重组鲈鱼抗菌肽Hepcidin‑LJ及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及重组鲈鱼抗菌肽Hepcidin-LJ及其应用。
背景技术：
：抗菌肽(Antimicrobialpeptide,AMPs)是一类小分子多肽(12-60个氨基酸)，广泛存在于生物有机体中，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学功能。鱼类中目前已报道的AMPs有150多种，是鱼体固有免疫系统的重要组成成分。Hepcidin是一类由肝脏分泌的多肽类激素，是抗菌肽家族中的一员，是病原体感染和炎症反应等急性反应中的重要作用因子。目前，在植物、无脊椎动物以及高等脊椎动物体内已分离得到了多种Hepcidin蛋白。天然形成的Hepcidin抗菌肽，其N端都含有一段信号肽，在蛋白质的后期的修饰中将信号肽切除，剩下的原前体肽随着血液循环进入血液中，经前体肽转化酶切掉前体肽后，最终形成具有生物活性的成熟肽。Hepcidin基因组结构高度保守，目前发现的Hepcidin基因均含有3个外显子，2个内含子，成熟肽中含有6-8个用于形成二硫键的半胱氨酸残基，一般情况下鱼类的Hepcidin成熟肽含有8个保守的半胱氨酸残基，与哺乳类的Hepcidin同源性较高的区域仅限于成熟肽。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，其杀菌机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。相对于传统抗生素抑制细菌代谢不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。Hepcidin具有较好的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性。多数抗菌肽的研究基于化学合成，但是多对二硫键（>3）的存在使得化学合成的价格相对较高，从而导致后期的应用受到成本的限制。本发明提供一种低成本重组表达鲈鱼的Hepcidin抗菌肽的方法，及重组蛋白在抗菌活性方面的应用。技术实现要素：本发明提供一种重组鲈鱼Hepcidin-LJ抗菌肽，所述抗菌肽的序列为：Gln-Ser-His-Leu-Ser-Leu-Cys-Arg-Trp-Cys-Cys-Asn-Cys-Cys-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Cys-Gly-Phe-Cys-Cys-Lys。本发明的抗菌肽可用于预防或治疗细菌感染的抗生物制剂中，因此，本发明保护涉及本发明的抗菌肽或其活性成分在用于预防或治疗细菌感染抗生物试剂制备中的应用，所述抗生物制剂可具体为抗细菌制剂，所述细菌可为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌(E.coli)、鳗弧菌(V.anguillarum)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。本发明提供的抗菌肽Hepcidin-LJ，对多数细菌有很好的抑制作用，具有广阔的应用前景。说明书附图图1为抗菌肽Hepcidin-LJ的SDS-PAGE电泳图。图中，M为蛋白marker，1为培养12h的上清液，2-为培养24h的上清液，3-为培养48h的上清液，4为培养72h的上清液，5为甲醇诱导前培养液。图2为抗菌肽Hepcidin-LJ对大肠杆菌的作用图。图中，A为150μLPBS，B为30μLHepcidin蛋白，C为15μL10mg/mL的卡那霉素，D为60μLHepcidin蛋白。图3为抗菌肽Hepcidin-LJ细菌凝集活性分析图。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。实施例1：重组鲈鱼抗菌肽hepcidin-LJ的制备1.1鲈鱼hepcidin-LJ基因的克隆鲈鱼肝脏总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法获得鲈鱼hepcidin-LJ基因。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，基因测序结果表明编码鲈鱼hepcidin-LJ的cDNA编码框273bp，序列表1所示。表达的最终成熟肽段含有25个氨基酸，分子量3006.1Da，序列表2所示。1.2重组鲈鱼hepcidin-LJ抗菌肽的制备根据已知的cDNA序列设计引物PCR，将扩增出的成熟肽序列DNA片段连接入pPICZαA，转化毕赤酵母GS115细胞。具体包括：（1）毕赤酵母感受态的制备：接种毕赤酵母的单菌落到3mL的YPD培养基中，30℃过夜培养后，按照1∶100的比例转培养于50mLYPD培养基中，30℃过夜培养，直至OD600值约为1.3-1.5，2000rpm离心5min弃上清，加入10mLEZ1溶液重悬菌体，2000rpm离心5min弃上清，加入1mL的EZ重悬菌体后分装，置入-80℃冰箱保存。（2）毕赤酵母表达菌株的转化：取50μL的毕赤酵母感受态与0.2-1μg的线性化的质粒，加入500μL的EZ3溶液，充分混匀，30℃培养45min，可延长到2-3h效果更佳，培养期间取出混匀几次，培养结束后取50-150μL菌液，涂布于含50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD固体培养基上，30℃培养3-5d，筛选阳性转化子。（3）重组蛋白的表达与纯化：将毕赤酵母转化子接种于BMGY培养基中，28-30℃,250-300rpm过夜培养；按照1∶100的比例将过夜菌株转培养至30-50mLBMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养至对数生长期，约16-18h；3000g离心5min，弃上清后将沉淀用BMMY重悬至OD600值为1左右，加入诱导剂甲醇，终浓度为1%；将重悬后的毕赤酵母于30℃,250rpm振荡培养，12-72h后取样，10000rpm，离心10min，收集上清，对重组蛋白进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析表达情况见图1，结果表明，重组蛋白hepcidin-LJ存在于毕赤酵母培养液的上清液中。实施例2：制备的抗菌肽的抑菌活性分析2.1抑菌能力分析挑取保存于斜面上的试验菌株大肠杆菌（E.coli）均匀涂布于MH固体培养基平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加一定浓度的重组Hepcidin-LJ样品溶液，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。结果如图2所示，表明Hepcidin-LJ重组蛋白对大肠杆菌（E.coli）具有较强的抑制作用，2.2最小抑菌浓度测定试验菌株接种到MH液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜MH液体培养基稀释到2×105cfu/ml。在1.9mL培养基中加入经0.22um孔径膜过滤的一定浓度的重组Hepcidin-LJ样品0.1mL作为第一管，混匀后取1mL加入第2管，依次倍比稀释，自第9管吸出1mL弃去，第10管系对照管，如表1所示。表1稀释方法试管号12345678910培养基（mL）1.9111111111样品（mL）0.1111111111(弃去)向各管中加入已稀释好的菌液0.05mL，混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。表2重组Hepcidin-LJ蛋白最小抑菌浓度细菌细菌类型最小抑菌浓度巨大芽孢杆菌(B.megaterium)革兰氏阳性8μg/mL枯草芽孢杆菌(B.subtilis)革兰氏阳性5μg/mL大肠杆菌(E.coli)革兰氏阴性50μg/mL鳗弧菌(V.anguillarum)革兰氏阴性60μg/mL肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)革兰氏阴性30μg/mL绿脓杆菌(P.aeruginosa)革兰氏阴性30μg/mL金黄色葡萄球菌(S.aureus)革兰氏阳性50μg/mL苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)革兰氏阳性40μg/mL表2结果表明，制备的Hepcidin-LJ重组蛋白对巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌(E.coli)、鳗弧菌(V.anguillarum)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)均有较强的抑制作用。2.3重组Hepcidin-LJ抗菌肽的细菌凝集活性分析由图3可知，重组Hepcidin-LJ抗菌肽可以凝集鳗弧菌(V.anguillarum)、大肠杆菌(E.coli)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，对于巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)凝集作用不明显。重组Hepcidin-LJ蛋白对多数试验菌株都具有非常好的抗菌活性，具有一定的广谱抗菌的特点。<110>山东群英医学研究有限公司<120>重组鲈鱼抗菌肽Hepcidin-LJ及其应用<160>2<210>1<211>275<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atgaaggcatttagcattgcagttgcagtgacacactcgtgctcgcctttatttgcattc60tggagagctctgccatcccattcaccggggtgcaaaatctggaggaggaagggagcaatg120acactccagttgcggtatatcaaggaatgtcaatggaatcgaagatgatgccaggtcact180tcaggcagaagcgtcagagccacctctccttgtgccgctggtgctgcaactgctgcaggg240gctacaagggctgcggcttctgctgcaagttctga275<210>2<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2GlnSerHisLeuSerLeuCysArgTrpCysCysAsnCysCysArgGly151015TyrLysGlyCysGlyPheCysCysLys2025当前第1页1 2 3