抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用图

抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用图
【专利摘要】本发明涉及抗第三方中枢记忆性T细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途。公开了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法。所述方法包括：(a) 将非同基因的细胞或组织移植物移植到所述受试者内；和(b) 给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，并且其中进一步地，所述细胞是以下任一种：(i) 对所述受试者和所述移植物而言是非同基因的；或(ii) 对所述移植物而言是非同基因的和对所述受试者而言是同基因的，从而治疗所述受试者。
【专利说明】抗第三方中枢记忆性T细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
[0001 ] 本申请是国际申请日为2011年9月8日的国际申请PCT/IL2011/000727进入中国、申请号为201180053858.9的题为“抗第三方中枢记忆性T细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途”的发明专利申请的分案申请。
[0002]技术领域和
【背景技术】
本发明在其一些实施方案中涉及包括中枢记忆性T淋巴细胞表型的不诱导移植物抗宿主病(GVHD)的抗第三方细胞(non-graft versus host disease (GVHD) inducing ant1-third party cell)，和更具体而言但并非排他地涉及其在移植物抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途。
[0003]对于患有血液恶性肿瘤例如非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者的治疗选项有很多并且各不相同。这些现代治疗方案导致相当大比例的患者完全缓解(CR)。然而，这些患者中的许多人最终复发，暗示残余肿瘤细胞仍保留在达到临床CR的患者体内。为了应对该挑战，现在正在开发赋予移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)反应性的供体淋巴细胞输注(DLI)。具体地讲，在同种异体的骨髓移植(BMT)以及移植后DLI方面，已经取得了进展[Grigg A和RitchieD, B1l Blood Marrow Transplant (2004) 10: 579-590]。因此，已经证明了干细胞移植中或DLI中存在的供体CD8+ T细胞具有GVL作用的额外益处，其可杀死残留的恶性细胞[HoWY 等，J Clin Invest.(2002) 110: 1415-1417]。然而，该益处被移植物抗宿主病(GVHD)抵消，其与CD8 T细胞相关，这对移植相关死亡率具有不利影响。
[0004]本发明人进行的先前工作表明针对第三方刺激物的鼠CD8+T细胞的离体刺激，在IL-2剥夺的情况下，导致第三方限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆的选择性生长，其可促进T细胞耗尽的BMT (TDBMT)移入，而不引起GVHD [Bachar-Lustig E.等，Blood(2003) 102:1943-1950；Reich-Zeliger S.等，Immunity (2000) 13: 507-515]。近来，本发明人证明了具有中枢记忆性表型的激活的抗第三方CD8+细胞(Tcm)，可进一步支持和改善骨髓(BM)移入，可能是因为Tcm细胞的改善的淋巴结归巢、它们的增殖能力和在BMT受体中的延长的持久性[Ophir E等，Blood (2010) 115: 2095-2104]。
[0005]此外，本发明人已经证明在人类，抗第三方CTL，尽管耗尽了同种异体反应性，但仍显示出体外有效杀死B-CLL和不同类型的原代淋巴瘤细胞[Lask A等(2010年提交)；Arditti FD等，Blood (2005) 105:3365-3371 ]。已证明这种独特形式的GVL不依赖于TCR识别并且已发现其由自体和由同种异体的抗第三方CTL两者介导。此外，已证明这种由抗第三方CTL对B细胞恶性肿瘤的TCR独立性杀死经由如下被介导:通过ICAM1-LFA1结合的快速粘附、随后在CTL上的CD8与肿瘤细胞上的I类MHC之间的关键性相互作用时细胞凋亡的缓慢诱导。此外，已证明这类杀死独立于经典的CTL死亡分子:FASL、穿孔素、TNF和Trail [LaskA等，同上]。
[0006]额外的【背景技术】包括W0/2010/049935。

【发明内容】

[0007]
依据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括:(a)将非同基因的细胞或组织移植物移植到所述受试者内；和(b)给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞(tolerance-1nducing cell)并且在移植后能够归巢至淋巴结，并且进一步地，其中所述细胞是以下任一种:(i)对所述受试者和所述移植物而言是非同基因的;或(ii)对所述移植物而言是非同基因的和对所述受试者而言是同基因的，从而治疗所述受试者。
[0008]依据本发明的一些实施方案的一方面，提供了分离的细胞群体作为用于在已移植非同基因的细胞或组织移植物的受试者中消除疾病的辅助治疗的用途，其中所述分离的细胞群体包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，其中所述细胞是以下任一种:(i)对所述受试者和所述移植物而言是非同基因的;或(ii)对所述移植物而言是非同基因的和对所述受试者而言是同基因的。
[0009]依据本发明的一些实施方案的一方面，提供了分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导GVHD的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，并且其中所述细胞是以下任一种:(i)对宿主受试者和移植物而言都是非同基因的，其中所述受试者和所述移植物是非同基因的;或(ii)对移植物而言是非同基因的和对宿主受试者而言是同基因的，其中所述受试者和所述移植物是非同基因的。
[0010]依据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括:(a)将未成熟造血细胞移植到所述受试者内；和(b)给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是同基因的时，选择所述分离的细胞群体，其对所述受试者而言是同基因的或对所述受试者而言是非同基因的。
[0011]依据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括:(a)将未成熟造血细胞移植到所述受试者内；和(b)给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是非同基因的时，选择所述分离的细胞群体，其对所述受试者而言是同基因的或者对所述受试者和所述未成熟造血细胞而言都是非同基因的。
[0012]依据本发明的一些实施方案，所述非同基因的细胞或组织移植物衍生自选自HLA相同的供体和HLA不相同的供体的供体。
[0013]依据本发明的一些实施方案，所述受试者和所述供体都是人。
[0014]依据本发明的一些实施方案，所述受试者是人受试者。
[0015]依据本发明的一些实施方案，所述细胞或组织移植物是非自体的和所述分离的细胞群体是自体的。
[0016]依据本发明的一些实施方案，所述细胞或组织移植物和所述分离的细胞群体来自不同供体。
[0017]依据本发明的一些实施方案，所述疾病包括恶性肿瘤。
[0018]依据本发明的一些实施方案，所述恶性肿瘤包括B细胞恶性肿瘤。
[0019]依据本发明的一些实施方案，所述恶性肿瘤包括白血病。
[0020]依据本发明的一些实施方案，所述恶性肿瘤包括淋巴瘤。
[0021]依据本发明的一些实施方案，所述移植物包括骨髓细胞。
[0022]依据本发明的一些实施方案，所述骨髓细胞包括未成熟造血细胞。
[0023]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是非同基因的，所述分离的细胞群体对所述受试者而言是同基因的。
[0024]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞是非自体的和所述分离的细胞群体是自体的。
[0025]依据本发明的一些实施方案，当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是非同基因的时，所述分离的细胞群体对所述受试者和所述移植物而言都是非同基因的。
[0026]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞和所述分离的细胞群体来自不同供体。
[0027]依据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括将至少一种免疫抑制药给予所述受试者。
[0028]依据本发明的一些实施方案，在步骤(a)之前在亚致死、致死或超致死条件下进一步调节所述受试者。
[0029]依据本发明的一些实施方案，同时进行步骤(a)和步骤(b)。
[0030]依据本发明的一些实施方案，在进行步骤(a)之前进行步骤(b)。
[0031]依据本发明的一些实施方案，在进行步骤(a)之后一天进行步骤(b)。
[0032]依据本发明的一些实施方案，所述中枢记忆性T-淋巴细胞(Tcm)表型包括⑶8+/CD62L+标志。
[0033]依据本发明的一些实施方案，至少50%的所述分离的细胞群体具有所述标志。
[0034]依据本发明的一些实施方案，所述淋巴结包括外周淋巴结。
[0035]依据本发明的一些实施方案，所述淋巴结包括肠系膜淋巴结。
[0036]依据本发明的一些实施方案，对移植物而言是非同基因的和对受试者而言是同基因的细胞包括自体细胞。
[0037]依据本发明的一些实施方案，对移植物而言是非同基因的和对宿主受试者而言是同基因的细胞是自体的。
[0038]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞和所述分离的细胞群体是自体的。
[0039]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞是自体的和所述分离的细胞群体是非自体的。
[0040]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞是非自体的和所述分离的细胞群体是自体的。
[0041]依据本发明的一些实施方案，所述未成熟造血细胞和所述分离的细胞群体来自不同供体。
[0042]依据本发明的一些实施方案，具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞通过下述生成，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结:(a)在IL-21存在或不存在时，在允许GVH反应性细胞消除的条件下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触;和(b)在IL-15存在下，在无抗原环境中，在允许包括中枢记忆性T-淋巴细胞(Tcm)表型的细胞增殖的条件下，培养得自步骤(a)的细胞，从而生成分离的细胞群体。
[0043]依据本发明的一些实施方案，允许GVH反应性细胞消除的条件包括培养1-5天。
[0044]依据本发明的一些实施方案，允许GVH反应性细胞消除的条件包括在剥夺细胞因子的培养中1-5天。
[0045]依据本发明的一些实施方案，一种或多种第三方抗原包括树突细胞。
[0046]依据本发明的一些实施方案，一种或多种第三方抗原选自第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质和通过自体呈递细胞、非自体呈递细胞或者在人工载体上或人工抗原呈递细胞呈递的合成肽。
[0047]依据本发明的一些实施方案，允许细胞增殖的所述条件进一步包括IL-7。
[0048]依据本发明的一些实施方案，在IL-15存在下的培养进行3-30天。
[0049]依据本发明的一些实施方案，在IL-15存在下的培养进行6-30天。
[0050]依据本发明的一些实施方案，在IL-15存在下的培养进行3-20天。
[0051 ]依据本发明的一些实施方案，允许细胞增殖的所述条件包括培养3-10天。
[0052]依据本发明的一些实施方案，允许细胞增殖的条件包括培养3-7天。
[0053]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与由本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性方法和/或材料，但与本文描述的那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试中。在冲突的情况下，以本专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，且并非意欲是必要限制性的。
【附图说明】
[0054]
参考附图，对本文中本发明的一些实施方案进行了描述，这仅仅是示例性的。现在详细地具体参考附图，重点在于显示的细节是示例性的并且目的在于说明性论述本发明的实施方案。在这点上，说明书连同附图使得可如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员是显然的。
[0055]在附图中:
图1A-1描绘了在同基因骨髓移植之后，同基因衍生的抗第三方Tcm细胞对肿瘤复发的抑制。在5 X 13 A20-1UC淋巴瘤细胞存在或不存在时，受致死照射的(8 Gy) BALB/c小鼠(H-2d)经静脉内接受3 X 16同基因的T细胞耗尽的骨髓(BALB/c-NUDE (H_2d)移植(第O天)。然后在第+1天，给小鼠经静脉内注射或不注射指定数目的BALB/c衍生的抗第三方Tcm细胞(分别表示为白血病细胞+Tcm，η = 7;或仅用白血病细胞，η =7)。图1A-H是描绘从第14天起以每周间隔经生物发光成像(BLI)监测的肿瘤生长的图；图1I是描绘不同治疗组的动物存活率的图。X轴表示肿瘤细胞注射之后的天数，y轴表示受体小鼠存活比例。
[0056]图2A-G描绘了在同基因骨髓移植之后，Fl衍生的抗第三方⑶8T细胞对肿瘤复发的抑制。在5 X 13 A20-1UC淋巴瘤细胞存在或不存在时，受致死照射的(8 Gy) BALB/c小鼠(H-2d)经静脉内接受3 X 16同基因的T细胞耗尽的骨髓细胞(BALB/c-NUDE (H_2d)移植(第O天)。然后在第+1天，给小鼠经静脉内注射或不注射2 X 17 Fl衍生的抗第三方Tcm细胞(白血病细胞+Tcm，η = 7)或不注射(仅白血病细胞，n=5);图2A-F是描绘从第14天起以每周间隔经BLI监测的肿瘤生长的图。图2G是描绘不同处理组的动物存活率的图。X轴表示肿瘤细胞注射之后的天数，y轴表示受体小鼠存活比例。
[0057]图3A-1描绘了在同种异体骨髓移植之后，同种异体衍生的抗第三方Tcm细胞对肿瘤复发的抑制。在5 X 13 A20-1UC淋巴瘤细胞存在或不存在时，受致死照射的(8 Gy)BALB/c (H-2d)小鼠经静脉内接受3 x 16同种异体的T细胞耗尽的骨髓细胞(C57BL/6-NUDE(H-2b)移植(第O天)。然后给小鼠经静脉内注射C57BL/6衍生的细胞(在第+1天)。图3A-H是描绘从第13天起以每周间隔经BLI监测的肿瘤生长的图；图31是描绘不同处理组的动物存活率的图。X轴表示肿瘤细胞注射之后的天数，y轴表示受体小鼠存活比例。
[0058]图4A-B是描绘本发明的抗第三方T中枢记忆性细胞的增殖和细胞表型的图。图4A描绘了自培养第O天至第12天的Tcm细胞增殖;图4B描绘了细胞表型，使用针对Allo-DC的相同培养。
[0059]图5是描绘与B细胞淋巴瘤和浆细胞白血病细胞系的混合淋巴细胞反应(MLR)22小时后的凋亡细胞百分率的图。将CalceinAM预标记的Daudi，H.My2 ClR HLA A2 K66A突变体或L363细胞系与或不与5倍过量的抗第三方Tcm—起温育22小时。膜联蛋白V+细胞经FACS测定。数据显示为5次重复培养的平均值土 30。#印〈0.001值表示与在Tcm不存在时培养的样品相比的统计学显著变化。
[0060]图6是描绘与B细胞淋巴瘤EBV-LCL和浆细胞白血病细胞系的混合淋巴细胞反应(MLR) 22小时后的活细胞数目的图。将CalceinAM预标记的Daudi, H.My2 ClR HLA A2K66A突变体或L363细胞系与或不与5倍过量的抗第三方Tcm —起温育22小时。活的CalceinAM+细胞数目经FACS测定。数据显示为5次重复培养的平均值土 30。#吨〈0.001值表示与在Tcm不存在时培养的样品相比的统计学显著变化。
【具体实施方式】
[0061]
本发明在其一些实施方案中涉及包括中枢记忆性T淋巴细胞表型的不诱导移植物抗宿主病(GVHD)的抗第三方细胞，和更具体而言但并非排他地涉及其在移植物抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途。
[0062]本发明的原理和操作可以参考附图和伴随说明书得到更好理解。
[0063]在详细解释本发明的至少一个实施方案前，应当理解本发明不必然使其应用限制于下述说明书中所示或由实施例例示的细节。本发明能够具有其他实施方案或以各种方式进行实践或实施。此外，应当理解本文采用的措辞和术语用于描述的目的并且不应被视为限制性的。
[0064]在使本发明变成实践的同时，本发明人已揭露了抗第三方CD8+T中枢记忆性(Tcm)细胞包括体内移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)活性并因此可用于治疗恶性造血性疾病，例如淋巴瘤和白血病。
[0065]如下文和以下实施例部分所示，本发明人已经显示了在特别设计为在淋巴瘤患者中模仿同种异体骨髓移植(BMT)的体内小鼠模型中抗第三方CD8+ Tcm细胞的GVL反应性。最初，发明人在体外证实非同种异体反应性衍生的鼠抗第三方Tcm细胞的作用类似于人抗第三方CTL并直接消除A20鼠淋巴瘤细胞(参见以下实施例部分的实施例1)。随后，本发明人利用A20 B细胞淋巴瘤细胞系建立了用于B细胞淋巴瘤的最低残余疾病小鼠模型，其中萤光素酶报道基因被稳定整合到其基因组(A20-1UC)。这些细胞使得能够通过生物发光成像(BLI)而灵敏地监测体内肿瘤发展。使用该模型，发明人发现，当与同基因骨髓移植联合给予时，同基因的和同种异体的抗第三方Tcm细胞都表现出明显的GVL反应性，而不引起移植物抗宿主病(GVHD)(分别为以下实施例部分的实施例2和3)。此外，本发明人证明有效的GVL作用而没有GVHD，当给予同种异体的抗第三方Tcm细胞(供体类型)联合同种异体骨髓移植时(以下实施例部分中的实施例4)。总之，所有这些发现证实抗第三方Tcm细胞作为移植物抗白血病/淋巴瘤细胞用于在患病细胞的消除中的用途。此外，该结果证明了使用来自对受体和对移植供体而言是非同基因的供体(例如来自2个不同供体)的抗第三方Tcm细胞的能力。
[0066]因此，依据本发明的一方面，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括:(a)将细胞或组织移植物移植到所述受试者内；和(b)给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，并且进一步地，其中所述细胞是以下任一种:(i)对所述受试者和所述移植物而言是非同基因的；或(ii)对所述移植物而言是非同基因的和对所述受试者而言是同基因的，从而治疗所述受试者。
[0067]本文所用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学(aesthetical)症状，或基本上预防病况的临床或美学症状的出现。
[0068]本文所用的术语“受试者”或“有此需要的受试者”指哺乳动物，优选人类，需要细胞或组织移植物的处于任何年龄的男性或女性。一般地，由于可适于经由细胞或组织移植物的移植治疗的病症或病理上的或不希望有的病况、状态或症状，或身体、形态或生理学异常，受试者需要细胞或组织移植物(在本文中也称为受体)。此类病症的例子在下文进一步提供。
[0069]本文所用的短语“细胞或组织移植物”是指体细胞(例如单细胞或细胞群)或组织(例如可以全部或部分移植的实体组织或软组织)。可根据本教导进行移植的示例性组织包括但不限于淋巴样/造血组织(例如淋巴结、Peyer氏斑、胸腺或骨髓)。可根据本教导进行移植的示例性细胞包括但不限于造血干细胞(例如未成熟造血细胞)。
[0070]依据具体的实施方案，本发明的造血干细胞是⑶34+。
[0071]取决于应用，所述方法可以使用对所述受试者而言是同基因的或非同基因的细胞或组织移植物来实现。
[0072]本文所用的术语“同基因的”是指衍生自与受试者在遗传上基本上等同的个体的细胞或组织。一般地，基本上完全近交的哺乳动物、哺乳动物克隆或同卵双生哺乳动物是同基因的。
[0073]同基因的细胞或组织的实例包括衍生自受试者(在本领域中也称为“自体的”)、受试者克隆、或受试者的同卵双生子的细胞或组织。
[0074]本文所用的术语“非同基因的”是指衍生自对受试者的淋巴细胞而言是同种异体或异种的个体的细胞或组织(在本领域中也称为“非自体的”)。
[0075]本文所用的术语“同种异体的”指这样的细胞或组织，其衍生自具有与受试者相同物种的供体，但对受试者而言是基本上非克隆的。一般地，相同物种的远交、非接合体双生(non-zygotic twin)哺乳动物彼此是同种异体的。应当理解同种异体供体就受试者而言可以是HLA相同或HLA不相同的。
[0076]本文所用的术语“异种的”是指相对于受试者的显著比例淋巴细胞的种类，基本上表达不同物种的抗原的细胞或组织。一般地，不同物种的远交哺乳动物彼此是异种的。
[0077]本发明设想异种细胞或组织衍生自各种物种，例如但不限于牛科(例如牛)、马科(例如马)、猪科(例如猪)、羊(ovids)(例如山羊、绵羊)、猫科(例如家猫(Felisdomestica))、犬科(例如家犬(Canis domestica))、嗤齿类(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)或灵长类(例如黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴)。
[0078]异种起源(例如猪起源)的细胞或组织优选得自已知不含人畜共患病例如猪内源性逆转录病毒的来源。类似地，人衍生的细胞或组织优选得自基本上无病原体的来源。
[0079]依据本发明的一个实施方案，所述受试者和所述供体都是人。
[0080]取决于应用和可用来源，本发明的细胞或组织移植物可以得自出生前的生物、出生后的生物、成体或尸体供体。此外，取决于需要的应用，细胞或组织可以是幼稚的或经遗传修饰的。此类确定完全在本领域普通技术人员的能力内。
[0081 ]本领域已知的任何方法都可以用于获得细胞或组织(例如用于移植)。
[0082]将细胞或组织移植物移植到受试者内可以以众多方式实现，这取决于各种参数，例如细胞或组织类型;受体疾病(例如器官衰竭)的类型、阶段或严重性;对于受试者特异的身体或生理学参数;和/或所需治疗后果。
[0083]移植本发明的细胞或组织移植物可以通过将细胞或组织移植物移植到各种解剖学位置中的任何一个内来实现，这取决于于应用。细胞或组织移植物可以移植到等位的解剖学位置内(对于移植物正常的解剖学位置)或异位的解剖学位置内(对于移植物异常的解剖学位置)。取决于应用，细胞或组织移植物可以有利地植入肾囊下或肾、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、门静脉、肝、脾、骨、心腔、心脏、胸腔、肺、皮肤、胰腺和/或腹内空间内。
[0084]例如，在需要未成熟造血细胞移植的情况下，可以衍生自例如同基因或非同基因的供体的骨髓、动员外周血(通过例如白细胞去除术)、胎儿肝、卵黄囊和/或脐带血的未成熟自体的、同种异体或异种造血细胞(例如干细胞)，可以移植给患有疾病的受体。
[0085]依据本发明的一个实施方案，所述疾病是恶性疾病。依据具体的实施方案，所述恶性疾病是造血或淋巴组织的恶性肿瘤。依据另一个具体的实施方案，所述恶性疾病是B细胞恶性肿瘤(即涉及B淋巴细胞)。
[0086]此类疾病包括但不限于白血病[例如急性淋巴细胞性、急性成淋巴细胞性、急性成淋巴细胞性前B细胞、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、急性-成巨核细胞性、单核细胞性、急性髓性、急性髓样、急性髓样伴嗜酸性粒细胞增多症、B细胞、嗜碱性粒细胞性、慢性髓样、慢性、B细胞、嗜酸性粒细胞性、Friend、粒细胞或髓细胞性、多毛细胞、淋巴细胞性、成巨核细胞性、单核细胞性、单核细胞-巨噬细胞、成髓细胞性、髓样、骨髓单核细胞性、浆细胞、前B细胞、前髓细胞性、亚急性、T细胞、淋巴样赘生物、骨髓样恶性肿瘤倾向、急性非淋巴细胞性白血病、T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)]、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、B细胞、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞、皮肤T细胞、前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、组织细胞性、淋巴母细胞性、胸腺性和蕈样肉芽肿病];与移植物移植有关的疾病(例如移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主病)、自身免疫性疾病例如I型糖尿病、重症联合免疫缺陷综合征(SCID)包括腺苷脱氨酶(ADA)、骨硬化症、再生障碍性贫血、Gaucher氏病、地中海贫血和其他先天或遗传上决定的造血异常。
[0087]可以理解，使用本领域用于细胞移植的任何已知方法，例如但不限于细胞输注(例如1.V.)或经由腹膜内途径，可以将本发明的同基因或非同基因的造血细胞(例如未成熟造血细胞)移植到受体内。
[0088]任选地，当将本发明的细胞或组织移植物移植到具有缺陷器官的受试者内时，首先从受试者中至少部分去除衰退器官可为有利的，以便使得移植物能够最佳发育，及其与受试者的解剖学/生理学的结构/功能整合。
[0089]根据本教导将细胞或组织移植物移植到受试者内后，根据标准医学实践，根据各种标准领域技术中的任何一种监测器官的生长功能性和免疫相容性是可取的。例如，细胞或组织的结构发展可以经由计算机断层扫描或超声成像进行监测，而非同基因的细胞或骨髓移植物的移入可通过例如嵌合测试[例如通过基于PCR的方法，使用短串联重复序列(STR)分析]来监测。
[0090]无论移植类型如何，为了避免移植物排斥和移植物抗宿主病和为了消除任何残留肿瘤细胞，本发明的方法利用抗第三方Tcm细胞。
[0091]因此，依据本发明的一方面，给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结。
[0092]本文所用的短语“分离的细胞群体”是指已从其天然环境(例如人体)中分离的细胞。
[0093]本文所用的术语“非GVHD”是指基本上不具有移植物抗宿主诱导反应性。因此，本发明的细胞这样生成，以便不显著引起移植物抗宿主病(GVHD)。
[0094]本文所用的短语“抗第三方细胞”是指针对(例如通过T细胞识别)一种或多种第三方抗原的淋巴细胞(例如T淋巴细胞)。
[0095]本文所用的短语“一种或多种第三方抗原”是指可溶性或不溶性(例如膜结合)抗原，其不存在于供体或受体中，如下文详细描述的。
[0096]依据一个实施方案，本发明的一种或多种第三方抗原选自第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质和通过自体呈递细胞、非自体呈递细胞或者在人工载体上或人工抗原呈递细胞呈递的合成肽。
[0097]例如，第三方抗原可以是第三方细胞、病毒抗原例如EB病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)、或细菌抗原例如鞭毛蛋白。病毒抗原或细菌抗原可以由细胞(例如细胞系)呈递，所述细胞由此感染或以其他方式使得表达病毒/细菌蛋白质。自体或非自体抗原呈递细胞可以用于呈递与之融合或由之装载的短合成肽。此类短肽可为病毒衍生的肽或代表任何其他抗原的肽。
[0098]专门软件可以用于分析病毒序列或其他序列，以鉴定免疫原性短肽，即可在I类MHC或II类MHC背景中呈递的肽。
[0099]第三方细胞就受体而言可以是同种异体或异种的(在下文进一步详细解释)。在同种异体第三方细胞的情况下，此类细胞具有不同于供体抗原但与受体HLA抗原不交叉反应的HLA抗原，从而使得针对此类细胞生成的抗第三方细胞针对移植物或受体抗原不具有反应性。
[0100]依据本发明的实施方案，同种异体或异种第三方细胞是刺激细胞，例如但不限于由外周血淋巴细胞(PBL)、脾或淋巴结纯化的细胞，细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递树突细胞(APC)、B细胞系、抗原呈递细胞(APC)例如人工APC(例如用HLA和/或共刺激分子转染的K562细胞系)。
[0101]依据实施方案，一种或多种第三方抗原包括树突细胞。
[0102]第三方抗原可以在细胞、病毒或细菌表面上呈递或由其衍生和/或纯化。另外，病毒抗原、细菌抗原或任何外源抗原可以在受感染细胞上展示或者可以在人工载体例如脂质体或人工APC (例如用一种或多种第三方抗原转染的成纤维细胞或白血病细胞系)上展示。
[0103]另外，第三方抗原可以是例如由各种来源提取或纯化的蛋白质。可以充当本发明第三方抗原的纯化的蛋白质实例是卵白蛋白。设想了其他实例。
[0104]利用细胞、病毒、细菌、病毒感染的、细菌感染的、病毒肽或细菌肽呈递细胞作为第三方抗原是特别有利的，因为此类第三方抗原包括各种不同的抗原决定簇，并由此指导不同群体的抗第三方细胞形成，这可进一步用于更快速的T细胞重建，在其中需要此类重建的情况下，例如在致死或亚致死照射或化学治疗程序后。
[0105]此外，当抗第三方细胞针对第三方抗原时，有利的是，获得至少一些移植物抗疾病(例如癌细胞，例如移植物抗白血病)活性，由于由LFA1-1CAM1结合介导的TCR独立性杀死[Arditti等，Blood(2005)105(8):3365-71.Epub 2004年7月6日]。
[0106]依据一些实施方案，本发明的抗第三方细胞包括中枢记忆性T-淋巴细胞(Tcm)表型。
[0107]本文所用的短语“中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型”是指归巢至淋巴结的T细胞毒性细胞亚组。在人中具有Tcm表型的细胞一般表达CD8+/CD62L+/CD45R0+/L-选择素+/CD45RA-。根据一个更具体的实施方案，Tcm表型包括CD8+/CD62L+标志。可以理解，Tcm细胞可以在单一细胞上表达所有标志标记，或可以在单一细胞上表达仅部分标志标记。
[0108]可以理解，至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%的分离的细胞群体包括具有Tcm细胞标志的细胞。
[0109]如所述的，Tcm细胞在移植后一般归巢至淋巴结。依据一些实施方案，本发明的抗第三方Tcm细胞在移植后可归巢至任何淋巴结，例如外周淋巴结和肠系膜淋巴结。这些细胞的归巢性质允许其以快速有效的方式发挥其耐受作用。
[0110]因此，本发明的抗第三方Tcm细胞是诱导耐受性的细胞。
[0111]本文所用的短语“诱导耐受性的细胞”是指当它们与受体细胞(例如受体T细胞)接触时，引起受体细胞的应答性下降的细胞。诱导耐受性的细胞包括反抑细胞(即在与其接触后导致宿主T细胞凋亡的T细胞)，如先前在PCT公开号WO 2001/049243和WO 2002/102971中描述的。
[0112]诱导耐受性的细胞的应用在需要消除移植物排斥和克服移植物抗宿主病(GVHD)的情况下，例如在同种异体或异种细胞或组织移植中，是特别有益的。
[0113]依据一些实施方案，本发明的Tcm细胞可以是幼稚细胞(例如未经遗传修饰的)或经遗传修饰的细胞(例如已经遗传工程改造以表达或不表达特定基因、标记或肽或者分泌或不分泌特定细胞因子的细胞)。可实施本领域已知的任何方法，对细胞进行遗传工程改造，例如通过一种或多种相关基因的失活或通过干扰多肽表达的反义RNA的插入(参见例如W0/2000/039294，其通过引用结合到本文中)。
[0114]用于产生抗第三方非同种异体反应性的细胞(缺乏移植物抗宿主(GVH)活性)的任何方法可根据本教导而使用。
[0115]本发明的抗第三方Tcm细胞通常通过下述生成:首先在剥夺细胞因子(即不添加细胞因子)的培养中，使同基因或非同基因的外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原(例如如上所述)接触。该步骤通常进行大约12-72小时、24-48小时、1-10天、1-7天、1-5天、2-3天或2天并允许消除GVH反应性细胞(例如T细胞)。或者，可通过用IL-21 (0.001-3000 ng/ml、10 - 1000 ng/ml、10-100 ng/ml、1-100 ng/ml、0.1-100 ng/ml、0.1-10 ng/mia-50 ng/ml或1-10 ng/ml)补充在其他方面无细胞因子的培养，产生抗第三方Tcm细胞，其缺乏移植物抗宿主(GVH)活性。该步骤通常进行大约12-72小时、24-48小时、1-10天、1-10天、1-7天、1-5天、2-3天或3天。
[0116]然后，在无抗原环境中，在IL-15存在下(0.05-500ng/ml、0.001-3000 ng/ml、10-1000 ng/mln10-100 ng/mln1-100 ng/ml、0.1-100 ng/ml、0.1-10 ng/ml、l_50 ng/ml或1-10 ng/ml，依据一个具体的实施方案，浓度为5 ng/ml)，培养抗第三方细胞，时间为大约3-30 天、6-30 天、3-20 天、10-20 天、3-15 天、5-15 天、7-15 天、7-14 天、3-10 天、3-7 天或 14 天。还可在额外细胞因子例如IL-7 (0.05-500 ng/ml、0.001-3000 ng/ml、10 - 1000 ng/ml、10-100 ng/ml、l_100 ng/ml、0.1-100 ng/ml、0.1-10 ng/ml、l_50 ng/ml或1-10 ng/ml，依据一个具体的实施方案，浓度为5 ng/ml)和/或IL-21 (0.001-3000 ng/ml、0.001-3000ng/ml N10 - 1000 ng/ml n 10-100 ng/ml、l_100 ng/ml、0.1-100 ng/mK0.1-10 ng/ml、l_50 ng/ml或20-50 ng/ml，依据一个具体的实施方案，浓度为30 ng/ml)存在下，进一步进行培养。该过程使抗第三方细胞能够增殖，所述细胞包括中枢记忆性T-淋巴细胞(Tcm)表型并剥夺GVHD反应性。
[0117]可以理解，在IL-15存在下培养细胞之前，可以进行允许选择⑶8+T细胞的额外步骤，例如通过使用MACS珠。此类步骤可以是有利的，以便增加培养物内的CD8+细胞纯度(SP消除细胞培养物内的其他淋巴细胞，例如T CD4+细胞)，或以便增加CD8+ T细胞数目。因此，在与一种或多种第三方抗原一起培养之前或与一种或多种第三方抗原一起培养之后和与⑶15—起培养之前，可进行⑶8+细胞的分离。
[0118]依据本发明的一些实施方案，同基因的PBMC(例如来自受试者)可根据本教导而使用(即在同基因的Tcm细胞对治疗可能有益的情况下)。同样，非同基因的PBMC (例如对受试者而言是同种异体的或异种的)可根据本教导而使用。PBMC的来源可以相对于细胞的预期用途进行确定(参见下文进一步细节)，并且完全在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
[0119]正如以下实施例部分详述的那样，本发明人已经证明抗第三方Tcm细胞可与细胞或组织移植物(例如骨髓细胞)具有相同来源，具体地讲，它们可都衍生自同基因的供体(例如来自受试者，参见实施例2和图1A-1)或可都衍生自非同基因的供体(例如来自同种异体的供体，参见实施例4和图3A-1)。相反，抗第三方Tcm细胞可来自与细胞或组织移植物相比的不同来源(例如骨髓细胞可来自受试者，抗第三方细胞可来自同种异体的供体，实施例3和图2A-G)。
[0120]因此，依据本发明的一个实施方案，抗第三方Tcm细胞对受试者和移植物而言可以是非同基因的(例如同种异体的或异种的)。
[0121]本文所用的短语“对受试者和移植物而言是非同基因的”当涉及本发明的抗第三方Tcm细胞时，限定抗第三方Tcm细胞以任意组合对受试者而言是同种异体的或异种的且对移植物而言是同种异体的或异种的。因此，抗第三方Tcm细胞可得自不同于受试者和不同于移植物供体来源的来源。
[0122]依据具体的实施方案，抗第三方Tcm细胞对受试者和移植物而言是非同基因的(例如来自第二供体)。
[0123]依据另一个实施方案，抗第三方Tcm细胞可仅对受试者而言是非同基因的。依据另一个实施方案，抗第三方Tcm细胞可仅对细胞或组织移植物而言是非同基因的。
[0124]依据一个实施方案，抗第三方Tcm细胞对移植物而言是非同基因的和对受试者而言是同基因的(例如是自体来源的，在移植物是非自体来源的情况下)。
[0125]依据具体的实施方案，当移植物包括对受试者而言是非同基因的(例如非自体的)未成熟造血细胞时，分离的细胞群体对受试者而言是同基因的(例如自体的)。
[0126]本文所用的术语“未成熟造血细胞”是指能够分化成一种或多种类型的完全分化的造血细胞的任何类型的未完全分化的细胞。未成熟造血细胞包括但不限于在本领域中被称为“祖细胞”、“前体细胞”、“干细胞”、“多潜能细胞”、“多能细胞”等的细胞类型。
[0127]优选地，未成熟造血细胞是造血干细胞。
[0128]优选地，当未成熟造血细胞来源于人时，所述未成熟造血细胞是⑶34+细胞，例如CD34+CD133+细胞。
[0129]包括未成熟造血细胞的本发明移植物类型包括全骨髓细胞移植物(T细胞耗尽的或非T细胞耗尽的)、来自骨髓抽出物的未成熟造血细胞移植物、外周血衍生的未成熟造血细胞移植物和脐带血衍生的未成熟造血细胞移植物。获取这类移植物的方法描述如下。
[0130]可按照标准方法，例如通过动员CD34+细胞到外周血中通过对供体进行细胞因子处理，并经由白细胞去除术收获经动员的⑶34+细胞，获取包括人外周血衍生的造血干细胞的移植物。对于将骨髓衍生的干细胞从骨髓或血中分离出来的实践，本领域的文献中提供了大量的指导(参考例如Arai S，Klingemann HG., 2003.Arch Med Res.34: 545-53；和 Repka T^PWeisdorf D., 1998.Curr Opin Oncol.10:112-7; Janssen WE.等，1994.Cancer Control 1:225-230； Atkinson K.，1999.Curr Top Pathol.92:107-36)。 可按照标准方法(参考例如:Quillen K, Berkman EM., 1996.J Hematother.5:153-5)，获取人脐带血衍生的造血干细胞的移植物。
[0131]本发明的造血干细胞移植物也可衍生自肝组织或卵黄囊。
[0132]可通过原代造血干细胞的离体扩增，提供所需数量的造血干细胞(综述参见Emerson , 1996 , Blood 87: 3082，并更详细地描述于Petzer等，1996，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.3:1470; Zundstra等，1994，B1Technology 12:909;和WO 9511692)。依据另一个具体的实施方案，当移植物包括对受试者而言是非同基因的(例如非自体的)未成熟造血细胞时，分离的细胞群体对受试者和移植物而言都是非同基因的(例如未成熟造血细胞和分离的细胞群体来自不同供体)。
[0133]依据另一个实施方案，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括:(a)将未成熟造血细胞移植到所述受试者内；和(b)给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是同基因的时，选择分离的细胞群体，其对所述受试者而言是同基因的或对所述受试者而言是非同基因的。
[0134]依据具体的实施方案，未成熟造血细胞和分离的细胞群体都是自体的(例如来自受试者)。
[0135]依据另一个具体的实施方案，未成熟造血细胞是自体的(例如来自受试者)，而分离的细胞群体是非自体的(例如来自供体)。
[0136]依据另一个实施方案，提供了在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括:(a)将未成熟造血细胞移植到所述受试者内；和(b)给予所述受试者治疗有效量的分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是非同基因的时，选择分离的细胞群体，其对所述受试者而言是同基因的或者对所述受试者和所述未成熟造血细胞而言都是非同基因的。
[0137]依据具体的实施方案，未成熟造血细胞是非自体的(例如来自供体)，而分离的细胞群体是自体的(例如来自受试者)。
[0138]依据另一个实施方案，当未成熟造血细胞对受试者而言是非同基因的(例如非自体的)时，抗第三方Tcm细胞对受试者和移植物而言是非同基因的(例如两个不同供体)。
[0139]依据具体的实施方案，未成熟造血细胞和分离的细胞群体来自不同供体。
[0140]依据本发明的额外方面，提供了分离的细胞群体，其包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，并且进一步地，其中所述细胞对受试者和对细胞或组织移植物而言都是非同基因的。
[0141](i)对宿主受试者和移植物而言都是非同基因的;或
(ii)对移植物而言是非同基因的和对宿主受试者而言是同基因的。
[0142]依据一个实施方案，对移植物而言是非同基因的和对宿主受试者而言是同基因的细胞是自体的。
[0143]因此，本发明考虑给予受试者任何抗第三方Tcm细胞(例如对受试者和移植物而言都是非同基因的或者对移植物而言是非同基因的和对受试者而言是同基因的)，其将通过成为致耐受性细胞(tolerogenic cell)和非GVHD而导致疾病(例如白血病或淋巴瘤)的消除并将同时增强细胞或组织移植物(例如自体或非自体骨髓细胞)的移入。
[0144]可以理解，抗第三方细胞可与细胞或组织移植物同时给予(例如作为辅助治疗)，可在细胞或组织移植物移植之前给予(例如以便在移植之前消除残留癌细胞并消除移植物排斥和移植物抗宿主病)，或可在细胞或组织移植物移植之后给予(例如以便在移植之后消除残留癌细胞并消除移植物排斥和移植物抗宿主病)。
[0145]可以理解，可在移植之后的任何时间给予抗第三方细胞。通常，可在移植后O天、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或10天给予抗第三方Tcm细胞。然而，可在移植之后的延长时间，例如移植后2周、I个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月或24个月，给予抗第三方Tcm细胞。
[0146]可经由本领域已知用于细胞移植的任何方法，例如但不限于细胞输注(例如1.V.)或经由腹膜内途径，给予抗第三方Tcm细胞。
[OH7]不受理论的束缚，治疗有效量是对于耐受作用(tolerizat1n)、抗瘤作用和/或免疫重建有效而不诱导GVHD的抗第三方Tcm细胞量。因为本发明的Tcm细胞在移植后归巢至淋巴结，所以可能需要较低的细胞量(与先前使用的细胞剂量比较，参见例如WO 2001/049243)，以达到细胞的有益作用(例如耐受作用、抗瘤作用和/或免疫重建)。可以理解，可能需要与本发明的Tcm细胞联合的较低水平的免疫抑制药物(例如从治疗方案中排除雷帕霉素)。
[0148]治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
[0149]对于本发明的方法中使用的任何制备物，治疗有效量或剂量可最初由体外和细胞培养测定进行估计。例如，剂量可以在动物模型中配制以达到所需浓度或滴度。此类信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。
[0150]例如，在组织移植物的情况下，输注给受体的抗第三方Tcm细胞数目应超过IX104/Kg体重。输注给受体的抗第三方Tcm细胞数目应在I X 104/Kg体重至I x 109/Kg体重范围内。
[0151]为了促进细胞或组织移植物的移入，所述方法还可进一步有利地包括在细胞或组织移植物移植之前、同时或之后用免疫抑制方案调节受试者。
[0152]因此，依据本发明的一个实施方案，在细胞或组织移植物移植之前，在亚致死、致死或超致死条件下调节所述受试者。
[0153]例如，所述受试者可用骨髓抑制性或非骨髓抑制性调节(myeloablative or non-myeloablative condit1ning)进行治疗。调节类型可由本领域普通技术人员确定并考虑到受试者的年龄和疾病严重程度。因此，例如，年长的受试者(例如年龄超过40岁的受试者)可用温和免疫抑制方案进行治疗。
[0154]合适类型的免疫抑制方案的实例包括给予免疫抑制药、诱导耐受性的细胞群体(如上文详述的)、和/或免疫抑制性照射。
[0155]选择和给予用于移植的合适免疫抑制方案的大量指导在本领域文献中提供(例如参考:Kirkpatrick CH.和Rowlands DT Jr., 1992.JAMA.268，2952； Higgins RM.等，1996.Lancet 348, 1208 ； Suthanthiran MjPStrom TB., 1996.New Engl.J.Med.331，365； Midthun DE.等，1997.Mayo Clin Proc.72，175； Morrison VA.等，1994.Am J Med.97，14; Hanto Dff., 1995.Annu Rev Med.46，381； Senderowicz AM.等，1997.Ann Intern Med.126, 882； Vincenti F.等，1998.New Engl.J.Med.338,161 ； Dantal J.等，1998.Lancet 351, 623) 0
[0156]优选地，免疫抑制方案由给予受试者至少一种免疫抑制剂组成。
[0157]免疫抑制剂的实例包括但不限于氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、环孢素A、氯喹、轻氯喹、柳氮磺胺啦啶(811]^1^83132(^71'；[116)、金盐、0-青霉胺、来氟米特、硫卩坐嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNFa、阻断剂、靶向炎症细胞因子的生物制剂、和非留体抗炎药(NSAID) JSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、剛噪美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯灭酸盐、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、曲马多、雷帕霉素(西罗莫司)和雷帕霉素类似物(例如CC1-779、RAD001、AP23573)。这些药剂可单独或组合给予。
[0158]本文所用的术语“约”是指±10%。
[0159]术语“包含”、“含有”、“包括”、“具有”及其变化形式是指“包括但不限于”。
[0160]术语“由……组成”意指“包括且限制于”。
[0161]术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分实质上不改变请求保护的组合物、方法或结构的基本和新特性的情况下。
[0162]本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
[0163]贯穿于本申请，本发明的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解以范围形式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应解释为对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为已具体公开所有可能子范围以及在那个范围内的各个数值。例如，范围的描述例如1-6应视为已具体公开子范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及在那个范围内的各个数目，例如1、2、3、4、5和6。这不管范围的宽度而适用。
[0164]无论何时在本文中指出数目范围，它意欲包括在所示范围内的任何引用数目(分数或整数)。短语第一个指示数目和第二个指示数目“之间的范围/多个范围”和“从”第一个指示数目“到”第二个指示数目“范围/多个范围”在本文中可互换使用，并且意欲包括第一个和第二个指示数目以及其间的所有分数和整数。
[0165]本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业者已知的那些方式、手段、技术和程序，或化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业者从已知方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
[0166]应当理解，为了清楚起见在分开实施方案的背景中描述的本发明的某些特征也可以与单个实施方案组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案的背景中描述的本发明的各种特征也可以分开或以任何合适的亚组合或如在本发明的任何其他所述实施方案中合适的提供。在各种实施方案的背景中描述的某些特征不视为那些实施方案的必需特征，除非实施方案没有那些元素是无效的。
[0167]如上文描述且如所附权利要求书部分请求保护的本发明各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
[0168]现在参考以下实施例，这连同上述说明一起以非限制性方式说明本发明。
[0169]—般地，在本文中使用的命名法和在本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，"MolecularCloning: A laboratory Manual" Sambrook等，(1989) ； "Current Protocols inMolecular B1logy"第 1-1II 卷 Ausubel，R.M.编辑(1994); Ausubel 等，"CurrentProtocols in Molecular B1logy,,，John Wiley 和Sons，Baltimore, Maryland(1989); Perbal，〃A Practical Guide to Molecular Cloning,,，John Wiley & Sons,New York (1988)； Watson等，〃 Recombinant DNA〃，Scientific American Books, NewYork； Birren等(编辑)〃 Genome Analysis: A Laboratory Manual Series,,，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);如美国专利号4，666，828； 4,683,202； 4,801,531； 5，192，659和5，272，057中所示的方法;"Cell B1logy: ALaboratory Handbook"，第1-1II卷 Cellis，J.E.编辑(1994); "Current Protocolsin Immunology"第1-1II卷 Coligan J.E.编辑(1994); Stites等(编辑)，"Basic andClinical Immunology"(第8版)，Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell和Shiigi (编辑)，"Selected Methods in Cellular Immunology,,，ff.H.Freeman和C0.，New York (1980);可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见例如，美国专利号3,791,932； 3,839,153； 3,850,752； 3,850,578； 3,853,987； 3,867,517； 3,879,262；3,901,654； 3,935,074； 3,984,533； 3,996,345； 4,034,074； 4,098,876； 4,879,219；5，011，771 和5，281，521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J.编辑(1984);“Nucleic Acid Hybridizat1n" Hames, B.D.，和Higgins S.J.，编辑.(1985); 〃Transcript1n and Translat1n" Hames, B.D.，和Higgins S.J.,编辑.(1984); 〃Animal Cell Culture" Freshney, R.1.编辑(1986); "Immobilized Cells andEnzymes 〃 IRL Press, (1986)； 〃A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.，( 1984)和"Methods in Enzymology^ 第1-317卷，Academic Press ； "PCRProtocols: A Guide To Methods And Applicat1ns,,，Academic Press, San Diego,CA ( 1990) ； Marshak等，"Strategies for Protein Purificat1n andCharacterizat1n - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);所有这些都通过引入而结合，如同在本文中充分阐述一样。其他一般参考文献在本文件自始至终提供。其中的程序被认为是本领域众所周知的并且为了读者方便而提供。其中包含的所有信息通过引用结合到本文中。
[0170]通用材料和实验程序动物雌性6-12周龄8六1^八、086 (Fl)、FVB、C57BL/6和BALB/c-NUDE小鼠得自 HarlanLaboratories。在魏兹曼研究所动物中心(Weizmann Institute Animal Center)繁育B6-NUDE小鼠后代。所有小鼠维持在小笼中(每笼5只动物)并喂以无菌食物和酸性水。所有研究都得到魏兹曼研究所科学机构动物护理和使用委员会(Weizmann Institute of ScienceInstitut1nal Animal Care and Use Committee)的批准。
[0171]细胞
将先前已描述[Kim KJ等，J.1mmunol.(1979) 122: 549-554]的A20鼠淋巴瘤细胞系，一种BALb/c (H-2d)衍生的B细胞淋巴瘤/白血病系，与先前已描述[Edinger M等，Blood.(2003) 101: 640-648]的A20的稳定转染子，A20 yfp/luc+，均维持在补充有5%FCS,2 mM谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素和50 μΜ 2_β巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。
[0172]宿主非反应性抗第三方Tcm的制备
按照先前所述[Ophir E等，Blood (2010) 115: 2095-2104]，制备抗第三方Tcm。简而言之，针对受照射的第三方脾细胞，在细胞因子剥夺下将供体小鼠的脾细胞培养60小时。然后，用磁性颗粒(Magnetic Particle) (BD Pharmingen)对⑶8+细胞进行阳性选择并培养在无Ag环境中。每2天加入rhIL-15 (20 ng/mL；R&D Systems)。为了在培养结束时(第16天)得到纯化的群体，通过磁性激活的细胞分选[MACS，Milteny , Bergisch Gladbach ,Germany ]对T cm细胞的⑶62L表达进行阳性选择。
[0173]流式细胞术分析
使用改进的Becton Dickinson FACScan进行焚光激活细胞分选(FACS)分析。使用对CD8-藻红蛋白(PE)/异硫氰酸荧光素(FITC)/别藻蓝蛋白(APC) (BD Pharmingen),CalceinAM (Molecular Probes, INC., Eugene, OR, USA)具有特异性的标记抗体对细胞染色。按照制造商的操作说明(BD Pharmingen)对膜联蛋白V和7-氨基-放线菌素D (7AAD)进行染色。
[0174]MLR培养和细胞毒性测定
通过Ficol I密度梯度离心获取抗第三方Tcm和淋巴瘤细胞，按照制造商的操作说明将淋巴瘤细胞用0.15 pg/ml CalceinAM (Molecular Probes, INC., Eugene, OR, USA)标记并在所需培养基中使其浓度为I X 16细胞/ml。按照指定比率和时间间隔，将3 X 15的淋巴瘤细胞与抗第三方CTL在24孔板上一起温育。回收细胞并使用表面标记例如膜联蛋白-V (BD)分析存活率并通过FACS测量CalceinAM染色的淋巴瘤细胞数目。
[0175]通过膜联蛋白V染色来检测细胞凋亡
膜联蛋白V APC用于检测凋亡的细胞。将来自体外培养的样品与用不同荧光染料标记的所选单克隆抗体混合物一起在4° C温育20分钟。在用膜联蛋白-V结合缓冲液洗掉未结合的游离抗体之后，给样品补充5 μ?膜联蛋白V-APC (BD)。然后将细胞在室温下在黑暗处温育15分钟并用膜联蛋白-V结合缓冲液洗涤。通过FACS分析样品的活细胞，其是膜联蛋白V阳性染色的细胞。
[0176]最低残余疾病体内模型
将12周龄BALB/c雌性受体小鼠暴露于来自γ射线150-Α 60 Co源(由Atomic Energyof Canada (Kanata, ON, Canada)制造)的单剂量8 Gy全身照射(TBI)(第-1天)。次日(第O天)受体小鼠经静脉内输注来自BALb/c-Nude小鼠(同基因的)的3 x 16 T细胞耗尽的骨髓或者输注来自B6-Nude小鼠的3 x 16 T细胞耗尽的骨髓，每只小鼠补充5 x 13 A20 Iuc淋巴瘤细胞。在接下来的一天(第+1天)小鼠经静脉内接受或不接受10 X 16 BALB/c衍生的抗第三方Tcm (同基因的)或5 X 16 C57BL/6衍生的抗第三方Tcm (同种异体的)。使用体内成像系统研究肿瘤定位、A20细胞的迀移模式和抗第三方CTL的抗淋巴瘤反应性。
[0177]体内成像.小鼠用氯胺酮(100 mg/kg腹膜内(i.P) (Kepro Holand Netherlands)和赛拉嘆(Kepro Holand Netherlands) (20 mg/Kg i.ρ)麻醉，并且在成像之前10分钟注射D萤光素水溶液(150 mg/Kg 1.p) (Cat#XR-1001, 30 mg/ml的PBS;Xenogen)。在魏兹曼研究所兽医资源系(Department of Veterinary Resources of the Weizmann Institute)，将动物放置在连接有Pixelf Iy QE (P⑶，K，Germany)电荷耦合器件(CXD)相机的体内成像系统(IVIS? 100, Xenogen)的遮光室内。在强烈照明下10秒钟曝光之后获取灰度体表参考图像(数码照片)。图像数据处理和分析使用Living Image 2.5软件进行。从第14天起以每周间隔监测小鼠的肿瘤生长。
[0178]统计分析
使用Kaplan-Meier曲线(log-秩检验)进行存活数据的分析。使用学生t检验进行平均值的比较。
[0179]实施例1
小鼠模型的建立
为了建立合适的小鼠模型，发明人首先证实衍生自(B6 X BALB/c) Fl的抗第三方Tcm细胞显示出对BALB/c来源的A20淋巴瘤细胞的TCR独立性杀死(4次实验中34.8 土 12.1%，5:1 Tcm/淋巴瘤细胞比率，与无Tcm而温育的A20细胞相比，p〈0.05)。此外，与Tcm细胞一起温育16小时之后，A20细胞的膜联蛋白V染色与基础染色水平相比显著增强(分别为14.8 土4.5%和5.2 土 2.2%，在3次实验中，p〈0.05)，表明基于细胞凋亡的机制，类似于先前对人淋巴瘤细胞的杀死所描述的[Lask A等(2010年提交)；Arditti FD等，Blood (2005) 105:3365-3371] ο
[0180]实施例2
通过同基因骨髓移植和Tcm细胞的治疗方案
使用表达萤光素酶的A20细胞，发明人能够在模拟最低残余疾病的模型中在体内跟踪恶性细胞的命运，并研究添加的供体抗第三方Tcm对同基因或同种异体骨髓移植(BMT，下文)的抗淋巴瘤作用。在同基因模型中，将3 X 16 Nude BALB/c BM细胞与5000 A20细胞一起移植到受致死照射的BALB/c小鼠内。次日，输注同基因的Tcm。如图1A-D所示，在骨髓移植(BMT，23天的中值存活)后100天，未经治疗的小鼠无一存活(0/7)。然而，给予I x 17或2 x17同基因的Tcm细胞导致在BMT后100天肿瘤负荷显著减少(图1E-H)并且28%小鼠(2/7，P〈
0.0001)和40%小鼠(2/5，P〈0.002)的总体存活提高，且中位存活分别为49天和80天(图1I)。
[0181]实施例3
通过同基因骨髓移植和同种异体Tcm细胞的治疗方案
在我们实验室中进行的较早研究[Ophir E.等，Blood (2010) 115: 2095-2104]表明，抗第三方Tcm细胞被赋予耐受活性，转化为BMT之后的延长的持久性，甚至当使用部分匹配的供体时。发明人因此在上述同基因BMT模型中测试了2 X 17 Fl (CB6)衍生的Tcm细胞的抗淋巴瘤作用，替代先前给予的同基因Tcm细胞。尽管预期这些Fl衍生的Tcm细胞因MHC不同而被排斥，但是它们甚至在移植后2个月仍然持续存在且未被排斥(数据未显示)。它们的长期持久性可能是上述其耐受活性的结果。与未经治疗组中的0%小鼠(0/5，图2A-C和2G)存活相比，57.1%小鼠(4/7，图2D-G)的总体存活提高，这证明了这些Fl衍生的Tcm细胞的显著临床作用。因此，这些结果决定性地证明了衍生自同种异体供体的抗第三方Tcm细胞可用作抗B细胞恶性肿瘤细胞治疗，无论是单用还是与骨髓细胞组合使用。
[0182]实施例4
通过同种异体骨髓移植和同种异体Tcm细胞的治疗方案
当在同种异体背景中检查时，表现出对肿瘤消除的进一步改善。该作用可能是因为残余同种异体反应性，其相对于新发现的T细胞受体(TCR)独立性细胞杀死而言提供额外移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)作用。重要地，达到该附加作用而不引起GVHD。在该同种异体模型中，将3 X 16同种异体Nude B6 BM细胞与5000 A20细胞一起移植到受致死照射的BALB/c小鼠内。次日，用供体类型的Tcm治疗小鼠。类似于同基因模型中的结果(描述于以上实施例2和3)，在BMT后100天，未经治疗的小鼠无一存活(0/8，23天的中位存活，图3A-D和31 )，而给予5 X 16供体类型的Tcm细胞，则导致在BMT后100天有100%的显著总体存活(7/7)(图3E-1)。尽管与同基因Tcm细胞相比，同种异体Tcm细胞表现出增强的GVL活性，但该作用与GVHD的任何表现无关。因此，正如先前所述，接受同种异体的抗第三方Tcm细胞的小鼠体重和总体面貌与仅用Nude BM移植物而受福射保护的(rad1-protected)对照组中的小鼠相同。
[0183]总之，本发明人首次通过体内成像证明了鼠抗第三方Tcm的GVL反应性。这些结果表明抗第三方Tcm细胞可通过促进BM移入，并同时诱导GVL反应性而不弓丨起GVHD，而提供了“双重支持性作用”。这类细胞治疗非常具有吸引力，尤其是对患有B-CLL和其它B细胞恶性肿瘤、且可能不耐受攻击性调节(aggressive condit1ning)的年长患者来说，并且可被开发成“现成的(off the shelf)”容易得到的产品，用作抗癌细胞治疗。
[0184]实施例5
抗第三方T中枢记忆性细胞的生成
材料和实验程序
幼稚的CD8+ T细胞细胞的富集
通过来自健康供体的血沉棕黄层(buffy coat)的Ficoll密度梯度离心而获取外周血单核细胞(PBMC)。然后将供体PBMC移至10% DMSO冷冻溶液中并在液氮中冻存。
[0185]在第-2天:将供体的冷冻PBMC在37°C水浴中快速融化并移至温暖的融化培养基(补充有10%人血清的Cellgro DC和为避免因死亡细胞所致的细胞凝块形成而补充有Benzonase ?核酸酶的Pen/Strep培养基)。融化的供体PBMC用温暖的融化培养基洗涤2次。为了耗尽粘附细胞，然后将供体PBMC重悬于培养基(补充有5%人血清和Pen/Str印和10 ng/ml IL-7的Cellgro DC)并铺在经特别包被的6孔板上，在37°C温育过夜。
[0186]在第-1天:移出未粘附细胞(该过程通过移出粘附的单核细胞而增加了所需T细胞的浓度，并且此外允许在进行磁富集过程之前从融化过程中回收融化的细胞)。
[0187]在第O天:用来自Miltenyi的⑶8分离试剂盒，按照制造商的方案分离未触及的(Untouched) CD8+ T细胞。然后，通过使用CD45R0磁珠而耗尽表达激活标记CD45R0的细胞，从总⑶8群体中获取具有幼稚表型的⑶8 T细胞。
[0188]单核细胞衍生的树突细胞(DC)的生成
从同种异体的冻存PBMC生成单核细胞衍生的DC。通过塑性粘附，从PBMC富集单核细胞并在GM-CSF和IL-4培养超过3天的时程。在培养的最后24小时添加LPS和IFN-γ，诱导成熟。
[0189]抗第三方Tcm细胞(幼稚的⑶8T细胞靶向单核细胞衍生的DC)的生成
幼稚的⑶8+ T细胞用受照射的(30 gy)单核细胞衍生的DC以1:0.25的比率在补充有IL-21的培养基(补充有5%人血清和Pen/Strep的Cellgro DC)中活化3天。然后，所得到的⑶8+ T细胞不进一步活化，并将其与IL-7和IL-15—起培养到第12天。
[0190]结果
在培养第11天，用FACS分析评价细胞组成和细胞表型并通过台盼蓝排除(trypan blueexclus1n)而测定细胞数目。结果表明细胞组成(来自淋巴细胞门(Lymphogate)，数据未显示)主要包括94.6% CD8+ 1'细胞(003+0)8+)、少量的1.2% CD56+ NK细胞(CD3-CD56+)和1.1% NK T细胞(CD3+CD56+)。此外，CD8+ T细胞主要包括76% Tcm细胞、9%幼稚细胞、8.5%Teff/Tem和6.5% Temra0
[0191]实施例6
Tcm移植物抗白血病(GVL)测定材料和实验程序 GVL测定
按照制造商的操作说明，将B细胞系用0.15 pg/ml CalceinAM (一种活体染料，当细胞死亡时被释放出来)标记。然后，将0.3 XlO6 Calcein标记的细胞系与或不与1.5 xlO6抗第三方Tcm—起在24孔板中温育22小时。没有外源细胞因子加入到MLL22小时后回收细胞并通过FACS测量存活的Calcein染色细胞数目而分析其存活。
[0192]为了得到细胞的绝对值，将样品以恒定体积悬浮并在恒定的预定的时间段内对每个样品获取流式细胞术计数，并与固定体积和固定数量的输入细胞所获取的流式细胞术计数进行比较。
[0193]细胞凋亡的检测
为了通过膜联蛋白V染色检测细胞凋亡，将样品与5 μ?膜联蛋白V-APC (BD) —起在室温下温育10分钟。然后，将未结合的膜联蛋白V洗掉，并通过FACS分析样品。
[0194]尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但显而易见的是许多替代方案、修饰和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，预期包含属于所附权利要求书的精神和广泛范围的所有此类替代方案、修饰和变化。
[0195]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部结合到说明书内，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特别且个别指出通过引用结合到本文中相同。此外，任何参考文献在本申请中的引用或确证不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。至使用的部分标题的程度，它们不应解释为必定是限制性的。
【主权项】
1.包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导GVHD的抗第三方细胞的分离的细胞群体，所述中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型包含⑶8+/⑶62L+/⑶45R0+标志且其中至少50%的所述分离的细胞群体具有所述标志，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，且进一步地其中所述细胞通过包含下述的方法生成: (a)在IL-21存在时，在允许GVH反应性细胞消除的条件下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触;和 (b)在IL-15存在下，在无抗原环境中，在允许包括所述中枢记忆性T-淋巴细胞(Tcm)表型的细胞增殖的条件下，培养得自步骤(a)的所述细胞。2.分离的细胞群体用于制备经鉴定用于在已移植非同基因的细胞或组织移植物的受试者中消除疾病的药物的用途，其中所述分离的细胞群体包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型包含⑶8+/CD62L+/⑶45RO+标志且其中至少50%的所述分离的细胞群体具有所述标志，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，其中所述细胞是以下任一种: (i)对所述受试者和所述移植物而言是非同基因的；或 (?)对所述移植物而言是非同基因的和对所述受试者而言是同基因的。3.权利要求2的用途，其中所述非同基因的细胞或组织移植物衍生自选自HLA相同的供体和HLA不相同的供体的供体。4.权利要求3的用途，其中所述受试者和所述供体都是人。5.权利要求2的用途，其中所述受试者是人受试者。6.权利要求2的用途，其中所述细胞或组织移植物是非自体的和所述分离的细胞群体是自体的。7.权利要求2的用途，其中所述细胞或组织移植物和所述分离的细胞群体来自不同供体。8.权利要求2的用途，其中所述疾病包括恶性肿瘤。9.权利要求8的用途，其中所述恶性肿瘤包括B细胞恶性肿瘤。10.权利要求8或9的用途，其中所述恶性肿瘤包括白血病。11.权利要求8或9的用途，其中所述恶性肿瘤包括淋巴瘤。12.权利要求2的用途，其中所述移植物包括骨髓细胞。13.权利要求12的用途，其中所述骨髓细胞包括未成熟造血细胞。14.权利要求13的用途，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是非同基因的时，所述分离的细胞群体对所述受试者而言是同基因的。15.权利要求14的用途，其中所述未成熟造血细胞是非自体的和所述分离的细胞群体是自体的。16.权利要求13的用途，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是非同基因的时，所述分离的细胞群体对所述受试者和对所述移植物而言都是非同基因的。17.权利要求16的用途，其中所述未成熟造血细胞和所述分离的细胞群体来自不同供体。18.权利要求2的用途，进一步包括使用至少一种免疫抑制药。19.权利要求2的用途，进一步包括使用亚致死、致死或超致死调节。20.权利要求2的用途，其中所述淋巴结包括外周淋巴结。21.权利要求2的用途，其中所述淋巴结包括肠系膜淋巴结。22.权利要求2的用途，其中对所述移植物而言是非同基因的和对所述受试者而言是同基因的所述细胞包括自体细胞。23.治疗有效量的分离的细胞群体用于制备经鉴定用于在已移植未成熟造血细胞的受试者中消除疾病的药物的用途，所述分离的细胞群体包括具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的不诱导移植物抗宿主(GVHD)的抗第三方细胞，所述中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型包含⑶8+/⑶62L+/CD45RO+标志且其中至少50%的所述分离的细胞群体具有所述标志，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结，并且进一步地，其中当所述未成熟造血细胞对所述受试者而言是同基因的时，选择所述分离的细胞群体，其对所述受试者而言是同基因的或对所述受试者而言是非同基因的。24.权利要求23的用途，其中所述未成熟造血细胞和所述分离的细胞群体是自体的。25.权利要求23的用途，其中所述未成熟造血细胞是自体的和所述分离的细胞群体是非自体的。26.权利要求23的用途，其中所述疾病包含恶性肿瘤。27.权利要求26的用途，其中所述恶性肿瘤包含B细胞恶性肿瘤。28.权利要求26或27的用途，其中所述恶性肿瘤包含白血病。29.权利要求26或27的用途，其中所述恶性肿瘤包含淋巴瘤。30.权利要求2或23的用途，其中所述具有中枢记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞通过下述生成，所述细胞是诱导耐受性的细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结: (a)在IL-21存在时，在允许GVH反应性细胞消除的条件下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触;和 (b)在IL-15存在下，在无抗原环境中，在允许包括所述中枢记忆性T-淋巴细胞(Tcm)表型的细胞增殖的条件下，培养得自步骤(a)的所述细胞，从而生成所述分离的细胞群体。31.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述允许GVH反应性细胞消除的条件包括培养1-5天。32.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述一种或多种第三方抗原包括树突细胞。33.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述一种或多种第三方抗原选自第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质和通过自体呈递细胞、非自体呈递细胞或者在人工载体上或人工抗原呈递细胞呈递的合成肽。34.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述允许细胞增殖的条件进一步包括IL-7和/或IL-21。35.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述在IL-15存在下的培养进行3-30天。36.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述在IL-15存在下的培养进行6-30天。37.权利要求1的分离的细胞群体或权利要求30的用途，其中所述在IL-15存在下的培 养进行3-20天。
【文档编号】A61P35/00GK105907713SQ201610307275
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2011年9月8日
【发明人】Y.雷斯纳, A.拉斯克, E.奧普希尔, N.奧-格瓦, A.科亨, R.阿菲克, E.巴查鲁斯蒂格, Y.埃德斯泰恩
【申请人】耶达研究及发展有限公司