本发明涉及水产食品加工技术领域，具体地涉及一种具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖浓度以及改善其症状的生物活性成分。目前研究较多的天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同。天然产物类降糖因子按化学结构可分为黄酮类、活性多糖类、生物碱类、皂甙类、萜类、共轭亚油酸、多肽类等。自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的药物相继问世，然而化学药物常产生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用温和而持久，性质稳定，几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存，综合起作用等优点，备受患者以及和医学界的青睐，也成为了降血糖功能因子的主要研究方向。
目前国内外专利中未见利用鱼鳔资源制备二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV：DPP-IV)抑制肽的专利文献报道。本发明针对目前鱼类加工产业的快速发展，鱼鳔蛋白资源数量的快速增加，根据鱼鳔蛋白的特性，以鱼鳔为原料，通过对鱼鳔高温高压和超声波等预处理，利用多种蛋白酶分步酶解技术，通过膜分离、凝胶分离及高效液相色谱分离技术，开发了同时具有特定降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽，建立一套高效的多功能鱼鳔蛋白肽的制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供一种具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述鱼鳔蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述鱼鳔蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽的制备方法，包括以下步骤:
(1)超声处理去脂的鱼鳔浆液；
(2)加入复合蛋白酶进行二步法酶解；
(3)对酶解液高温下保温后冷却至室温，离心并取上清液通过二步超滤法处理；
(4)滤液过柱层析分离，收集洗脱峰，即得。
上述制备方法中，步骤(1)的鱼鳔清洗后先经高温处理，再制备鱼鳔浆液。所述高温处理为本领域公知的处理方式，例如可以采用110-121℃下20-40min。
步骤(1)超声处理方法为将去脂的鱼鳔浆液温度调至65-75℃，30-40kH的超声频率处理15-25min。
本发明的实施例中，具体操作为选用冷冻鱼鳔，在2-8℃条件下进行解冻清洗，取鱼鳔，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼鳔清洗后在110-121℃的条件下保温20-40分钟，然后在鱼鳔中加入2.0～4.0倍的水，用打浆机将鱼鳔打成浆，通过6000～8000g离心10～15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼鳔浆液。
本发明提供的具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽的制备方法中，步骤(2)二步法酶解中，第一步酶解加入的复合蛋白酶为碱性蛋白酶和动物蛋白酶，二者质量比为1-2:1，且加入的复合蛋白酶质量为鱼鳔质量的0.2％-0.3％；
第一步酶解条件为50-55℃，pH值7.0-8.0，酶解0.5-1.5h。
其中，步骤(2)二步法酶解中，第二步酶解加入的复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶，二者质量比为1-2:1，且加入的复合蛋白酶质量为鱼鳔质量的0.1％-0.3％；
第二步酶解条件为50-60℃，pH值7.0-8.0，酶解1.0-2.0h。
上述制备方法中，步骤(3)的高温下保温是指于90-95℃下保温3-5min；
步骤(3)的离心是指3000-4000g条件下离心10-15min。
步骤(3)的两步超滤法为先用孔径为6000D的膜超滤上清液，得到分子量小于6000D的滤液，再对该滤液用孔径为3000D的膜超滤，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
步骤(4)的具体操作是：取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰,再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取8-11分收集的肽溶液。
本发明提供的制备方法中，还包括步骤(5)将步骤(4)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳔抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通过LC-MS/MS对制得的鱼鳔蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量为40％～60％。
上述制备方法制备得到的鱼鳔蛋白肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的鱼鳔蛋白肽具有优异的降血糖和抗氧化功能。
进而，本发明提供了该鱼鳔蛋白肽在制备降血糖或抗氧化药物中的应用。含有本发明方法制得的鱼鳔蛋白肽的食品、保健品或药物也属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：
(1)本发明方法所用原料易得，成本低，可控性强，适于产业化生产。
(2)本发明首先对鱼鳔先进行高温(110-121℃)处理，结合特定频率超声波技术处理的鱼鳔蛋白浆，可以明显改善鱼鳔蛋白的结构，提高鱼鳔蛋白的酶敏感性和产品的得率。
(3)本发明制得的鱼鳔蛋白肽具有较好的DPP-Ⅳ抑制的功能，其IC50值小于0.6mg/mL，同时具有较好的抗氧化功能，在1mg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到88％以上，还原力达到0.88以上。
(4)本发明制备的鱼鳔蛋白肽安全无污染，采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、动物蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量的鱼鳔蛋白肽，不加任何添加剂，为100％鱼鳔蛋白肽。
(5)本发明开发鱼鳔蛋白肽中具有特定功能的三种肽(Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu)的比例为40％以上。本发明开发鱼鳔蛋白肽中分子量小于2000的肽的比例为95％以上易于机体消化和吸收。
(6)本发明方法制得的鱼鳔蛋白肽，能广泛应用于特需食品和营养食品的制造。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鱼鳔100克，在4℃条件下进行解冻，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼鳔清洗后在121℃的条件下保温20分钟，然后在鱼鳔中加入2.0倍的水，用打浆机将鱼鳔打成浆，通过6000g离心10～15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼鳔浆液。
(2)将去脂鱼鳔浆液的温度调整到65℃，于超声波发生器中经超声波(频率为40kH)处理15分钟。
(3)按照鱼鳔重量0.4％的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼鳔浆液体中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.2％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶和动物蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)，在50℃，pH为7.5(用1mol/L的NaOH或HCl来调节)的条件下进行酶解反应1.5h；然后利用0.2％复合蛋白酶(中性蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)，在55℃、pH为7.0(用1mol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解反应2.0h；在95℃下保温5分钟，冷却至室温，在4000g条件下离心10min钟，收集上清液；
(4)将步骤(3)所得的上清液利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜将分子量小于6000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量把小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰,用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳔抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通过LC-MS/MS对鱼鳔蛋白肽的主要成分进行测定，本实施例制得的鱼鳔蛋白肽中氨基酸序列为Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量为42％。
实施例2具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鱼鳔10克，在6℃条件下进行解冻，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗，鱼鳔清洗后在110℃的条件下保温40分钟，然后在鱼鳔中加入3.0倍的水，用打浆机将鱼鳔打成浆，通过6000g离心15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼鳔浆液。
(2)将去脂鱼鳔浆液的温度调整到70℃，于超声波发生器中经超声波(频率为40kH)处理25分钟。
(3)按照鱼鳔重量0.5％的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼鳔浆液体中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.2％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶和动物蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)，在55℃，pH为7.5(用1mol/L的NaOH或HCl来调节)的条件下进行酶解反应1.0h；然后利用0.3％复合蛋白酶(中性蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)，在55℃、pH为7.5(用1mol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解反应2.0h；在95℃下保温5分钟，冷却至室温，在3500g条件下离15min，收集上清液；
(4)将步骤(3)所得的上清液利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰,再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳔抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通过LC-MS/MS对鱼鳔蛋白肽的主要成分进行测定，本实施例制得的鱼鳔蛋白肽中其氨基酸序列为Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量为43％。
实施例3具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鱼鳔1000克，在8℃条件下进行解冻清洗，取鱼鳔，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼鳔清洗后在121℃的条件下保温25分钟，然后在鱼鳔中加入3.0倍的水，用打浆机将鱼鳔打成浆，通过6000g离心15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼鳔浆液。
(2)将去脂鱼鳔浆液的温度调整到70℃，于超声波发生器中经超声波(频率为40kH)处理15分钟。
(3)按照鱼鳔重量0.4％的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼鳔浆液体中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.2％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶和动物蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)，在55℃，pH为8(用1mol/L的NaOH或HCl来调节)的条件下进行酶解反应1.5h；然后利用0.2％复合蛋白酶(中性蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)，在60℃、pH为7.0(用1mol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解反应2.0h；在95℃下保温5分钟，冷却至室温，在4000g条件下离心12min，收集上清液；
(4)将步骤(3)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，收集第1个洗脱峰,再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳔抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通过LC-MS/MS对鱼鳔蛋白肽的主要成分进行测定，本实施例制得的鱼鳔蛋白肽中氨基酸序列为Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量为43％。
实施例4鱼鳔蛋白肽DPP-Ⅳ抑制能力的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼鳔蛋白肽及合成的肽DPP-Ⅳ抑制能力按照如下方法进行：
将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL 1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A样品-A样品空白对照)/(A阴性对照-A阴性空白对照)}×100
A样品：为样品反应液在405nm处的吸光值A；
A样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A；
A阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值；
A阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值
DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由回归方程计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制是肽的浓度。结果见表1。
实施例5本发明鱼鳔蛋白抗氧化活性的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼鳔蛋白肽。
按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的鱼鳔蛋白肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)还原力测定：取1mg/mL的鱼鳔蛋白肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
结果(见表1)本发明鱼鳔蛋白肽具有很好的DPP-IV抑制能力，DPP-IV抑制活性(IC50值)低于0.60mg/mL，显著低于同类复合蛋白肽的IC50值，具有很好的DPP-IV抑制能力。同时本发明的鱼鳔蛋白肽具有较好的抗氧化能力，在1mg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到88％以上，还原力达到0.88以上，也是一种较好的抗氧化肽。
表1本发明鱼鳔蛋白肽的DPP-IV抑制和抗氧化活性试验结果
注：合成肽1的氨基酸序列Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His
合成肽2的氨基酸序列Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His
合成肽3的氨基酸序列Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种具有降血糖和抗氧化功能的鱼鳔蛋白肽及其制备方法
<130> KHP161116973.3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 1
Trp Gly Asp Glu His Ile Pro Gly Ser Pro Tyr His
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 2
Ile Ala Gln Pro Gln Glu Lys Ala Pro Asp Pro Phe Arg His
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 3
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
1 5