用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年10月20日提交的题为“用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法”的美国临时专利申请号62/066,279、2015年5月15日提交的题为“用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法”的美国临时专利申请号62/162,647、2015年5月29日提交的题为“用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法”的美国临时专利申请号62/168,710、和2015年9月8日提交的题为“用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法”的美国临时专利申请号62/215,732的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

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本申请涉及过继细胞治疗，包括给予多剂量的细胞，及其使用的方法、组合物和制品。细胞一般表达重组受体如嵌合受体，例如，嵌合抗原受体(car)或其他转基因受体如t细胞受体(tcr)。方法的特征，包括给药时间和给予的细胞数量提供了各种优势，如较低毒性和/或改善的功效，例如，由于增加的对象与给予的细胞的接触。在一些实施方式中，第一剂量包括与在其他方法中给予的剂量相比较低数量的细胞。在一些实施方式中，第一剂量降低了肿瘤或疾病负荷，从而改善了连续或后续剂量的功效。在一些实施方式中，设计连续剂量的时间以最小化毒性和/或对象对细胞的宿主免疫应答，从而改善持久性和功效。

背景技术：

各种方法可用于使用工程改造的表达重组受体，如嵌合抗原受体(car)的细胞的过继细胞治疗。例如，需要改善的方法以降低毒性风险和/或增加功效，例如，通过增加对象与给予的细胞的接触，例如，通过改善给予的细胞的增殖和/或持久性。提供满足此类需求的方法、组合物、和制品。

发明概述

提供了用于在过继细胞治疗中给予对象表达遗传工程改造(重组)的细胞表面受体以治疗对象中的疾病和/或病症的方法。该方法一般包括向之前已经用这类细胞的在先(例如，第一)剂量治疗的对象给予连续剂量，和/或给予多剂量的这类细胞。在一些实施方式中，剂量是第一剂量和一个或多个连续剂量。在一些实施方式中，第一剂量是较低剂量和/或是调节或减量剂量和/或连续剂量是巩固剂量。还提供可用于这类方法的细胞、组合物和制品。在一些实施方式中，重组受体是遗传工程改造的抗原受体，如功能性非-tcr抗原受体，例如，嵌合抗原受体(car)和其他重组抗原受体如转基因t细胞受体(tcr)。受体还包括其他重组嵌合受体，如含特异性结合至配体或受体或其他结合伴侣的胞外部分和胞内部分，如car的胞内信号转导部分的那些受体。在一些实施方式中，剂量包括较低的第一剂量。

在一些实施方式中，该方法包括(a)给予患有疾病或病症的对象第一剂量的表达重组受体(例如，嵌合抗原受体(car))的细胞，第一剂量含该细胞；和(b)给予对象表达重组受体(例如，car-表达)的细胞的连续剂量。在其他实施方式中，例如，为了提供巩固治疗，通过向像(a)中那样之前已经给予第一剂量的对象给予像(b)那样给予对象的一个或多个连续剂量来进行该方法。

在一些实施方式中，该方法包括(a)给予具有疾病或病症的对象第一剂量的表达重组受体(例如，嵌合抗原受体(car))的细胞。在一些实施方式中，第一剂量含不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/m²对象。在一些实施方式中，该方法还包括(b)在(a)中的给予开始之后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点处向对象给予表达重组受体(例如，car)的细胞的连续剂量。

在一些实施方式中，在(b)中给药的时间处，表示细胞因子释放综合征(crs)的对象中血清水平比在(a)中所述给药之前即刻的对象中血清水平小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍。在一些实施方式中，对象没有显示出3级或更高的神经毒性。在一些实施方式中，在给予第一剂量之后，对象中的神经毒性的crs-相关结果或症状已经达到峰值水平并且在(a)中的给药之后开始下降。在一些实施方式中，对象没有显示出针对由所述第一剂量的细胞表达的受体(例如，car)的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。

在一些实施方式中，该方法还包括给予其他连续和后续剂量，使得例如，按照第一和连续剂量所示的剂量和时间方案给予第一和多个连续剂量。在一些实施方式中，在给予连续剂量开始之后至少或超过14天的时间处给予一个或多个连续剂量中的第一个。在一些实施方式中，给予第一，连续和后续剂量包括在28天内或约28天内给予至少三个剂量。在一些实施方式中，在给予第一剂量开始后的约14天时给予连续剂量，并且在给予第一剂量开始后28天时给予额外连续或后续剂量。在一些实施方式中，在给予第一剂量开始后的42天和/或56天时给予额外后续剂量。

在一些实施方式中，以足够降低对象中疾病或病症的负荷的量给予第一剂量。在一些实施方式中，第一剂量是低剂量，如减量剂量，如低于根除疾病或病症所需但可能实现这类疾病或病症中的负荷或主体减少的剂量。在一些实施方式中，给予第一剂量不在对象中诱导严重细胞因子释放综合征(crs)。在一些实施方式中，给予第一剂量不在对象中诱导crs。在一些实施方式中，基于临床数据，给予第一剂量不在大部分对象中诱导严重crs。在一些实施方式中，给予第一剂量不诱导包括以下的组合的crs：(1)持续性发热(持续至少3天的至少38℃的发热)和(2)至少等于或约20mg/dl的c反应性蛋白(crp)的血清水平，和/或不诱导包括需要使用两种或更多种血管升压类药物的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭的crs。

在一些实施方式中，给予第一剂量不在对象中诱导3级或更高的神经毒性。在一些实施方式中，基于临床数据，给予第一剂量不在大部分对象中诱导3级或更高的神经毒性。在一些实施方式中，与神经毒性的临床风险和/或3级或更高神经毒性相关的症状包括混乱、谵妄、表达性失语、反应迟钝、肌阵挛、嗜睡、改变的精神状态、惊厥、癫痫-样活动、癫痫(任选地由脑电图[eeg]确诊)、升高水平的淀粉样β(aβ)、升高水平的谷氨酸、和升高水平的氧自由基。

在一些实施方式中，第一剂量低于会导致对象中crs或衍生crs的剂量。在一些实施方式中，第一剂量包括不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过5x10⁵细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，或不超过约1x10⁸细胞/m²对象。

在一些实施方式中，在神经毒性、细胞因子释放综合征(crs)、巨噬细胞活化综合征、或肿瘤裂解综合征的临床风险不存在或者在给予第一(或在先)剂量之后已经过去或消退时给予连续剂量。在一些实施方式中，在表明crs、神经毒性、巨噬细胞活化综合征、或肿瘤裂解综合征的生物化学读数不存在或者在所述给予第一(或在先)剂量之后已经过去或消退时给予连续剂量。在一些实施方式中，在对象中表明细胞因子释放综合征(crs)或神经毒性的因子的血清水平比给予第一剂量之前即刻的对象中指示物的血清水平低约10倍、低约25倍、和/或低约50倍时给予连续剂量。在一些实施方式中，在指示对象中crs的神经毒性和/或crs-相关结果或血清因子已经达到峰值并在所述给予之后开始下降时给予连续剂量，使得在给予连续剂量时，指示crs的crs-相关结果或血清因子水平与给予第一剂量之前即刻的水平相比不超过50％的峰值水平，不超过20％的峰值水平，或不超过5％的峰值水平，或等于或约等于该水平。

在一些实施方式中，在给予第一剂量和/或给予连续剂量之后，对象没有显示出细胞因子释放综合征(crs)，没有显示严重crs，没有显示神经毒性，没有显示严重神经毒性，或没有显示超过3级的神经毒性。

crs-相关结果是发热、低血压、缺氧、神经障碍、或血清水平的炎性细胞因子，如干扰素γ(ifnγ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、il-6、il-10、il-1β、il-8、il-2、mip-1、flt-3l、分形趋化因子、和il-5、以及c反应性蛋白(crp)。指示crs的因子，例如，血清因子是炎性细胞因子，如ifnγ、gm-csf、tnfα、il-6、il-10、il-1β、il-8、il-2、mip-1、flt-3l、分形趋化因子、和il-5、以及crp。

在一些方面中，给予连续剂量的时间是在对象没有显示免疫应答，例如，没有显示可检测的针对由所述第一(或在先)剂量的细胞表达的受体(例如，car)的过继宿主免疫应答。

在一些实施方式中，给予第一剂量，例如，开始给予第一或在先剂量，和开始给予连续剂量(即给予连续剂量开始)之间的时间超过约4天，例如，超过约5、6、7、8、或9天，例如，超过约20天，例如，约9至约35天，约14至约28天，15至27天，或17至约21天，和/或等于或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27天。在一些实施方式中，在给予第一或在先剂量(例如，其开始)之后超过约14天并不到约28天给予连续剂量(例如，其开始)。在一些实施方式中，在开始第一剂量之后21天开始给予连续剂量。在一些实施方式中，给予第一和连续剂量(例如，其开始)或在先和接着的连续剂量之间的时间超过约14天并且不到约28天，如15-27天，如约21天。在一些实施方式中，给予第一和连续剂量(例如，其开始)之间的时间是约17天。

在一些实施方式中，给予连续剂量时，对象中指示crs的因子的血清水平与所述第一剂量的给予之前即刻的对象中的水平相比小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍；和/或所述第一剂量给予之后对象中的crs-相关结果已达到峰值水平并且在(a)中的给予之后开始下降；和/或对象没有显示出针对所述第一剂量的细胞所表达的受体(例如，car)的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，在(b)中的给予或连续剂量之后，所述指示crs的因子的血清水平不超过(a)中的给予或第一剂量之前即刻的水平的10倍。

在一些实施方式中，对象还没有在(a)中的给予之前接受表达由第一剂量中的细胞表达的受体(例如，car)的细胞的剂量。在一些实施方式中，由连续剂量中的细胞表达的受体(例如，car)含有至少一种由在第一剂量中的细胞表达的受体(例如，car)中存在的至少一种免疫反应表位。在一些实施方式中，连续剂量的细胞中的受体与由第一剂量中的细胞表达的受体(例如，car)相同或基本相同。在一些实施方式中，由第一剂量的细胞表达的受体特异性结合至疾病或病症的或与疾病或病症相关的组织或细胞表达的抗原。在一些实施方式中，由连续剂量的细胞表达的受体结合至相同抗原，例如，结合至相同表位，和/或含有与第一剂量相同的抗原结合结构域。

在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤。在一些实施方式中，其是癌症，恶性肿瘤，神经瘤或其他增殖性疾病或病症，如白血病、淋巴瘤、例如、慢性淋巴细胞白血病(cll)、all、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治滤泡性淋巴瘤淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤，和/或间皮瘤。在一些实施方式中，疾病或病症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，疾病或病症是急性淋巴细胞性白血病。在一些实施方式中，疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(nhl)。

在一些实施方式中，疾病是癌症并且对象在开始给予连续剂量时没有显示出形态学疾病。在一些实施方式中，疾病是白血病或淋巴瘤并且对象在给予连续剂量时没有显示出骨髓中超过5％的胚细胞。在一些实施方式中，对象在给予连续剂量时显示出可检测的分子疾病和/或最小残留疾病。

在一些实施方式中，给予第一剂量导致对象中疾病或病症负荷减少，例如，如所述给予第一剂量之后，例如(a)中的给予之后，指示疾病负荷的一种或多种因子减少。在一些实施方式中，(b)中的给予或给予连续剂量时，对象还没有复发和/或疾病负荷在第一剂量后经过初始降低之后没有增加。在一些实施方式中，细胞的连续剂量含有足够降低对象中疾病或病症负荷的量的细胞。在一些实施方式中，给予连续剂量导致对象中疾病或病症负荷的进一步降低。在一些实施方式中，与初始给予连续剂量之前即刻相比，给予连续剂量导致对象中疾病或病症的负荷降低。在一些实施方式中，与用替代的给药方案的方法相比，该方法以更大的程度和/或持续更长时间地降低了疾病或病症的负荷，在替代方法中向对象给予第一剂量的细胞和单一剂量的连续剂量的细胞。负荷的降低和/或负荷的进一步降低可包括对象中，对象的器官中，对象的组织中，或对象的体液中疾病的细胞，例如肿瘤细胞总数的降低。这种降低可包括由流式细胞术或定量pcr的分子检测，肿瘤的质量或体积的降低，和/或转移数量和/或程度的降低。在一些实施方式中，降低包括对象中存活的改善，例如，增加的存活或无事件、无发展、或无复发存活的时间。

在一些实施方式中，疾病或病症在给予第一剂量后持续和/或给予第一剂量不足以根除对象中的疾病或病症。在一些实施方式中，与初始给予连续剂量之前即刻相比，给予所述连续剂量导致对象中疾病或病症的负荷降低。

在一些实施方式中，与用替代的给药方案的方法相比，该方法以更大的程度和/或持续更长时间地降低了疾病或病症的负荷，在替代方法中向对象给予(a)(或第一剂量)的细胞和单一剂量的(b)(或连续剂量)的细胞。在一些实施方式中，与通过包括替代性给药方案的方法所实现的相比，给予连续剂量(或(b)中的给予)之后对象中的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞随时间的曲线下面积(auc)，和/或对象中可检测的受体表达细胞的持续时间更大，其中以单一剂量给予对象(a)(或第一剂量)中的细胞和(b)(或连续剂量)中的细胞。在一些实施方式中，该方法导致以下的对象血液中的受体表达(例如，car-表达)细胞的最大浓度或数量：至少等于或约10个受体表达细胞/微升、至少等于或约100个受体表达细胞/微升、至少50％的外周血单核细胞(pbmc)的总数、至少约1x10⁵个受体表达细胞，或至少5,000个拷贝的重组受体编码(例如，car-编码)dna/微克dna，或至少10,000个拷贝的重组受体编码dna/微克dna。在一些实施方式中，在(a)或第一剂量中的给予开始之后90天时，可在对象的血液或血清中检测到重组受体表达(例如，car-表达)细胞，例如，对象的血液含有至少10％、至少20％、至少40％、或至少50％受体(例如，car)-表达细胞，至少10个受体(例如，car)-表达细胞/微升，或至少1x10⁴个受体(例如，car)-表达细胞。

在一些实施方式中，在(a)或第一剂量给予之后，与包含替代给药方案的方法相比，受体-表达(例如，car-表达)细胞的随着时间的血液浓度的auc更大，在替代给药方案中以单一剂量给予对象(a)或第一剂量中的细胞和(b)或第二剂量中的细胞。

在一些实施方式中，在(b)或连续剂量的给予之后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14天时，对象中没有可检测的crs-相关结果，或者与包含替代给药方案的方法相比降低，在替代给药方案中在没有给予第一剂量的情况下给予对象(b)或连续剂量中的细胞。

在一些实施方式中，与包含替代给药方案的方法相比，在(b)中或连续剂量给予之后，对象中指示crs的因子血清水平随时间的auc较低，在替代给药方案中，对象在没有给予第一剂量的情况下，给予(b)中或连续剂量中的细胞。

在一些实施方式中，在给予第一剂量之前已经用靶向肿瘤的治疗剂治疗该对象。在一些方面中，在给予第一剂量和/或连续剂量时，对象对于所述治疗剂的难治性的或非响应性的。在一些实施方式中，在(a)中或第一剂量给予之后并在(b)中或连续剂量的所述给予之前，或在(a)中或第一剂量给予之前，该方法还包括评价对象中指示crs的因子、指示疾病负荷的因子、和/或宿主抗-重组受体(例如，抗-car)免疫应答，如体液或细胞介导的免疫应答的指示物的血清水平。在一些这类实施方式中，检测到的指示疾病负荷的因子是或包括对象中、对象的器官中、对象的组织中、或对象的体液中疾病的细胞总数，通过流式细胞术或定量pcr的分子检测，实体瘤的质量或体积，或转移的程度或数量。

在一些实施方式中，该方法包括评价给予连续剂量之前指示疾病负荷的因子，并且基于评价的结果，确定待给予对象的细胞的连续剂量。在一些实施方式中，如果评价确定对象具有形态学疾病，则给予对象含有小于或约等于第一剂量中重组受体-(例如，car-)表达细胞数量的重组受体-(例如，car-)表达细胞数量的连续剂量。在一些实施方式中，如果评价确定对象有最小残留疾病，给予对象与第一剂量相比含增加数量的受体-(例如，car-)表达细胞的连续剂量。在一些实施方式中，连续剂量包括与第一剂量中的数量大约相同数量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞。在一些实施方式中，连续剂量中给予的每千克的受体-(例如，car-)表达细胞的数量小于或约小于或等于或约等于第一剂量中给予的每千克的受体-(例如，car-)表达细胞的数量。在其他实施方式中，连续剂量中给予的每千克的受体-表达(例如，car-表达)细胞的数量大于第一剂量中给予的每千克的受体-表达(例如，car-表达)细胞的数量。在一些实施方式中，连续剂量包括与第一剂量相比增加数量的这类细胞，如比第一剂量的数量高至少2倍、5倍或10倍。在一些实施方式中，连续剂量中给予的每千克的受体-表达(例如，car-表达)细胞的数量比第一剂量中给予的每千克的受体-表达(例如，car-表达)细胞的数量大至少等于或约2倍或等于或约3倍。

在一些实施方式中，在给予第一剂量之后和/或给予连续剂量之后，在对象中增殖第一剂量中的受体-表达(例如，car-表达)细胞。在一些实施方式中，由与给予之前即刻相比，给予第一剂量和/或连续剂量之后血清crp水平增加来证明增殖。在一些实施方式中，由与给予之前即刻相比，给予第一剂量和/或连续剂量之后通过qpcr测量的血清中受体-(例如，car-)编码核酸的水平增加来证明增殖。在一些实施方式中，增加是至少1、2或3倍。

在一些实施方式中，第一和/或连续剂量不是分开剂量。例如，在一些实施方式中，在包含第一剂量的细胞的单一药物组合物中给予第一剂量的细胞和/或在包含连续剂量的细胞的单一药物组合物中给予连续剂量的细胞。在其他实施方式中，第一和/或连续剂量是分开剂量，例如，其中第一剂量的细胞在不超过3天的时间段内在多个组合物中给予，其一起包含第一剂量的细胞；和/或连续剂量是分开剂量，其中连续剂量在不超过3天的时间段内在多个组合物中给予，其一起包含连续剂量的细胞。

在一些实施方式中，该方法包括向之前给予第一剂量的表达car的细胞的对象给予连续剂量的表达重组受体(例如，嵌合抗原受体(car))的细胞。在一些实施方式中，在第一剂量开始后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间段上给予连续剂量的细胞。在一些实施方式中，与第一剂量相比，以连续剂量给予的受体-(例如，car-)表达细胞的数量增加。

在一些实施方式中，第一剂量中给予的细胞的数量为约0.5x10⁶细胞/kg对象体重至3x10⁶细胞/kg，约0.75x10⁶细胞/kg至2.5x10⁶细胞/kg或约1x10⁶细胞/kg至2x10⁶细胞/kg。

在一些实施方式中，以连续剂量的受体-(例如，car-)表达细胞给予的细胞的数量为约2x10⁶细胞/千克(细胞/kg)体重至约6x10⁶细胞/kg，约2.5x10⁶细胞/kg至约5.0x10⁶细胞/kg，或约3.0x10⁶细胞/kg至约4.0x10⁶细胞/kg，各自包括端值。

在一些实施方式中，以第一剂量给予的受体-(例如，car-)表达细胞的数量等于或约为或不超过或不超过约1x10⁶/千克对象和/或以连续剂量给予的受体-(例如，car-)表达细胞的数量等于或约为3x10⁶/千克对象。

在一些实施方式中，该方法还包括在(a)中给予之前或在第一剂量之前和/或在(b)中给予之前或在连续剂量之前给予化疗剂。在一些实施方式中，在(a)中给予之前，已经用化疗剂治疗该对象。在一些实施方式中，化疗剂是或包含调节化疗，其在第一剂量和/或连续剂量之前降低对象中疾病或病症的负荷。在一些实施方式中，化疗剂是环磷酰胺、氟达拉滨，和/或其组合。在一些实施方式中，给予化疗剂包括在给予第一剂量之前并任选地不在给予连续剂量之前给予化疗剂。在一些实施方式中，在给予第一剂量之前2-5天给予化疗剂。在一些实施方式中，在给予第二剂量之前2-5天给予化疗剂。在一些实施方式中，在给予第一剂量之前2-5天并在给予第二剂量之前2-5天给予化疗剂。在一些实施方式中，在等于或约1g/m²对象和等于或约3g/m²对象的剂量下给予化疗剂。

在一些实施方式中，在给予第一剂量之前，对象已经接受了冷冻还原化疗。在一些实施方式中，该方法还包括在给予第一剂量之前给予冷冻还原化疗。

还提供了使用的细胞和组合物以及细胞和组合物治疗对象中疾病或病症，如肿瘤或癌症中的用途，其中所述细胞含有重组受体-(例如，嵌合抗原受体(car)-)表达细胞用于治疗对象中的疾病或病症或用于制备用于治疗之前用重组受体-表达(例如，car-表达)细胞治疗的对象中疾病或病症的药物中的用途。在一些实施方式中，使用或医药用途的组合物和细胞在之前之后14-28天使用。在一些实施方式中，配制使用的组合物或细胞用于以对降低对象中的疾病或病症的负荷而言足够的量给予连续剂量，该对象之前已经用重组受体-表达(例如，car-表达)细胞治疗。

在这种医药用途的一些实施方式中，组合物或细胞用于包括向具有疾病或病症的对象给予第一剂量的表达受体(例如，car)的细胞的用途。在一些实施方式中，第一剂量含不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/千克对象。在一些实施方式中，该组合物或细胞用于包括在给予第一剂量开始之后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点处向对象给予表达重组受体(例如，car)的细胞的连续剂量的用途。

在一些实施方式中，使用的细胞是表达用于治疗之前用受体-(例如，car-)表达细胞治疗的对象中的疾病的方法中的重组受体(例如，嵌合抗原受体(car))的细胞。在一些实施方式中，细胞在在先治疗后约14-28天使用。在一些实施方式中，配制使用的细胞用于以对降低对象中的疾病或病症的负荷而言足够的量给予连续剂量，该对象之前已经用受体-(例如，car-)表达细胞治疗。

在一些用于医药用途的任何这类组合物或细胞的实施方式中，对象没有显示出形态学疾病和/或对象没有显示出骨髓中超过5％的胚细胞。

在一些实施方式中，组合物或细胞用于包括向具有疾病或病症的对象给予第一剂量的表达受体(例如，car)的细胞的方法。在一些实施方式中，第一剂量含不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/千克对象。在一些实施方式中，该细胞用于包括在给予第一剂量开始之后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点处向对象给予表达重组受体(例如，car)的细胞的连续剂量的方法。

在一些实施方式中，配置使用的组合物或细胞用于以不在对象中诱导严重crs或不在对象中诱导crs的量给予。在一些实施方式中，以不在对象中诱导3级或更高神经毒性的量配制用于给药的使用的细胞。在一些实施方式中，以基于临床数据不在大部分治疗的对象中诱导严重crs的量配制使用的细胞。在一些实施方式中，以基于临床数据不在大部分治疗的对象中诱导3级或更高神经毒性的量配制使用的细胞。

在一些实施方式中，表达受体(例如，嵌合抗原受体(car))的细胞的用途是为了配制用于治疗对象中疾病或病症的药物，包括配制和/或包装用于以第一和连续剂量给予对象的细胞。在一些实施方式中，治疗包括以第一和连续剂量向对象给予细胞，其中第一剂量包括不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/m²对象。

在使用或医药用途的任何这类组合物或细胞的一些实施方式中，在第一给药开始后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间段上给予连续剂量的细胞。在一些实施方式中，连续剂量用于在表示细胞因子释放综合征(crs)的对象中血清水平比在所述第一给药之前即刻的对象中血清水平小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍的时间点处给予。在一些实施方式中，连续剂量用于在对象不显示3级或更高神经毒性的时间点处给予。在一些实施方式中，连续剂量用于在给予所述第一剂量后对象中神经毒性的crs-相关结果或症状已经达到峰值水平并在第一给予之后开始下降的时间点处给予。在一些实施方式中，连续剂量用于在对象没有显示处针对由所述第一剂量的细胞表达的受体(例如，car)的可检测的体液或细胞介导的免疫应答的时间点处给予。

在一些实施方式中，使用的细胞经配制和/或包装用于以第一和连续剂量给予对象和/或所述治疗包括以第一和连续剂量向对象给予细胞。在一些实施方式中，第一剂量含不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/千克对象。

在一些实施方式中，用途包括其中第一和连续给药包括以一个或多个单位剂量给予细胞，各单位剂量包括约5x10⁷个细胞至约5x10⁸个细胞，约5x10⁷个细胞至约2.5x10⁸个细胞或约2.5x10⁸个细胞至约4x10⁸个细胞。在一些实施方式中，细胞配制成包含不超过约5x10⁷个细胞，不超过约1x10⁸个细胞，不超过约2x10⁸个细胞，不超过约2.5x10⁸个细胞，不超过约3.0x10⁸个细胞或不超过约4x10⁸个细胞的单位剂量。

在一些实施方式中，细胞或用途包括其中第一给药包括给予单个单位剂量的情况。在一些实施方式中，细胞或用途包括其中连续给药包括给予2个或更多个单位剂量的情况。在一些实施方式中，细胞或用途包括其中连续给药包括给予单个单位剂量的情况。

在一些实施方式中，使用的细胞组合物或用途包括其中疾病或病症是肿瘤或癌症的情况。在一些实施方式中，使用的细胞或组合物或用途包括其中肿瘤或癌症是白血病或淋巴瘤的情况。在一些实施方式中，组合物或细胞用于治疗急性淋巴细胞性白血病。在一些实施方式中，组合物或细胞用于治疗非霍奇金淋巴瘤(nhl)。

在一些实施方式中，细胞、组合物或用途包括其中连续剂量配制用于给予小于或约等于之前剂量中重组受体-表达(例如，car-表达)细胞的数量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞的数量。在一些实施方式中，含连续剂量的细胞的组合物经配制用于给予与第一剂量或之前剂量相比增加数量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞。

还提供了用于进行该方法的制品。在一些实施方式中，制品包括多个容器，例如，可密封容器，各自单独包含用于给予对象的表达重组受体，例如，嵌合抗原受体(car)的细胞的单位剂量，包装材料，和/或标签或包装插页。

在一些实施方式中，单位剂量包括待以方法中的最低剂量，如第一剂量大小给予的细胞的量。在一些实施方式中，单位剂量包括不超过约1x10⁸个细胞，不超过约5x10⁷个细胞，不超过约1x10⁶个细胞/千克对象，或不超过约5x10⁵个细胞/kg对象。

在一些实施方式中，标签或包装插页包括用于向对象给予多个单位剂量的说明，例如，通过给予特定数量的这类单位剂量，例如，给予第一剂量中的1个单位剂量，并且然后给予包括1个或多个单位剂量的连续剂量。在一些实施方式中，说明具体指定了进行第一给药，所述第一给药包括向对象递送所述单位剂量之一，和进行连续给药，所述连续给药包括向对象给予所述单位剂量之一或多个。在一些实施方式中，它们具体指定在所述第一给药后约15至约27天的时间上进行连续给药。在一些实施方式中，该说明具体指定在已经确定指示对象中细胞因子释放综合征(crs)的因子的血清水平与所述之前剂量之前即刻的对象中所述指示物的血清水平相比低约10倍，低约25倍，和/或低约50倍时之后，或在已经确定crs的指示物已经达到峰值并正在下降，如小于或约峰值的40％、30％、20％或10％时之后，和/或对象没有显示可检测的针对由之前剂量的细胞表达的受体(例如，car)特异性的过继宿主免疫应答的之后进行连续给药。在一些实施方式中，容器是或包括柔性细胞灌注袋。在一些实施方式中，待给予和/或容器或单位剂量中的细胞是用于自体转移。因此，在一些实施方式中，细胞已经衍生自它们待给予的对象中。在一些实施方式中，该方法是用于同种异体给药。在一些实施方式中，标签和/或包装材料还包括对象特异性的标识符，其表示细胞衍生自该对象和/或应该特异性地给予该对象。

在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如原代人免疫细胞，例如，pbmc、t细胞、和/或nk细胞。在一些实施方式中，细胞包括cd8+和/或cd4+t细胞。在一些实施方式中，t细胞对于对象是自体同源的。

附图简要说明

图1a显示了用单次输注不同剂量的car-表达t细胞治疗的患有形态学或分子疾病(治疗开始时的疾病负荷)的对象的疾病反应。mrd-cr＝无最小残留疾病，完全缓解；mrd+cr＝最小残留疾病，完全缓解；nr＝没有反应。

图1b显示了用单次输注不同剂量car-表达t细胞治疗的具有形态学或分子疾病(治疗开始时的疾病负荷)的对象中严重的细胞因子释放综合征(crs)的存在(y)或不存在(n)细胞。

图1c显示用单次输注不同剂量的car-表达t细胞治疗的具有形态学或分子疾病(治疗开始时的疾病负荷)的对象中严重神经毒性的存在(y)或不存在(n)。

图2显示在给予第一剂量(输注＝#1)(左图)时呈现形态学或分子疾病的对象中和在给予连续剂量的car-表达t细胞(输注＝#2)(右图)时呈现形态学或分子疾病的对象中的峰值c反应蛋白(crp)水平。单个数据点旁边显示的数字和文字/缩写(例如“mrd-cr”，“mrd+cr”等)反映了所示输注后的患者人数和疾病负荷。mrd+＝最小残留疾病；mrd-＝无最小残留疾病；cr＝完全缓解。

图3a描绘了在各种条件下孵育24小时(培养基，k562-tcd19，k562-tror1，acd3/acd28)后，通过流式细胞术检测的pd-1、pd-l1和pd-l2在cd4和抗cd19嵌合抗原受体(car)的阳性表面表达门选的t细胞群上的表面表达，如实施例8所述。

图3b描述了在各种条件下孵育24小时(培养基，k562-tcd19，k562-tror1，acd3/acd28)后，通过流式细胞术检测的pd-1、pd-l1和pd-l2在cd4阳性表面表达和抗cd19嵌合抗原受体(car)阴性表面表达门选的t细胞群上的表面表达(上图中所示的门选策略)，如实施例8所述。

图4a描绘了在各种条件下孵育24小时(培养基，k562-tcd19，k562-tror1，acd3/acd28)后，通过流式细胞术检测的pd-1、pd-l1和pd-l2在cd8和抗cd19嵌合抗原受体(car)的阳性表面表达门选的t细胞群上的表面表达，如实施例8所述。

图4b描述了在各种条件下孵育24小时(培养基，k562-tcd19，k562-tror1，acd3/acd28)后，通过流式细胞术检测的pd-1、pd-l1和pd-l2在cd8的阳性表面表达的和抗cd19嵌合抗原受体(car)的阴性表面表达门选的t细胞群上的表面表达(上图中所示的门选策略)，如实施例8所述。

图5a显示在用单次输注car-表达t细胞治疗的对象中观察到的神经毒性程度(0-2级，3级，4-5级)。数据以肿瘤负荷(骨髓母细胞百分数)与对比每μl外周血的car表达-t细胞数(cd8⁺/egfr⁺，上图；或cd4⁺/egfr⁺，下图)作图。

图5b显示了用单次输注car-表达t细胞治疗的对象在重症监护病房(icu)中的护理需求。将数据以肿瘤负荷(髓胚百分比)对比每μl外周血cd8⁺/egfr⁺(上图)或cd4⁺/egfr⁺(下图)细胞数作图。

图6a显示通过流式细胞术测量的在输注后28天内用单次输注2×10⁵或2×10⁶car-表达t细胞治疗的对象的每μl外周血的cd8+car-表达t细胞(cd8⁺/egfr⁺)的数量。在输注之前，用2g/m²环磷酰胺与或不与3个剂量的100mg/m²依托泊苷(noflu)预调节对象，或者用60mg/kg(约2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(flu)治疗对象。

图6b显示通过流式细胞术测量的在输注后28天内用单次输注2×10⁵或2×10⁶car-表达t细胞治疗的对象每μl外周血的cd4+car-表达t细胞(cd4⁺/egfr⁺)数。在输注之前，用2g/m²环磷酰胺与或不与3个剂量的100mg/m²依托泊苷(noflu)预调节对象，或者用60mg/kg(约2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(flu)治疗对象。

图6c显示了用单次灌注2x10⁵or2x10⁶car-表达t细胞治疗的对象的无疾病存活百分比曲线。在输注之前，用2g/m²环磷酰胺与或不与3个剂量的100mg/m²依托泊苷(noflu)，或者用60mg/kg(约2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(flu)预调节对象。

图7a显示通过流式细胞术测量的在输注后28天内用单次输注2×10⁷car-表达t细胞治疗的对象的每μl外周血的cd8+car-表达t细胞(cd8⁺/egfr⁺)的数量(上图)和百分比(下图)。在输注之前，用2-4g/m²环磷酰胺与或不与3个剂量的100-200mg/m²依托泊苷(noflu)预调节对象，或者用30-60mg/kg(约1-2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(cy/flu)治疗对象。

图7b显示通过流式细胞术测量的在输注后28天内用单次输注2×10⁷car-表达t细胞治疗的对象的每μl外周血的cd4+car-表达t细胞(cd4⁺/egfr⁺)的数量(上图)和百分比(下图)。在输注之前，用2-4g/m²环磷酰胺与或不与3个剂量的100-200mg/m²依托泊苷(noflu)预调节对象，或者用30-60mg/kg(约1-2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(cy/flu)治疗对象。

发明详述

i.用表达重组受体的细胞治疗的方法

提供了用于细胞治疗，用于治疗包括各种肿瘤的疾病或病症的方法、组合物和制品。该方法涉及给予表达重组受体的工程细胞，所述重组受体被设计为识别和/或特异性地结合与疾病或病症相关的分子，并导致响应，例如在结合到这些分子时对这些分子的免疫应答。受体可以包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(car)和其它转基因抗原受体，包括转基因t细胞受体(tcr)。

具体地，所述方法包括向接受第一剂量的对象给予一个或多个连续剂量的细胞，和/或给予第一和一个或多个连续剂量。剂量通常以特定量和根据特定时间参数给予。在一些实施方式中，该方法通常包括给予第一剂量的细胞，从而减少疾病负荷，之后在相对于第一剂量的特定时间窗口期间给予连续剂量的细胞的，或向已经接受了这样的第一剂量的对象给予连续剂量。第一剂通常是较低的剂量。在一些实施方式中，然后例如在相对于连续剂量的相同或相似的时间窗内给予额外的连续剂量。在一些实施方式中，给予的细胞数量和多次剂量的时间经设计以改善一种或多种结果，例如降低对象的毒性程度或可能性，改善对象对给予的细胞的接触和/或持续性，和/或改善治疗功效。还提供含有细胞的制品，并且经设计用于这种给药方案之后的给药。

在一些实施方式中，所提供的方法是基于本文观察到的对象对所给予的细胞的暴露增加(例如，随时间增加的细胞数或持续时间)可以改善过继细胞治疗中的功效和治疗结果。在多个临床试验中向患有各种cd19-表达癌症的对象给予不同的cd19-靶向car-表达t细胞之后进行的初步分析显示更高和/或更长的与car-表达细胞的暴露程度与治疗结果之间存在相关性。这些结果包括患者的生存和缓解，甚至在具有严重肿瘤负荷的个体中。

然而，递送高初始剂量的重组免疫刺激细胞不一定增加暴露。特别是在高疾病负荷(因此抗原量较高)的情况下，给予大剂量不一定会提高功效，并且可导致细胞增加或快速增殖并产生毒性。某些报告表明，剂量和毒性之间缺乏相关性。参见park等，moleculartherapy15(4)：825-833(2007)。另一方面，较高初始剂量可以促进毒性结局，如细胞因子释放综合征(crs)，特别是在高疾病负荷的背景下。此外，高剂量不一定转变成所给予的细胞的持久性增加，因此不一定随时间增加暴露。参见park等，moleculartherapy15(4)：825-833(2007)。同样，通常在治疗开始时存在的高度疾病负荷的情况下给予细胞可能导致转移的细胞耗尽，从而降低临床疗效。参见davila和brentjens，hematoloncolclinnortham.27(2)：341-53(2013)。

给予后续剂量可能不是有效的，特别是在复发之后和/或对象已经对细胞或表达的重组受体具有特异性的免疫应答的情况中。需要改进的方法来增加随时间的细胞暴露，同时避免毒性结果。

所提供的方法优于其他旨在解决毒性结果风险和/或改善功效的方法。许多这样的方法例如聚焦于在靶向毒性的下游作用，例如通过细胞因子阻断，和/或递送剂如高剂量类固醇，其还可以消除或损害所给予的细胞的功能。许多这些其他方法也不能阻止其他形式的毒性，如神经毒性，这可能与过继细胞治疗有关。另一方面，给予较低剂量的细胞(例如car-表达细胞)可能降低风险，但可能不是完全有效的。后续剂量的细胞的递送，例如，在初次给药后的复发之后，也不完全令人满意。由于针对初始剂量的宿主免疫应答，这种给药方法可导致后续剂量的有限或无效的应答。

提供的方法包括以最小化毒性风险并使功效最大化的方式给予连续剂量的细胞治疗。如本文所观察到的，在给予患有b细胞癌的人类对象不同类型的cd19-靶向cart细胞后，等于或低于1×10⁶个细胞/千克体重的初始剂量有效减少肿瘤负荷。与较高剂量相比，这些低剂量也与较低频率的严重crs、神经毒性和其他不良事件相关。在一些实施方式中，所提供的方法包括这种低剂量的安全初始给药，接着是用于增加暴露的连续剂量，其中剂量和时间经设计以避免宿主免疫应答对功效的损害，同时最小化毒性风险。

在一些情况下，如果需要或在特定疾病或情况中需要，所提供的方法涉及以比第一剂量的细胞增加数量，因此以较高剂量给予的连续剂量的细胞。如本文所示，在一些方面，与较低剂量相比，给予较高剂量的细胞是有利的。在一些实施方式中，给予较高剂量的细胞，例如大于或等于2.5×10⁶个细胞/kg或更高的剂量，与对象，特别是在治疗前显示形态学疾病的对象中总体存活率增加相关。然而，在一些实施方式中，这些较高剂量可与毒性结果相关，特别是与神经毒性(例如严重的神经毒性，例如3级神经毒性或更高)有关，特别是在治疗前具有形态学疾病的对象中。在一些情况下，当治疗具有减轻的疾病负荷的对象时，没有观察到给予高剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞后的毒性结果，或者没有观察到大的程度，例如具有可分子检测的疾病的具有最小残留疾病的对象。在一些实施方式中，首先给予低剂量重组受体-表达(例如，car-表达)细胞的方法可以减少对象的疾病负荷，例如从形态学疾病状态到最小残留疾病，以便随后对象中给予较高的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞的剂量在大多数治疗的对象中不太可能导致毒性结果。在一些实施方式中，所提供的方法避免了与以较高剂量给药相关的毒性问题，同时最大化在给予较高数量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞后可能出现的治疗功效。

在一些实施方式中，该方法包括给予初始剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞，其可以在疾病相关抗原存在下增殖并减少疾病负荷，但不具有相同程度的可能与较高剂量相关的毒性结果。在一些方面，第一剂量是低剂量，例如小于等于或不超过或约1×10⁶个细胞/千克对象体重(细胞/kg)、0.5×10⁶个细胞/kg或1×10⁵个细胞/kg的剂量。在一些方面，第一剂量是已被观察到的不会在疾病或病症或对象中引起毒性结果，例如在一些实施方式中为crs或神经毒性的细胞数量或量。在一些实施方式中，第一剂量是与这样的结果相关的细胞的量或数量，例如基于临床数据，仅在相对较小百分比的患者中，例如不超过50％、40％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的对象。

在一些实施方案中，第一剂量通常也足够大以有效减少疾病负荷。在一些情况下，如果细胞剂量足以在体内增殖和减灭疾病，则第一剂量足够大以减少疾病负荷。在一些实施方式中，第一剂量的细胞因此减灭或减少疾病负荷，例如肿瘤大小，而不导致严重不希望的结果。在一些情况下，第一剂量是有效减少肿瘤负荷的细胞量，例如通过将疾病从形态学状态降低到最小残留疾病和/或临床或完全缓解。在一些方面，初始剂量是低剂量。在一些方面，例如，在较低的疾病负荷的情况下，第一剂量可能更高。

在一些方面，风险适应剂量方案用于确定剂量中适当的数量或量或相对数量或量的细胞或重组受体-表达(例如car-表达)细胞。例如，在一些方面，在输注重组受体-表达(例如，car-表达)细胞之前，确定对象的疾病负荷，并且基于疾病负荷，选择第一剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞(例如低剂量或高剂量)使其可以最小化毒性并最大化功效，例如，基于上文和本文其他地方的观察结果，其中较高剂量的重组受体-表达细胞(例如car-表达，如car-表达t细胞)可能与具有形态学疾病负荷的对象中的毒性结果(如严重的神经毒性)相关，这些不一定被观察到，或者在较低疾病负荷的对象中没有观察到大的程度。例如，在治疗之前具有在一些情况下可以与治疗后的更大的cart-细胞增殖相关的高骨髓肿瘤负荷的对象中观察到发生可能需要icu护理的严重神经毒性的较高风险。

在一些实施方式中，为了使在向不会或更不易于在输注重组受体-表达(例如，car-表达)细胞，例如，car-t细胞输注，重组受体表达的细胞之后产生毒性结果的对象(如不显示形态学疾病(即具有非形态学疾病)或不表现出明显形态学疾病的对象)中的功效最大化，可给予较高剂量的细胞，例如大于1×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg或1×10⁷个细胞/kg。相反地，在一些方面中，对例如通过存在形态学疾病或明显形态学疾病确定为具有较高疾病负荷的对象，可以相比给予不显示形态学疾病或不表现出明显形态学疾病的对象给予较低剂量的细胞，例如小于或等于或约1×10⁶个细胞/kg或者小于或等于或约0.5×10⁶个细胞/kg的剂量。在一些实施方式中，可以给予一个或多个其他连续剂量，其任选地可以基于如上所述的疾病负荷的程度或度来给予，或者可选地以固定剂量给予，而不管疾病负荷。在一些实施方式中，如果骨髓中存在大于或等于或约5％的胚细胞，则对象表现出形态学疾病或明显形态学疾病负荷。在一些实施方式中，具有较高相对疾病负荷(例如具有高骨髓肿瘤负荷)的对象在骨髓中具有大于、等于或大于约10％的胚细胞，或者大于、等于或大于约20％的胚细胞。

在一些实施方式中，在治疗之前评估对象的疾病负荷，并且如果对象显示小于5％的骨髓胚细胞，则可以给予对象大于1×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg或1×10⁷个细胞/kg的重组受体-表达(例如，car-表达，如car-表达t细胞)的剂量，或者如果对象表现出大于或等于5％的骨髓胚细胞，则可给予对象小于或等于或约1×10⁶个细胞/kg或0.5×10⁶个细胞/kg的重组受体-表达(例如car-表达，如car-表达t细胞)的剂量。在一些实施方式中，在治疗之前评估对象的疾病负荷，并且如果对象显示小于10％的骨髓胚细胞，则可以给予对象大于1×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg或1×10⁷个细胞/kg的重组受体-表达(例如，car-表达，如car-表达t细胞)的剂量，或者如果对象表现出大于或等于10％的骨髓胚细胞，则可给予对象小于或等于或约1×10⁶个细胞/kg或0.5×10⁶个细胞/kg的重组受体-表达(例如car-表达，如car-表达t细胞)的剂量。在一些实施方式中，在治疗之前评估对象的疾病负荷，并且如果对象显示小于20％的骨髓胚细胞，则可以给予对象大于1×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg或1×10⁷个细胞/kg的重组受体-表达(例如，car-表达，如car-表达t细胞)的剂量，或者如果对象表现出大于或等于20％的骨髓胚细胞，则可给予对象小于或等于或约1×10⁶个细胞/kg或0.5×10⁶个细胞/kg的重组受体-表达(例如car-表达，如car-表达t细胞)的剂量。在一些实施方式中，评估疾病负荷并且在第一剂量的重组受体-表达(例如car-表达，如car-表达t细胞)之前选择风险适应剂量。在一些实施方式中，评估疾病负荷并且在一个或多个连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达，如car-表达t细胞)之前选择风险适应剂量。

在一些实施方式中，在给予第一或初始剂量的细胞之后时，向对象给予连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞，其中对象的肿瘤负荷可能已被第一剂量降低。在一些实施方式中，在给予连续剂量之前，实际上并非所有对象的肿瘤负荷必须降低，而是在受治疗的对象中平均降低肿瘤负荷，例如基于临床数据，其中大多数用这样的第一剂量治疗的对象表现出减少的肿瘤负荷，例如用第一或初始剂量治疗的对象中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多显示减少的肿瘤负荷。通常在疾病负荷已经通过第一剂量减少或可能已经被第一剂量减少的时间点，向对象给予连续剂量，从而进一步减少和/或消除疾病或其症状或结果或者防止其扩大或发展。在一些方面，连续给药时减少疾病负荷的情况减少了转移的细胞耗尽的可能性，从而提高了疗效。与第一剂量相比，连续剂量可以是相同、较低或较高的剂量。在一些实施方式中，在第一剂量之后给予多个连续剂量。

在一些实施方式中，以高于第一剂量的剂量给予连续剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞，使得增加数量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞通过连续剂量给予对象。在一些实施方式中，较高剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞是可以促进增加的应答或功效的细胞，例如与通过给予较低剂量或数量的细胞所实现的效果相比，改善或更大降低肿瘤负荷和/或改善的或更长的总生存时间。在一些实施方式中，因为给予第一剂量的细胞可以降低对象的肿瘤负荷，所以以较高数量的细胞给予连续剂量可以在给予连续剂量之后避免或最小化对象中的否则可能发生在具有形态学疾病的对象中的crs和/或神经毒性。

在一些实施方式中，在给予连续剂量之前，对象是表现出非形态学疾病，例如分子可检测疾病和/或最小残留疾病的对象。在一些实施方式中，可以在给予第一剂量之后和给予连续剂量之前评估对象的肿瘤负荷，以确认与用第一剂量治疗之前存在的肿瘤负荷相比肿瘤负荷已经降低。在一些实施方式中，如果对象的评估指示肿瘤负荷降低和/或对象表现出非形态学疾病，例如，分子可检测疾病和/或最小残留疾病，则所提供的方法包括给予高于第一剂量或初始剂量的连续剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞。在一些实施方式中，如果对象的评估指示肿瘤负荷未降低和/或受试者表现出形态学疾病，则所提供的方法包括给予等于或小于第一或初始剂量的连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。

在一些实施方式中，连续剂量相对于第一和/或另一个剂量的时间经设计以降低不希望的毒性结果的风险并且促进最大功效。在一些实施方式中，在对象的疾病负荷仍然减少或者对象平均减少，例如基于临床数据，但在crs和/或神经毒性的风险仍然很低时，给予连续剂量，例如相同、较低或较高的连续剂量。在一些实施方式中，提供了通过首先给予低剂量的car+t细胞以减少对非形态学疾病的疾病或肿瘤负荷来预防、最小化或减少对象中的crs和/或神经毒性的方法，例如以实现最小残留疾病或分子可检测疾病状态，随后给予连续剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞。

在一些实施方式中，通常在毒性结果或其症状或生物化学指标(例如crs或神经毒性、巨噬细胞活化综合征或肿瘤裂解综合征)的风险等于或低于可接受水平的相对于第一或先前剂量的时间点给予连续剂量。例如，可在毒性结果达到峰值并且正在降低之后给予或在初始剂量后降至低于可接受水平之后给予连续剂量。因此，在一些实施方式中，第一次或在先剂量开始后至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27天，或在第一次或在先剂量开始之后的超过约14或15天或21天给予连续剂量。在一些实施方式中，通过监测和/或评估与毒性事件相关的一种或多种症状或结果的存在并在确定症状或结果等于或低于可接受水平之后递送连续剂量来确定适当的时间。

在一些实施方式中，连续剂量的时间是这样的，即避免了给予后续的剂量后由在给予第一剂量之后已经产生的宿主免疫应答可能诱导的功效降低。在一些方面，在发展出宿主免疫应答，例如针对给予的细胞和/或其表达的重组受体的适应性或特异性，例如体液或细胞介导的免疫应答之前，和/或例如，通过一种或多种专门的检测方法可以检测到这种响应之前给予连续剂量。通常在针对细胞的宿主适应性免疫应答未被检测到，尚未建立和/或尚未达到一定水平或程度或阶段时给予一个或多个连续剂量。在这方面，与在复发时(通常是在抗转基因应答已经出现之后)提供后续剂量相比，该方法是有利的。在一些实施方式中，在第一次或之前剂量之后的约28天或35天之前或制备或在第一剂量或先前剂量开始之后约24、25、26或27天之前给予连续剂量。

因此，在一些实施方式中所提供的方法涉及在毒性风险的窗口之后，在用第一剂量减灭或减少疾病负荷后，但在免疫应答的产生之前，给予一个或多个连续剂量。在这种环境和适当的时机下，连续剂量可以安全且有效地提供免疫监测、清除或预防残留疾病细胞的增殖或转移，无论是否通过标准或研究级分析方法测量。因此，在一些实施方案中，连续剂量是疾病巩固剂量。

在具体实施方式中，第一剂量包括足以降低对象中的疾病或病症负荷的量的细胞，并且在对象中指示细胞因子-释放综合征(crs)的因子的血清水平不超过该对象在给予第一剂量之前即刻的血清水平的10倍或25倍时和/或在对象中crs相关结果峰值水平并在给予第一剂量后开始下降时，并且在给予第一剂量后开始下降，并且对象不显示由第一剂量的细胞表达的重组受体特异的可检测的适应性宿主免疫应答时给予连续剂量。

在具体实施方式中，第一剂量包含少于约1×10⁶个细胞/千克对象体重，少于或约1×10⁸个细胞，和/或少于或约1×10⁸个细胞/m²对象，并且连续剂量在开始给予第一剂量之后超过约14天并且不到约28天的时间点给予。在一些实施方式中，连续剂量在第一或在先剂量后的或约14天，15天，16天，17天，18天，19天，20天，21天，22天，23天，24天，25天，26天，27天或28天给予。在具体实施方式中，连续剂量在第一或在先剂量后的约17天或约21天给予。

因此，所提供的方法提供优于单剂量给药的优点，其可导致严重的毒性、不期望的结果和/或较低的功效，特别是在高疾病负荷的情况下。它们还可以优于在初始剂量之后过快-增加不想要的副作用的风险-或者太晚，例如在建立对先前剂量的免疫应答之后给予后续剂量的方法。所提供的方法延长暴露于治疗性细胞、提高临床反应和/或患者存活的持久性和程度，同时减少毒性结果。还提供了提供用于这些方法的剂量的组合物和制品。

ii.过继细胞治疗中给予细胞。

提供的方法一般包括向具有被受体特异性识别的疾病或病症的对象给予多剂量的表达重组受体，如car，或其他抗原受体，如转基因tcr的细胞。给予一般实现疾病的一种或多种症状中的改善和/或治疗或预防疾病或病症或其症状。

本文中所用的“对象”是哺乳动物，例如人或其它动物，并且通常是人。在一些实施方式中，在给予第一剂量和/或在给予连续剂量之前，已经靶向疾病或病症，例如，肿瘤的治疗剂治疗对象。在一些方面中，对象对于其他治疗剂是难治性的或非响应性的。

在一些实施方式中，对象具有持续或复发的疾病，例如，在用另一种治疗性介入之后，包括化疗、放射、和/或造血干细胞移植(hsct)，例如，同种异体hsct。在一些实施方式中，所述给予有效地治疗对象，无论该对象是否已对另一种疗法具有抗性。

在一些实施方式中，对象对其他治疗剂有响应性并且用治疗剂治疗降低了疾病负荷。在一些方面中，对象初始对治疗剂有响应性，但是随着时间显示出疾病或病症的复发。在一些实施方式中，对象还没有复发。在一些这类实施方式中，所述对象经测定具有复发风险，例如处于复发高风险中，并且由此预防性地给予细胞，例如，以减小复发可能性或预防复发。

在一些方面中，对象还没有接受用另一种治疗剂的在先治疗。在一些实施方式中，对象在给予第一剂量之前没有接受表达car的细胞的剂量和/或没有接受表达car或由该细胞表达的其他受体或表达靶向相同分子或抗原的任何重组受体的细胞的剂量。在一些方面中，在给予第一剂量之前，对象没有接受第一剂量的表达car的细胞的剂量。

所述疾病、病症和紊乱包括肿瘤，包括实体肿瘤、血液恶性肿瘤，和黑素瘤，并包括局部和转移性肿瘤，感染性疾病，例如病毒或其它病原体，例如，hiv，hcv，hbv，cmv的感染，和寄生性疾病，以及自身免疫和炎性疾病。在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤，癌症，恶性肿瘤，赘生物，或其它增殖性疾病或病症。所述疾病包括但不限于：白血病、淋巴瘤、例如、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治滤泡性淋巴瘤淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、包括黑素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤，和/或间皮瘤。在一些实施方式中，对象患有急性淋巴细胞性白血病(all)。在一些实施方式中，对象具有非霍奇金氏淋巴瘤。

insomeembodiments,thesizeortimingofthedosesisdeterminedasafunctionoftheparticulardiseaseorconditioninthesubject.itiswithinthelevelofaskilledartisantoempiricallydeterminethesizeortimingofthedosesforaparticulardiseaseinviewoftheprovideddescription.insomecases,forexample,subjectswithnon-hodgkin’slymphoma(nhl)canbelessresponsiveoronlypartiallyresponsivetotreatmentwithrecombinantreceptor-expressingcells(e.g.,car-expressingcells,suchascar-expressingtcells)thansubjectswithacute-lymphoblasticleukemia(all).在一些情况中，给予具有nhl的对象的较低剂量的细胞可能不降低对象中的肿瘤负荷，从而增加了当给予连续剂量时对象中毒性结果的风险，如crs和/或神经毒性。在一些实施方式中，提供了方法，其中向具有nhl的对象给予比在第一剂量中给予的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞的剂量相同或较低的连续剂量，从而最小化或降低可能在给予连续剂量之后出现毒性副作用的风险。

在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤或癌症，并且对象在给予第一剂量之前有大肿瘤负荷，如大实体瘤或大量或大体积的疾病相关的，例如，肿瘤或癌细胞。在一些方面中，对象具有大量的转移癌和/或广泛的转移癌定位。在一些方面中，对象中的初始肿瘤负荷低并且对象有较少的转移癌。

在一些实施方式中，剂量的大小或时间由对象中的初始疾病负荷，如肿瘤负荷决定。例如，在一些情况中，对象一般给予第一剂量中的较低数量的细胞，在较低疾病负荷的情况下，如分子可检测的疾病和/或最小残留疾病，初始剂量可能较高。在其他情况中，在给予第一剂量之后显示较高疾病负荷的对象中，连续剂量可能与第一剂量相同或低于第一剂量。在一些实施方式中，使用本文所述的方法来评价对象的疾病负荷，如通过流式细胞术或qpcr方法评价分子疾病或骨髓中的胚的方法。

在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于，病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(cmv)、eb病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒。在一些实施方式中，所述疾病或病症是自体免疫或炎性疾病或病症，例如关节炎，例如类风湿性关节炎(ra)，i型糖尿病，系统性红斑狼疮(sle)，炎性肠病，牛皮癣，硬皮病，自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫斯病，克罗恩病多发性硬化，哮喘和/与移植相关的疾病或病症。

在一些实施方式中，与所述疾病或紊乱相关的其他抗原选择自下组：孤儿酪氨酸激酶受体rorl、tegfr、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea、和肝炎b表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erbb2、3、或4、fbp、胎儿乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1-细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、癌胚抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶b2、cd123、cs-1、c-met、gd-2，和magea3、ce7、维尔姆斯瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白a1(ccna1)和/或生物素化分子，和/或通过hiv、hcv、hbv或其它病原体表达的分子。

本文中所用的术语“治疗”(及其语法变化形式例如“治疗的”和“治疗性”)指完全或部分减轻或减少疾病或病症或紊乱或与其相关的症状、不利作用或结果或表型。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和减轻或改善预后。该术语不表示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果具有效果。

本文中所用的“延迟疾病的发展"表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、遏制和/或拖延所述疾病(例如癌症)的发展。该延迟可具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或待治疗的个体。本领域技术人员应明了，实际上，充分或显著的延迟可涵盖预防(对于未发展所述疾病的个体而言)。例如，晚期癌症，例如转移的发展，可被延迟。

本文中所用的“预防”包括对于疾病在倾向于发展疾病但尚未被诊断患病的对象中的发生或复发提供预防方法。在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。

本文中所用的“遏制”功能或活性意指，在与其它情况下的相同(除感兴趣病症或参数)病症相比时或者相较于另一病症，功能或活性的减少。例如，与没有细胞下的肿瘤生长速率相比，遏制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。

试剂，例如，药物制剂、细胞或组合物，在给予情况下的“有效量”，指某一个量，其在一定剂量/量下且作用必要的时间长度时，有效于实现所需结果，例如治疗或预防结果。

试剂，例如，药物制剂或细胞的“治疗有效量”，指某一个量，其在剂量上和必需时程上，有效于实现所需治疗结果，例如疾病、病症或紊乱的治疗，和/或该治疗的药物动力学或药代动力学效果。治疗有效量可根据多种因素变化，例如，疾病状态、年龄、性别，和对象体重，以及给予的细胞群。在一些实施方式中，所提供的方法涉及给予有效量(例如，治疗有效量)的所述细胞和/或组合物。

“预防有效量”指，某一个量，其对于一定剂量和必要时程而言，有效于实现所需预防结果。通常而言(但不一定)，由于预防剂量在疾病的早期或之前用于对象，预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负荷的情况中，在一些方面中，预防有效量将高于治疗有效量。

用于给予用于过继细胞治疗的细胞的方法是已知的，并可与本文提供的方法和组合物联用。例如，过继t细胞治疗方法描述于，例如，gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；rosenberg的美国专利号4,690,915；rosenberg(2011)natrevclinoncol.8(10):577-85)。参见例如themeli等.(2013)natbiotechnol.31(10):928-933；tsukahara等.(2013)biochembiophysrescommun438(1):84-9；davila等.(2013)plosone8(4):e61338。

在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继t细胞治疗，通过如下方式进行：自体转移，其中，所述细胞经分离和/或在其它情况中从接受所述细胞治疗的对象或从源自此类对象的样品制备。因此，在一些方面中，所述细胞源自需要治疗和所述细胞的对象(例如，患者)，并在分离和处理之后给予同一对象。

在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继t细胞治疗，通过如下方式进行：同种异体转移，其中，所述细胞分离和/或在其它情况中从对象制备，该对象与待接受或最终接受所述细胞治疗的对象(例如，第一对象)不同。在此类实施方式中，然后将所述细胞给予相同物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相同的。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相似的。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象相同的hla类别或超类型。

所述细胞可通过任何合适的方式给予，例如，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一些实施方式中，它们通过胃肠外、肺内的和鼻内，以及如果希望局部治疗，病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，通过多次推注给予细胞，例如，在不超过3天的时间上，或通过连续输注给予细胞来给予。

对于预防或治疗疾病，合适剂量可取决于待治疗的疾病类型，重组受体或细胞类型，疾病的严重程度和疾病病程、该细胞是否给予用于预防性或治疗性目的、先前治疗、对象的临床史和对所述细胞的响应，以及主治医师的判断。在一些实施方式中，所述组合物和细胞适合在一个时间点或以一系列治疗来给予对象。

在一些实施方式中，所述细胞作为联合治疗的部分给予，例如，与另一治疗性介入，例如抗体或经工程改造的细胞或受体或试剂，例如细胞毒性或治疗剂，同时或依次地，以任何顺序给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种其它治疗剂共同给予，或与另一治疗介入联合，同时或以任何顺序依次进行。在一些情况中，所述细胞与另一治疗在足够接近的时间共同给予，从而所述细胞群增强一种或多种其它治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，所述细胞在一种或多种其它治疗剂之前给予。在一些实施方式中，所述细胞在一种或多种其它治疗剂之后给予。在一些实施方式中，一种或多种其他治疗剂包括细胞因子，如il-2，例如，以增强持久性。

在一些实施方式中，该方法包括在第一或连续剂量给予之前给予化疗剂，例如，调节化疗剂，例如，以降低肿瘤负荷。

用免疫消耗(例如，淋巴消耗)疗法预调节对象可改善过继细胞治疗(act)的效果。用淋巴消耗剂，包括环孢霉素和氟达拉滨的组合预调节已经有效该少了细胞治疗中转移的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的功效，包括该少转移的细胞的响应和/或持久性。参见，例如，dudley等，2002science,298,850-54；rosenberg等，clincancerres2011,17(13):4550–4557。类似地，在car+t细胞的情况中，几项研究已经纳入了淋巴消耗剂，最常见的是环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀、或其组合，有时伴随低剂量辐射。参见han等，journalofhematology&oncology2013,6:47；kochenderfer等，blood2012；119:2709-2720；kalos等，scitranslmed2011,3(95):95ra73；临床试验研究记录号:nct02315612；nct01822652。可以降低可能降低治疗功效的多种结构中的一种或多种的风险为目标来进行这类预调节。这些包括称为“细胞因子槽”的现象，通过该现象，t细胞、b细胞、nk细胞与til竞争稳态和活化细胞因子，如il-2、il-7和/或il-15；由调节t细胞、nk细胞或免疫系统的其他细胞抑制til；负调节剂在肿瘤微环境中的影响。muranski等，natclinpractoncol.2006年12月；3(12):668–681。

因此，在一些实施方式中，该方法包括在第一或后续剂量之前向对象给予预调节剂，例如淋巴消耗剂或化学治疗剂，例如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可在第一或后续剂量之前至少2天，如3天、4天、5天、6天或7天之前，给予对象预调节剂。在一些实施方式中，在第一剂量或后续剂量之前不超过7天(例如之前不超过6、5、4、3或2天)给予对象预调节剂。

在一些实施方式中，当淋巴消耗剂包含环磷酰胺时，向对象给予约0.5g/m²至5g/m²，如约1g/m²至4g/m²，1g/m²至3g/m²，或2g/m²至4g/m²的环磷酰胺。在一些方面，给予对象2g/m²环磷酰胺或约2g/m²环磷酰胺。在一些实施方式中，用约20mg/kg至100mg/kg，如约40mg/kg至80mg/kg之间的剂量的环磷酰胺预调节对象。在一些方面，用约60mg/kg环磷酰胺预调节对象。

在一些实施方式中，当淋巴消耗剂包含氟达拉滨时，以约1g/m²至100g/m²，例如约10g/m²至75g/m²，15g/m²至50g/m²，20g/m²至30g/m²，或24g/m²至26g/m²的剂量向对象给予氟达拉滨。在一些情况下，给予对象25g/m²的氟达拉滨。在一些实施方式中，可以单一剂量给予或可以多个剂量，例如每天，每隔一天或每三天给予氟达拉滨。例如，在一些情况下，约1至5次，例如约3至5次给予所述药剂，例如氟达拉滨。在一些实施方式中，这样的多个剂量在同一天给予，例如每天1至5次或3至5次。

在一些实施方式中，淋巴消耗剂包含试剂的组合，例如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，试剂的组合可包含任何剂量或给药方案(例如上述那些)的环磷酰胺和任何剂量或给药方案(例如上述那些)的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一或后续剂量之前，给予对象60mg/kg(约2g/m²)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m²氟达拉滨。

在一些实施方式中，在输注第一剂量或后续剂量之前给予预调节剂改善了治疗的结果。例如，在一些方面，预调节改善了用第一或后续剂量治疗的功效，或增加了对象中重组受体-表达细胞(例如car-表达细胞，如car-表达t细胞)的持久性。在一些实施方式中，预调节治疗增加无病生存期，例如存活对象的百分比并且在第一或后续剂量之后的给定时间段之后没有显示最小残留或分子可检测的疾病。在一些实施方式中，中位无病存活时间增加。

一旦向对象(例如，人)给予细胞，在一些方面中，通过多种已知方法中的任一种来测量工程改造的细胞群的生物活性。用以评估的参数包括：工程改造的或天然t细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过elisa或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，kochenderfer等，j.immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和herman等.j.immunologicalmethods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，也可通过测定某些细胞因子，例如cd107a，ifnγ，il-2和tnf的表达和/或分泌，来测量细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减少，来检测。在一些方面，评估细胞的毒性结果、持久性和/或增殖，和/或存在或不存在宿主免疫应答。

在某些实施方式中，工程改造的细胞以任何数量的方式修饰，从而增加其治疗或预防性功效。例如，通过所述群表达的工程改造的car或tcr可通过接头直接或间接连接靶向部分。连接化合物，例如，将car或tcr连接至靶向部分的实践是本领域已知的。参见例如，wadwa等,j.drugtargeting3:111(1995)，和美国专利5,087,616。

iii.给药

多个剂量的细胞的时间和大小通常经设计以降低风险或最小化毒性结果和/或提高功效，例如通过随时间提供对象对细胞的暴露增加。该方法包括通常在一个或多个连续剂量之后，在不同剂量之间的特定时间范围内给予第一剂量。

在过继细胞治疗的情况下，给予给定的“剂量”包括以单一组合物和/或单次不间断给药，例如以单次注射或连续输注给予给定量或数量的细胞，并且还包括在不超过3天特定时间段内，以分开剂量，在多个单独组合物或输注物中提供，给予给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，第一或连续剂量是在单个时间点给予或开始的指定数量的细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，第一或连续剂量在不超过三天的时间段内进行多次注射或输注，例如每天一次持续三天或两天，或通过在一天时间内的多次输注。

因此，在一些方面，第一剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以单一药物组合物给予。

在一些实施方式中，第一剂量的细胞以总体含有第一剂量的细胞的多个组合物给予。在一些实施方式中，连续剂量的细胞以总体含有连续剂量的细胞的多个组合物给予。在一些方面，可以在不超过3天的时间内以多个组合物给予额外的连续剂量。

术语“分开剂量”是指分开的剂量，使其在超过一天的时间内给药。这种类型的给药包括在本方法中，并且被认为是单一剂量。

因此，在一些方面中，第一剂量和/或连续剂量可以分开剂量给予。例如，在一些实施方式中，可在2天或3天内向对象给予该剂量。分开给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量，并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方式中，第一剂量的33％可以在第一天给予，而在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施方式中，分开剂量扩展不超过3天。

关于在先剂量，例如第一剂量，术语“连续剂量”是指在在先的，例如，第一剂量之后期间没有向对象给予任何间插剂量的情况下给予受试者的剂量。尽管如此，该术语不包括在单次分开剂量内包含的一系列输注或注射中的第二，第三和/或其他注射或输注。因此，除非另有说明，否则在一天、两天或三天内的第二输注不被认为是本文所用的“连续”剂量。类似地，在分开剂量内的多个剂量系列中的第二，第三和其他的剂量也不被认为是“连续”剂量意义内容中的“间插”剂量。因此，除非另有说明，即使在对象在第一剂量开始之后接受第二或后续注射或输注，在第一或在先剂量开始之后，在超过3天的一定时间段给予的剂量被认为是“连续”剂量只要在第一或在先剂量开始后的三天时间内开始第二或后续注射或输注。

因此，除非另有说明，否则在多达3天的时间段内将相同细胞的多次给予视为单一剂量，并且在初始给药后3天内给予细胞不被认为是连续剂量，并且不被认为是以确定第二剂量是否与第一剂量“连续”为目的的间插剂量。

在一些实施方式中，在一些方面，给予多个连续剂量，使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时间相同的时序指导，例如通过给予一段时间内给予的每个连续剂量的第一和多个连续剂量，这段时间是给予第一次或在先的剂量之后即刻的超过约14天并小于约28天，例如约21天。额外的多个其他连续剂量也称为后续剂量或后续连续剂量。

如本文所用，“第一剂量”用于描述在给予连续或后续剂量之前给定剂量的时间。该术语并不一定意味着对象之前从未接受过一定剂量的细胞治疗，或者对象之前还没有接受表达相同重组受体或靶向相同抗原的相同细胞的剂量。

剂量的量或大小

通常设计第一和/或一个或多个连续剂量的细胞的大小以提供改善的功效和/或降低的毒性风险。在一些实施方式中，第一剂量中的细胞的数量为约0.5x10⁶细胞/kg对象体重至3x10⁶细胞/kg，约0.75x10⁶细胞/kg至2.5x10⁶细胞/kg或约1x10⁶细胞/kg至2x10⁶细胞/kg，各自包括端值。

在一些实施方式中，第一剂量是低剂量。在具体实施方式中，第一剂量包含一定数量的细胞、一定数量的重组受体(例如，car)-表达细胞，一定数量的t细胞或一定数量的外周血单核细胞(pbmc)，该数量为约10⁵至约10⁶这类细胞/千克对象体重，包括端值，和/或一定数量的此类细胞，该数量不超过约10⁵或约10⁶个此类细胞/千克对象体重，包括端值。例如，在一些实施方式中，第一剂量包括小于或不超过或约1×10⁵，等于或约2×10⁵，等于或约5×10⁵，或等于或约1×10⁶个此类细胞/千克对象体重。在一些实施方式中，第一剂量包括等于或约1×10⁵，等于或约2×10⁵，等于或约5×10⁵，或等于或约1×10⁶的这类细胞/千克对象体重，或在任何两个上述值之间的范围内的值。在具体实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如car)-表达细胞的数量。在其他实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、t细胞或外周血单个核细胞(pbmc)的数量或浓度。

在一些实施方式中，例如，在对象是人的情况下，第一剂量包括小于或等于约1×10⁸个总重组受体(例如car)-表达细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)，例如，在约1×10⁶至1×10⁸个此类细胞(包括端值)，例如不超过2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、或1x10⁸或全部此类细胞，或任何两个前述值之间的范围。

在一些实施方式中，例如，第一剂量包括小于或等于约1×10⁸个总重组受体(例如car)-表达细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)/m²对象，例如，在约1×10⁶至1×10⁸个此类细胞/m²对象(包括端值)，例如不超过2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、或1x10⁸或全部此类细胞/m²对象，或任何两个前述值之间的范围。

在某些实施方式中，例如，当确定对象的毒性风险和/或疾病负荷被确定为低时，第一剂量可以是较高剂量，例如大于1×10⁶个细胞/kg或其包括超过1×10⁸个细胞，例如t细胞或pbmc，或超过1×10⁸个此类细胞/m²对象的剂量。在一些实施方式中，如果对象不显示明显形态学疾病或不显示形态学疾病或显示骨髓中小于20％的胚细胞，骨髓中小于15％的胚细胞，骨髓中小于10％的胚细胞或骨髓中小于5％的胚细胞，则疾病负荷低。在一些实施方式中，如果对象表现出非形态学疾病，例如显示最小残留疾病或分子可检测的疾病，但不显示与其他地方所述的本领域已知的形态学疾病相关的特征，如不显示骨髓中超过5％的胚细胞，则疾病负荷低。在一些实施方式中，第一剂量中的细胞、重组受体(例如，car)表达细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)的数量大于约1×10⁶个此类细胞/千克对象体重，例如，2×10⁶、3×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、1×10⁹，或1×10¹⁰个此类细胞/千克体重，和/或1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰个此类细胞/m²对象或总数，或任何两个前述值之间的范围。

在一些实施方式中，以连续剂量给予的细胞数量与本文的任何实施方式中在第一剂量中给予的细胞数量相同或类似，例如小于或不超过等于或约1×10⁵，等于或约2×10⁵，等于或约5×10⁵，或等于或约1×10⁶个此类细胞/千克对象体重。在一些实施方式中，连续剂量含有等于或约1×10⁵，等于或约2×10⁵，等于或约5×10⁵，或等于或约1×10⁶的这类细胞/千克对象体重，或在任何两个上述值之间的范围内的值。

关于细胞数量，在一些实施方式中，这些值是指重组受体-表达(例如car-表达)细胞的数量；在其它实施方式中，它们是指给予的t细胞或pbmc或总细胞的数量。

在一些方面，连续剂量大于第一剂量。例如，在一些实施方式中，连续剂量含有超过约1×10⁶个细胞、重组受体(例如car)-表达细胞、t细胞和/或pbmc/千克对象体重，例如约或至少约2x10⁶、3x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、或1x10⁹个此类细胞/千克对象体重。在一些实施方式中，连续剂量中的细胞的数量为约2x10⁶细胞/kg对象体重至6x10⁶细胞/kg，约2.5x10⁶细胞/kg至5.0x10⁶细胞/kg或约3.0x10⁶细胞/kg至4.0x10⁶细胞/kg，各自包括端值。在一些实施方式中，连续剂量的量或大小足以减少疾病负荷或其指标，和/或疾病或病症的一种或多种症状。在一些实施方式中，剂量具有有效改善对象生存的大小，例如，改善对象存活，例如，诱导对象存活、无复发存活或无事件存活持续至少6个月或至少1、2、3、4或5年。在一些实施方式中，以连续剂量给予每对象体重的细胞、重组受体(例如car)表达的细胞、t细胞和/或pbmc的数量和/或此类细胞的数量为第一剂量中给予的数量至少2倍、5倍、10倍、50倍或100倍或更多。在一些实施方式中，与给予第一剂量或连续剂量之前即刻相比，在连续剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少等于或约50％、60％、70％、80％、90％或更多。

在其他实施方式中，以连续剂量给予的细胞的数量低于在第一剂量中给予的细胞的数量。

在一些实施方式中，在第一剂量之后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量后给予额外的剂量。在一些方面，以另外的剂量(即，第三，第四，第五等)给予对象的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方式中，额外剂量大于在先剂量。

在一些方面，基于一个或多个标准来确定第一和/或连续剂量的大小，例如对象对在先治疗的反应，例如，化疗，对象的疾病负荷，例如肿瘤负荷，体积，大小或度，程度，或转移类型，阶段和/或对象发生毒性结果的可能性或发生率，例如crs，巨噬细胞活化综合征，肿瘤溶解综合征，神经毒性和/或针对给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答。

在一些方面，第一和/或连续剂量的大小由对象中疾病或病症的负荷决定。例如，在一些方面，基于在给予第一剂量之前即刻存在于对象中的肿瘤负荷来确定以第一剂量给予的细胞的数量。在一些实施方式中，第一和/或连续剂量的大小与疾病负荷成反比。在一些方面，如在疾病负荷较大的情况下，对象被给予少量细胞，例如小于约1×10⁶个细胞/千克对象体重。在其它实施方式中，如在较低疾病负荷的情况中，给予对象较大数量的细胞，例如大于约1×10⁶个细胞/千克对象体重，例如大于约2×10⁶、2.5×10⁶或3×10⁶个细胞/kg。

在一些方面，基于在给予第一剂量之前即刻存在于对象中的肿瘤负荷来确定以连续剂量给予的细胞的数量。在一些实施方式中，例如，其中第一剂量导致疾病负荷减少或降低，或已经低于特定阈值量或水平，例如高于其表示毒性结果的风险增加，连续剂量高或大，例如，超过1×10⁶个细胞(例如，总细胞、受体-表达细胞、t细胞或pbmc)/千克体重，例如，大于2.0x10⁶、2.5x10⁶或3.0x10⁶个细胞/kg，和/或大于第一剂量。在一些实施方式中，如果对象在治疗前表现出形态学疾病并且显示具有或不具有分子上可检测的(例如通过流式细胞术或定量pcr检测)分子疾病(例如，最小残留疾病(mrd))的完全缓解(例如骨髓中少于5％的胚细胞)，则该对象表现出减少或降低的疾病负荷。在一些实施方式中，如果对象在治疗前显示分子疾病并且在治疗后不显示分子疾病，则对象表现出减少或降低的疾病负荷。

在其他方面，以连续剂量给予的细胞数量低，例如，小于约1×10⁶，例如，与第一剂量相同或更低，其中第一剂量在很小程度上降低了肿瘤负荷，或者其中第一剂量未导致肿瘤负荷的可检测的降低。在一些情况下，即使在接受第一剂后对象的肿瘤负荷没有降低，连续剂量可以高或大，例如，超过1×10⁶个细胞(例如，总细胞、受体-表达细胞，t细胞或pbmc)/千克体重，例如超过2.0×10⁶，2.5×10⁶或3.0×10⁶个细胞/kg，和/或大于第一剂量。

在一些实施方式中，第一剂量包括不引起或降低毒性或毒性结果的可能性的量的细胞，例如细胞因子释放综合征(crs)、严重crs(scrs)、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、持续三天或更多天的至少38摄氏度或约38摄氏度的发热，crp血浆水平至少等于或约20mg/dl，神经毒性和/或神经毒性。在一些方面，基于在给予细胞后对象将显示毒性或毒性结果(例如crs，scrs和/或crs相关结果)的可能性来确定在第一剂量中给予的细胞的数量。例如，在一些实施方式中，基于肿瘤负荷预测对象中发展毒性结果的可能性。在一些实施方式中，该方法包括在给予剂量之前检测或评估毒性结果和/或疾病负荷。

在一些方面，基于给予第一剂量后的毒性或毒性结果，例如，crs-相关结果的水平确定以连续剂量给予的细胞的数量。例如，在一些实施方式中，以连续剂量给予的细胞数量较低，例如，小于1×10⁶个细胞/千克体重，例如，如果对象在给予第一剂量后呈现可检测水平的毒性或毒性结果，例如crs相关结果，则与第一剂量相同或低于第一剂量。

在一些实施方式中，对象在其显示毒性或毒性结果，例如crs相关结果的第一剂量之后的一个时间不给予连续剂量(例如，如果crs或毒性的其他生物化学指示物的血清水平比基线或处理前水平(如在给予第一剂量之前即刻的指示物的血清水平)高等于或约10倍、高等于或约15倍、高等于或约20倍、高等于或约25倍、高等于或约50倍、高等于或约75倍、高等于或约100倍、高等于或约125倍、高等于或约150倍、高等于或约200倍、或高等于或约250倍)。

在一些实施方式中，对象被给予连续剂量，如果且当第一剂量之后的，毒性结果的生物化学指示物或其他指示物，例如，crs指示物的血清水平没有增加到高于给定水平，例如可接受的水平，例如大于或等于或约10、15、20、25、50、75或100倍的给予第一剂量之前即刻的指示物的血清水平，或者已经增加到可接受水平之上，但已经下降到等于或低于可接受水平时。在某些方面，如果指示物在给予第一剂量的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35天内，例如，在21天内和/或在15-27天内，21天内，28天内，或35天内下降至可接受水平以下，则给予连续剂量，但如果指示物的水平不在该时间段内降低到可接受水平以下，则不给予连续剂量。

在一些实施方式中，如果在发生细胞因子释放综合征(crs)、巨噬细胞活化综合征或肿瘤溶解综合征或神经毒性的临床风险不存在或已过去或在第一次给药后已经消退，则给予连续剂量，如在这种事件通常已经消退和/或不太可能发生的关键窗口之后，例如在60％、70％、80％、90％或95％的具有特定疾病或病症的对象中。

在一些实施方式中，是否给予连续剂量，何时给予连续剂量，和/或连续剂量中给予的细胞数量基于对象中针对第一剂量的细胞或其表达的重组受体的免疫应答或可检测免疫应答的存在、不存在或程度确定。在一些方面，含表达第一剂量的细胞的受体的细胞的连续剂量将不会给予具有可检测的宿主适应性免疫应答或已经建立或达到一定水平、阶段或程度的免疫应答的对象。

剂量的时间

在一些方面，从第一剂量开始到连续剂量开始测量连续剂量的时间。在其它实施方式中，连续剂量的时间是从第一剂量完成，或从给予第一剂量的中位日起，例如，在本文所述的分开剂量的情况下，其中超过1天，例如，2天或3天给予剂量。

在一些实施方式中，在对象中指示crs的因子的血清水平不超过给予第一剂量前即刻的对象中该指示物的血清水平的10倍、25倍、50倍或100倍时给予连续剂量。

在一些实施方式中，在对象中与crs相关的结果(例如与crs相关或指示crs的血清因子)或其临床迹象或症状如发热、缺氧、低血压或神经障碍已经达到峰值水平，并且在给予第一剂量后开始下降之后时给予连续剂量。在一些实施方式中，在观察到给予后与这类结果的最高水平相比下降时，或在与给予后达到结果的最大值或水平之后水平下降时给予连续剂量。

在一些实施方式中，当毒性结果的指示物(例如crs的血清指示物)的水平下降到第一剂量之前即刻的指示物水平的25倍以下时，给予连续剂量。在一些方面，连续剂量在对象不显示crs或不显示严重crs时给予。

在一些方面，连续剂量在与给予第一剂量之前即刻的疾病负荷相比患者中的疾病负荷下降的时间点给予。在一些实施方式中，如果对象在治疗前表现出形态学疾病并且显示具有或不具有分子上可检测的(例如通过流式细胞术或定量pcr检测)分子疾病(例如，最小残留疾病(mrd))的完全缓解(例如骨髓中少于5％的胚细胞)，则该对象表现出减少或降低的疾病负荷。在一些实施方式中，如果对象在治疗前显示分子疾病并且在治疗后不显示分子疾病，则对象表现出减少或降低的疾病负荷。在一些实施方式中，连续剂量在给予第一剂量后，在疾病负荷或其指示物，如对象的血液、其他体液、器官或组织中的疾病(例如，肿瘤)细胞的体积或数量或百分比，或肿瘤大小已经减少了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多时给予。

在一些实施方式中，在对象的疾病或病症在对第一剂量或在先剂量的应答降低后没有复发时给予连续剂量。在一些实施方式中，减轻疾病负荷由一个或多个因子的降低来指示，所述因子例如对象或其体液或器官或组织中的疾病细胞的负荷或数量、肿瘤的质量或体积、转移的程度或度。如果在对初始治疗或给药作出反应的因子减少之后，该因子随后增加，则该因子被认为已复发。在一些实施方式中，复发是一般或一个或多个因子，或在疾病负荷中。在一些方面，在对象、疾病负担或其因子与在第一次或在先给药之后测量或达到的最低点相比复发，但仍然低于第一次剂量之前即刻时给予连续剂量。在一些实施方式中，在疾病负荷或其指示因子未发生变化时，例如，当已阻止疾病负荷增加时，给予对象连续剂量。

在一些实施方式中，在宿主适应性免疫应答未被检测到、尚未建立、或尚未达到一定水平、程度或阶段时给予连续剂量。在一些方面，在对象的记忆免疫应答发展之前给予连续剂量。

在一些方面，给予第一剂量与给予连续剂量之间的时间为约9至约35天，约14至约28天，或15至27天。在一些实施方式中，在给予第一剂量后超过约14天且不到约28天时给予连续剂量。在一些实施方案中，给予连续剂量不超过给予第一剂量后的约14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天。在一些方面，第一剂量和连续剂量之间的时间为约14天、约17天或约21天。

在一些实施方式中，在给予其他连续剂量后，给予额外或后续剂量，例如，其他连续剂量。在一些方面，在给予在先剂量(例如在先连续剂量)后至少约14天且不到约28天时给予额外的连续剂量。在一些实施方式中，示例性剂量方案包括何时或大约何时给予重组受体表达细胞(例如，car表达细胞，例如car表达t细胞)的时间表。在一些实施方式中，在先前剂量后约14天，例如，在先前剂量后不到4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天时给予给予额外的剂量。在一些实施方式中，在先剂量之后不少于约14天给予剂量，和/或在先前剂量后不超过约28天给予剂量。

在任何实施方式中，在一些情况下，该方法包括给予第一剂量或在先剂量和连续剂量，并且在其他情况下包括向先前已接受过第一剂量或在先剂量的对象给予连续剂量，该对象已经之前接受了第一剂量或在先剂量，但不包括给予第一剂量或在先剂量本身。因此，在某些情况下，该方法涉及给予巩固治疗，例如通过对先前已经接受剂量(例如减灭剂量)的重组受体-表达(例如car表达)细胞的对象给予巩固连续剂量。在一些方面，受体表达，例如car表达细胞的先前剂量已经足以减少对象中的疾病或病症负荷，使得给予连续剂量的细胞的功效和/或安全性相对于给予没有接受第一剂量的对象的剂量得到改善。

在一些实施方式中，与给予第一剂量或连续剂量之前即刻相比，在连续剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少等于或约50％、60％、70％、80％、90％或更多。

iv.毒性和毒性结果

在一些实施方式中，例如，与单剂量给予相同或相似的总细胞数量，给予连续剂量而对象先前没有接受了第一剂量，在相对于第一剂量的不同时间给予连续剂量，和/或以一个或多个剂量给予不同量相比，剂量的时间或量减少或预防毒性或其结果或症状。

给予过继t细胞疗法，如用表达嵌合抗原受体的t细胞治疗可引起毒性作用或结果，如细胞因子释放综合征和神经毒性。在一些实施例中，这种作用或结果与高水平的循环细胞因子平行，这可能是观察到的毒性的基础。

在一些实施方式中，例如，与给予单剂量相同或相似的总细胞数量，给予连续剂量而对象之前没有接受第一剂量，在相对于第一剂量的不同时间给予连续剂量，和/或以一个或多个剂量中不同量的给予相比，所提供的方法经设计为或包括导致较低程度的毒性、毒性结果或症状、毒性促进特征、因子或性质的特征，例如与细胞因子释放综合征(crs)相关或指示其的症状或结果。

在一些方面，毒性结果与细胞因子释放综合征(crs)或严重crs(scrs)相关或指示其。在某些情况下，crs，例如，scrs可以在对象的过继t细胞治疗和给予其他生物制品之后出现。参见davila等，scitranslmed6,224ra25(2014)；brentjens等，sci.transl.med.5,177ra38(2013)；grupp等，n.engl.j.med.368,1509–1518(2013)；和kochenderfer等，blood119,2709–2720(2012)；xu等，cancerletters343(2014)172-78。

通常，crs由例如由t细胞、b细胞、nk细胞、单核细胞、和/或巨噬细胞介导的放大的全身免疫应答引起。这样的细胞可以释放大量的炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症反应和/或诱导内皮器官损伤，这可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。严重的危及生命的crs可导致肺部浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他严重的危及生命的毒性可包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。

crs可以用抗炎治疗如抗il-6治疗，例如抗-il-6抗体，例如托珠单抗或抗生素治疗。在一些实施方式中，在第一次给药后，用这种疗法治疗对象，并且只有当该治疗后crs相关症状减少或下降或降低至低于可接受水平时，给予连续剂量。

crs的结果、迹象和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方式中，在特定剂量方案或给药实现或不实现给定的crs相关的结果、迹象或症状的的情况中，可以规定特定结果、体征、和症状和/或其数量或程度。

在给予car-表达细胞的情况下，crs通常在输注表达car的细胞后6-20天出现。参见xu等，cancerletters343(2014)172-78。在一些情况下，crs在cart细胞输注后不到6天或超过20天时出现。crs的发生和时间可能与输注时基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，crs涉及升高的干扰素(ifn)-γ、肿瘤坏死因子(tnf)-α和/或白介素(il)-2的血清水平。可能在crs中被快速诱导的其他细胞因子是il-1β、il-6、il-8和il-10。

在一些方面，在通过本方法的给药方案给予细胞的对象中观察到较低程度的毒性、结果、症状、特征、因子或性质，例如，与单剂量给予相同或相似的总细胞数量，给予连续剂量而对象先前没有接受了第一剂量，在相对于第一剂量的不同时间给予连续剂量，和/或以一个或多个剂量给予不同量相比，剂量的时间或量减少或预防毒性或其结果或症状。例如，在一些实施方式中，在向对象给予第一剂量后，与向对象给予较大数量的细胞相比，对象表现出较低程度的crs相关结果，和/或表现出较低血清水平的炎性细胞因子或指示crs的因子。在一些实施方式中，在向对象给予连续剂量后，与向对象给予连续剂量而对象没有接受第一剂量相比，或与作为单一剂量给予第一和连续剂量相比，或与在早于或晚于指定时间段给予连续剂量相比，对象表现出较低程度的crs相关结果，和/或表现出较低血清水平的炎性细胞因子或指示crs的结果。在一些实施方式中，对象在给予第一剂量和/或给予连续剂量后不显示crs或严重crs。

与crs相关的示例性结果包括发热、僵直、发冷、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ards)、脑病、alt/ast升高、肾衰竭、心脏疾病、缺氧、神经障碍和死亡。神经并发症包括谵妄、癫痫样活动、混乱、找词困难、失语症和/或变得迟钝。其他crs-相关结果包括疲劳、恶心、头痛、癫痫发作、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能障碍和肾功能衰竭。在一些方面，crs与一种或多种因子如血清铁蛋白、d-二聚体、氨基转移酶、乳酸脱氢酶和甘油三酸酯、或低纤维蛋白原血症或肝脾肿大相关。

在一些实施方式中，与crs相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如，持续2天或更多天，例如3天或更多天，例如4天或更多天，或至少连续三天的，例如，指定温度的发热，超过等于或约38摄氏度的发热；超过等于或约38摄氏度的发热；与至少两种细胞因子(例如，下组中的至少两个：干扰素γ(ifnγ)、gm-csf、il-6、il-10、flt-3l、分形趋化因子、和il-5，和/或肿瘤坏死因子α(tnfα))的预处理水平相比，例如至少等于或约75的最大倍数变化的细胞因子升高，或例如至少一种这样的细胞因子的至少等于或约250的最大倍数变化；和/或至少一种毒性的临床迹象，例如低血压(例如，通过至少一种静脉内血管活性加压剂测量)；缺氧(例如小于等于或约90％的血浆氧(po2)水平)；和/或一种或多种神经系统疾病(包括精神状态变化，痴呆和癫痫发作)。

示例性的crs相关结果包括一个或多个因子，包括细胞因子和趋化因子以及与crs相关的其他因子的增加或高血清水平。示例性结果还包括一种或多种这些因子的合成或分泌增加。这种合成或分泌可通过t细胞或与t细胞相互作用的细胞，例如先天免疫细胞或b细胞。

在一些实施方式中，与crs相关的血清因子或crs相关的结果包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(ifn-γ)，tnf-α，il-1β，il-2，il-6，il-7，il-8，il-10，il-12，sil-2rα，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，巨噬细胞炎症蛋白(mip)-1，肿瘤坏死因子α(tnfα)和il-10，il-1β，il-8，il-2，mip-1，flt-3l，分形趋化因子和/或il-5。在一些实施方式中，因子或结果包括c反应性蛋白(crp)。除了作为crs的早期和容易测量的风险因子以外，crp也是细胞扩增的标志物。在一些实施方式中，测量具有高水平crp(例如≥15mg/dl)的对象具有crs。在一些实施方式中，测量具有高水平crp的对象没有crs。在一些实施方式中，crs的量度包括crp和指示crs的另一种因子的量度。

在一些实施方式中，在car治疗之前、期间或之后，监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面，一种或多种细胞因子或趋化因子包括ifn-γ，tnf-α，il-2，il-1β，il-6，il-7，il-8，il-10，il-12，2rα，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)或巨噬细胞炎症蛋白(mip)。在一些实施方式中，监测ifn-γ，tnf-α和il-6。

已经开发了与crs发病相关的crs标准，以预测哪些患者更有可能发展scrs的风险(参见davilla等，sciencetranslationalmedicine.2014；6(224)：224ra25)。因子包括发热，缺氧，低血压，神经变化，炎症细胞因子血清水平升高，如7种细胞因子(ifnγ，il-5，il-6，il-10，flt-3l，分形趋化因子和gm-csf)，其治疗诱导的升高可以与预处理肿瘤负荷和scrs症状良好相关。关于crs的诊断和治疗的其它指导是已知的(参见例如lee等，blood.214；124(2)：188-95)。在一些实施方案中，反映crs等级的标准是下表1中详述的那些。

如本文所用，如果在给药后，对象显示：(1)持续至少3天的至少38摄氏度的发热；(2)细胞因子升高，其包括(a)与紧随给药后的水平相比，下组7种细胞因子中的至少两种的至少为75的最大倍数变化：干扰素γ(ifnγ)、gm-csf、il-6、il-10、flt-3l、分形趋化因子和il-5和/或(b)与紧随给药后的水平相比，下组7种细胞因子中的至少一种的至少250的最大倍数变化：干扰素γ(ifnγ)、gm-csf、il-6、il-10、flt-3l、分形趋化因子和il-5；和(c)至少一种毒性的临床症状，例如低血压(需要至少一种静脉内血管活加压剂)或缺氧(po2<90％)或一种或多种神经系统疾病(包括精神状态改变、肥胖症和/或癫痫发作)，则对象被认为发生响应给予细胞疗法或其细胞剂量或其继发的“严重crs”(“scrs”)。在一些实施方式中，严重crs包括等级为3或更高的crs，如表1所示。

在一些实施方式中，crs包括(1)持续发热(持续至少3天至少38摄氏度的发热)和(2)至少等于或约20mg/dl的血清crp水平的组合。

在一些实施方式中，crs包括需要使用两种或更多种血管加压剂的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。

可以规定测量或检测各种结果的方法。

在一些方面，在给予第一剂量之前，在给予第一剂量之后并在给予连续剂量之前，或在给予连续剂量之后，评估对象中与crs相关的结果。在一些实施方式中，通过elisa测量毒性结果的水平，例如，crs相关结果，例如，crs指示物的血清水平。在一些实施方式中，可测量发热和/或crp水平。在一些实施方式中，发热和crp≥15mg/dl的对象可能被认为处于发展严重crs的高风险中。

在一些实施方式中，在给药后的指定时间点测量毒性结果、毒性或症状。在一些实施方式中，毒性结果，例如，crs、严重crs和/或crs相关的结果或血清水平，或较低程度的结果或血清水平，在给药后的24小时、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时，或者在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天上测量。在一些实施方式中，在第3、4、5、6、7、8或9天测量crp。在一些实施方式中，以治疗前与治疗后第2、3、4、5、6、7、14或20或21天的水平之间的倍数变化测量因子或多种因子(例如细胞因子)的倍数变化。

在一些实施方式中，在给予连续剂量时，crs相关结果的水平不超过峰值水平的50％，不超过峰值水平的40％，不超过30峰值的百分比，不超过峰值的20％，不超过峰值的15％，不超过峰值的10％，不超过峰值的5％或等于或约等于或低于给予第一剂量前即刻的水平和/或等于或约等于或低于基线。

在一些方面，在给予连续剂量时，crs相关结果的水平不超过给予第一剂量之前即刻的水平的十倍。

在一些实施方式中，与其中向对象给予连续剂量但未给予第一剂量的方法，和/或以单次剂量给予第一和第二剂量的细胞的方法和/或方法，和/或其中在比该方法指定的第一和连续剂量之间的时间早的时间给予连续剂量相比，在给予连续剂量后第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天对象中的crs相关结果降低或未检测到。

在一些实施方式中，与向对象给予2倍、5倍、10倍或100倍的细胞、t细胞、表达重组受体的细胞或pbmc的数量的剂量相比，在给予第一剂量后第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天对象中的crs相关结果未检测到或降低。

在一些实施方式中，与其中给予对象连续剂量而没有给予第一剂量的方法，和/或以单剂量给予第一次和连续剂量的细胞的方法，和/或其中在早于方法指定的第一次和连续剂量之间的时间的时间给予连续剂量的方法相比，给予连续剂量后对象中指示的因子crs的血清水平或crs相关结果的随时间变化的曲线下面积(auc)较低。

在一些实施方式中，在给予第一剂量后，对象中crs相关结果或指示crs的因子的血清水平随时间变化的曲线下面积(auc)与给予对象2倍、5倍、10倍或100倍的细胞、t细胞、表达重组受体的细胞或pbmc的数量相比较低。

在一些方面，毒性结果是神经毒性或与神经毒性有关。在一些实施方式中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括混乱、谵妄、表达性失语、反应迟钝、肌阵挛、嗜睡、改变的精神状态、惊厥、癫痫-样活动、癫痫(任选地由脑电图[eeg]确诊)、升高水平的淀粉样β(aβ)、升高水平的谷氨酸、和升高水平的氧自由基。在一些实施方式中，神经毒性基于严重性分级(例如，使用1-5级标度(参见例如guidocavaletti和paolamarmirolinaturereviewsneurology6,657-666(2010年12月))；国立癌症研究院-常用毒性标准4.03版(nci-ctcaev4.03)。

在一些情况下，神经系统症状可能是scrs的最早症状。在一些实施方式中，看到神经症状在细胞治疗输注后5至7天开始。在一些实施方式中，神经变化的持续时间可以在3至19天的范围内。在一些情况下，scrs的其他症状已经解决之后发生神经变化的恢复。在一些实施方式中，通过用抗il-6和/或类固醇治疗不会加速神经变化的时间或程度。

如本文所使用的，如果在给药后，对象显示以下限制的自我护理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、使用厕所、服用药物)的症状，则认为对象响应细胞疗法或其细胞剂量的给予或其继发为“严重神经毒性”：1)周围运动神经病变的症状，包括周围运动神经的炎症或变性；2)外周感觉神经病变的症状，包括周围感觉神经的炎症或变性，感觉异常，如感觉的扭曲，导致异常和不愉快的感觉，神经痛，如神经或一组神经的剧烈疼痛感觉，和/或感觉异常，例如感觉神经元的功能障碍，导致刺激不存在刺痛，麻木，压力，冷热的异常皮肤感觉。在一些实施方式中，严重神经毒性包括等级为3或更高的神经毒性，如表2所示。

表2：神经毒性的示例性分级标准

在一些实施方式中，与其它方法相比，该方法减少与神经毒性相关的症状。例如，通过其他方法治疗的对象相比，根据本发明的方法治疗的对象可能具有减少的神经毒性症状，例如肢体虚弱或麻木，丧失记忆、视力和/或智力，不可控制的强迫症和/或强迫行为，妄想，头痛，认知和行为问题，包括运动控制丧失、认知衰退和自主神经系统功能障碍以及性功能障碍等问题。在一些实施方式中，根据本发明方法治疗的对象可以具有减少的与外周运动神经病变、周围感觉神经病、异常感觉、神经痛或感觉异常相关的症状。

在一些实施方式中，该方法减少与神经毒性相关的结果，包括对神经系统和/或脑的损伤，例如神经元的死亡。在某些方面，该方法降低与神经毒性相关的因子的水平，例如β淀粉样蛋白(aβ)、谷氨酸和氧自由基。

在一些实施方式中，与在不存在第一剂量时给予连续剂量，将第一和第二剂量的细胞于单一剂量给予，和/或在比该方法指定的第一和第二剂量之间的时间早的时间给予连续剂量相比，在第一剂量之后给予连续剂量的对象具有减少的症状、结果或与神经毒性相关的因子。

v.针对转移的细胞的宿主免疫应答

在一些实施方式中，一个或多个剂量，例如连续剂量在对象的免疫应答(例如对转基因受体或细胞的适应性或特异性免疫应答)不存在，不可检测，或在一定水平以上无法检测时给予。对转基因的特异性免疫应答的存在或程度通常与受体的免疫原性(例如由细胞表达的car或转基因tcr)和/或对象暴露于细胞的时间有关。例如，在一些实施方式中，在对象首次接触表达受体的细胞之后的28天、35天或42天之前，未检测到针对受体的免疫应答，例如特异性体液和/或细胞介导的免疫应答。因此，在一些实施方式中，在对象中已经发展针对重组受体或细胞的免疫应答，适应性或特异性免疫应答，可检测的免疫应答和/或记忆应答之前给予连续剂量。在这方面，与其他与在线或第一剂量相比，在较晚时间点给予连续剂量的其它方法相比，连续剂量的细胞增殖和/或持续存在于对象中的能力得到改善。

该方法可以包括检测这种免疫应答或其指示物的存在或不存在或水平，例如，在给予第一或连续的剂量之后和给予连续或下一个连续剂量之前。

在一些实施方式中，何时和/或是否给予连续剂量的决定取决于对象是否表现出这样的免疫应答或其可检测的读数，例如对细胞或重组受体特异的可检测的特异性或适应性宿主免疫应答，例如由第一剂量的细胞表达的car，和/或是否在某一水平上检测到这样的反应。在一些实施方式中，在检测到这样的反应的情况下，不向对象给予连续剂量。

通常，在对象不表现出针对受体(例如由第一剂量的细胞表达的car)的特异性或适应性(例如体液或细胞介导的)免疫应答时，或者不表现出在可检测水平或高于可接受水平的这种反应或指示物时给予连续剂量。在一些方面，在给予连续剂量时，与初始剂量较大时相比，对象表现出减少的针对第一剂量的细胞表达的car的体液或细胞介导的免疫应答。

在一些实施方式中，宿主免疫应答是或包含体液免疫应答。体液免疫应答可以由对于对象的血清、其他体液和/或器官或组织中的细胞或由其表达的受体特异性的抗体的存在来指示。在一些实施方式中，存在特定同种型的此类抗体，例如igm或igg，例如igg1、igg2、igg3和/或igg4；在一些实施方式中，它们包括ige。

在一些实施方式中，免疫应答是或包含细胞介导组分。细胞介导的反应可以通过细胞，例如t细胞，例如辅助性或细胞毒性t细胞的存在来表示，其通过t细胞受体特异性识别细胞或重组受体的一个或多个表位。

在一些实施方式中，免疫应答是初级免疫应答；在一些方面，免疫应答是记忆应答。

在上述实施方式的任何一个中，可检测的免疫应答是指通过用于评估对特定抗原和细胞的特异性免疫应答的许多已知方法中的任何一种可检测到的量。例如，在一些实施方式中，通过在对象的血清上进行elispot、elisa或基于细胞的抗体检测方法(例如，通过流式细胞术)以检测特异性结合和/或中和存在于细胞上的抗原，例如结合重组受体的表位，例如car的抗体的存在来检测特定类型的免疫应答。在一些这样的测定中，确定检测到的抗体的同种型并且可以指示应答的类型和/或应答是否是记忆应答。

在一些实施方式中，通过用于检测特异性结合并诱导响应于重组受体中的表位的cd8⁺t细胞的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)测定，和/或混合淋巴细胞反应，使用细胞，例如表达重组受体的辐照细胞作为刺激细胞的可检测的特定免疫应答。

在一些方面，可检测的免疫应答是通过这种方法检测的高于或显著高于对照样品(例如未涂覆的孔或涂覆有对照肽或未表达重组受体的细胞)的水平，和/或在用表达重组受体的细胞治疗之前基于来自对象的预处理血清或血液样品检测的水平的免疫应答。

在一些方面，例如，在给予第一剂量或连续剂量之后，检测或测量这种宿主免疫应答和/或其数量、程度或度的存在或不存在。

体液免疫应答可以通过许多众所周知的用于检测针对特定抗原或细胞特异性的抗体的测定来检测，包括结合测定、免疫测定和基于细胞的测定。测定可包括设计用于评估抗体的特定功能的存在或不存在的那些，例如在结合抗原时进行特定效应功能的能力，例如中和抗体测定。在一些实施方式中，使用基于细胞的测定法，例如通过将来自对象的治疗前和治疗后细胞与表达重组受体的细胞(和对照细胞)孵育来检测体液免疫应答(例如抗原特异性抗体，例如中和抗体)的结果并检测抗原特异性结合和/或其他结果，例如中和结果，例如通过流式细胞术或酶测定法。在一些实施方式中，elisa和/或elispot测定法用于检测和定量对重组受体(例如car)特异性的抗体，以及使用已知技术(例如使用代表受体部分的各个肽)对表位进行作图。参见例如jensen等，biolbloodmarrowtransplant.2010年9月；16(9):1245–1256。在一些实施方式中，例如通过使用对特定同种型(例如人同种型)特异性的检测抗体来评估所检测抗体的同种型。

可以使用多种众所周知的技术中的任何一种检测和/或测量对细胞和/或受体的基于细胞或细胞的免疫应答。这样的技术可包括用于检测cd8⁺t细胞的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)测定，其特异性结合并诱导响应于所给予的重组受体例如car和/或细胞中的表位的细胞毒性。在一些实施方式中，所述测定是混合淋巴细胞反应，例如使用来自血液或其它器官或组织作为应答细胞的pbmc或其它宿主衍生细胞的那些，以及诱导表达重组受体的细胞，例如表达car，作为刺激细胞的辐射的t细胞。刺激细胞通常是自体的，并且可以是与给予对象的细胞相同的细胞，并且可以被辐射。非转导细胞或未表达感兴趣转基因的细胞可用作阴性对照，代替对照样品中的刺激细胞。同样，来自治疗前时间点或其他对象的应答细胞样品可用于对照样品。在一些方面，这样的测定评估宿主细胞执行一种或多种效应功能(例如，抗原特异性细胞裂解)的能力，例如使用铬释放测定来检测存在于对象中的特异性识别所给予的细胞上或其中存在的抗原的细胞毒性t细胞，并诱导细胞毒性反应。在一些实施方式中，外周血细胞(例如pbmc)在给予细胞之前和之后从对象获得，并且各自用于使用经修饰以表达重组受体的自体t细胞的测定法，例如细胞裂解测定法，其通常被辐射。特异性裂解表明存在受体特异性细胞介导的免疫应答。可以使用代表重组受体部分的肽的组图组进行表位作图。参见，例如，riddell等，naturemedicine2,26-223(1996)；lamers，blood2011117：72-82。hla四聚体结合测定可用于对抗原特异性t细胞进行计数。在一些方面，使用淋巴增生性测定(lpa)和/或评估分泌的细胞因子的测定，如elisa和/或细胞内染色和通过流式细胞术评估的测定法用于检测转基因特异性cd4⁺t细胞。

在一些实施方式中，该方法防止针对受体的抗体的诱导或降低其水平，例如，抗-car抗体。例如，抗-受体的抗体滴度，例如，抗-car抗体，例如，与相对于给予第一剂量在不同时间，如在稍后的时间，例如，在复发之后给予连续剂量的方法相比，通过elisa在对象的血清中测量的滴度降低。因此，在一些实施方式中，该方法通过增加对象暴露于所给予的细胞来提高功效，其通过预防或减少否则会清除或预防所给予的细胞增殖的宿主免疫应答。

vi.疾病负荷

给药，例如一种或多种剂量通常降低或预防受试者中疾病或病症的扩张或负荷。例如，当疾病或病症是肿瘤时，该方法通常减少肿瘤大小、体积、转移、骨髓中的胚细胞百分数或分子可检测的癌症和/或改善与肿瘤负荷相关的预后或存活或其他症状。在一些实施方式中，给予连续剂量相对于第一剂量或在线剂量之后的负荷和/或复发的减轻而定时。

疾病负荷可以包括对象或对象的器官、组织或体液中的疾病数量的总数，例如肿瘤或另一位置的器官或组织，例如，其将指示转移。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下，可以在血液或骨髓中检测和/或定量肿瘤细胞。疾病负荷在一些实施方式中可以包括肿瘤的质量、转移的数量或程度和/或存在于骨髓中的胚细胞的百分比。

在一些实施方式中，对象患有白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残留白血病来确定。在一些实施方式中，如果在骨髓中存在大于或等于5％的胚细胞，例如，通过光学显微镜检测，对象表现出形态学疾病。在一些实施方式中，如果在骨髓中存在小于5％的胚细胞，对象表现出完全或临床缓解。

在一些实施方式中，对象可以显示完全缓解，但存在形态学上不可检测(通过光学显微术技术)残留白血病细胞的一小部分。如果对象在骨髓中显示小于5％的胚细胞并显示分子可检测的癌症，则称该对象显示最小残留病(mrd)。在一些实施方式中，可以使用允许敏感检测少量细胞的各种分子技术中的任何一种来评估分子可检测的癌症。在一些方面，这些技术包括可以测定由染色体易位产生的独特的ig/t-细胞受体基因重排或融合转录物的pcr测定。在一些实施方式中，可以使用流式细胞术来基于白血病特异性免疫表型鉴定癌细胞。在一些实施方式中，癌症的分子检测可以在100,000个正常细胞中检测到少至1个白血病细胞。在一些实施方式中，如果检测到100,000个细胞中至少或大于1个白血病细胞，例如通过pcr或流式细胞术，则对象表现出可分子检测的mrd。在一些实施方式中，对象的疾病负荷是分子检测不到的或mrd^-，使得在某些情况下，使用pcr或流式细胞术技术在对象中不能检测到白血病细胞。

在一些实施方式中，与给予第一剂量之前即刻的时间的疾病负荷相比，第一剂量的方法和/或给予减少了疾病负荷。在一些方面，给予第一剂量减少疾病负荷，例如，肿瘤负荷。在一些实施方式中，连续剂量会影响疾病负荷的减少，例如进一步减少。

在一些实施方式中，第一剂量含有有效减少对象中疾病或病症负荷(例如肿瘤负荷)的量的细胞。在一些实施方式中，例如，其中疾病或病症是肿瘤，给予第一剂量是减灭肿瘤的剂量。如本文所用，“减灭剂量”是指有效地至少部分减轻对象中疾病或病症的负荷，例如，肿瘤负荷的剂量。在一些方面，减灭剂量可能不能完全消除疾病或病症。

在一些方面，给予第一剂量和/或连续剂量可以防止疾病负荷的增加，并且这可以通过疾病负荷的变化来证明。

在一些方面，在给予第一剂量后疾病或病症仍然存在和/或给予第一剂量不足以消除对象中的疾病或病症。

在一些方面，与第一剂量之前的时间相比，或在紧随连续剂量之前的时间相比，连续剂量的给药减少了疾病负荷。在一些方面，例如在复发的情况下，与给予第一剂量后的疾病负荷的峰值水平相比，给予连续剂量实现了疾病负荷的降低。

在一些实施方式中，与使用替代给药方案的比较方法观察到的减少，例如其中对象接受单一剂量(例如，单个大剂量的细胞)，例如，以所提供的方法统一地以第一剂量和连续剂量给予的细胞总数代替单个剂量，或者给予彼此间隔小于约14或超过约28天的多个大剂量或多个剂量相比，该方法在更大程度上减少疾病或病症负荷，例如肿瘤细胞的数目，肿瘤的大小，患者存活的持续时间或无事件的存活时间，以及更长的时间段。在一些实施方式中，与通过向未接受第一剂量的对象给予连续剂量而实现的降低相比，在连续剂量之后，疾病负荷减少到更大程度或持续更长时间。

在一些实施方式中，检测、评估或测量对象中疾病或病症的负荷。在一些方面，通过检测对象中，或对象的器官、组织或体液例如血液或血清，中的疾病或疾病相关细胞，例如肿瘤细胞的总数可以检测疾病负荷。在一些实施方式中，疾病负荷，例如，通过测量实体瘤的质量和/或转移的数量或程度来评估肿瘤负荷。在一些方面，评估对象的生存期，在一定时间段内的存活，存活范围，无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方式中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方式中，指定疾病或病症负荷的量度。

在一些方面，在给予第一剂量之前，在给予第一剂量之后但在给予连续剂量之前，和/或在给予连续剂量后，测量或检测疾病负荷。在多个连续剂量的情况下，一些实施方式中的疾病负荷可以在任何连续剂量之前或之后或在给予连续剂量之间时测量。

在一些实施方案中，在给予第一剂量后，该负荷减少至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％或100％。在一些方面，给予连续剂量会进一步降低疾病负荷，例如，肿瘤负荷，例如与给予连续剂量之前即刻相比或与在第一剂量之前即刻相比，有等于或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％或100％的负荷减轻。在一些实施方式中，与给予第一剂量或连续剂量之前即刻相比，在连续剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少等于或约50％、60％、70％、80％、90％或更多。

在一些实施方式中，通过该方法减少疾病负荷包括在形态完全缓解中的诱导，例如，通过在给予例如第一个或连续剂量之后1个月，2个月，3个月或3个月以上评估。在一些方面，例如，通过多参数流式细胞术测量，最小残留疾病的测定是阴性的，或者最小残留疾病的水平小于约0.3％，小于约0.2％，小于约0.1％，或小于约0.05％。

在一些实施方式中，与其他方法相比，通过该方法改善对象的无事件存活率或总体存活率。例如，在一些实施方式中，在第一剂量后6个月通过该方法治疗的对象的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、或大于约95％。在一些方面，总存活率大于约40％，大于约50％，大于约60％，大于约70％，大于约80％，大于约90％或大于约95％。在一些实施方式中，用该方法治疗的对象表现出无事件存活，无复发生存或存活至少6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方式中，改善进展的时间，例如大于或约6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年的进展时间。

在一些实施方式中，通过该方法进行的治疗，与其它方法相比，复发的概率降低。例如，在一些实施方式中，第一剂量后6个月复发的概率小于约80％，小于约70％，小于约60％，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，或小于约10％。

在一些方面，减少疾病负荷，例如，在第一剂量后，减灭肿瘤减少了连续剂量后的毒性或毒性结果。减轻肿瘤负荷后的毒性结果可以如本文所述进行评估。

在一些方面，减少疾病负荷，例如，由本方法导致的肿瘤减灭改善了对象中细胞的持续性。例如，在一些方面，给予第一剂量减少疾病负荷，例如，肿瘤负荷，使得以连续剂量给予的细胞比通过其它给药方案给予的细胞持续时间更长，例如向尚未给予第一剂量的细胞的对象给予连续剂量。

vii.细胞暴露和持久性

在一些实施方式中，其剂量和/或其时间经设计为促进对象暴露于细胞，例如通过随时间促进其增殖和/或持久性。

在一些实施方案中，所提供的方法增加受试者对所施用细胞的暴露(例如，随时间增加的细胞数量或持续时间)和/或改善过继细胞疗法中的功效和治疗结果。在一些方面，该方法的优点在于，与其他方法相比，表达重组受体的细胞(例如car-表达细胞)的暴露程度更大和/或更长程度地改善治疗结果。这些结果可包括患者的生存和缓解，甚至在具有严重肿瘤负荷的个体中。

在一些实施方式中，与给予高初始剂量的细胞相比，给予第一剂量(例如，第一剂量)增加了对象中暴露于细胞的最大值，总数和/或持续时间。在一些方面，与在相同情况中给予较大剂量相比，在高疾病负荷(因此更高量的抗原)的情况下给予第一剂量增强了功效，这可能导致可能阻止细胞增殖和/或持续性的消耗。在一些实施方式中，在高疾病负荷的情况下给予第一剂量减少转移的细胞的消耗，从而与其它方法(例如给予较高初始剂量的那些)相比增加了临床疗效。

在一些实施方式中，检测在第一剂量和/或连续剂量之后在对象中表达重组受体的细胞(例如car-表达细胞)的存在和/或量。在一些方面，使用定量pcr(qpcr)来评估在对象的血液或血清或器官或组织(例如疾病部位)中表达重组受体的细胞(例如car-表达细胞)的量。在一些方面，持续性被定量为每微克dna中编码受体，例如car的dna或质粒的拷贝，或作为每微升样品例如，血液或血清的受体表达，例如car表达细胞的数量，或每微升样品的外周血单核细胞(pbmc)或白细胞或t细胞的总数。

在一些实施方式中，在给予第一剂量之后或至少在第4、14、15、27或28天，在对象中检测到细胞。在一些方面，在或者至少在给予第一次或连续剂量后2、4或6周，或者3、6或12、18或24、或30或36个月，或者1、2、3、4、5或更多年检测到细胞。

在一些实施方式中，与通过替代方法，诸如涉及给予单一剂量的方法，例如含有比第一剂量更多的细胞的方法，将总和剂量的细胞作为单一剂量施用，向未接受第一剂量的对象给予的连续剂量的细胞，和/或在指定时间窗外的时间给予连续剂量，例如晚于对象针对受体(例如car)的免疫应答出现所规定的时间或随后。

在一些实施方式中，与通过使用替代给药方案的方法，例如涉及给予连续剂量的细胞而对象没有给予第一剂量的细胞或其中给予对象的细胞以单次剂量的第一和连续的剂量共同给药的细胞相比。

可以根据对象暴露的细胞的最大数目，高于特定数量或百分比的可检测细胞的持续时间，随时间的细胞数曲线下面积和/或其组合以及其指标来表示例如指示细胞数、增殖和/或持续性的接触。与特定样品，例如血液或血清中的核酸或dna的总量相比，可以使用已知的方法例如qpcr来评估这样的结果，以检测编码重组受体的核酸的拷贝数，和/或通常使用对受体特异性的抗体来检测表达受体的细胞的流式细胞术测定法。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，例如能够结合和/或中和和/或诱导针对疾病或病症或表达被受体识别的抗原的细胞的应答(例如，细胞毒性应答)。

在一些方面，对象对细胞的增加的暴露包括增加细胞的增殖。在一些实施方式中，在给予第一剂量和/或给予连续剂量后，受体-(例如car-)表达细胞在对象中增殖。在一些方面，与其他方法，例如涉及以单一剂量给予细胞，给予较大的第一剂量，给予连续剂量而不给予第一剂量的那些方法，和/或在指定的时间窗或时间点之前或之后给予连续剂量，使得例如在给予连续剂量之前产生免疫应答的方法相比，该方法导致更大的细胞增殖。

在一些方面，该方法导致所给予的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术测量。在一些方面，检测到高峰比例的细胞。例如，在一些实施方式中，在第一次或连续给药之后，在对象的血液或疾病部位或其白细胞部分(例如pbmc部分或t细胞部分)中处于峰值或最大水平时，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％的细胞表达重组受体，例如car。

在一些实施方式中，该方法导致在对象的血液或血清或其他体液或器官或组织中至少100、500、1000、1500、2000、5000、10000或15000个拷贝的或编码受体的核酸的最大浓度，例如每微克dna的car，或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的受体表达，例如car表达的细胞/外周血单核细胞(pbmc)总数、单核细胞总数、t细胞总数或总微升数。在一些实施方式中，表达受体的细胞被检测为对象血液中总pbmc的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或在该水平在第一或后续给药后持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、或52周，或者这种给药后持续1、2、3、4或5年或更多年。

在一些方面，该方法导致例如，在对象的血清中编码重组受体，例如car的核酸的拷贝每微克dna增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。

在一些实施方式中，表达受体的细胞可在对象的血液或血清中检测到，例如通过指定的方法，例如qpcr或基于流式细胞术的检测方法，给予第一剂量后或在给予连续剂量后至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60或更多天，或者在给予第一剂量或连续剂量之后持续至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多周。

在一些方面，至少约1×10²，至少约1×10³，至少约1×10⁴，至少约1×10⁵，或至少约1×10⁶或至少约5×10⁶或至少约1×10⁷或至少约5×10⁷或至少约1×10⁸重组受体-表达，例如car-表达细胞，和/或每微升至少10、25、50、100、200、300、400、或500、或1000个受体表达-细胞，例如每微升至少10个，可检测或存在于对象或其流体、组织或其隔室中，例如在血液中，例如外周血或其疾病部位。在一些实施方式中，在给予第一剂量后或给予连续剂量后，细胞数量或浓度在对象中可检测持续至少约20天、至少约40天、或至少约60天、或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年。这样的细胞数可以通过基于流式细胞术或基于定量pcr的方法检测，并使用已知方法外推至总细胞数。参见，例如brentjens等，scitranslmed.20135(177),park等，moleculartherapy15(4):825–833(2007),savoldo等，jci121(5):1822-1826(2011),davila等，(2013)plosone8(4):e61338,davila等，oncoimmunology1(9):1577-1583(2012),lamers,blood2011117:72-82,jensen等，biolbloodmarrowtransplant2010年9月；16(9):1245–1256,brentjens等，blood2011118(18):4817-4828。

在一些方面，通过免疫组织化学、pcr和/或流式细胞术测量，每100个细胞中编码重组受体的核酸的拷贝数，例如载体拷贝数，例如在外周血或骨髓或其他隔室中，位至少0.01、至少0.1、至少1、或至少10，在给予细胞，例如，在第一或连续剂量后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、或至少约6周，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年时。在一些实施方式中，每微克基因组dna中表达受体，例如，car的载体的拷贝数，在给予第一剂量或连续剂量的受体表达，例如，car表达细胞后约1周、约2周、约3周或至少约4周时，或这种给药后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月，或至少2或3年时，为至少100、至少1000、至少5000、或至少10000、或至少15000、或至少20000。

在一些方面，由细胞表达的受体，例如car，可以通过定量pcr(qpcr)或通过流式细胞术检测在对象，其血液和/或其疾病部位中检测的，在给予细胞后，例如在开始给予第一剂量或连续剂量或后续连续剂量后至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年或超过3年时。

在一些实施方式中，在给予第一剂量后随着时间变化的对象在体液、组织或器官(例如血液)中的受体-(例如car-)表达细胞的浓度的曲线下的面积(auc)比通过其中对象以单一剂量给予第一剂量和连续剂量的细胞的替代给药方案所达到的面积更大。

在一些方面，在给予连续剂量后随时间变化的对象在体液、组织或器官，例如血液中的受体(例如car-)表达细胞的浓度的曲线下面积(auc)比通过其中给予对象连续剂量而没有给予第一剂量或其中以单剂量给予第一和第二剂量的细胞的替代给药方案实现的面积更大。

viii.由细胞表达的重组受体

细胞通常表达重组受体，包括抗原受体，例如功能性非tcr抗原受体，例如嵌合抗原受体(car)和其它抗原结合受体如转基因t细胞受体(tcr)。受体包括其他嵌合受体。

示例性的抗原受体，包括car，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，包括例如，在国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061，美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号ep2537416中所述的那些，和/或sadelain等，cancerdiscov.2013年4月；3(4):388–398；davila等，(2013)plosone8(4):e61338；turtle等，curr.opin.immunol.,2012年10月；24(5):633-39；wu等，cancer,2012年3月18(2):160-75中所述的那些。car的实例包括任何上述出版物中公开的car，例如wo2014031687，us8,339,645，us7,446,179，us2013/0149337，美国专利号7,446,190，美国专利号8,389,282，kochenderfer等，2013,naturereviewsclinicaloncology,10,267-276(2013)；wang等，(2012)j.immunother.35(9):689-701；和brentjens等，scitranslmed.20135(177)。seealsowo2014031687,us8,339,645,us7,446,179,us2013/0149337,u.s.patentno.:7,446,190,anduspatentno.:8,389,282.还参见wo2014031687，us8,339,645，us7,446,179，us2013/0149337，美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。

所述嵌合受体包括嵌合抗原受体(car)。嵌合受体，例如car通常包括细胞外抗原结合结构域，例如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(vh)链区和/或可变轻(vl)链区，例如，scfv抗体片段。

在一些实施方式中，重组受体(例如car)的抗体部分还包括间隔物，其可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或其修饰形式的至少一部分，例如铰链区，例如，igg4铰链区和/或ch1/cl和/或fc区。在一些实施方式中，所述恒定区或部分是人igg的，例如igg4或igg1的。在一些方面中，恒定区的部分作为抗原-识别部分，例如，scfv，和跨膜结构域之间的间隔物区域。所述间隔物可具有这样的长度，相较于该间隔物不存在的情况，该长度在抗原结合之后提供增加细胞响应性。在一些实例中，间隔物长度为或约为12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性的间隔物包括具有如下长度的那些：至少约10-229个氨基酸、约10-200个氨基酸、约10-175个氨基酸、约10-150个氨基酸、约10-125个氨基酸、约10-100个氨基酸、约10-75个氨基酸、约10-50个氨基酸、约10-40个氨基酸、约10-30个氨基酸、约10-20个氨基酸或约10-15个氨基酸，并且包括上述所列范围的任何端点之间的整数。在一些实施方式中，间隔物区具有约12个氨基酸或更短，约119个氨基酸或更短或约229个氨基酸或更短。示例性的间隔物包括单独igg4铰链，连接至ch2和ch3结构域的igg4铰链或连接至ch3结构域的igg4铰链。示例性的间隔物包括但不限于，描述于如下文献的那些：hudecek等.(2013)clin.cancerres.,19:3153,国际专利申请公开号wo2014031687，美国专利号8,822,647或公开申请号us2014/0271635。

在一些实施方式中，所述恒定区或部分是人igg的，例如igg4或igg1的。在一些实施方式中，所述间隔物具有序列eskygppcppcp(示于seqidno:1)，并且由示于seqidno:2的序列编码。在一些实施方式中，所述间隔物具有示于seqidno:3的序列。在一些实施方式中，所述间隔物具有示于seqidno:4的序列。在一些实施方式中，所述恒定区或部分是igd的。在一些实施方式中，所述间隔物具有示于seqidno:5的序列。在一些实施方式中，所述间隔物具有与seqidno:1、3、4或5显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。

该抗原识别结构域一般连接至一个或多个胞内信号转导部分，例如在car的情况中，通过抗原受体复合物(例如tcr复合物)模拟活化的信号转导部分，和/或通过另一细胞表面受体的信号。因此，在一些实施方式中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号转导结构域连接。在一些实施方式中，所述跨膜结构域融合至所述胞外结构域。在一个实施方式中，使用天然关联受体(例如car)中的结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，所述跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免所述结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。

在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，在一些方面中，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自t-细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154，和/或跨膜区包含其功能变体(例如基本保留其结构部分(例如，跨膜结构部分)、性质的那些)的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是源自cd4、cd28或cd8的跨膜结构域，例如，cd8α或其功能变体。或者，在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面中，所述合成跨膜结构域主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。在一些实施方式中，所述连接通过接头、间隔物和/或跨膜结构域发生。

所述胞内信号转导结构域包括模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体联合共刺激受体的信号，和/或通过单独共刺激受体的信号的那些。在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2-10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸，例如，甘氨酸-丝氨酸双联体的接头，并在car的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间形成连接。

所述受体，例如，car，一般包括至少一种的一个或多个胞内信号转导部分。在一些实施方式中，所述受体包括tcr复合物的胞内组分，例如介导t-细胞活化和细胞毒性的tcrcd3⁺链，例如，cd3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接到一个或多个细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括cd3跨膜结构域、cd3胞内信号转导结构域，和/或其它cd跨膜结构域。在一些实施方式中，所述受体，例如，car，还包括一种或多种其它分子的部分，例如fc受体γ、cd8、cd4、cd25或cd16。例如，在一些方面，car或其它嵌合受体包括cd3ζ(cd3-ζ)或fc受体γ与cd8、cd4、cd25或cd16之间的嵌合分子。

在一些实施方式中，在car或其它嵌合受体结合时，受体的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域激活免疫细胞的正常效应功能或应答中的至少一种，例如经工程改造以表达car的t细胞。例如，在一些情况中，car诱导t细胞的功能，例如溶细胞活性或辅助性t细胞活性，例如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方式中，采用抗原受体部分或共刺激分子的胞内信号转导结构域的截短部分来替代完整免疫刺激链，例如，如果其转导效应物功能信号的话。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域包括t细胞受体(tcr)的胞质序列，并且在一些方面，还包括天然情况下存在的共受体的那些与这些受体一致作用以在抗原受体接合后启动信号转导。

在天然tcr的情况中，完全活化一般不仅需要通过tcr的信号转导，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，用于产生第二或共刺激信号的组分也包括在所述car中。在其他实施方式中，car不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面中，其他car在同一细胞中表达并且提供用于生成第二或共刺激信号的组分。

在一些方面中，t细胞活化描述为通过两类胞质信号转导序列介导：通过tcr起始抗原依赖性第一活化的那些(第一胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。在一些方面中，所述car包括此类信号转导组分之一或两者。

在一些方面中，所述car包括主要胞质信号转导序列，其调节tcr复合物的初始活化。以刺激方式作用的第一胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是免疫受体基于酪氨酸的活化基序或itam。itam的实例包括第一胞质信号转导序列，其包括源自如下的那些：tcrζ，fcrγ，fcrβ，cd3γ，cd3δ，cd3ε，cds，cd22，cd79a，cd79b，和cd66d。在一些实施方式中，car中的胞质信号转导分子包含胞质信号转导结构域，其部分或源自cd3ζ的序列。

在一些实施方式中，所述car包括共刺激受体的跨膜部分和/或信号转导结构域，例如cd28，4-1bb，ox40，dap10，和icos。在一些方面中，同一car同时包括活化和共刺激部分。

在一些实施方式中，激活结构域包括在一个car内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一car提供。在一些实施方式中，所述car包括活化或刺激car、共刺激car，其均表达在同一细胞上(参见wo2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或活化car和/或共刺激car。在一些实施方式中，细胞还包括抑制性car(icar，参见fedorov等，sci.transl.medicine,5(215)(2013年12月))，例如识别除了与疾病或病症相关和/或特异性的car，由此通过所述疾病靶向car递送的激活信号通过抑制性car与其配体结合而减少或抑制，例如减少脱靶效应。

在一些实施方式中，所述重组受体的胞内信号转导部分，例如car，包含cd3ζ胞内结构域和共刺激信号转导区。在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含cd28跨膜和信号转导结构域，其连接至cd3(例如，cd3-ζ)胞内结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含嵌合cd28和/或cd137(4-1bb、tnfrsf9)共刺激结构域，其连接至cd3ζ胞内结构域。

在一些实施方式中，所述car涵盖一个或多个，例如，两个或更多个，共刺激结构域和活化结构域，例如，胞质部分中的初始活化结构域。示例性的car包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的胞内部分。

在一些实施方式中，所述car或其它抗原受体还包括标志物，例如细胞表面标志物，其可用于确定所述细胞用于表达所述受体的转导或工程改造，例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的egfr(tegfr)。在一些方面，标记物包括cd34、ngfr或表皮生长因子受体(例如tegfr)的全部或部分(例如截短形式)。在一些实施方式中，编码所述标志物的核酸经操作性地连接至编码接头序列(例如可切割接头序列，例如，t2a)的多核苷酸。例如，标志物，和任选地，接头序列，可以是公开的专利申请号wo2014031687中描述的任意种。例如，所述标志物可以是截短的egfr(tegfr)，即任选地连接至接头序列，例如t2a可切割接头序列。用于截短的egfr(例如tegfr)的示例性的多肽包含示于seqidno:15的氨基酸序列，或与seqidno:15显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。示例性的t2a接头序列包含seqidno：14所示的氨基酸序列或显示出与seqidno：14有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述标志物是分子，例如，细胞表面蛋白质，其非天然见于t细胞上的或非天然见于t细胞表面或其部分。

在一些实施方式中，所述分子是非自体分子，例如，非自体蛋白质，即，不被待向其过继转移所述细胞的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。

在一些实施方式中，所述标志物无治疗性功能和/或除了用作遗传工程改造的标志物(例如，用于选择成功地工程改造的细胞)之外没有任何作用。在其它实施方式中，所述标志物可以是治疗性分子或在其它情况中发挥一些所需效果的分子，例如用于待在体内遇到的细胞的配体，例如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或抑制所述细胞在过继转移和遇到配体之后的响应。

在一些情况中，car被称为第一、第二和/或第三代car。在一些方面，第一代car是在抗原结合时仅提供cd3链诱导信号的car；在一些方面，第二代car是提供这样的信号和共刺激信号的car，例如包括来自共刺激受体(例如cd28或cd137)的细胞内信号转导结构域的car；在一些方面，第三代car是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的car。

在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的胞外部分和细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，所述抗体或片段包括scfv，且所述胞内结构域包含itam。在一些方面中，所述胞内信号转导结构域包括cd3-ζ链的ζ链的信号转导结构域。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括跨膜结构域，其连接胞外结构域和胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述跨膜结构域包含cd28的跨膜部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有t细胞共刺激分子的细胞内结构域。胞外结构域和跨膜结构域可直接或间接相连。在一些实施方式中，所述胞外结构域和跨膜通过间隔物，例如本文所述的任何间隔物连接。在一些实施方式中，所述受体包含作为跨膜结构域的衍生来源的分子的胞外部分，例如cd28胞外部分。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含源自t细胞共刺激分子或其功能变体的胞内结构域，例如在跨膜结构域和胞内信号转导结构域之间。在一些方面中，t细胞共刺激分子是cd28或41bb。

例如，在一些实施方式中，car含有抗体，例如抗体片段，是或含有cd28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有cd28的信号转导部分或功能性变体的细胞内信号转导结构域，和cd3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些实施方式中，car含有抗体，例如抗体片段，是包含或含有cd28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有4-1bb的信号转导部分或功能变体的细胞内信号转导结构域，以及cd3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些所述实施方式中，所述受体还包括间隔物，其包含ig分子(例如人ig分子)的部分，例如ig铰链，例如igg4铰链，例如仅铰链间隔物。

在一些实施方式中，所述重组受体(例如，car)的跨膜结构域是或包括人cd28(例如登录号p01747.1)或其变体的跨膜结构域，例如包含示于seqidno:6的氨基酸序列的跨膜结构域，或与seqidno:6显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列；在一些实施方式中，包含重组受体的部分的跨膜-结构域包含示于seqidno:7的氨基酸序列，或与其具有至少是或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述重组受体(例如car)的胞内信号转导部分包含人cd28或其功能变体或部分的胞内共刺激信号转导结构域，例如在原始cd28蛋白的位置186-187处具有ll-gg取代的结构域。例如，胞内信号转导结构域可包含示于seqidno:8或9的氨基酸序列，或与seqidno:8或9显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述胞内结构域包含4-1bb(例如(登录号q07011.1)或功能变体或其部分的胞内共刺激信号转导结构域，例如示于seqidno:10的氨基酸序列，或与seqidno:10显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述重组受体(例如car)的胞内信号转导结构域包含人cd3ζ刺激信号转导结构域或其功能变体，例如人cd3ζ(登录号:p20963.2)同种型3的112aa胞质结构域，或cd3ζ信号转导结构域，其描述于美国专利号:7,446,190或美国专利号8,911,993。例如，在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含如seqidno：11、12或13所示的氨基酸序列或显示与seqidno：11、12或13有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列相同性的氨基酸序列。

在一些方面中，所述间隔物仅包含igg的铰链区，例如仅igg4或igg1的铰链，例如仅示于seqidno:1的间隔物铰链。在其它实施方式中，所述间隔物是或包含ig铰链，例如，igg4源性的铰链，其任选地连接至ch2和/或ch3结构域。在一些实施方式中，所述间隔物是ig铰链，例如，igg4铰链，其连接至ch2和ch3结构域，例如示于seqidno:4。在一些实施方式中，所述间隔物是ig铰链，例如，igg4铰链，其仅连接至ch3结构域，例如示于seqidno:3。在一些实施方式中，所述间隔物是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其它柔性接头，例如已知柔性接头。

例如，在一些实施方式中，car包括抗体，例如抗体片段，包括scfv，间隔物，例如含有免疫球蛋白分子的一部分的间隔物，例如铰链区和/或一个或多个重链分子恒定区，例如含有ig-铰链的间隔物，含有全部或部分cd28衍生的跨膜结构域的跨膜结构域，cd28衍生的细胞内信号结构域和cd3ζ信号转导结构域。在一些实施方式中，car包括抗体或片段，例如scfv，间隔物，例如任何含有ig-铰链的间隔物，cd28衍生的跨膜结构域，4-1bb衍生的细胞内信号转导结构域和cd3ζ衍生信号转导结构域。

在一些实施方式中，所述car构建体还包括t2a核糖体跳过元件和/或tegfr序列，例如，car下游，例如分别示于seqidno:14和/或15，或，与seqidno:14或15显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包括提供的受体和其他多肽(例如接头或肽)的多肽可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面中，所述多肽可包含对原始或天然序列进行的修饰，只要该蛋白质保留所需活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变或者可以是意外的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或pcr扩增所致的误差。

在一些实施方式中，连续剂量的由细胞表达的受体，例如car包含至少一种免疫反应性表位作为由第一剂量的细胞表达的受体，例如car。在一些方面，由以连续剂量给予的细胞表达的受体(例如car)与例如由第一剂量表达的受体，例如car相同，或者与由第一剂量给予的细胞表达的受体，例如car基本相同。

由以各种剂量给予对象的细胞表达的重组受体(例如car)通常识别或特异性结合被治疗的疾病或病症或细胞所表达的、与之相关的和/或特异性的分子。在特异性结合分子例如抗原时，受体通常将免疫刺激信号(例如itam转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方式中，第一剂量中的细胞表达特异性结合由疾病或病症的细胞或组织表达的抗原或与疾病或病症相关的抗原的car。

以连续剂量由细胞表达的受体(例如car)通常特异性结合与第一剂量的car相同的抗原，并且通常是与第一剂量的细胞的受体相同的受体或极端相似的受体。在一些实施方式中，连续剂量的细胞上的受体与第一剂量的细胞中的受体相同或者与该受体有大的相同性。

在一些实施方式中，由连续剂量的细胞表达的car包含与由第一剂量的细胞表达的car相同的scfv，相同的信号转导结构域和/或相同的连接。在一些实施方式中，其还包含与第一剂量相同的共刺激、刺激、跨膜和/或其它结构域。在一些实施方式中，连续剂量的car的一种或多种组分不同于第一剂量的car。

ix.工程改造的细胞

表达受体并通过本文所述的方法提供的细胞是工程改造的细胞。

所述细胞一般是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是t细胞和/或nk细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如专能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(ipsc)。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括t细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全t细胞群、cd4+细胞、cd8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。在一些方面中，如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，如干细胞，如诱导性多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，并且在冷冻保存前或后将其再导入同一患者。

t细胞和/或cd4⁺和/或cd8⁺t细胞的亚型和亚群包括：原初t(tn)细胞、效应t细胞(teff)、记忆t细胞及其亚型，例如干细胞记忆t(tscm)、中心记忆t(tcm)、效应记忆t(tem)、或最终分化的效应记忆t细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(til)、不成熟t细胞、成熟t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、粘膜相关的非变体t(mait)细胞、天然产生的和过继性调节t(treg)细胞、辅助性t细胞，例如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞、滤泡辅助性t细胞、α/βt细胞，和δ/γt细胞。

在一些实施方式中，所述细胞是自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方式中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方式中，所述细胞包括通过遗传工程改造导入的一种或多种核酸，并，由此表达所述核酸的重组或经遗传工程改造的产物。在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一个生物体或细胞获得的样品，其例如通常不在工程改造中的细胞和/或这类细胞来源的生物体中发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然中发现的，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。

用于遗传工程改造的方法和载体

还提供了用于产生表达重组受体的遗传工程改造的细胞的方法、组合物和试剂盒。遗传工程改造一般涉及将编码所述重组或经工程改造的部分的核酸导入细胞，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化进行。

在一些实施方式中，基因转移通过如下方式进行：首先，刺激细胞，例如，通过将其与刺激物合并，所述刺激物诱导响应，例如增殖、存活和/或活化，例如，通过细胞因子或活化标志物的表达来检测，然后转导该活化的细胞，并且在培养物中扩增至足以供于临床应用的数量。

在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对对象具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包括，例如在过继免疫治疗中给予之后，使细胞对体内负选择易感的基因区段。例如在一些方面中，所述细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的对象的体内状况的变化而被消除。可负选择的表型可通过将提供对给予的试剂(例如，化合物)的敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒i型胸苷激酶(hsv-itk)基因(wigler等，cellii:223，i977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(aprt)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(mullen等，proc.natl.acad.sci.usa.89:33(1992))。

在一些方面中，细胞还经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入遗传工程改造的组分，例如，抗原受体(例如，car)的各种方法是熟知的，并可采用本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒，例如，逆转录病毒或慢病毒，转导，转座子，和电穿孔。

在一些实施方式中，采用重组感染性病毒颗粒将重组核酸转移进入细胞，例如，源自猿病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体。在一些实施方式中，采用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入t细胞(参见例如，koste等，(2014)genetherapy2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；carlens等，(2000)exphematol28(10):1137-46；alonso-camino等，(2013)molthernuclacids2,e93；park等，trendsbiotechnol.2011年11月；29(11):550–557)。

在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(ltr)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)，骨髓增生性肉瘤病毒(mpsv)，鼠胚胎干细胞病毒(mesv)，鼠干细胞病毒(mscv)，脾病灶形成病毒(sffv)或腺相关病毒(aav)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，所述逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染数种物种(包括人类)的宿主细胞。在一个实施方式中，用待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；miller和rosman(1989)biotechniques7:980-990；miller，a.d.(1990)humangenetherapy1:5-14；scarpa等(1991)virology180:849-852；burns等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:8033-8037；和boris-lawrie和temin(1993)cur.opin.genet.develop.3:102-109。

慢病毒转导方法是已知的。示例性方法描述于，例如，wang等，(2012)j.immunother.35(9):689-701；cooper等，(2003)blood.101:1637–1644；verhoeyen等，(2009)methodsmolbiol.506:97-114；和cavalieri等，(2003)blood.102(2):497-505。

在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入t细胞(参见例如，chicaybam等，(2013)plosone8(3):e60298和vantedeloo等.(2000)genetherapy7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入t细胞(参见例如，manuri等(2010)humgenether21(4):427-437；sharma等，(2013)molecthernuclacids2,e74；和huang等，(2009)methodsmolbiol506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(currentprotocolsinmolecularbiology)，约翰威利父子公司(johnwiley&sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(johnston，nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶dna共沉淀(brash等，mol.cellbiol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号wo2014055668和美国专利号7,446,190的那些。

用于引入的其他核酸(例如基因)包括用以例如通过促进转移的细胞的活力和/或功能改善治疗功效的那些；用以提供遗传标志物以供选择和/或评价细胞的基因，例如以评估体内存活或定位；用以改善安全性的基因，例如，通过使细胞对体内负选择易感，如luptons.d.等，mol.andcellbiol.,11:6(1991)；和riddell等，humangenetherapy3:319-338(1992)所述；也参见lupton的公开号pct/us91/08442和pct/us94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因的应用。参见例如riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。

用于工程改造的细胞的制备

在一些实施方式中，经工程改造的细胞的制备包括一种或多种培养和/或一个或多个制备步骤。用于导入编码转基因受体(例如，car)的核酸的细胞可从样品(例如生物样品，例如获自或源自对象的样品)分离。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗性介入的人，例如，需要过继细胞疗法的人，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。

因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、体液和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。

在一些方面中，从中衍生或分离细胞的样品是血液或血液源性的样品或者，是或源自单采或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗)的情况中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，t细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类，和猪。

在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种物质的存在下经清洗、离心和/或孵育，例如，以移除不需要的组分，富集所需组分，裂解或移除对具体物质敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一种或多种性质，例如密度、粘附性质、尺寸、对具体组分的敏感性和/或抗性被分离。

在一些实例中，例如，通过单采或白细胞去除术，获得来自对象循环血液的细胞。在一些方面中，所述样品包括淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞，和/或血小板，和，在一些方面中包括与血红细胞和血小板不同的细胞。

在一些实施方式中，从所述对象收集的血液细胞经清洗，例如，以移除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，cobe2991细胞处理器，百特公司(baxter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(tff)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在多种生物相容缓冲液中重悬，例如，无ca⁺⁺/mg⁺⁺pbs。在某些实施方式中，移除血液细胞样品组分，并将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方式中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如，通过裂解血红细胞并通过percoll或ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。

在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用基于此类标志物进行分离的任何已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，在一些方面中，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合至此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，和从尚未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离已结合所述抗体或结合伴侣的细胞。

此类分离步骤可基于正选择，其中已结合所述试剂的细胞被保留用于进一步应用，和/或，负选择，其中尚未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两种部分均保留用于进一步应用。在一些方面中，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，从而分离最好基于通过与所需群不同的细胞表达的标志物进行。

所述分离不需导致具体细胞群或表达具体标志物的细胞的100％的富集或移除。例如，正选择或富集具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，增加所述细胞的数量或百分数，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，负选择、移除或消耗具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，减少所述细胞的数量或百分数，但不需要导致所有此类细胞的完全移除。

在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的部分进行另一分离步骤，例如后续正或负选择。在一些实例中，单一分离步骤同时消耗表达多重标志物的细胞，例如通过孵育使细胞与各自对负选择靶向的标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣孵育。同样地，可通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣孵育来对多重细胞类型进行同时正选择。

例如，在一些方面中，t细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如，cd28⁺、cd62l⁺、ccr7⁺、cd27⁺、cd127⁺、cd4⁺、cd8⁺、cd45ra⁺和/或cd45ro⁺t细胞，通过正或负选择技术分离。

例如，cd3⁺、cd28⁺t细胞可以采用cd3/cd28连接的磁珠(例如，dyna珠m-450cd3/cd28t细胞扩增器)来正选择。

在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集具体细胞群或通过负选择消耗具体细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性地结合至一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合试剂孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物⁺)或以相对较高水平表达(标志物^高)。

在一些实施方式中，t细胞通过对在非t细胞(例如b细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如cd14)进行负选择来从pbmc样品分离分离。在一些方面中，使用cd4⁺或cd8⁺选择步骤来分离辅助性cd4⁺和cd8⁺细胞毒性t细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应t细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物进行正或负选择，可将此类cd4⁺和cd8⁺群进一步分选成亚群。

在一些实施方式中，cd8⁺细胞针对原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进行进一步富集或消耗，例如通过基于与对应亚群相关联的表面抗原进行正或负选择。在一些实施方式中，进行针对中心记忆t(tcm)细胞的富集，以增加功效，例如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，在一些方面中，其在此类亚群中特别强健。参见terakura等.(2012)blood.1:72–82；wang等(2012)jimmunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，将tcm-富集的cd8⁺t细胞与cd4⁺t细胞合并以进一步增强功效。

在实施方式中，记忆t细胞在cd8⁺外周血淋巴细胞的cd62l⁺和cd62l-亚组中存在。pbmc可以针对cd62l-cd8⁺和/或cd62l⁺cd8⁺部分进行富集或消耗，例如采用抗cd8和抗cd62l抗体。

在一些实施方式中，针对中心记忆t(tcm)细胞的富集基于cd45ro、cd62l、ccr7、cd28、cd3、和/或cd127阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于cd45ra和/或粒酶b表达或高度表达的细胞进行负选择。在一些方面中，针对tcm细胞富集的cd8⁺群的分离通过如下方式进行：消耗表达cd4、cd14、cd45ra的细胞，和正选择或针对表达cd62l的细胞进行富集。一方面，针对中心记忆t(tcm)细胞的富集通过如下方式进行：由基于cd4表达选择的细胞的阴性部分起始，其基于cd14和cd45ra的表达进行负选择，和基于cd62l进行正选择。在一些方面中，此类选择同时进行，且在其它方面中，此类选择以某一顺序依次进行。在一些方面中，相同的基于cd4表达的选择步骤用于制备cd8⁺细胞群或亚群，也用以产生cd4⁺细胞群或亚群，从而保留来自基于cd4分离的阳性和阴性部分，并任选地在一种或多种进一步正或负选择步骤之后，用于所述方法的后续步骤。

在具体实例中，对pbmc样品或其它血液白细胞样品进行cd4⁺细胞选择，其中保留阴性和阳性部分。然后，基于cd14和cd45ra或cd19的表达对阴性部分进行负选择，并基于中心记忆t细胞特征性标志物，例如cd62l或ccr7、进行正选择，其中，所述正和负选择以某一顺序进行。

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助性cd4⁺t细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。cd4⁺淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初cd4⁺t淋巴细胞是cd45ro^-、cd45ra⁺、cd62l⁺、cd4⁺t细胞。在一些实施方式中，中心记忆cd4⁺细胞是cd62l⁺和cd45ro⁺。在一些实施方式中，效应cd4⁺细胞是cd62l^-和cd45ro^-。

在一个实例中，为了通过负选择对cd4⁺细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr，和cd8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，例如磁珠或顺磁珠，以允许分离用于正和/或负选择的细胞。例如，在一些实施方式中，所述细胞和细胞群采用免疫磁性(或亲和性磁性)分离技术分开(separated)或分离(isolated)(综述参见《分子医学方法》(methodsinmolecularmedicine)，第58卷：代谢研究方法(metastasisresearchprotocols)，第2卷：细胞体外和体内性能(cellbehaviorinvitroandinvivo)，第17-25页，s.a.brooks和u.schumacher编新泽西州托托华的胡玛纳出版社(humanapressinc.))。

在一些方面中，使待分离的样品或细胞组合物与较小的可磁化或磁响应性材料(如磁响应性颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如，dynalbeads珠或macs珠))孵育。所述磁响应性材料(例如，颗粒)一般直接或间接连接至结合伴侣(例如，抗体)，其特异性地结合至某一分子，例如，需要分离(例如需要进行负或正选择)的一种或多种细胞或细胞群上存在的表面标志物。

在一些实施方式中，所述磁性颗粒或珠包含磁响应性材料，其结合至特异性的结合部分，例如抗体或其它结合伴侣。有多种熟知的磁响应性材料用于磁性分离方法。合适的磁性颗粒包括描述于molday，美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书ep452342b中的那些，其通过引用纳入本文。胶体定形的颗粒，例如描述于owen美国专利号4,795,698的那些，而liberti等，美国专利号5,200,084是其它实例。

孵育一般在一定条件下进行，由此，所述抗体或结合伴侣或分子，例如二抗或其它试剂，其特异性地结合至所述抗体或结合伴侣，其连接至所述磁性颗粒或珠，特异性地结合至所述样品中的细胞上(如果)存在的细胞表面分子。

在一些方面中，将所述样品置于磁场中，并且，具有与其连接的磁性响应或可磁化颗粒的那些细胞将被磁铁吸引，并与未标记的细胞分离。对于正选择而言，保留被磁铁吸引的细胞；对于负选择而言，保留不被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在相同选择步骤中进行正和负选择的组合，其中，保留阳性和阴性部分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。

在某些实施方式中，所述磁响应性颗粒在一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中被覆。在某些实施方式中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标志物具有特异性的一抗的覆层连接至细胞。在某些实施方式中，所述细胞，而非珠，用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)被覆的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素被覆的磁性颗粒与生物素化一抗或二抗联用。

在一些实施方式中，使所述磁响应性颗粒保留连接至待经后续孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面中，保留所述颗粒连接至用于给予患者的细胞。在一些实施方式中，从所述细胞移去可磁化的或磁响应性颗粒。用于从细胞移去可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括，例如，采用竞争性非标记的抗体、和可磁化颗粒或连接至可切割接头的抗体。在一些实施方式中，所述可磁化颗粒是生物可降解的。

在一些实施方式中，所述基于亲和性的选择通过磁性活化的细胞分选(macs)(加利福尼亚奥本的美天旎生物技术公司(miltenyibiotech))进行。磁性活化的细胞分选(macs)系统能够高纯度选择其上连接有磁化的颗粒的细胞。在某些实施方式中，macs以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。即，使附接至磁化的颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未附接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式解放，从而它们可以被洗脱和回收。在某些实施方式中，所述非靶细胞带标记并从异质细胞群消耗。

在某些实施方式中，所述分离(isolation)或分开(separation)采用进行所述方法的分离、细胞制备、分离、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一种或多种的系统、装置或设备来进行。在一些方面中，所述系统用以在封闭或为空菌环境中进行这些步骤中的各个步骤，例如，以使错误、用户处理和/或污染最小化。在一个实例中，所述系统是国际专利申请公开号wo2009/072003或us20110003380a1中描述的系统。

在一些实施方式中，所述系统或设备在整合或独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个，例如，全部。在一些方面中，所述系统或设备包括与所述系统或设备信息连通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。

在一些方面中，进行所述分离和/或其它步骤使用clinimacs系统(美天旎生物技术公司(miltenyibiotic))进行，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。组件可包括整合的微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵，和各种夹管阀。在一些方面中，整合的计算机控制所述仪器的所有组件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复的步骤。在一些方面中，所述磁性分离单元包括可移动的永久磁铁和用于所述选择柱的支持物(holder)。所述蠕动泵控制通过管组的流速，并且，与夹管阀一起，确保通过所述系统的缓冲液的受控流和细胞的连续悬液。

在一些方面中，clinimacs系统使用以无菌、无热源溶液的形式提供的抗体-偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，在用磁性颗粒标记细胞之后，所述细胞经清洗以移除过量的颗粒。然后，将细胞制备袋连接至管组，其进一步连接至包含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道组成，包括前置柱和分离柱，并且仅用于单一使用。在分离程序起始之后，所述系统自动化地将所述细胞样品施加至分离柱上。使带标记的细胞保留在柱中，而通过一系列清洗步骤移除未标记的细胞。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是未标记的，并且不被保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是经标记的，并且被保留在柱中。在一些实施方式中，在移除磁场之后，从所述柱洗脱用于本文所述方法的细胞群，并收集在细胞收集袋中。

在一些实施方式中，分离和/或其它步骤采用clinimacsprodigy系统(美天旎生物技术公司)进行。在一些方面中，clinimacsprodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和通过离心分级分离细胞。clinimacsprodigy系统还可包括内置摄像机和图像识别软件，其通过识别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优选细胞分级分离终点。例如，外周血被自动化地分离成红细胞、血液白细胞和血浆层。clinimacsprodigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如klebanoff等.(2012)jimmunother.35(9):651–660,terakura等.(2012)blood.1:72–82,和wang等.(2012)jimmunother.35(9):689-701。

在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过流式细胞术收集和富集(或消耗)，其中针对多重细胞表面标志物被染色的细胞携载于流体中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过制备规模(facs)-分选法收集和富集(或消耗)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群通过采用微电机系统(mems)芯片联合基于facs的检测系统来收集和富集(或消耗)(参见例如，wo2010/033140，cho等(2010)labchip10，1567-1573；和godin等(2008)jbiophoton.1(5):355–376。在这两种情况中，细胞可以用多重标志物标记，以允许以高纯度分离明确界定的t细胞亚组。

在一些实施方式中，所述抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标志物标记，以促进用于正和/或负选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，将基于抗体或对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，例如通过荧光活化的细胞分选(facs)(其包括制备规模(facs)和/或微电机系统(mems)芯片)，例如，与流式细胞术检测系统联合。此类方法允许进行基于多重标志物的同时正和负选择。

在一些实施方式中，制备方法包括：冷冻步骤，例如，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后，冻存所述细胞。在一些实施方式中，所述冷冻和后续融化步骤移除粒细胞，并且，在某种程度上，移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在清洗步骤以移除血浆和血小板之后，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可采用任何各种已知冷冻溶液和参数。一个实例涉及采用包含20％dmso和8％人血清白蛋白(has)的pbs或其它合适的细胞冷冻培养基。然后，其用培养基1:1稀释，从而dmso和hsa的终浓度分别是10％和4％。然后，一般以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。

在一些实施方式中，提供的方法包括培育、孵育、培养，和/或遗传工程改造步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于对消耗的细胞群和培养起始组合物进行孵育和/或工程改造的方法。

因此，在一些实施方式中，所述细胞群在培养起始组合物中孵育。可在培养器皿，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其它容器中进行孵育和/或工程改造。

在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化，和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激性试剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成在群中诱导细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活以模拟抗原接触，和/或引发细胞用于遗传工程改造，如用于导入重组抗原受体的那些。

所述条件可包括如下一种或多种：具体培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和经设计以活化细胞的任何其它物质。

在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种物质，例如，配体，其能够活化tcr复合物的胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述物质开启或启动t细胞中的tcr/cd3胞内信号转导级联。此类物质可包括抗体，例如对tcr组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如，抗cd3、抗cd28，例如，其结合至固体支持物，例如珠，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗cd3和/或抗cd28抗体。在一些实施方式中，刺激剂包括1l-2和/或il-15，例如，至少约10单位/ml浓度的il-2。

在一些方面中，孵育按照一些技术，例如授予riddell等的美国专利号6,040,177，klebanoff等.(2012)jimmunother.35(9):651–660,terakura等.(2012)blood.1:72–82和/或wang等.(2012)jimmunother.35(9):689-701中所述的那些进行。

在一些实施方式中，t细胞群通过如下方式扩增：添加至培养起始组合物饲养层细胞，例如非分裂型外周血单核细胞(pbmc)，(例如，从而针对待扩增的初始群中的各t淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40或更多pbmc饲养层细胞)；并孵育所述培养物(例如足以扩增所述数量的t细胞的时间)。在一些方面中，所述非分裂型饲养层细胞可包括γ-辐照的pbmc饲养层细胞。在一些实施方式中，所述pbmc用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。在一些方面中，所述饲养层细胞在添加t细胞的群之前添加至培养基。

在一些实施方式中，所述刺激条件包括适于人t淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。任选地，孵育还可包括添加非分裂型ebv-转化的类淋巴母细胞(lcl)作为饲养层细胞。lcl可以用约6000-10000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面中，lcl饲养层细胞以任何合适的量提供，例如lcl饲养层细胞与初始t淋巴细胞的比率是至少约10:1。

在实施方式中，通过用抗原刺激天然或抗原特异性t淋巴细胞来获得抗原特异性t细胞，如抗原特异性cd4+和/或cd8+t细胞。例如，抗原特异性t细胞系或克隆可针对巨细胞病毒抗原产生，通过从感染的对象分离t细胞并采用相同抗原体外刺激细胞来进行。

x.组合物和制剂

还提供了包括用于给药的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，如来自包含给定剂量或其部分的用于给药的细胞数量的单位剂型组合物。所述药物组合物和制剂一般包括一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述组合物包括至少一种其它治疗剂。

术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含具有待给予该制剂的对象不可接受的毒性的额外成分。

“药学上可接受的运载体”指，药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对于对象无毒性。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面中，运载体的选择部分由特定细胞和/或给药方法来确定。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)，第16版，osol,a.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。

在一些方面中，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面中，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)，lww公司(lippincottwilliams&wilkins)；第21版(2005年5月1日)。

该制剂可包含水溶液。所述制剂或组合物还可包含多于一种活性成分，该活性成分可用于待用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对所述细胞具有补充活性的那些，其中相应活性剂彼此不产生负面影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，和/或长春新碱。

在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量，如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防性功效。所需剂量可以通过单药丸给予所述细胞，通过多药丸给予所述细胞或通过连续输注给予细胞来递送。

在一些实施方式中，该组合物包含有效降低疾病或病症负荷的量，和/或在对象中不导致crs或严重crs的量和/或实现本文所述的方法的任何其他结果的量的细胞。

该细胞和组合物可采用标准给予技术、制剂和/或装置给予。所述细胞的给予可以是自体同源或异源的。例如，免疫抑制细胞或祖细胞可获自一个对象，并给予相同对象或不同的相容对象。外周血衍生的免疫抑制细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫抑制细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。

制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”，包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。

在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水性溶液、悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可缓冲至选择的ph。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物多少更便于给药，尤其是通过注射。在另一方面，粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物。

可通过将所述细胞纳入溶剂中，如与合适运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等来制备无菌可注射溶液。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、和/或色素，取决于所需的给药和制备途径。在一些方面中，可查阅标准教科书来制备合适制备物。

可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、和山梨酸确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶演唱可注射药物形式的吸收。

用于体内给药的制剂一般为无菌的。无菌可例如通过无菌滤膜过滤来容易地实现。

xii.制品

还提供了制品，如试剂盒和装置，用于按照提供的用于过继细胞治疗的方法向对象给予细胞，并用于储存和给予该细胞和组合物。

制品包括一个或多个容器，一般是多个容器，包装材料，和与一个或多个容器和/或包装结合或其上的标签或包装插页，一般包括向对象给予细胞的说明。

容器一般含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。制品一般包括多个容器，各自含有单个单位剂量的细胞。单位剂量可以是以第一剂量的待给予对象的细胞的量或数量或两倍(或更多)于待以第一或连续剂量给予的细胞的数量。其可以是与给药方法相关的给予对象的细胞的最低剂量或最低可能剂量。在一些实施方式中，单位剂量是将按照本发明的方法以单位剂量给予具有热定疾病或病症的任何对象或任何对象的细胞数量或细胞最小数量。例如，在一些方面，单位剂量可包括将给予较低体重和/或较低疾病负荷的对象的细胞的最小量，如以第一剂量向给定对象给予一个或在一些情况中超过一个单位剂量并且在一个或多个连续剂量中向给定对象给予一个或超过一个单位剂量，例如，按照提供的方法。在一些实施方式中，单位剂量中的细胞数是需要以第一剂量给予特定对象，如细胞衍生的对象的重组受体-表达或car-表达的数量或细胞数。在一些实施方式中，细胞衍生自待通过本文提供的方法治疗或有此需要的对象。

在一些实施方式中，各容器单独包含单位剂量的细胞，例如，包括相同或基本相同数量的细胞。因此，在一些实施方式中，各容器包含相同或大约或基本相同数量的细胞或重组受体-表达细胞。在一些实施方式中，单位剂量包括小于约1x10⁸、小于约5x10⁷、小于约1x10⁶或小于约5x10⁵个工程改造的细胞、总细胞、t细胞、或pbmc/千克待治疗和/或细胞衍生的对象。在一些实施方式中，各单位剂量含有等于或约2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、或1x10⁸个工程改造的细胞、总细胞、t细胞、或pbmc。

合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、和柔性袋如输注袋。在特定实施方式中，容器是袋，例如，柔性袋，如适于向对象输注细胞的那些，例如，柔性塑料或pvc袋，和/或iv溶液袋。在一些实施方式中，袋是可密封和/或能够灭菌的，以提供无菌溶液以及细胞和组合物的递送。在一些实施方式中，容器，例如，袋的容积等于或约或至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、或1000ml容积，如等于或约10至等于或约100ml或者等于或约10至等于或约500ml容积。在一些实施方式中，容器，例如，袋是和/或由在一个或多个不同温度下稳定和/或提供细胞的稳定储存和/或维持的材料制成，如在低温下，例如，低于或约或等于或约-20℃、-80℃、-120℃、135℃和/或适于冷冻保存的温度，和/或其他温度，如适于冻融细胞的温度和体温，如等于或约37℃，以允许在治疗前立即冻融，例如，在对象的地点或治疗地点，例如，在床边。

该容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。在一些实施方式中，容器具有一个或多个端口，例如，无菌浸入端口，例如，用于通过管或导管连接至一个或多个管，例如，用于静脉内或其他输注和/或用于出于从其他容器和向其他容器转移的目的连接，如细胞培养和/或储存袋或其他容器。示例性的容器包括输注袋、静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可通过注射用针头穿破的塞盖的那些。

制品还可包括包装插页或标签，其一片或多片显示使用信息和/或说明。在一些实施方式中，信息或说明显示可以或应该用于治疗特定疾病或病症的内容，和/或提供其说明。标签或包装插页可显示待用于治疗疾病或病症的制品的内容。在一些实施方式中，标签或包装插页提供了治疗对象的说明，例如，细胞已衍生的对象，通过包括给予第一和一个或多个连续剂量的细胞，例如，按照提供的方法的实施方式中的任一个的方法。在一些实施方式中，说明指定了在第一剂量中，给予一个单位剂量，例如，制品的单个单独容器的内容物，之后在指定时间点或指定时间窗内和/或检测到对象中的一个或多个因子或结果的存在或缺失或量或程度之后给予一个或多个连续剂量。

在一些实施方式中，说明指定了通过进行第一给药和连续给药向对象给予多个单位剂量。在一些实施方式中，第一给药包括向对象递送所述单位剂量之一并且连续给药包括向对象给予所述单位剂量中的一个或多个。

在一些实施方式中，说明指定了待在第一给药后，例如在第一给药或在先给药开始后约15天至约27天或约9天至约35天，例如，等于或约21天的时间上进行的连续给药。在一些实施方式中，说明指定连续剂量将在确定对象中指示细胞因子释放综合征(crs)的因子的血清水平比所述第一次给予之前即刻的所述对象的指示物的血清水平低约10倍、低约25倍、和/或低约50倍，和/或crs的指标已经达到峰值并且正在下降，和/或所述对象不表现出对由细胞表达的受体(例如car)特异的可检测的适应性宿主免疫应答之后给予。

在一些实施方式中，标签或包装插页或包装包含标识符，以指示从其衍生细胞的对象和/或将待给予的对象的身份。在自体移植的情况下，细胞衍生自的对象的身份与待给予细胞的对象的身份相同。因此，识别信息可以指定将细胞给予特定患者，例如细胞原始来源的细胞。这样的信息可以以条形码或其他编码标识符的形式存在于包装材料和/或标签中，或者可以指示对象的姓名和/或其他识别特征。

在一些实施方式中，制品包括一个或多个，通常为含有包含细胞的组合物的多个容器，例如其单独的单位剂量形式，并且还包括其中包含组合物的一个或多个其他容器，其该组合物包含其他试剂，例如细胞毒性或其它治疗剂，其例如将与细胞组合，例如，同时或以任何顺序一次给予。或者或此外，所述制品还可包括包含药学上可接受的缓冲剂的另一或相同容器。其还可包括其它材料，例如其它缓冲剂、稀释剂、滤器、管、针头，和/或注射器。

术语“包装插页”指治疗性产品的商品包装中常包括的说明书，所述说明书包含关于这类治疗性产品使用的说明、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。

除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。

如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。应理解本文中所述的方面和变化形式包括：“由(这些方面和变化形式)组成”和/或“基本由(这些方面和变化形式)组成”。

本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这适用而无关范围的宽度。

本文使用的术语约摂是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约x”的描述包括“x”的描述。

本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞，的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。

本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阳性”指，所述细胞上或细胞中具体标志物(通常是表面标志物)的可检测的存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或显著高于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。

本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阴性”指，所述细胞上或细胞中具有具体标志物，通常是表面标志物，的基本可检测的不存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。

本文所用术语“载体”指一种核酸分子，所述核酸分子能够增殖其连接的另一核酸。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及被导入已将其导入的宿主细胞基因组的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。

本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据库，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。

本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。

xiii.示例性实施方式

本文中提供的实施方式包括：

1.一种治疗方法，所述方法包括：

(a)向具有疾病或病症的对象给予第一剂量的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，所述第一剂量包括不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/m²对象；并且

(b)在(a)中的所述给予开始之后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点处向所述对象给予连续剂量的表达car的细胞。

2.如实施方式1所述的方法，其中，在(b)中给予时：

(i)指示细胞因子释放综合征(crs)的因子的对象中血清水平倍数比在(a)中所述给予之前即刻的对象中的水平小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍；和/或

(ii)所述对象没有显示出3级或更高的神经毒性；和/或

(iii)在所述给予所述第一剂量之后，所述对象中的神经毒性的症状或crs-相关结果已经达到峰值水平并且在(a)中的给予之后开始下降；和/或

(iv)所述对象没有显示出针对由所述第一剂量的细胞表达的car的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。

3.一种治疗方法，所述方法包括：

(a)向对象给予第一剂量的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，所述第一剂量包含足以降低所述对象中疾病或病症的负荷的量的所述细胞；并且

(b)在以下时间处向所述对象给予连续剂量的car-表达细胞：

(i)神经毒性、细胞因子释放综合征(crs)、巨噬细胞活化综合征、或肿瘤裂解综合征的临床风险不存在或者在(a)中的所述给予后已经过去或消退，(ii)在表明crs、神经毒性、巨噬细胞活化综合征、或肿瘤裂解综合征的生物化学读数不存在或者在(a)中的所述给予后已经过去或消退，和/或(iii)所述对象中指示细胞因子释放综合征(crs)或神经毒性的因子的血清水平比(a)中的所述给予之前即刻的所述对象中指示物的血清水平低约10倍、低约25倍、和/或低约50倍；并且

所述对象没有显示出针对由所述第一剂量的细胞表达的car特异的可检测的适应性宿主免疫应答。

4.一种治疗方法，所述方法包括：

(a)向对象给予第一剂量的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，所述第一剂量包含足以降低所述对象中疾病或病症的负荷的量的所述细胞；并且

(b)在所述对象中的神经毒性和/或crs-相关结果已经达到峰值水平并在(a)中的所述给予之后开始下降并且所述对象没有显示出针对由所述第一剂量的细胞表达的car的可检测的体液或细胞介导的免疫应答时向所述对象给予连续剂量的car-表达细胞。

5.如实施方式3或实施方式4所述的方法，其中：

(i)(a)中的所述给予不在所述对象中诱导严重crs或不在所述对象中诱导crs；

(ii)(a)中的所述给予不在所述对象中诱导3级或更高的神经毒性；

(iii)基于临床数据，(a)中给予所述剂量的细胞不在大部分如此治疗的对象中诱导严重crs；和/或

(iv)基于临床数据，(a)中给予所述剂量的细胞不在大部分如此治疗的对象中诱导严重3级或更高的神经毒性。

6.如实施方式3-5中任一项所述的方法，其中：

(a)中的所述给予开始和(b)中的所述给予开始之间的时间是约9至约35天，约14至约28天，15至27天，或17天至约21天，各自包括端值；和/或

所述第一剂量包含不超过约1x10⁶个细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸个细胞，或不超过约1x10⁸个细胞/m²对象。

7.如实施方式2-6中任一项所述的方法，其中，所述crs-相关结果选自下组：发热、低血压、缺氧、神经障碍、或炎性细胞因子或c反应性蛋白(crp)的血清水平。

8.如实施方式2-6中任一项所述的方法，其中，指示crs的因子是选自下组的炎性细胞因子：干扰素γ(ifnγ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、il-6、il-10、il-1β、il-8、il-2、mip-1、flt-3l、分形趋化因子、和il-5或是crp。

9.如实施方式2-8中任一项所述的方法，其中，在(b)中的给予时：

所述crs-相关结果的所述水平不超过峰值水平的50％，不超过峰值水平的20％，或不超过峰值水平的5％，或者等于或约为在(a)中的给予前即刻的水平；或指示crs的所述因子的所述血清水平不超过在(a)中的给予前即刻的水平的10倍。

10.如实施方式2-9中任一项所述的方法，与神经毒性的临床风险和/或3级或更高神经毒性相关的症状选自混乱、谵妄、表达性失语、反应迟钝、肌阵挛、嗜睡、改变的精神状态、惊厥、癫痫-样活动、癫痫(任选地由脑电图[eeg]确诊)、淀粉样β(aβ)水平升高、谷氨酸水平升高、和氧自由基水平升高。

11.如实施方式1-10中任一项所述的方法，其中，(a)中的给予之前，所述对象没有接受一定剂量的表达由所述第一剂量中的细胞表达的car的细胞。

12.如实施方式1-11中任一项所述的方法，其中，由连续剂量中的细胞表达的car含有至少一种免疫反应表位，该至少一种免疫反应表位存在于由在所述第一剂量中的细胞表达的car中。

13.如实施方式12所述的方法，其中，由连续剂量中的细胞表达的car与由第一剂量中的细胞表达的car相同或与由第一剂量中的细胞表达的car基本相同。

14.如实施方式1-13中任一项所述的方法，其中，由第一剂量中的细胞表达的car特异性结合至疾病或病症的或与疾病或病症相关的组织或细胞表达的抗原。

15.如实施方式14所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。

16.如实施方式15所述的方法，其中，(a)中的给予导致所述对象中疾病或病症的负荷降低，如(a)中的所述给予之后指示疾病负荷的一种或多种因子的降低所示。

17.如实施方式16所述的方法，其中，在(b)中的给予时，所述对象还没有复发和/或指示疾病负荷的一种或多种因子在所述降低之后还没有增加。

18.如实施方式1-17中任一项所述的方法，其中，细胞的连续剂量包含足以降低所述对象中疾病或病症负荷的量的细胞。

19.如实施方式16-18中任一项所述的方法，其中，(b)中的给予导致所述对象中疾病或病症的负荷进一步降低。

20.如实施方式1-19中任一项所述的方法，与初始给予连续剂量之前即刻相比，给予所述连续剂量导致对象中疾病或病症的负荷降低。

21.如实施方式1-20中任一项所述的方法，其中，与包括替代给药方案的方法相比，所述方法以更大的程度和/或持续更长时间地降低了疾病或病症的负荷，在所述替代给药方案中向对象给予单一剂量的(a)中的细胞和(b)中的细胞。

22.如实施方式16-22中任一项所述的方法，其中：

所述负荷降低和/或负荷的进一步降低包括所述对象中，所述对象的器官中，所述对象的组织中，或所述对象的体液中疾病细胞总数降低，肿瘤的质量或体积降低，和/或转移的数量和/或程度降低。

23.如实施方式1-22中任一项所述的方法，其中：

所述疾病是癌症并且所述对象在开始(b)中的给予时没有显示出形态学疾病；和/或

所述疾病是白血病或淋巴瘤并且对象在(b)中的给予时没有显示出骨髓中超过5％的胚细胞。

24.如实施方式1-23中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症在给予所述第一剂量后持续和/或给予所述第一剂量不足以根除所述对象中的疾病或病症。

25.如实施方式1-24中任一项所述的方法，其中，所述对象在(b)中的给予时显示出可检测的分子疾病和/或最小残留疾病。

26.如实施方式1-25中任一项所述的方法，其中，(i)car-表达细胞的最大数量，(ii)car-表达细胞随时间的曲线下面积(auc)，和/或(iii)(b)中所述给予后所述对象中可检测的car-表达细胞的持续时间与包括替代的给药方案的方法所实现的相比更大，在所述替代的给药方案中，以单一剂量给予所述对象(a)中的细胞和(b)中的细胞。

27.如实施方式1-26中任一项所述的方法，其中：

所述方法导致所述对象的血液中car-表达细胞的最大浓度或数量为至少等于或约10个car-表达细胞/微升，至少50％的外周血单核细胞(pbmc)总数，至少约1x10⁵个car-表达细胞，或至少5,000个拷贝的car-编码dna/微克dna；和/或

在(a)中的给予开始后90天时，在所述对象的血液或血清中可检测到car-表达细胞；和/或

在(a)中的给予开始后90天时，所述对象的血液含有至少20％的car-表达细胞，至少10car-表达细胞/微升或至少1x10⁴个car-表达细胞。

28.如实施方式1-27中任一项所述的方法，其中(a)中的给予后随时间的car-表达细胞的血液浓度的曲线下面积(auc)与通过包括替代的给药方案的方法所实现的相比更大，在所述替代的给药方案中，以单一剂量向所述对象给予(a)中的细胞和(b)中的细胞。

29.如实施方式1-28中任一项所述的方法，其中，在(b)中的给予之后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14天时，对象中没有可检测的crs-相关结果，或者与包括替代给药方案的方法相比降低，在所述替代给药方案中在没有给予第一剂量的情况下给予对象(b)中的细胞。

30.如实施方式1-29中任一项所述的方法，其中，与包括替代给药方案的方法相比，在(b)中的给予之后，所述对象中指示crs的因子血清水平随时间的auc较低，在所述替代给药方案中，对象在没有给予第一剂量的情况下，给予(b)中的细胞。

31.如实施方式15-30中任一项所述的方法，其中，在(a)中的所述给予之前，所述对象已经用靶向肿瘤或癌症的治疗剂治疗，并且在(a)中的所述给予时对所述治疗剂是难治性的或非响应性的。

32.如实施方式1-31中任一项所述的方法，还包括，在(a)中的给予之后并在(b)中的所述给予之前，或在(a)中的给予之前，评价所述对象中指示crs的因子、指示神经毒性的因子、指示疾病负荷的因子、和/或指示宿主抗-car免疫应答的因子的血清水平。

33.如实施方式32所述的方法，其中，指示疾病负荷的因子被测量并包括对象中、对象的器官中、对象的组织中、或对象的体液中疾病的细胞总数，通过流式细胞术或定量pcr的分子检测，实体瘤的质量或体积，或转移的程度或数量。

34.如实施方式32或33所述的方法，包括：

i)在(b)中的给予之前评价指示疾病负荷的因子；和

ii)基于所述评价的结果，确定待给予所述对象的细胞的连续剂量，并且

iii)如果评价确定所述对象具有形态学疾病，给予所述对象包含少于所述第一剂量中的car-表达细胞的数量或与其大约相同的car-表达细胞的数量的连续剂量；和/或如果评价确定所述对象具有最小残留疾病，给予所述对象包含与所述第一剂量相比增加数量的car-表达细胞的连续剂量。

35.如实施方式1-33中任一项所述的方法，其中所述连续剂量包含与所述第一剂量中的car-表达细胞的数量大约相同数量的car-表达细胞。

36.如实施方式1-33中任一项所述的方法，其中所述连续剂量包含与所述第一剂量相比增加数量的car-表达细胞。

37.一种治疗方法，包括向在先给予第一剂量的表达car的细胞的对象给予连续剂量的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，其中：

在所述第一剂量开始后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点给予连续剂量的细胞；和/或

与所述第一剂量相比，以连续剂量给予的car-表达细胞的数量增加。

38.如实施方式1-37中任一项所述的方法，其中，第一剂量中给予的细胞的数量为约0.5x10⁶细胞/kg对象体重至3x10⁶细胞/kg，约0.75x10⁶细胞/kg至2.5x10⁶细胞/kg或约1x10⁶细胞/kg至2x10⁶细胞/kg，各自包括端值。

39.如实施方式34、36或37所述的方法，其中，增加的数量比所述第一剂量中的数量大至少2倍、5倍或10倍。

40.如实施方式1-39中任一项所述的方法，其中，以连续剂量的car-表达细胞给予的细胞的数量包含约2x10⁶细胞/千克(细胞/kg)体重至约6x10⁶细胞/kg，约2.5x10⁶细胞/kg至约5.0x10⁶细胞/kg，或约3.0x10⁶细胞/kg至约4.0x10⁶细胞/kg，各自包括端值。

41.如实施方式1-40中任一项所述的方法，其中，在给予第一剂量和/或给予连续剂量之后，所述对象没有显示出细胞因子释放综合征(crs)，没有显示严重crs，没有显示神经毒性，没有显示严重神经毒性，或没有显示超过3级的神经毒性。

42.如实施方式1-41中任一项所述的方法，其中，在给予第一剂量之后和/或给予连续剂量之后，所述第一剂量中的car-表达细胞在所述对象中增殖。

43.如实施方式42所述的方法，其中，所述增殖由以下显示：(i)与所述给予之前即刻相比，给予所述第一剂量和/或连续剂量之后血清crp水平增加，和/或(ii)与所述给予之前即刻相比，给予所述第一剂量和/或连续剂量之后血清中car-编码核酸的水平增加，如通过qpcr测量，其中所述增加是任选至少1、2或3倍。

44.如实施方式1-43中任一项所述的方法，其中，所述第一和连续剂量之间的时间是15-27天。

45.如实施方式44所述的方法，其中，所述第一和连续剂量之间的时间是约21天。

46.如实施方式44所述的方法，其中，所述第一和连续剂量之间的时间是约17天。

47.如实施方式1-46中任一项所述的方法，其中在包含第一剂量的细胞的单一药物组合物中给予第一剂量的细胞和/或其中在包含连续剂量的细胞的单一药物组合物中给予连续剂量的细胞。

48.如实施方式1-47中任一项所述的方法，其中：

所述第一剂量是分开剂量，其中在不超过3天的时间内在总体包含所述第一剂量的细胞的多个组合物中给予所述第一剂量的细胞；和/或

所述连续剂量是分开剂量，其中在不超过3天的时间内在总体包含所述连续剂量的细胞的多个组合物中给予所述连续剂量的细胞。

49.如实施方式1-48中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在(a)中的给予和/或(b)中的给予之前给予化疗剂和/或其中在给予所述第一剂量之前，所述对象之前已经用化疗剂治疗。

50.如实施方式49所述的方法，其中，所述化疗剂包括选自下组的试剂：环磷酰胺、氟达拉滨、和/或其组合。

51.如实施方式49或50所述的方法，其中，所述给予化疗剂包括在(a)中的给予之前和任选不在(b)中的给予之前给予化疗剂。

52.如实施方式49-51中任一项所述的方法，其中，所述化疗剂在(a)中的给予前2-5天给予和/或在(b)中的给予前2-5天给予。

53.如实施方式49-52中任一项所述的方法，其中，以等于或约1g/m²对象和等于或约100g/m²，15g/m²对象和50g/m²对象，0.5g/m²对象和5g/m²对象，或1g/m²对象和等于或约3g/m²对象的剂量给予所述化疗剂。

54.如实施方式1-53中任一项所述的方法，其中所述对象在给予所述第一剂量之前已接受冷冻还原化疗或所述方法还包括在给予所述第一剂量之前给予冷冻还原化疗。

55.如实施方式49-54中任一项所述的方法，其中，所述化疗剂包括调节化疗，其降低所述对象中疾病或病症的负荷。

56.一种提供巩固治疗的方法，包括向对象给予连续剂量的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，其中：

在所述给予之前，所述对象已经接受了足以降低所述对象中疾病或病症的负荷的量的car-表达的在先剂量；并且

在给予时，所述对象中指示细胞因子释放综合征(crs)的因子的血清水平比所述在先剂量之前即刻所述对象中所述指示物的血清水平低约10倍、低约25倍、和/或低约50倍，并且所述对象没有显示针对由所述在先剂量的细胞表达的car特异的可检测适应性宿主免疫应答；和/或所述在先和连续剂量之间的时间超过约14天并小于约28天。

57.如实施方式56所述的方法，其中，连续剂量的car-表达细胞的细胞的数量包含约2x10⁶细胞/千克(细胞/kg)体重至约6x10⁶细胞/kg，约2.5x10⁶细胞/kg至约5.0x10⁶细胞/kg，或约3.0x10⁶细胞/kg至约4.0x10⁶细胞/kg，各自包括端值。

58.如实施方式1-57中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是白血病或淋巴瘤。

59.如实施方式1-58中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是急性淋巴细胞白血病。

60.如实施方式59所述的方法，其中所述连续剂量中给予的car⁺细胞数量/千克大于所述第一剂量中给予的car⁺细胞数量/千克。

61.如实施方式60所述的方法，其中所述连续剂量中给予的car⁺细胞数量/千克比所述第一剂量中给予的car⁺细胞数量/千克大至少或约2倍或者至少或约3倍。

62.如实施方式1-58中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(nhl)。

63.如实施方式1-62中任一项所述的方法，其中，以第一剂量给予的car⁺细胞的数量等于或约为或不超过或不超过约1x10⁶/千克对象和/或以连续剂量给予的car⁺细胞的数量等于或约为3x10⁶/千克对象。

64.如实施方式62所述的方法，其中所述连续剂量中给予的car⁺细胞数量/千克小于或大约小于或者等于或约等于所述第一剂量中给予的car⁺细胞数量/千克。

65.如实施方式1-64中任一项所述的方法，还包括向所述对象给予一个或多个其他后续剂量，其中在给予所述连续剂量开始后至少或超过14天时给予所述一个或多个其他后续剂量中的第一个。

66.如实施方式65所述的方法，其中，给予第一，连续和后续剂量包括在28天内或约28天内给予至少三个剂量。

67.如实施方式65或66所述的方法，其中，在给予所述第一剂量开始后的约14天给予所述连续剂量，在给予所述第一剂量开始后的28天给予所述至少一个其他后续剂量之一，并且任选地其中在给予所述第一剂量开始后的42天和/或56天时给予其他后续剂量。

68.如实施方式1-67中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是t细胞。

69.如实施方式1-68中任一项所述的方法，其特征在于，所述t细胞对于所述对象是自体的。

70.包含表达嵌合抗原受体(car)的细胞的组合物在制备用于治疗用car-表达细胞在先治疗的对象中的疾病或病症的药物中的用途，其中：

所述组合物在在先治疗后的14-28天使用；和/或

所述组合物经配制用于以足以降低之前已经用car-表达细胞治疗的对象中疾病或病症的负荷的量给予连续剂量。

71.用于在用car-表达细胞在先治疗的对象中治疗疾病的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，其中：

所述细胞在在先治疗后约14-28天使用；并且

所述细胞经配制用于以足以降低之前已经用car-表达细胞治疗的对象中疾病或病症的负荷的量给予连续剂量。

72.如实施方式70所述的用途或如实施方式71所述的细胞，其中，所述对象没有显示出形态学疾病和/或对象没有显示出骨髓中超过5％的胚细胞。

73.表达嵌合抗原受体(car)的细胞在制备用于治疗疾病或病症的方法中的药物中的用途，所述方法包括：

(a)向具有所述疾病或病症的对象给予第一剂量的表达car的细胞，所述第一剂量包括不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/m²对象；并且

(b)在(a)中的所述给予开始之后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点处向所述对象给予连续剂量的表达car的细胞。

74.用于治疗疾病或病症的方法中的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，所述方法包括：

(a)向具有所述疾病或病症的对象给予第一剂量的表达car的细胞，所述第一剂量包括不超过约1x10⁶细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸细胞，和/或不超过约1x10⁸细胞/m²对象；并且

(b)在(a)中的所述给予开始之后的至少或超过约14天并且不到约28天的时间点处向所述对象给予连续剂量的表达car的细胞。

75.如实施方式70-74中任一项所述的用途或细胞，其中所述细胞配制用于以一定量给予，使得(i)不在对象中诱导严重crs或不在对象中诱导crs；(ii)不在对象中诱导3级或更高神经毒性；(iii)基于临床数据，不在大部分如此治疗的对象中诱导严重crs；和/或(iv)基于临床数据，不在大部分如此治疗的对象中诱导3级或更高神经毒性。

76.表达嵌合抗原受体(car)的细胞在制备用于治疗对象中疾病或病症的药物中的用途，

其中所述细胞经配制和/或包装用于以第一和连续剂量给予对象和/或所述治疗包括以第一和连续剂量向对象给予细胞，其中：

所述第一剂量包含不超过约1x10⁶个细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸个细胞，和/或不超过约1x10⁸个细胞/m²对象，并且

所述连续剂量用于在以下时间点给予；(a)第一给予开始后至少或超过约14天后并且不到约28天，和/或(b)(i)所述对象中指示细胞因子释放综合征(crs)的因子的血清水平是所述第一给予之前即刻的所述对象中的不到约10倍，不到约25倍，和/或不到约50倍；(ii)所述对象没有显示3级或更高神经毒性；(iii)所述给予第一剂量后所述对象中的神经毒性的症状或crs-相关结果已经达到峰值水平并且在所述第一给予之后开始下降，和/或(iv)所述对象没有显示针对所述第一剂量的细胞表达的car的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。

77.用于治疗对象中疾病或病症的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，

其中所述细胞经配制和/或包装用于以第一和连续剂量给予对象和/或所述治疗包括以第一和连续剂量向对象给予细胞，其中：

所述第一剂量包含不超过约1x10⁶个细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸个细胞，和/或不超过约1x10⁸个细胞/m²对象，并且

所述连续剂量用于在以下时间点给予；(a)第一给予开始后至少或超过约14天后并且不到约28天，和/或(b)(i)所述对象中指示细胞因子释放综合征(crs)的因子的血清水平是所述第一给予之前即刻的所述对象中的不到约10倍，不到约25倍，和/或不到约50倍；(ii)所述对象没有显示3级或更高神经毒性；(iii)所述给予第一剂量后所述对象中的神经毒性的症状或crs-相关结果已经达到峰值水平并且在所述第一给予之后开始下降，和/或(iv)所述对象没有显示针对所述第一剂量的细胞表达的car的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。

78.如实施方式73-77中任一项所述的用途或细胞，其中，所述第一和连续给予包括以一个或多个单位剂量给予所述细胞，各单位剂量包含约5x10⁷至约5x10⁸个细胞，约5x10⁷至约2.5x10⁸个细胞或约2.5x10⁸至4x10⁸个细胞；或者所述细胞配制成包含不超过约5x10⁷个细胞、不超过约1x10⁸个细胞、不超过约2x10⁸个细胞、不超过约2.5x10⁸个细胞、不超过约3.0x10⁸个细胞或不超过约4x10⁸个细胞的单位剂量。

79.如实施方式78所述的用途或细胞，其中，所述第一给予包括给予单个单位剂量。

80.如实施方式78或79所述的用途或细胞，其中所述连续给予包括给予2个或更多个单位剂量。

81.如实施方式78或79所述的用途或细胞，其中，所述连续给予包括给予单个单位剂量。

82.如实施方式68-81中任一项所述的用途、组合物或细胞，其中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。

83.如实施方式82所述的用途、组合物或细胞，其中，所述肿瘤或癌症是白血病或淋巴瘤。

84.如实施方式68-83中任一项所述的用途、组合物或细胞，其中所述连续剂量经配制用于给予与所述第一剂量或在先剂量相比数量增加的car-表达细胞。

85.如实施方式84所述的用途、组合物或细胞，其中，所述组合物用于治疗急性淋巴细胞性白血病。

86.如实施方式68-83中任一项所述的用途、组合物或细胞，其中，所述连续剂量经配制用于给予小于或约等于在先剂量中的car-表达细胞数量的数量的car-表达细胞。

87.如实施方式84或86所述的用途、组合物或细胞，其中，所述组合物用于治疗非霍奇金淋巴瘤(nhl)。

88.一种制品，其包含：

多个可密封容器，各自单独包含单位剂量的用于给予对象的表达嵌合抗原受体(car)的细胞，所述单位剂量包含约1x10⁸个所述细胞，不超过约1x10⁸个所述细胞，约5x10⁷个所述细胞，不超过约5x10⁷个所述细胞，约1x10⁶个细胞/kg对象，或不超过约1x10⁶个细胞/kg对象；

包装材料；和

标签或包装插页，其包含通过进行第一给予和连续给予向所述对象给予多个所述单位剂量的说明，所述第一给予包括向所述对象递送所述单位剂量之一并且所述连续给予包括向所述对象给予一个或多个所述单位剂量。

89.如实施方式88所述的制品，其中，所述说明指定在所述第一给予后的约14或15至27天，任选在约17天或约21天时进行所述连续给予。

90.如实施方式88或89所述的制品，其中，所述说明指定在已经确定所述对象中指示细胞因子释放综合征(crs)的因子的血清水平比所述第一给予之前即刻所述对象中所述指示物的血清水平低约10倍、低约25倍、和/或低约50倍之后进行所述连续给予。

91.如实施方式88-90中任一项所述的制品，其中，所述说明指定在已经确定crs的指示物已达到峰值并正在下降，和/或所述对象没有显示出针对所述第一剂量的细胞表达的car特异的可检测的适应性宿主免疫应答之后进行所述连续给予。

92.如实施方式88-91中任一项所述的制品，其中，所述细胞已从所述对象衍生。

93.如实施方式88-92中任一项所述的制品，其中，所述标记和/或所述包装材料还包括对象特异性的标识符，其表示细胞衍生自所述对象和/或应该特异性地给予所述对象。

94.如实施方式88-93中任一项所述的制品，其中，所述容器是或包含柔性细胞输注袋。

95.一种治疗方法，所述方法包括：

a)评价具有或疑似具有肿瘤的对象中指示疾病负荷的因子；并且

b)基于所述评价的结果，确定待给予所述对象的表达嵌合抗原受体(car)的细胞的剂量，其中：

i)如果所述评价确定所述对象没有形态学疾病或没有明显形态学疾病或没有等于或高于阈值水平的疾病负荷，给予所述对象超过约1x10⁶个细胞/kg的car-表达细胞的剂量；并且

ii)如果所述评价确定所述对象具有形态学疾病或明显形态学疾病或等于或高于阈值水平的疾病负荷，给予所述对象与ii)中相比较低的car-表达细胞的剂量。

96.如实施方式95所述的方法，其中：

所述对象没有显示形态学疾病或明显形态学疾病或等于或高于阈值水平的疾病负荷并给予大于或约2x10⁶个细胞/kg、3x10⁶个细胞/kg、4x10⁶个细胞/kg、5x10⁶个细胞/kg、6x10⁶个细胞/kg、7x10⁶个细胞/kg、8x10⁶个细胞/kg、9x10⁶个细胞/kg、1x10⁷个细胞/kg或2x10⁷个细胞/kg的细胞的剂量；和/或

所述对象显示形态学疾病或明显形态学疾病或具有高于阈值水平的疾病负荷并且给予小于或小于约1x10⁶个细胞/kg或5x10⁶个细胞/kg的细胞的剂量。

97.如实施方式95或96所述的方法，其中，如果骨髓中有超过或等于或约5％的胚，骨髓中有超过或等于或约10％的胚，骨髓中有超过或等于或约15％的胚，或骨髓中有超过或等于或约20％的胚，则所述对象显示出形态学疾病或明显形态学疾病或所述疾病负荷等于或高于阈值水平。

98.如实施方式95-97中任一项所述的方法，其中：

如果所述对象显示低于或低于约5％胚，给予所述对象大于或约1x10⁶个细胞/kg、2x10⁶个细胞/kg、3x10⁶个细胞/kg、4x10⁶个细胞/kg、5x10⁶个细胞/kg、6x10⁶个细胞/kg、7x10⁶个细胞/kg、8x10⁶个细胞/kg、9x10⁶个细胞/kg、1x10⁷个细胞/kg或2x10⁷个细胞/kg的细胞的剂量，和/或如果对象显示大于或等于或约5％胚，给予对象低于约1x10⁶个细胞/kg或5x10⁶个细胞/kg的剂量；

如果所述对象显示低于或低于约10％胚，给予所述对象大于或约1x10⁶个细胞/kg、2x10⁶个细胞/kg、3x10⁶个细胞/kg、4x10⁶个细胞/kg、5x10⁶个细胞/kg、6x10⁶个细胞/kg、7x10⁶个细胞/kg、8x10⁶个细胞/kg、9x10⁶个细胞/kg、1x10⁷个细胞/kg或2x10⁷个细胞/kg的细胞的剂量，和/或如果对象显示大于或等于或约10％胚，给予对象低于约1x10⁶个细胞/kg或5x10⁶个细胞/kg的剂量；

如果所述对象显示低于或低于约15％胚，给予所述对象大于或约1x10⁶个细胞/kg、2x10⁶个细胞/kg、3x10⁶个细胞/kg、4x10⁶个细胞/kg、5x10⁶个细胞/kg、6x10⁶个细胞/kg、7x10⁶个细胞/kg、8x10⁶个细胞/kg、9x10⁶个细胞/kg、1x10⁷个细胞/kg或2x10⁷个细胞/kg的细胞的剂量，和/或如果对象显示大于或等于或约15％胚，给予对象低于约1x10⁶个细胞/kg或5x10⁶个细胞/kg的剂量；

如果所述对象显示低于或低于约20％胚，给予所述对象大于或约1x10⁶个细胞/kg、2x10⁶个细胞/kg、3x10⁶个细胞/kg、4x10⁶个细胞/kg、5x10⁶个细胞/kg、6x10⁶个细胞/kg、7x10⁶个细胞/kg、8x10⁶个细胞/kg、9x10⁶个细胞/kg、1x10⁷个细胞/kg或2x10⁷个细胞/kg的细胞的剂量，和/或如果对象显示大于或等于或约20％胚，给予对象低于约1x10⁶个细胞/kg或5x10⁶个细胞/kg的剂量。

99.如实施方式95-98中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是白血病或淋巴瘤，任选地b细胞衍生的白血病或淋巴瘤。

100.如实施方式95-99中任一项所述的方法，其中，在给予所述剂量的细胞之后，所述对象没有显示出细胞因子释放综合征(crs)，没有显示严重crs，没有显示神经毒性，没有显示严重神经毒性，或没有显示超过3级的神经毒性。

101.如实施方式95-100中任一项所述的方法，其中，(a)中的给予导致所述对象中疾病或病症的负荷降低，如(a)中的所述给予之后指示疾病负荷的一种或多种因子的降低所示。

102.如实施方式95-101中任一项所述的方法，还包括向所述对象给予一个或多个连续剂量。

实施例

下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。

实施例1：用第一和连续剂量的car-表达自体同源t细胞治疗癌症患者

通过基于免疫亲和性的富集从患有癌症的人类对象的外周血中分离t细胞，并且用编码嵌合抗原受体(car)的病毒载体培养和转导细胞，所述嵌合抗原受体(car)特异性结合对象中由癌症表达的抗原，其是肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。细胞在单独的柔性输液袋中的输注介质中冷冻保存，每个包含单个单位剂量的细胞，其为约1×10⁶个细胞/对象体重或约5×10⁵个细胞/对象体重。在输注之前，将细胞保持在低于-130℃的温度下。

在开始细胞治疗之前，从对象获得血液，并且任选地通过elisa评估血清中指示细胞因子释放综合征(crs)的一种或多种血清因子的水平，例如肿瘤坏死因子α(tnfα)、干扰素γ(ifnγ)和il-6。在治疗开始之前，可以通过例如通过pet或ct扫描测量实体肿瘤的大小或质量来任选地评估肿瘤负荷，或通过评估与癌症相关的患者例如骨髓或外周血中的细胞数目。

通过升温至约37℃，将细胞在床边解冻，并且对象通过单次输注给予第一剂量的细胞。第一剂量的量是单一单位剂量。对于被认为具有低肿瘤负荷的对象，可以在第一剂量中给予两个单位剂量。通过在约15-30分钟时间内连续输注静脉内(iv)给予第一剂量。

在给予第一剂量后，对象接受身体检查，并监测任何毒性或毒性结果的症状，例如发热、低血压、缺氧、神经障碍或炎性细胞因子或c反应蛋白(crp)的血清水平升高。任选地，在给予第一剂量后，在一次或多次的情况下，从患者获得血液，并通过elisa评估指示crs的血清因子的水平。将血清因子的水平与刚好给予第一剂量之前获得的血清因子的水平进行比较。如有必要，给予抗il6或其他crs治疗以减少crs的症状。

在给予第一剂量后，例如在给药开始后1、2、3和/或4周，任选地检测对象中抗car免疫应答的存在或不存在，例如，通过elisa、elispot、基于细胞的抗体测定和/或混合淋巴细胞反应。

通过第一剂量实现的肿瘤负荷减少百分比可任选地在通过扫描(例如pet和ct扫描)在实体瘤患者中给予第一剂量后一次或多次进行测量，和/或通过量化在血液或肿瘤部位疾病阳性细胞，例如在具有血液癌症的对象中，并将其与在第一剂量之前观察到的值进行比较。

给予连续剂量。在一些对象中，在开始给予第一剂量后21天内给予连续剂量。在一些情况下，仅在经测试的crs相关结果或血清因子水平低于可接受水平并且在第一次给药后21天在对象中没有检测到抗car免疫应答时才给予连续剂量。在其他对象中，在第一剂量给予后超过3天的时间，并且将对象视为不具有crs或严重crs，或者所有测试的指示crs的血清因子的水平低于第一剂量给药后在峰值时观察到的crs的20％，并且认为对象没有可检测到的抗-car免疫应答时给予连续剂量。

连续剂量的大小是患者特异性的，并且基于肿瘤负荷，抗car免疫应答的存在和crs相关结果的水平。一些患者被给予含有1、2、3或甚至更多单位剂量的细胞的连续剂量。通过连续静脉输注在约15至30分钟内给予连续剂量。

从第一剂开始并持续长达数年，定期监测对象。评估抗-car免疫应答的发展，并测量肿瘤负荷。任选地，在随访期间，通过流式细胞术和定量聚合酶链反应(qpcr)检测car-表达细胞，以测量所给予的细胞的体内增殖和持久性。

实施例2：评估治疗前具有形态学疾病的对象中的car-t细胞治疗的神经毒性

给予cd19⁺b细胞急性淋巴细胞白血病(all)患者给予表达抗-cd19嵌合抗原受体(car)的自体t细胞。car包括截短的egfr(egfrt)部分作为标记物。在给予细胞之前，患者接受白细胞分离术，并用化学疗法治疗。为了产生自体car-表达t细胞，通过基于来自个体对象的白细胞分离样品的免疫亲和性富集分离t细胞，其通过编码抗cd19car的病毒载体被活化和转导。为在给药前，细胞经增殖、冷冻并在床边解冻。

通过评估骨髓对治疗前的肿瘤负荷进行评估，并确定骨髓胚细胞的百分比。在骨髓中具有至少5％的胚细胞的对象被认为具有形态学疾病(md)。显示如下定义的完全缓解(cr)的对象：包括在骨髓中具有小于5％的胚细胞，但在骨髓中显示分子可检测的残留疾病(通过流式细胞术)被认为具有最小的残留疾病(mrd)。通过在大约15-30分钟内单次静脉内(iv)连续输注，以约或约0.9×10⁶car+细胞/kg至约或约5.6×10⁶car+细胞/kg向对象给予car-表达t细胞(见图1a-c)。将环磷酰胺作为预处理化疗治疗在细胞输注前2至7天给予对象。

在给予car-表达t细胞后评估对象的疾病状态(mrd或md)以评估对治疗的反应。如果中性粒细胞计数>1,000×10⁶/l，血小板计数>100,000×10⁶/l，并且血红蛋白>10g/dl恢复正常造血，治疗后骨髓差异存在<5％的胚，并且没有白血病的临床证据持续最少4周，则确定对象完全缓解(cr)。治疗后，对对象进行评估并监测神经毒性(神经系统并发症，包括混乱症状，失语症，癫痫发作，抽搐，嗜睡和/或改变的精神状态)，根据严重程度分级(使用1-5级量表例如，guidocavaletti和paolamarmirolinaturereviewsneurology6，657-666(2010年12月)，其中3级(严重症状)，4(危及生命的症状)或5(死亡)被认为是严重的神经毒性。也确定并监测细胞因子释放综合征(crs)，基于严重程度分级。

在治疗前基于疾病负荷分离的对象组中评估了与剂量相比，用单次输注不同剂量的car表达t细胞的治疗后的响应、严重crs的存在、以及严重的神经毒性的存在。结果示于图1a-c中。

如图1a所示，无论治疗前的疾病负荷(形态学或分子可检测的疾病)如何，在测试的所有剂量下，在用car-表达t细胞治疗的大多数对象中观察到完全缓解(cr)。在治疗前，主要在分类为具有形态学疾病的对象中观察到crs。然而，图1b中所示的结果显示，在该组内，观察到接受各种剂量水平的car-表达t细胞的对象存在crs。

如图1c所示，与只有接受较高剂量的对象才观察到神经毒性的crs结果相反，形态学疾病对象中最常观察到严重神经毒性作为治疗前的最小残留疾病。在本研究中分析的对象接受了低于约3.5×10⁶个细胞/kg的car-表达t细胞的剂量，治疗后没有表现出严重的神经毒性。除了一个例外，在治疗前分类为具有分子可检测疾病的对象中一般没有观察到严重的神经毒性。因此，在治疗前接受较低剂量的给予的t细胞和/或具有较低疾病负荷的对象通常不表现出严重的神经毒性。

这些结果支持了，为了最小化毒性和最大化功效，使用剂量方案，其包括向具有形态学疾病的对象给予第一低剂量car表达-t细胞(其可能不一定在所有或大多数对象中足以根除疾病)以减轻疾病负荷，随后在肿瘤负荷已经减少后给予连续或后续细胞剂量。结果还支持一个结论，即如果在特定疾病或情境中希望或需要(例如，促进增加的反应或功效)，连续或后续给予细胞(在减少肿瘤负荷后给予，在全部或大多数对象应表现出最小疾病时)，可以更高的剂量进行连续剂量，没有或具有严重的神经毒性风险。

实施例3：第一和连续剂量car⁺自体t细胞后的功效和毒性评估

在实施例2中描述的研究的对象亚组中评估治疗功效和毒性作用，向其给予多个剂量的car⁺t细胞。下表3列出了以各种多剂量给予的细胞的特定剂量，并且在每种情况下是在第一剂量和连续剂量之间经过的时间。表3还列出了根据实施例2所述的标准，在给予每个剂量之前评估的每个对象的肿瘤负荷(mrd或md与骨髓中具有的胚细胞％；在标记为“疾病负荷”的列下列出)。表3还列出了每个患者对每次给药的响应的结果(在“应答”一栏列出了给予后的肿瘤负荷，其与给药前的疾病负荷相比，表明对治疗的响应)，存在或不存在(y/n)严重crs和严重神经毒性，如实施例2所述。

*第三剂量；第一和第二剂量后cr中的对象

id:对象编号

mrd:最小残留疾病

cr:完全缓解

cri:完全缓解和不完全血液计数恢复

nr:无响应

n/a:不可得

n:否

y:是

表3中的结果表明，大多数治疗的对象对于第一剂量的细胞是有反应的，这是通过对象的肿瘤负荷减少所证实的，例如，从存在>5％的胚细胞到mrd⁺或在某些情况下mrd^-，或从mrd⁺到mrd^-的肿瘤负荷减少。也观察到一些对象的完全缓解(cr)。如表3所示，在给予连续剂量的细胞后观察到肿瘤减少，如通过流式细胞术分析mrd的存在评估的完全缓解或疾病减少所证明的(参见患者编号：1、2、7、8和9)。因此，该结果表明给予连续剂量的细胞也是有效的。大多数对象在任何剂量下均未显示严重crs。此外，与实施例2一致，观察到仅在接受较高剂量的car-表达细胞的对象中和通常仅在具有形态学疾病的对象中的给药后才出现严重神经毒性。

在某些情况下，表3表明一些对象对第一剂量不具有反应性(nr)(参见患者编号：5和2*)，从而未能实现疾病或肿瘤负荷水平的降低。此外，结果表明，当给予连续较高剂量时，在第一剂量输注后不能实现临床缓解的没有增加对象的神经毒性的风险或频率，因为在接受连续较高剂量后这些对象的任一个中未检测到严重神经毒性。

在一些实施方式中，对象中缺乏(或相对较低)的反应性或毒性程度表明对象可能不能对car⁺t细胞治疗作出良好反应，但是在另一次输注时也不具有某些毒性不良事件的风险，否则可能表明后续给药需要避免更高剂量。因此，与第一剂量相比，这些结果支持剂量方案(例如，如果需要或最大化或改善功效所必需)，其中通过第一低剂量给药后连续给药(例如，在较短时间内)使用较高剂量。这里显示的结果表明，即使某些对象没有对第一次给药产生反应(因此在连续剂量时不具有较低的肿瘤负荷)，给予连续剂量后严重神经毒性的风险较低，甚至对于这些不响应的对象。

为了进一步评估在第一和连续剂量中给予的细胞的功效，基于采用c反应蛋白(crp)的血清水平测量的峰值水平，比较所给予的细胞的生物学活性。血清中crp升高峰值水平作为输注后t细胞增殖的证据。结果如图2所示。结果显示输注第一和连续剂量的t细胞后细胞增殖的证据。因此，这些结果表明，虽然对象在连续而不是首次给予car+t细胞后表现出降低的crs和神经毒性，但是在每次给予中，给予的细胞的生物活性及其增殖能力相当。

研究中的对象还接受了身体检查，并监测其他不良事件(ae)的症状，包括表4中列出的症状。为了评估对象中car+t细胞的第一和连续给药之间的差异，对这些数据进行了比较。将第一剂量输注后的治疗急性ae(teae)定义为在接受第一剂量后30天内但在接受连续剂量之前出现的任何ae。输注连续剂量后的teae被定义为在接受连续剂量后30天内但在任何后续剂量之前出现的任何ae。表4列出了与同一teae评估的总对象数相比，显示teae的对象的数量和显示这种teae的对象的百分比(括号中)。结果显示，输注第一剂量和连续剂量后不良事件的百分比相当。

实施例4：car⁺t细胞剂量对不同对象群总体生存的影响

为了进一步评估car⁺t细胞剂量对对象的整体治疗的影响，在根据给予的细胞数量和给药时的疾病状态划分的小组对象之间比较实施例2所述研究中对象的总生存期。通过计算具有检查观察值的kaplan-meier估计来确定乘积极限生存率，例如，如果患者退出研究时发生。

比较一组给予少于2.5×10⁶car⁺细胞/kg的对象中的所有对象和另一组的已经给予大于2.5×10⁶car⁺t细胞/kg的剂量的对象中的所有对象，结果表明给予较高剂量的对象组的总生存优势。仅观察在给药时具有形态行疾病的对象，较高剂量对总生存率的观察到的影响甚至更大。总的来说，本文提供的结果支持在连续给药中使用较高剂量(与第一剂量相比)的剂量方案，当在患者平均疾病负荷仍然降低的时间给予连续剂量，但是crs和/或神经毒性的风险仍然很低时。该实施例中的结果支持一个结论，即使用更高的连续剂量将促进增加功效。此外，如上所述，实施例2中显示的结果支持以下结论：即在后续给药(对象应具有低的疾病负荷或另外没有毒性风险)下使用较高剂量不会导致毒性风险增加。

实施例5：用于治疗急性淋巴细胞性白血病(all)的car⁺t细胞多重剂量方案

在示例性剂量方案中，用两种剂量的car-表达t细胞治疗具有cd19⁺b细胞急性淋巴细胞白血病(all)的对象，其包括给予第一低剂量的细胞和连续较高剂量的细胞。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体car-表达t细胞。对象在首次给予car-表达t细胞前2-5天接受预调节化疗，包括1.0-3.0g/m²环磷酰胺的单次静脉内淋巴消耗剂量。第一剂量包括大约1×10⁶个细胞/kg患者体重。在第一剂量给药后14-28天给予连续剂量的car-表达细胞(约3×10⁶个这类细胞/kg患者体重)。

监测对象的治疗功效，包括通过骨髓，外周血和脑脊髓液(csf)检查，中枢神经系统(cns)症状的评估，以评估和监测疾病负荷(包括形态学疾病的水平和存在或不存在和分子可检测疾病的程度)，不良事件的证据，包括crs和神经毒性，以及存活。

实施例6：用于治疗急性淋巴细胞性白血病(all)的car⁺t细胞重复给药方案

在示例性剂量方案中，用重复剂量的car-表达t细胞治疗具有复发性或难治性b细胞急性成淋巴细胞白血病(all)的对象，其包括在前28天内给予至少三个剂量的细胞。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体car-表达t细胞。任选地，对象接受环磷酰胺和/或氟达拉滨(cy/flu)的预调节免疫抑制化疗，其在第一剂量的car-表达细胞之前至少两天给予并在给予细胞前一般不超过5天或不超过7天。

对象接受小于或等于约1×10⁶个细胞/kg患者体重，例如约0.4×10⁶个细胞/kg至约1×10⁶个细胞/kg的car-表达细胞的第一剂量，包括端值。在给予第一剂量后14-28天内和/或在对象发展针对car的免疫应答之前，向对象输注另外两个更高剂量的细胞。在一些实施方式中，在第一剂量后约14天以高于第一剂量的剂量给予连续剂量的car-表达细胞，例如约2.5×10⁶个细胞/kg至约4.5×10⁶细胞/kg，例如，约3×10⁶个细胞/kg患者体重的剂量，随后是以高于第一剂量的剂量在第一剂量后约28天给予的第三剂量的car-表达细胞，例如范围为约2.5×10⁶个细胞/kg至约4.5×10⁶个细胞/kg，例如约3×10⁶个细胞/kg患者体重的剂量。在一些实施方式中，给予一个或多个后续剂量的细胞。在一些实施方式中，在第一剂量之后约42至56天内以高于第一剂量的剂量给予第四剂量的car-表达细胞，例如约2.5×10⁶个细胞/kg至约4.5×10⁶个细胞/kg，如约3×10⁶个细胞/kg患者体重的剂量。

通过测量对象中细胞最后剂量后的总体缓解率(orr)来监测对象的治疗功效。在一些实施方式中，监测在治疗前具有疾病形态学证据的对象(骨髓中大于或等于的5％的细胞是胚细胞)的功效。根据骨髓，外周血和脑脊髓液(csf)的检查以及中枢神经系统(cns)症状的身体检查和评估确定，orr被确定为具有不完全血细胞计数恢复(cri)的cr的对象的比例。

实施例7：用于治疗非霍奇金淋巴瘤(nhl)的car⁺t细胞多剂量方案与淋巴细胞消耗化疗预调节

在用于治疗cd19⁺b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)的示例性剂量方案中，使用car-表达t细胞的多剂量方案来治疗对象。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体car-表达t细胞。用至少两个剂量的car-表达t细胞治疗具有nhl的对象。对象接受小于或等于约1×10⁶个细胞/kg患者体重，例如约0.4×10⁶个细胞/kg至约1×10⁶个细胞/kg的car-表达细胞的第一剂量，包括端值。在示例性剂量方案中，在第一剂量后14至28天给予连续剂量的car-表达t细胞。

在一个示例性剂量方案中，具有nhl的对象以与第一剂量的car-表达t细胞相同或更低的剂量接受连续剂量的car表达，例如小于或等于约1×10⁶个细胞/kg患者体重，例如约0.4×10⁶个细胞/kg至约1×10⁶个细胞/kg的剂量。任选地，在在先给予后14至28天以小于或等于在先给予中给予的剂量的剂量给予其他重复剂量。

在一个示例性剂量方案中，在接受连续剂量之前，任选地监测对象肿瘤负荷。如果检测到分子缓解，如从形态学疾病到mrd的肿瘤减少所证明的，以高于第一剂量的剂量给予对象连续剂量的car-表达t细胞，例如约2.5×10⁶个细胞/kg至约4.5×10⁶个细胞/kg，例如约3×10⁶个细胞/kg患者体重的剂量。如果没有发生分子缓解，则以与第一剂量的car-表达t细胞相同或更低的剂量，如小于或等于约1×10⁶个细胞/kg患者体重，例如约0.4×10⁶个细胞/kg至约1×10⁶个细胞/kg的剂量向对象给予连续剂量。任选地，在先给予后14至28天给予其他重复剂量，如果出现分子缓解，则给予较高剂量，如果没有出现分子缓解，则给予较低剂量。

在一个示例性剂量方案中，在接受第一剂量之前，对象接受环磷酰胺和氟达拉滨(cy/flu)的免疫消耗预调节化疗，其在第一剂量的car-表达细胞之前至少两天且通常不超过给予细胞前7天给予。在预调节处理后，以小于或等于约1×10⁶个细胞/kg患者体重，如约0.4×10⁶个细胞/kg至约1×10⁶个细胞/kg的car-表达t细胞的剂量范围，如上所述给予对象第一剂量，包括端值。对象以高于第一剂量的剂量给予连续剂量的car-表达t细胞，例如约2.5×10⁶个细胞/kg至约4.5×10⁶个细胞/kg，例如约3×10⁶个细胞/kg患者体重的剂量。任选地，在约2.5×10⁶个细胞/kg至约4.5×10⁶个细胞/kg的剂量(例如约3×10⁶个细胞/kg患者体重)的在先给予之后14至28天给予另外的重复剂量。

实施例8：通过嵌合抗原受体(car)刺激的t细胞中pd1/pd-l1表达的评估

通过来自人对象的白细胞分离样品的免疫亲和性富集分离t细胞，并用编码含有人cd28衍生的细胞内信号转导结构域和人cd3的抗cd19嵌合抗原受体(car)的病毒载体激活和转导细胞ζ衍生的信号转导域。通过流式细胞术评估所得分离的组合物(car和某些t细胞标记物)的表面表达，以确定组合物中t细胞亚群中和t细胞亚群间所有t细胞中car+细胞的百分比，以及cd4+与cd8+t细胞的比率(参见表5)。

然后通过与以下孵育将组合物分成不同的样品：1)表达car特异性的抗原的k562细胞(k562-tcd19细胞)(抗原特异性共培养物)；2)表达不相关抗原的k562细胞(k562-ror1细胞)(非特异性共培养对照)；或3)平板结合的抗cd3抗体和可溶性抗cd28抗体(用于通过tcr复合物刺激)，最初使用平板结合的抗cd3和可溶性抗cd28，以及在第3天，适用的情况下孵育。对于(1)和(2)，k562(永生化骨髓性白血病细胞系)细胞被分别工程改造以表达cd19和ror1，并以1:1的比率与car-表达t细胞一起孵育。对于每种条件，刺激car-表达t细胞24小时。使用未刺激的样品(“基质”，无k562细胞或刺激抗体)作为额外的阴性对照。

培养24小时后，进行流式细胞术来评价pd1、pd-l1、pd-l2、t细胞标记物和car在各样品中细胞上的表面表达(基于山羊抗小鼠(“gam”)染色以检测car的鼠可变区部分)。门选带有匹配淋巴细胞的前向散射和侧面散射概况的活单细胞用于分析。在各种门选t细胞群(cd4⁺/car⁺，cd4⁺/car^-，cd8⁺/car⁺，和cd8⁺/car^-)上评估pd1、pd-l1和pd-l2的表达，基于各种标记物的表面表达设定门选，并使用阴性对照(“基质”)样品的值来确定合适的门选。

如图3a和4a所示，当与表达car特异性的抗原的细胞(k562-tcd19)一起培养时，pd1和pd-l1表达在24小时内在cd4⁺/car⁺和cd8⁺/car⁺t细胞中增加。在与表达不相关抗原细胞(k562-ror1)的相同类型的细胞孵育的car+细胞中或在任何经设计以实现通过tcr复合物的刺激的条件下孵育的任何cd4+或cd8+细胞群体的car+细胞中，在该时间段内没有观察到pd1和pd-l1的表达增加。在任何测试的刺激条件下，pd-l2的表达在该时间段内未被上调。

如图3b和4b所示，观察到与cd19-表达细胞孵育的细胞中pd-1和pd-l1的表达增加主要是由于抗cd19car的表达。在与cd19-表达细胞孵育后，不表达car(“car-”)的cd4+门选和cd8+门选的t细胞均未显示出pd-1或pd-l1表面表达的明显增加。

在用含有人4-1bb衍生的细胞内信号转导结构域和人cd3ζ衍生的信号转导结构域的抗-cd19嵌合抗原受体(car)进行遗传工程改造的t细胞的存在下获得相似的结果。因此，结果显示pd-1和pd-l1的上调出现在用含有cd28或4-1bb共刺激信号转导结构域的car构建体转导的t细胞上。这些数据表明通过嵌合抗原受体刺激后24小时内pd1和pd-l1的表面表达上调，但是在设计模拟通过典型t细胞抗原受体复合物(cd3/cd28抗体)信号的条件下刺激后没有上调。

这些数据进一步支持一个结论，即在体内给予对象之后，car特异性的抗原的暴露可能在一些情况下导致pd-l1和/或pd-1的上调，这可能比通过内源性tcr与同源抗原相互作用后出现的在更大程度上和/或更快(或与之不同)出现。

这类分子和其它抑制性标记物的上调可能导致t细胞的功能丧失和/或耗尽，并且例如可能破坏对细胞的长期暴露。与对象中存在的细胞相比，重复或连续剂量的细胞可用于递送尚未表达抑制性分子，例如pd-1和/或pd-l1，或以较低水平表达它们的细胞。因此，这些数据进一步支持多剂量方案，其中连续剂量的t细胞在初始剂量之后，例如暴露于靶抗原后在pd-l1或pd-1在初始剂量的细胞上已经或被上调时给予对象。

在一些实施方式中，在连续剂量中，抑制性分子在其中的细胞上不表达或基本上表达(或与参考细胞群体相同的程度)(或在超过50％、40％、30％、20％、10％或5％的细胞上)。在一些实施方式中，不表达或基本不表达抑制性分子(例如pd-1和pd-l1)的重复剂量的细胞可以延长具有强大功能的car-表达t细胞或功能性car-表达t细胞在对象中存在的时间。在一些实施方式中，通过给予一个或多个连续剂量来补充遗传工程改造的t细胞的臂可导致抗原受体(例如car)-表达细胞的更大和/或更长程度的暴露并改善治疗结果。在一些实施方式中，与参考水平或群相比，如与刚好给予对象之前的第一剂量的组合物中的细胞相比，pd-l1或pd-1与参考群相比上调至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的表面表达程度时，给予连续剂量。

实施例9：基于肿瘤负荷的对象神经毒性评估

给予cd19⁺b细胞急性淋巴细胞白血病(all)患者给予表达抗-cd19嵌合抗原受体(car)的自体t细胞。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体car-表达t细胞。

在2×10⁵个细胞/kg(n＝13)，2×10⁶个细胞/kg(n＝15)或2×10⁷个细胞/kg(n＝2)的剂量下，接受单次iv连续输注car表达t细胞后，在一组患者中观察到神经毒性(参见图5a和5b)。在一些情况下，在输注前向对象给予环磷酰胺(约2g/m²)，环磷酰胺(2g/m²)和依托泊苷(100mg/m²，每天给予三次)或环磷酰胺(60mg/kg)和氟达拉滨(25mg/m²，每天给予3-5次)的预调节化疗治疗。

通过进行egfrt(car特异性标记物)和cd4或cd8的表面表达的流式细胞术，确定治疗后治疗的对象中外周血中存在的car-t细胞数。还确定并监测神经毒性，并根据如上所述的严重程度进行分级。

如图5a所示，本研究中观察到的治疗的对象中的神经毒性程度与治疗前较高肿瘤负荷的存在相关。如图5a所示，显示3级或更高神经毒性的严重症状的对象在评估时也显示较多数量的外周血中cd8+或cd4+car-t细胞，表明肿瘤负荷、car+t细胞增殖程度和神经毒性之间的关联性。图5b显示在治疗之前确定需要重症监护病房(icu)护理的对象是具有较高百分比的骨髓胚细胞的对象。

实施例10：car+t细胞的风险适应剂量

在如实施例9所述治疗的那些中的5名对象以基于肿瘤负荷适应的剂量给予抗cd19car-t细胞。

在治疗之前，通过评估骨髓中存在的骨髓胚细胞的百分比来评估肿瘤负荷。选择在骨髓中具有大于20％胚细胞(>20％)的对象用于给予相对于具有小于或等于20％胚细胞的对象给予的剂量较低的剂量的car-t细胞(2×10⁵t细胞/kg)。选择具有小于或等于20％胚细胞(≤20％)的对象用于给予较高剂量(2×10⁶个car-t细胞/kg)。通过单次静脉注射(iv)连续输注向对象给予car-表达t细胞。

在治疗后第0、1、3、7、10、14、21和28天，通过进行egfrt(car特异性标记物)和cd4或cd8表面表达的细胞样品的流式细胞术来确定治疗的对象的外周血中存在的car-t细胞数。也监测对象的毒性，包括需要重症监护病房(icu)护理的严重毒性结果。

观察到car-t细胞在所有对象中增殖。与接受类似治疗的一组对象相比，给予的剂量不是基于肿瘤负荷，风险适应的给药导致严重毒性的发生率降低。例如，在给药剂量不是基于肿瘤负荷的对象中，11名对象中的7名需要进行icu护理。相比之下，使用风险适应剂量的五个对象中没有(0％)需要icu护理。

实施例11：在具有b细胞急性淋巴细胞性白血病(all)的对象中进行car-t细胞给药前，用氟达拉滨预调节

给予cd19⁺b细胞急性淋巴细胞白血病(all)患者给予2x10⁶个细胞/kg的表达抗-cd19嵌合抗原受体(car)的自体t细胞。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体car-表达t细胞。

在给予car-表达t细胞之前，用以下来处理对象：1)2g/m²环磷酰胺(每天三次，给予或不给予100mg/m²依托泊苷)(n＝5，无flu治疗组)，或用60mg/kg(约2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(n＝10，指定的flu治疗组)处理。

在治疗后第0、1、3、7、10、14、21和28天，通过进行egfrt(car特异性标记物)和cd4或cd8表面表达的细胞样品的流式细胞术来确定治疗的对象的外周血中存在的car-t细胞数。

如图6a和6b所示，与在给予car-t细胞前未接受氟达拉滨的对象相比，在环磷酰胺/氟达拉滨预调节的对象中，治疗后7至28天观察到更大程度的car-t细胞增殖和/或持续性，如通过外周血中cd8+(图6a)或cd4+(图6b)car-t细胞的存在测量。该结果表明用环磷酰胺/氟达拉滨预调节可影响体内car-t细胞扩增。

如图6c所示，在已经用环磷酰胺和氟达拉滨预处理的对象中观察到较大百分比的在所显示的时间段内显示无病存活的患者。

实施例12：在具有非霍奇金淋巴瘤(nhl)的对象中car-t细胞给药前，用氟达拉滨预调节

给予具有非霍奇金淋巴瘤(nhl)的对象2×10⁷个细胞/kg的表达抗-cd19嵌合抗原受体(car)的自体t细胞。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体car-表达t细胞。

在给予car-表达t细胞之前，用以下处理对象：1)2-4g/m²环磷酰胺(每天三次，给予或不给与100-200mg/m²依托泊苷)(n＝3，指定为无flu处理组)，或2)30-60mg/kg(约1-2g/m²)环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m²氟达拉滨(n＝6，指定为cy/flu处理组)。

在治疗后第0、1、3、7、10、14、21和28天，通过进行egfrt(car特异性标记物)和cd4或cd8表面表达的细胞样品的流式细胞术来确定治疗的对象的外周血中存在的car-t细胞数。

结果示于图7a和7b中，其分别列出了car表达cd8+或cd4+t细胞，分别为样品中每μl的总细胞或cd4+或cd8+细胞的总百分比。如图7a和7b所示，与在给予car-t细胞前未接受氟达拉滨的对象相比，在环磷酰胺/氟达拉滨预调节的对象中，治疗后3至28天观察到更大程度的car-t细胞增殖和/或持续性，如通过外周血中cd8+(图7a)或cd4+(图7b)car-t细胞的存在测量。该结果表明在具有nhl的对象中用环磷酰胺/氟达拉滨预调节可影响体内car-t细胞扩增。

通过测量总体缓解率(orr)来监测对象的治疗功效。根据骨髓，外周血和脑脊髓液(csf)的检查以及中枢神经系统(cns)症状的身体检查和评估确定，orr被确定为具有完全缓解(cr)或部分缓解(pr)的对象的比例。

用环磷酰胺/氟达拉滨预调节的对象的总体缓解率为62％(8/13)，其中38％的cr率和23％的pr率(cr＝5/13，pr＝3/13)，而没有接受氟达拉滨预调节的对象的总体缓解率为50％(6/12)，其中cr率为8％并且pr率为42％(cr＝1/12，pr＝5/12)。

本发明并不意在将范围限制于具体公开的实施方式，这些实施方式仅为提供，例如，对于本发明不同方面的说明。本文所述的组合物和方法的各种修饰将在本文的说明和启示后变得显而易见。可实施这类变化而不偏离本公开的真正范围和精神，并且落入本发明的范围内。

序列表

<110>朱诺治疗学股份有限公司（junotherapeutics,inc.）

m·j·吉尔伯特（gilbert,mark）

<120>用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法

<130>735042001040

<140>未分配

<141>同时附上

<150>us62/066,279

<151>2014-10-20

<150>us62/162,647

<151>2015-05-15

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202530

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354045

glulysglugluglnglugluarggluthrlysthrproglucyspro

505560

serhisthrglnproleuglyvaltyrleuleuthrproalavalgln

65707580

aspleutrpleuargasplysalathrphethrcysphevalvalgly

859095

seraspleulysaspalahisleuthrtrpgluvalalaglylysval

100105110

prothrglyglyvalglugluglyleuleugluarghisserasngly

115120125

serglnserglnhisserargleuthrleuproargserleutrpasn

130135140

alaglythrservalthrcysthrleuasnhisproserleupropro

145150155160

glnargleumetalaleuarggluproalaalaglnalaprovallys

165170175

leuserleuasnleuleualaserseraspproproglualaalaser

180185190

trpleuleucysgluvalserglypheserproproasnileleuleu

195200205

mettrpleugluaspglnarggluvalasnthrserglyphealapro

210215220

alaargproproproglnproglyserthrthrphetrpalatrpser

225230235240

valleuargvalproalaproproserproglnproalathrtyrthr

245250255

cysvalvalserhisgluaspserargthrleuleuasnalaserarg

260265270

serleugluvalsertyrvalthrasphis

275280

<210>6

<211>27

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd28(登录号p10747的氨基酸153-179)

<400>6

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpval

2025

<210>7

<211>66

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd28(登录号p10747的氨基酸114-179)

<400>7

ilegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysserasn

151015

glythrileilehisvallysglylyshisleucysproserproleu

202530

pheproglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalglygly

354045

valleualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileilephe

505560

trpval

65

<210>8

<211>41

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd28(p10747的氨基酸180-220)

<400>8

argserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>9

<211>41

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd28(ll到gg)

<400>9

argserlysargserargglyglyhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>10

<211>42

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>4-1bb(q07011.1的氨基酸214-255)

<400>10

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>11

<211>112

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd3ζ

<400>11

argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>12

<211>112

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd3ζ

<400>12

argvallyspheserargseralagluproproalatyrglnglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>13

<211>112

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<220>

<223>cd3ζ

<400>13

argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrlysglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>14

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<220>

<223>t2a

<400>14

leugluglyglyglygluglyargglyserleuleuthrcysglyasp

151015

valglugluasnproglyproarg

20

<210>15

<211>357

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<220>

<223>tegfr

<400>15

metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro

151015

alapheleuleuileproarglysvalcysasnglyileglyilegly

202530

gluphelysaspserleuserileasnalathrasnilelyshisphe

354045

lysasncysthrserileserglyaspleuhisileleuprovalala

505560

pheargglyaspserphethrhisthrproproleuaspproglnglu

65707580

leuaspileleulysthrvallysgluilethrglypheleuleuile

859095

glnalatrpprogluasnargthraspleuhisalaphegluasnleu

100105110

gluileileargglyargthrlysglnhisglyglnpheserleuala

115120125

valvalserleuasnilethrserleuglyleuargserleulysglu

130135140

ileseraspglyaspvalileileserglyasnlysasnleucystyr

145150155160

alaasnthrileasntrplyslysleupheglythrserglyglnlys

165170175

thrlysileileserasnargglygluasnsercyslysalathrgly

180185190

glnvalcyshisalaleucysserprogluglycystrpglyproglu

195200205

proargaspcysvalsercysargasnvalserargglyargglucys

210215220

valasplyscysasnleuleugluglygluproarggluphevalglu

225230235240

asnserglucysileglncyshisproglucysleuproglnalamet

245250255

asnilethrcysthrglyargglyproaspasncysileglncysala

260265270

histyrileaspglyprohiscysvallysthrcysproalaglyval

275280285

metglygluasnasnthrleuvaltrplystyralaaspalaglyhis

290295300

valcyshisleucyshisproasncysthrtyrglycysthrglypro

305310315320

glyleugluglycysprothrasnglyprolysileproserileala

325330335

thrglymetvalglyalaleuleuleuleuleuvalvalalaleugly

340345350

ileglyleuphemet

355