体内动物研究)和临床研究并分析由其获得的数据确定，所述数据的获得是通过本领域技术人员可以容易地实施的适当的统计学，生物学和临床方法和技术。

与抗原过表达相关的症状包括任何这样的疾病或病症，其中抗原相关细胞或分子事件的活性缺乏，活性过度或不正常活性存在，并且典型地由受影响的细胞(例如，白血病细胞)中与正常细胞相比不正常高的(具有统计学显著性)水平的抗原表达所致。具有此种疾病或病症的受试者将受益于利用本文所述的实施方案的组合物或方法的治疗。一些与抗原过表达相关的病症因此可以包括急性以及慢性病症和疾病，如使受试者易患特定疾病的那些病理学症状。

一些与抗原过表达相关的病症的实例包括过增生疾病，其是指受试者中激活的和/或增殖的细胞(其也可以是在转录方面活性过度的)的状态，包括肿瘤，赘生物，癌症，恶性肿瘤等。除了激活的和/或增殖的细胞以外，过增生疾病还可以包括细胞死亡过程的异常或失调，不论是通过坏死还是凋亡。细胞死亡过程的此种异常可以与多种病症相关，包括癌症(包括原发性、次生性恶性肿瘤以及转移瘤)或其他病症。

根据某些实施方案，实际上表征为抗原表达或过表达的任何类型的癌症都可以通过使用本文中公开的组合物和方法治疗，所述癌症类型包括血液学癌症(例如，白血病，包括急性髓细胞白血病(aml)，t或b细胞淋巴瘤，骨髓瘤等)。此外，″癌症″可以是指任何加速的细胞增殖，包括实体瘤，腹水瘤，血液或淋巴或其他恶性肿瘤；结缔组织恶性肿瘤；转移疾病；器官或干细胞移植后的最小残留疾病；多抗药性癌症，原发性或继发性恶性肿瘤，与恶性肿瘤相关的血管发生，或其他形式的癌症。在本发明公开的实施方案内还考虑具体的实施方案，其中仅包括一种上述类型的疾病，或其中具体病症可以被排除而不管其是否表征为靶抗原过表达。

本文中考虑的某些治疗或预防方法包括施用宿主细胞(其可以是自体的，同种异基因的或同基因的)，所述宿主细胞包含所需的如本文中所述的核酸分子，所述核酸分子被稳定地整合到细胞的染色体中。例如，此种细胞组合物可以在体外使用自体的，同种异基因的或同基因的免疫系统细胞(例如，t细胞，抗原递呈细胞，天然杀伤细胞)产生从而将所需的靶向抗原的t-细胞组合物与表达抗原的细胞组合物一起施用于受试者作为过继免疫疗法。

当在本文中使用时，组合物或治疗的施用是指将其递送至受试者，不管递送途径或方式如何。施用可以连续地或间歇地并且肠胃外地实施。施用可以是用于治疗已被确认为患有认可的症状，疾病或疾病状态的受试者，或用于治疗易具有此种症状，疾病或疾病状态或有发展出此种症状，疾病或疾病状态的风险的受试者。与辅助性治疗共同施用可以包括以任何次序和以任何用药方案同时和/或顺序递送多种试剂(例如，抗原特异性重组宿主t细胞和表达抗原的细胞以及一种或多种细胞因子；免疫抑制治疗如钙神经素抑制剂，皮质类固醇，微管抑制剂，低剂量的霉酚酸前药，或其任意组合)。

在某些实施方案中，多个剂量的如本文中所述的重组宿主t细胞被施用于受试者，其可以约两周至约四周的施用间隔施用，并且受试者可以被任选地与重组(修饰的)t细胞的施用同时地、共同或相继地施用以如本文中所述的表达抗原的细胞。在另外的实施方案中，细胞因子被相继地施用，前提是在细胞因子施用前受试者被施用以重组宿主t细胞至少三或四次。在某些实施方案中，细胞因子被皮下施用(例如，il-2，il-15，il-21)。在另外的实施方案中，受治疗的受试者还接受免疫抑制治疗，如钙神经素抑制剂，皮质类固醇，微管抑制剂，低剂量的霉酚酸前药，或其任意组合。在另外的实施方案中，受治疗的受试者已经接受了非骨髓根除或骨髓根除造血细胞移植(例如，自体的，同种异基因的)，其中所述治疗可以在骨髓根除或非骨髓根除造血细胞移植后至少两个月至至少三个月被施用。

治疗或药物组合物的有效量是指足以在所需的剂量并且在所需的时间内实现如本文中所述的理想的临床结果或有益治疗的量。有效量可以在一次或多次施用中被递送。如果施用是向已知或被确认具有疾病或疾病状态的受试者，则术语″治疗量″可以关于治疗使用，而″预防有效量″可以用以描述向易具有疾病或疾病状态(例如，复发)或具有发展出疾病或疾病状态(例如，复发)的风险的受试者施用有效量作为预防性措施。

car-ctl免疫应答的水平可以通过本文中描述的和本领域中常规实施的多种免疫学方法中的任一种确定。car-ctl免疫应答的水平可以在施用任一本文所述的修饰的造血干细胞，免疫系统细胞(例如，t细胞)或其任意组合之前和之后确定。用于确定ctl活性的细胞毒性测定可以使用本领域中常规实施的若干技术和方法中的任一种进行(参见，例如，henkart等，″cytotoxict-lymphocytes″infundamentalimmunology，paul(ed.)(2003lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，pa)，1127-50页，及其中引用的参考文献)。

抗原特异性t细胞反应典型地通过根据任何本文中所述的t细胞功能参数(例如，增殖，细胞因子释放，ctl活性，改变的细胞表面标志物表型等)比较观察到的t细胞反应来确定，所述比较可以在暴露于在适当环境中的同源抗原(例如，用于引发或激活修饰的t细胞的抗原或ag-apc)的t细胞和代替地暴露于结构上不同或不相关的对照抗原的来自相同来源群体的t细胞之间进行。与对照抗原的反应相比，在统计学上显著更大的对同源抗原的反应表示抗原特异性。

生物学样品可以获得自受试者以用于确定如本文中所述的免疫应答的存在和水平。当在本文中使用时，″生物学样品″可以是血液样品(由其可制备血清或血浆)，活检样本，体液(例如，肺灌洗液，腹水，黏膜洗液，滑液)，骨髓，淋巴结，组织外植体，器官培养物或来自受试者或生物学来源的任何其他组织或细胞制剂。生物学样品也可以获得自接受任何免疫原性组合物之前的受试者，所述生物学样品可用作对照用以确定基线(即，免疫疗法前的)数据。

本文中公开的药物组合物可以被提供于单位剂量或多剂量容器(如密封的安瓿或小瓶)中。此种容器可以被冷冻以保持制剂的稳定性直至。在某些实施方案中，单位剂量包含的如本文中所述的重组宿主细胞的剂量为约10⁶个细胞/m²至约10¹¹个细胞/m²。开发合适的用药和治疗方案以用于将本文中所述的特定组合物用于多种治疗方案中，包括例如，肠胃外或静脉内施用或制剂。

如果在肠胃外施用所述受试者组合物，则所述组合物还可以包含无菌的含水或油质溶液或悬浮液。合适的无毒性肠胃外可用的稀释剂或溶剂包括水，林格溶液，等渗盐溶液，1，3-丁二醇，乙醇，丙二醇或聚乙二醇(与水的混合物)。水溶液或水性悬浮液还可以包含一种或多种缓冲剂，如乙酸钠，柠檬酸钠，硼酸钠或酒石酸钠。当然，任何用于制备任何剂量单位制剂的物质应当是药物纯的并且在所用的量应当是基本上无毒性的。此外，活性化合物可以被结合到持续释放制剂和剂型中。当在本文中使用时，剂量单位形式是指适用作受治受试者的单一剂量的物理上离散的单位；各单位可以包含经计算的预定量的重组细胞或活性物质以与合适的药物载体一起产生所需的治疗效果。

通常，合适的剂量和治疗方案提供的活性分子或细胞的量足以提供治疗或预防性益处。此种反应可以通过与未治疗的受试者相比确定受治疗的受试者中改善的临床结果(例如，更高频率的消退，完全或部分，或更长的无病存活)来监测。对肿瘤蛋白的预先存在的免疫应答的提高通常与改善的临床结果相关。此种免疫应答通常可以使用标准增殖，细胞毒性或细胞因子测定评估，所述测定是本领域中常规的并且可以使用获得自治疗前后的受试者的样品进行。

实施例

实施例1

针对过继转移免疫疗法的ror1car-t细胞的表征

人和猕猴4-1bb和cd3ζ信号转导分子是高度保守的(95％)，并且cd3ζ的基于免疫受体酪氨酸的激活基序有100％同一性。为了保证ror1car在猕猴t细胞中起作用，给t细胞转导以编码人或猕猴4-1bb和cd3ζ信号转导结构域的ror1car，并且评估ror1⁺靶细胞的识别。为了提供选择标志物以纯化转导的t细胞，将编码猕猴tcd19的序列结合到载体中t2a核糖体滑动元件的下游(berger等，j.med.primatol.40：88，2011)。转导有含人4-1bb/cd3ζ的ror1car或含猕猴4-1bb/cd3ζ的ror1car的猕猴t细胞对k562/ror1肿瘤细胞的识别是相当的(图1a)。因此，利用含人信号转导结构域的构建体的体内安全性研究被用于检测该载体的潜在的临床翻译。

对于过继转移实验，外周血样品获得自三只成年猕猴，并且来自各动物的pbmc被用抗-cd3/cd28mab刺激，然后用ror1car反转录病毒载体转导t细胞。通过tcd19的共表达测量的cd4⁺和cd8⁺t细胞的平均转导效率为28.2％(6.6-58.1％)并且转导后4-5天的免疫-磁性选择使转导的细胞富集至大于90％的纯度(图1b)。在扩大后，进行第二免疫-磁性选择以纯化cd4⁺和cd8⁺car-t细胞，并且将各亚组分别扩大以允许配制1∶1混合物。这保证在各过继转移实验中的均一的ror1car-t细胞组合物。此外，产生被修饰成表达egfrt或tcd34的自体的cd4⁺和cd8⁺t细胞，并且制备成转导了对照的cd4⁺和cd8⁺t细胞的1∶1混合物以用于与ror1car-t细胞共灌输。

在与k562/ror1细胞共培养后，通过细胞毒性，增殖和细胞因子-释放测定确定ror1car在cd4⁺和cd8⁺t细胞中的功能。与cd4⁺ror1car-t细胞相比，cd8⁺ror1car-t细胞溶解k562/ror1靶标的效率更高(图1c)，并且两个亚组都扩增并产生细胞因子以特异性地响应于k562/ror1细胞(图1d)。

实施例2

ror1car-t细胞在体内是有功能的

为了确定是否可以安全地转移自体ror1car-t细胞并且为了分析其体内持久性和迁移，将1x10⁸个ror1car-t细胞/kg(cd4∶cd8之比为1∶1)的剂量施用于单只猕猴。该细胞剂量低于安全施用于猕猴的cmv特异性t细胞的剂量，但是等于或超过在用于cdl9⁺b细胞恶性肿瘤的car-t细胞疗法的临床试验中使用的剂量(maus等，blood123：2625，2014)。同时，向细胞持久性和迁移的对照施用相同剂量的egfrt⁺t细胞。在t细胞灌输后监测动物的发热，呼吸窘迫，食欲，腹泻和体重损失，并在灌输前后检测血液样品的cbc，血清化学和细胞因子水平。在该细胞剂量没有观察到立即或延迟的临床异常。除了在t-细胞灌输前为了镇静动物而肌肉内(i.m.)注射克他命(ketamine)后在猕猴中观察到的来源于肌肉的肌氨酸磷酸激酶(cpk)的短暂增加以外，体重，cbc和血清化学保持在正常限度内(图2a)。ifn-γ和il-6的血浆水平在ror1car-t细胞后第1天升高，但是到第3天回到正常(图2b)。在向单独的动物转移高5倍细胞剂量的仅转导有标志物基因的自体t细胞后，没有观察到ifn-γ和il-6的增加(数据未显示)，这表明灌输ror1car-t细胞后升高的细胞因子水平反映了体内car-t细胞的瞬时激活。

对ror1car-t细胞和对照t细胞在血液中的频率的分析揭示了在灌输后最早的时间点开始的差异。在灌输后一天在血液中检测到的ror1car-t细胞的频率为0.3％的cd4⁺和0.8％的cd8⁺t细胞(7个细胞/μl和6个细胞/μl)，并且在随后的2周保持在4-11个细胞/μl的水平。对照cd4⁺和cd8⁺egfrt⁺t细胞在第1天的频率更高(6.2％的cd4⁺和4.6％的cd8⁺t细胞，对应于137个细胞/μl和36个细胞/μl)。在随后的4周时间，egfrt⁺t细胞逐渐衰减至6-13个细胞/μl的稳定水平(图2c-d)。对转基因特异性序列的qpcr分析确认不同模式的体内持久性(图2e)。

持久性数据指示，ror1car-t细胞可能从血液迁移，可能到可以表达ror1的组织中。之前证明，骨髓(bm)中不成熟b细胞的亚组表达ror1并且过继转移的猕猴t细胞迁移至bm和淋巴结(ln)(hudecek等，blood116：4532，2010)。因此，检测在灌输前以及在灌输后第5天获得的bm和ln样品的等分试样是否存在ror1⁺b细胞和转移的t细胞两者。egfrt⁺和ror1car-t细胞存在于灌输后第5天的bm和ln样品中，但是存在的ror1car-t细胞的频率是对照egfrt⁺t细胞的1.1-2.3倍(图3a)。用于检测cd19⁺cd45^intermediateb细胞的亚组的门控策略被用于bm细胞悬浮液，所述悬浮液含有在人中表达ror1的前-bii-大阶段的b-细胞(数据未显示)。在t-细胞灌输前获得的bm中的cd19⁺cd45^intermediateb细胞(8.3％)的亚组上检测ror1表达，并且该亚组在转移ror1car-t细胞后第5天获得的bm样品中被除去(图3b)。ror1^-的外周血cd19⁺b细胞的计数证明在研究的28天里ror1car-t细胞对成熟cd19⁺b细胞库没有影响(图3c)。这些结果证明，转移的ror1car-t细胞迁移至bm并识别和除去ror1⁺b-细胞前体，但是并不引起器官毒性或减少循环的成熟b细胞。

为了确认ror1car-t细胞在体内保持功能性，将在灌输后一周获得的pbmc用k562/ror1细胞，pma/离子霉素，或单独的培养基刺激。灌输前pbmc和ror1car-t细胞充当测定中的对照。刺激4小时后，分析所述细胞的cd107a表达，cd107a是通过cd8⁺t细胞的抗原识别后脱粒的标志物(chan和kaur，j.immunol.methods325：20，2007)。在刺激后在体内持续的cd8⁺ror1car-t细胞亚组中检测到cd107a表达的增加，并且该增加的水平与在灌输前在ror1car-t细胞中观察到的水平类似(图3d)。因此，在体内在血液内持续的转移的ror1car-t细胞仍然具有功能，这指示b-细胞前体消耗后观察到的器官毒性的缺少不是由于ror1car-t细胞的功能障碍。

实施例3

在体内ror1car-t细胞响应抗原

更高car-t细胞剂量的灌输对于治疗ror1⁺恶性肿瘤可能是必需的并且可能对正常组织显示毒性，特别是如果体内通过识别表达高水平ror1的肿瘤细胞而使car-t细胞被激活。在猕猴中b细胞上的ror1-表达的分析期间，观察到，与人不同，一些动物在ln中具有高频率的表达ror1的成熟b细胞(数据未显示)。选择两只在ln中具有高水平的ror1⁺b细胞的动物用于更高剂量(5x10⁸/kg)的ror1car-t细胞的安全性分析，因为第一只动物中的表现表明ror1⁺b细胞的减少为car-t细胞的体内功能提供替代方案。将tcd34用作这些动物中的对照t细胞中的标志物基因，因为cd34富集比egfrt选择更有效，这有助于获得该实验所需的更高的t-细胞剂量。为了使体内激活ror1car-t细胞可以显示毒性的可能性最大化，如果之前没有观察到毒性，则使用施用car-t细胞后5天被转染成表达细胞-表面tror1的的自体t细胞的灌输(图4a)。

更高剂量的ror1car-t细胞被很好地耐受并且虽然cd4⁺和cd8⁺ror1car-t细胞在两种动物中都可被容易地检测到，但是与对照tcd34t细胞相比，在过继转移后一天在血液中再次观察到ror1car-t细胞的频率减小(图4b)。峰值频率的差异不反映可能影响迁移的标志物基因的独特性质，因为对照动物中仅用tcd19或tcd34标记的t细胞的共灌输在体内提供同等高水平的两种群体(数据未显示)。

针对转移的t细胞的存在，对来自获得自灌输后第3天的各动物的pbmc，bm和ln的细胞悬浮液进行染色。在两种动物中，ror1car-t细胞在bm中的出现频率比在pbmc中更高，但是对照tcd34⁺t细胞却不是这样，并且ror1car-t细胞在ln中的频率超过了对照tcd34⁺t细胞的频率(图4c)。在过继转移后第3天bm和ln中ror1car-t细胞的积聚符合与处理前的bm和ln相比ror1⁺b细胞＞65％-80％的减少(参见图4d和4e)。这些数据与在用较低剂量的ror1car-t细胞处理的第一只动物中观察到的数据一致，并且显示转移的ror1car-t细胞自血液中迁移出并且积聚在存在ror1⁺b细胞的位点。

为了确定体内系统性激活ror1car-t细胞是否可能显示毒性，将被转导成表达tror1的自体t细胞(tror⁺t细胞)灌输到各动物中。在体外，自体ror1car-t细胞对tror1-修饰的t细胞的识别与对k562/ror1细胞一样有效(数据未显示)。tror⁺t细胞的灌输在任一动物中都不引起急性副作用，并且观察到在5-7天的时间里，cd4⁺和cd8⁺ror1car-t细胞分别增加至30个细胞/μl和52个细胞/μl(a13011)，以及22个细胞/μl和34个细胞/μl(a13002)(图5a)。这表示在内源性或tcd34标记的cd4⁺和cd8⁺t细胞的数目基本不变的情况下ror1car-t细胞多达7.7倍(a13011)和4.3倍(a13002)的增加(图5a-b)。为了确定在体内ror1car-t细胞是否消除tror⁺t细胞，检测t-apc激发后第1，5和7天获得的pbmc样品是否存在循环tror⁺t细胞。在a13011中，在转移后第1天，tror⁺t细胞的出现频率为1.0％的cd8⁺t细胞，并且这些细胞中的大部分与输入tror1⁺t细胞相比仅显示低水平的ror1表达(图5c)。重要地，到第5天和第7天，ror1^低t细胞分别进一步衰减至0.3％和＜0.1％的cd8⁺t细胞的频率(图5c)。在a13002中观察到类似模式的tror⁺t细胞持久性，其中仅很少的ror1^低t细胞在体内持续(数据未显示)。相比而言，在向动物灌输这些t细胞后的第1，5和7天，tror1⁺t细胞在血液中的频率为5.5％，8.6％和8.0％，而没有可检测的ror1car-t细胞(图5c和5d)。

总而言之，这证明表达被car修饰的t细胞识别的相同抗原的重组制备的″抗原递呈细胞″(在此情况中为产生抗原的t细胞，但是其他免疫系统细胞并且甚至是造血干细胞都可以被用作apc)能够促进或增强过继转移免疫疗法。

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