一种抗菌肽、其制备方法及应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽、其制备方法及应用。

背景技术：

抗菌肽是生物防御系统中所产生的对抗外源病原体的肽类物质，广泛存在于动物、植物、微生物中，是机体先天性免疫系统的重要组成部分。迄今为止，已有数千种抗菌肽得到分离和鉴定。抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用。近年来，抗生素的滥用引发了一系列安全问题，如病原菌的耐药性不断增强，种类不断增加，进而严重威胁人类健康。抗菌肽作为一种安全环保的抗生素替代品，在医药行业、饲料和食品添加剂等领域都具有广泛的应用前景。

目前已报道的抗菌肽中，有几种来自于唾液乳杆菌的抗菌肽类物质被证实具有高效广谱的抑菌活性和良好的开发潜力，其中部分唾液乳杆菌天然存在于动物的消化道中。

现有技术中已报道的研究比较成熟的抗菌肽ABP-118，由唾液乳杆菌L.salivarius UCC118产生，由两条多肽所组成，包括ABP-118α(4096Da)和ABP-118β(4332Da)，分别由abp118α和abp118β基因编码，另外由abpIM基因所编码的免疫蛋白可免疫该抗菌肽对产生菌自身的抑制作用。该机制普遍存在于可产生该抗菌肽的唾液乳杆菌中。组成该抗菌肽的两种多肽均为小分子肽，具有较高的热稳定性，且对很多革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌均具有较好的抑菌活性，因而具有较好的应用前景。有些该类抗菌肽的两条多肽分开时不具有抑菌活性或活性较弱，只有在两者混合在一起时才会有很好的抑菌效果。

为了进一步开发利用抗菌肽，找到更多的抗菌肽进行研究可以为后期的实际应用奠定基础。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种抗菌肽、其制备方法及应用，所述抗菌肽，所述抗菌肽具有较强的抑制耐药性金黄色葡萄球菌的活性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗菌肽，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列。

本发明中，所述抗菌肽命名为salivaricin SJH-8，简称SJH-8，包括SJH-8α和SJH-8β两条肽链。

所述SEQ ID NO.1(SJH-8α)所示的氨基酸序列如下：Lys Arg Gly Pro Asn Cys Val Gly Asn Phe Leu Gly Gly Leu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ile Val Gly Gly Ala Asn Leu Gly Met Val Gly Gly Ala Leu Thr Cys Leu；

所述SEQ ID NO.2(SJH-8β)所示的氨基酸序列如下：Lys Asn Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Asn Arg Trp Val His Cys Gly Ala Gly Ile Val Gly Gly Ala Leu Ile Gly Ala Ile Gly Gly Pro Trp Ser Ala Val Ala Gly Gly Val Ser Gly Gly Phe Thr Ser Cys Arg。

优选地，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO.3(SJH-8α)所示的核苷酸序列如下：AAACG TGGAC CTAAC TGTGT AGGTA ACTTC TTAGG TGGTC TATTT GCTGG AGCAG CTGCA GGAGT TCCAC TTGGA CCAGC TGGTA TCGTA GGTGG GGCAA ACTTA GGAAT GGTAG GCGGA GCGCT TACTT GTTTA TAA；

所述SEQ ID NO.4(SJH-8β)所示的核苷酸序列如下：AAAAA TGGTT ATGGT GGTAG TGGAA ATCGC TGGGT TCACT GTGGA GCTGG CATCG TAGGT GGAGC TTTAA TTGGA GCTAT CGGTG GACCC TGGTC AGCCG TAGCG GGTGG AGTTT CTGGT GGTTT TACAA GTTGC CGTTA A。

优选地，所述抗菌肽包含的氨基酸序列的分子量为α链(SEQ ID NO.1)：4074；β链(SEQ ID NO.2)：4297。

优选地，所述抗菌肽来自于三黄鸡回肠菌群。

第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第一方面所述的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的表达载体。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌中的任意一种，优选为乳酸乳球菌。

本发明中，所述宿主为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌时，除抗菌肽自身(SJH-8α、SJH-8β)以外，应连同其携带的前导肽序列(SJH-8α的信号肽序列：MET MET Lys Glu Phe Thr Val Leu Thr Glu Cys Glu Leu Ala Lys Val Asp Gly Gly；SJH-8β的信号肽序列：MET Lys Asn Leu Asp Lys Arg Phe Thr Ile MET Thr Glu Asp Asn Leu Ala Ser Val Asn Gly Gly)和免疫蛋白SJH-8m一起转入宿主中表达；而宿主选用乳酸乳球菌时，用其特有的usp45信号肽替代原前导肽，同时表达免疫蛋白SJH-8m。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)提取三黄鸡回肠菌群宏基因组；

(2)根据抗菌肽ABP-118设计引物，以提取的三黄鸡回肠菌群宏基因组为模板进行扩增；

(3)将步骤(2)扩增出的片段的前导肽替换为宿主的分泌表达信号肽，再进行全合成整个片段，得到完整的分泌表达抗菌肽；

(4)构建分泌表达抗菌肽重组质粒，导入宿主细胞，得到表达抗菌肽的表达工程菌。

优选地，步骤(1)所述引物为SEQ ID NO.5-6所示的序列；

上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示：

上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQ ID NO.5)；

下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQ ID NO.6)。

优选地，步骤(4)所述构建分泌表达抗菌肽重组质粒为将得到的分泌表达抗菌肽连接到pNZ8148质粒的BtgI和HindⅢ克隆位点。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的宿主细胞在制备动物饲料中的应用。

第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的宿主细胞在制备治疗药物中的应用。

本发明中，所述的药物可以治疗包括但不限于由金黄色葡萄球菌引起的感染。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明制备的抗菌肽SJH-8，具有高效广谱抑菌作用，具有较强的抑制耐药菌的能力，尤其针对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用；

(2)本发明制备的抗菌肽SJH-8毒性低，可作为抗生素替代品使用；

(3)本发明制备的抗菌肽SJH-8为进一步开发利用抗菌肽奠定了基础。

附图说明

图1是本发明抗菌肽相关基因的PCR产物；

图2是本发明重组质粒构建示意图；

图3是本发明NZ9000重组子的平板单菌落图；

图4是本发明工程菌发酵液抑菌效果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

三黄鸡购自广州南沙菜市场；

乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.Cremoris)NZ9000、配套质粒pNZ8148(氯霉素抗性)购于上海北诺生物科技有限公司；

大肠杆菌MG1655为本实验室保存；

引物由上海生工生物工程有限公司合成；

主要试剂购自上海生工生物工程有限公司；

质粒提取和DNA凝胶回收试剂盒购自天根公司；

酶制剂购自TaKaRa公司。

主要试剂的配制：

(1)乳酸乳球菌GM17培养基

大豆胨5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，抗坏血酸钠0.5g，β-甘油磷酸钠19.0g，硫酸镁0.25g，加ddH2O至900ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。待灭菌冷却后分别加入50ml用0.22μm滤膜过滤后的5％葡萄糖、5％乳糖溶液。配制固体培养基时加入琼脂粉含量为2％。

(2)LB培养基

胰化蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。配制固体培养基时加入琼脂粉含量为2％。

(3)乳酸乳球菌感受态细胞培养用G-SGM17培养基

大豆胨5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，抗坏血酸钠0.5g，β-甘油磷酸钠19.0g，硫酸镁0.25g，蔗糖171.1g，甘氨酸25g，加ddH2O至900ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。待灭菌冷却后分别加入50ml用0.22um滤膜过滤后的5％葡萄糖、5％乳糖溶液。

(4)MRS培养基

蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g，蒸馏水溶解并定容到1000ml，pH调至6.2–6.6，搅拌后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。

(5)氯霉素溶液

称取氯霉素溶解于无水乙醇中，0.22μm针头过滤器过滤除菌，1.5ml离心管分装，-20℃储存备用。储存浓度为35mg/ml，工作浓度为10μg/ml。

(6)大肠杆菌电转孵化液用SOC培养基

配方如下：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，20mM葡萄糖溶液(0.22μm过滤器除菌，培养基灭菌后加入)。121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后4℃储存备用。

(7)50×TAE(Tris-乙酸)电泳缓冲液

Tris碱242g，EDTA 18.622g，加入800ml ddH2O，充分搅拌溶解后加入57.1ml醋酸，充分混匀，再加ddH2O定容至1L，室温保存。使用前稀释为1×TAE电泳缓冲液。

实施例1 提取三黄鸡回肠的肠道菌群基因组

提取三黄鸡回肠的肠道菌群基因组，包括如下步骤：

(1)将剪刀、镊子用75％酒精消毒；

(2)取三黄鸡肠道，剪碎，加入5mL PBS，转移至15mL离心管，用振荡器混匀；

(3)4000×g室温离心10min；

(4)将上清转移至2mL EP管，12000rpm离心5min，弃上清，加入200μL溶菌酶溶液(20mg/mL)，37℃放置1h；

(5)将溶菌酶处理过的样品用Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒(生工Sangon Biotech)提取基因组。

实施例2 制备抗菌肽重组载体

(1)根据抗菌肽ABP-118基因序列设计引物：

上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQ ID NO.5)；

下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQ ID NO.6)。

(2)PCR扩增：以实施例1提取的三黄鸡回肠的肠道菌群基因组为模板进行PCR扩增，反应体系如下：

设置一组以水为样本的阴性对照。

反应条件如下：

所获得PCR产物核酸进行验证，结果如图1所示，可见条带正确。

验证后用天根公司的胶回收试剂盒进行切胶回收。

(3)全合成：

对PCR产物进行测序，并对原序列进行重新设计。

新序列包括α链、β链和免疫蛋白M。对α链和β链上的前导肽用乳酸乳球菌特有的分泌表达信号肽Usp45进行替换，并在序列5’端加上BtgI酶切位点，在3’端加上HindIII酶切位点。全长序列命名为SJH8αβM，如图2所示，由上海生工生物工程有限公司合成；

(4)构建重组质粒：

酶切连接，构建重组质粒，反应体系如下：

37℃恒温水浴锅中反应3h，酶切产物经胶纯化回收，将酶切后的载体与基因进行连接，反应体系如下：

轻轻混匀组分，置于16℃水浴锅反应2h，得到重组载体pNZ8148-SJH8αβM。

实施例3 构建抗菌肽宿主细胞

(1)将实施例2制备的重组载体转化MG1655感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证，涂氯霉素抗性LB平板，挑选阳性克隆；

大肠杆菌MG1655感受态细胞的制备：

①50μL菌液接种到5mL LB培养液中，37℃，200-250rpm过夜培养；

②5mL培养基稀释到800ml LB培养液中，37℃，200-250rpm培养，直到OD₆₀₀到0.4-0.6；

③菌液在冰上预冷30min；

④5000×g，4℃离心15min，弃上清；

⑤用灭菌的冰水重悬细胞，先用移液器重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水注满离心管，5000×g，4℃离心15min，弃上清；

⑥重复上述步骤一次；

⑦用灭菌的冰冷的10％甘油重悬细胞，先用移液器重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加10％甘油注满离心管，5000×g，4℃离心15min，弃上清；

⑧用灭菌的冰冷的10％甘油重悬细胞至终体积为2-3mL；

⑨分装100μL一管于1.5mL离心管里，-80℃保存，待用于转化。

(2)将重组质粒转化NZ9000感受态细胞，挑选阳性克隆；

乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000感受态细胞的制备：

Solution I的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，加ddH2O至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。

Solution II的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，EDTA 18.612g，加ddH2O至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。

Solution III的配制：G-M17培养液+20mM MgCl2+2mM CaCl2。

①50μL NZ9000菌液接种到5mL G-SGM17培养液中(拧紧15mL离心管管口)，30℃过夜培养；

②5mL菌液稀释到50mL G-SGM17培养液中(用封口膜封住锥形瓶瓶口)，30℃过夜培养；

③50mL菌液稀释到400mL G-SGM17培养液中(用封口膜封住锥形瓶瓶口)，30℃培养，直到OD₆₀₀在0.2-0.3之间(约3h)；

④6000×g，4℃离心20min,弃去上清；

⑤用400mL Solution I(4℃)洗涤细胞，6000×g离心，弃去上清；

⑥用200mL Solution II(4℃)重悬细胞，冰浴15min，6000×g离心，弃去上清；

⑦用100mL Solution I(4℃)洗涤细胞，6000×g离心，弃去上清；

⑧用4mL Solution I(4℃)重悬细胞；

⑨分装40μL一管到1.5mL离心管中，-80℃保存，使用前在冰上解冻。

(3)抗菌肽的表达

(1)将构建好的重组质粒pNZ8148-SJH8αβM转化乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000感受态细胞，在GM17平板上培养；

(2)挑取转化子到5mL GM17液体培养基(含氯霉素10μg/mL)中，30℃过夜培养；

(3)取0.8mL菌液到10mL新鲜GM17培养液(含氯霉素10μg/mL)中，至OD₆₀₀达0.4左右；

(4)加入终浓度为10ng/mL的Nisin诱导，12h后检测抗菌肽活性。

实施例4 构建抗菌肽宿主细胞

(1)所述重组质粒也可以通过电转化到大肠杆菌MG1655感受态细胞，其大肠杆菌MG1655感受态细胞的制备方法如下：

①从-80℃冰箱取出MG1655感受态细胞100μL，放在冰上解冻5min；待感受态细胞解冻后，与10μL连接产物混合加入已预冷的电转杯中，冰浴5min；

②在电击仪上调好电转条件：2kV，将电转杯放入电转槽，按下电击仪Pulse按钮进行电转化；

③电转化后立即加入1mL SOC培养基(4℃)，冰浴5min；

④将电转杯中菌液转入1.5mL离心管，37℃、250rpm复苏40min；

⑤离心管离心后倒掉上清，加入200μL含氯霉素抗性的LB培养液，吸取200μL培养液加到LB筛选平板(含氯霉素10μg/mL)，用玻璃涂布器把菌液涂布于整个平板的表面，37℃倒置过夜培养(12-16h)。

(2)所述重组质粒也可以通过电转化到乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000感受态细胞，其乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000感受态细胞的制备方法如下：

Solution I的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，加ddH2O至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。

Solution II的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，EDTA 18.612g，加ddH2O至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。

Solution III的配制：G-M17培养液+20mM MgCl2+2mM CaCl2。

①从-80℃冰箱取出NZ9000感受态细胞40μL，放在冰上解冻5min；

②待感受态细胞解冻后，与10μL连接产物混合加入已预冷的电转杯中，冰浴5min(阳性对照组：40μL感受态细胞+4μL空载pNZ8148)；

③在电击仪上调好电转条件：2kV，将电转杯放入电转槽，按下电击仪Pulse按钮进行电转化；

④电转化后立即加入1mL Solution III(4℃)，冰浴5min，然后在30℃孵育1.5h；

⑤离心管离心后倒掉上清，加入100μL含氯霉素抗性的GM17培养液，用移液器充分吸吹后吸取100μL培养液加到GM17筛选平板(含氯霉素10μg/mL)，用玻璃涂布器把菌液涂布于整个平板的表面，用封口膜将平板密封，30℃倒置过夜培养。

培养结果如图3所示，30℃培养后出现的单菌落图，从中筛选出阳性克隆。

(3)抗菌肽的表达

(1)将构建好的重组质粒pNZ8148-SJH8αβM转化乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000感受态细胞，在GM17平板上培养；

(2)挑取转化子到5mL GM17液体培养基(含氯霉素10μg/mL)中，30℃过夜培养；

(3)取0.8mL菌液到10mL新鲜GM17培养液(含氯霉素10μg/mL)中，至OD₆₀₀达0.4左右；

(4)加入终浓度为10ng/mL的Nisin诱导，12h后检测抗菌肽活性。

实施例5 抗菌肽活性的检测

(1)将两种菌发酵液于4℃ 6000g离心15min，将获得的上清液进行0.22μm过滤获得诱导后的无菌上清液；

(2)以金黄色葡萄球菌为指示菌(～10⁶CFU/mL)，用滤纸片法做抑菌实验，每个样品点10μL，做四个重复。

(3)于37℃培养12h后，导入SJH8αβM基因的重组乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000(实验组)上清液样品可见明显的抑菌圈，结果如图4所示。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。