一种淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法与流程

本发明属于水产食品加工
技术领域：
，具体涉及一种淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法。
背景技术：
：体内自由基代谢失衡累积过多的自由基，引起机体氧化应激，导致机体组织和细胞的氧化损伤，诱发各种慢性疾病。抗氧化剂通过清除自由基、调节机体内各类抗氧化物质的功能活性，调整和改善人体生理功能，从而达到预防和治疗慢性疾病的目的。商用抗氧化剂多是合成化合物，如BHT、BHA，虽抗氧化效果良好，但长期使用对人体肝、脾等具有不利影响，其应用受到极大的限制。因此逐步转向关注从各种动植物中分离天然抗氧化剂，其需求日益高涨。食品蛋白源抗氧化肽是非酶类自由基清除剂，具有低毒、高效、易吸收等特点，在食品、制药和化妆品行业中具有极大的利用价值和广泛的应用前景。随着肽转运载体(Peptidetransporter1，PepT1)的发现及多肽吸收转运机制的深入研究，表明小分子活性肽才可被人体小肠上皮细胞吸收利用。我国是淡水渔业大国，养殖产量位居全球榜首。淡水鱼具有丰富的营养价值，是优质的蛋白质资源。目前对于鱼蛋白加工利用，已采用化学法和酶法制备水解物。化学法用酸和碱处理鱼蛋白，得到的水解物感官和功能活性都不理想。而酶法制备的水解物具有良好的功能活性而备受关注。但现有的酶法生产的鱼蛋白水解物，由于原料中存在促氧化剂如肌红蛋白，以及磷脂膜中的不稳定脂质成分，影响水解效率且易导致活性肽被氧化而失活的问题；且水解物多为长链多肽，不能被肽转运载体(PepT1)识别和转运吸收，难以在体内发挥抗氧化功能。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述和/或现有的制备淡水鱼抗氧化活性多肽的技术空白，提出了本发明。因此，本发明目的是解决现有技术中的不足，提供一种抗氧化活性高的淡水鱼抗氧化活性多肽的制备方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法，包括，预处理，将淡水鱼鱼糜与NaCl溶液混合，均质搅拌离心后取沉淀，加入CaCl2和柠檬酸混合液，均质搅拌离心后取沉淀冻干，得到预处理后的鱼糜；制备鱼蛋白酶解物，对预处理后的鱼糜进行碱性蛋白酶酶解、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解，离心收集上清液冻干，得到鱼蛋白酶解物；制备抗氧化物活性肽，将制得的蛋白酶解物溶解于水，逐级过滤膜，将透过液冻干，得到淡水鱼抗氧化物活性肽。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述NaCl溶液质量浓度0.2％～1.0％，其添加质量为鱼糜质量的2～5倍。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述CaCl2和柠檬酸混合液包括5～10mmol/LCaCl2和1～10mmol/L柠檬酸溶液，其添加量为鱼糜质量的2～5倍。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述均质搅拌离心，其是在10000～13000rpm下均质1～3min，以200～1000rpm搅拌30～60min，在4000～10000×g下离心10～15min。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述离心收集上清液，其中，离心条件为在4000～10000×g下离心10～15min。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述逐级过滤膜，其是分别过分子截留量为10、5、3及1kDa的超滤膜，再过200～300Da的纳滤膜，作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述碱性蛋白酶酶解，其是向预处理后的鱼糜加入鱼糜质量15～25倍的水，均质后调节鱼浆液pH为6.0～8.5，调节温度为50～60℃，添加占鱼糜质量0.67％～2％的碱性蛋白酶，在50～60℃条件酶解1～3h，然后调节酶解液pH为5.0～5.5终止碱性蛋白酶酶解反应。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述胃蛋白酶酶解，其是添加鱼糜质量20～40倍的30～40mmol/LNaCl，调节混合液pH为1.5～2.0，调节温度为35～40℃，添加占鱼糜质量3.3％～10％的胃蛋白酶，在35～40℃酶解0.5～1.5h，然后调节pH至7.0～7.5终止胃蛋白酶酶解反应。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解，其是添加鱼糜质量100～150倍的磷酸钠缓冲溶液，最终保持磷酸钠缓冲溶液浓度为0.01～0.05mol/L，pH为6.0～7.0，添加占鱼糜质量0.67％～2％的胰蛋白酶，添加占鱼糜质量0.67％～2％的糜蛋白酶，在35～40℃酶解1～3h，在95～100℃下保温5～10min终止酶解反应，然后冷却至室温。作为本发明所述淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法的一种优选方案，其中：所述胰蛋白酶，其酶活为2200～3000U/mg；所述糜蛋白酶，其酶活为700～1000U/mg；所述碱性蛋白酶，其酶活为150～300U/mg；所述胃蛋白酶，其酶活为1100～1400U/mg。本发明所具有的有益效果：(1)本发明制备的预处理操作除去了鱼肉中的肌红蛋白85.1％，以及磷脂膜中磷脂72.2％。(2)本发明制备的淡水鱼蛋白酶解物为白色，而未处理鱼肉制备的酶解物为淡黄色。预处理鱼肉酶解物具有很好的白度，提升了1.12倍。(3)本发明制备的淡水鱼蛋白酶解物具有很好的抗氧化功能活性，与未处理鱼肉制备的酶解物相比，预处理鱼肉制备的酶解物的ABTS自由基清除活性和ORAC值分别增强了1.72倍和1.73倍，其中淡水鱼蛋白抗氧化肽(<1kDa)的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，分别为5263.78±77.64μmolTE/gprotein和446.55±15.32μmolTE/gprotein。(4)本发明淡水鱼蛋白酶解物小于1kDa的组分高达83.16％，其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％。(5)本发明淡水鱼蛋白酶解物和抗氧化肽是以天然产物为原料，所得产品安全、无毒、无腥味和泥土味，溶解性好，能被人体吸收利用且感官品质优良，能广泛应用于功能食品中。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为实施例1中鱼蛋白酶解物超滤前的分子量分布，由图可知，鱼蛋白酶解物主要成分为小于1kDa的多肽，高达83.16％；其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％。图2为实施例1中鱼肉酶解物超滤前后各组分的抗氧化活性，由图可知，<1kDa的抗氧化肽的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，说明了本发明制备的鱼肉蛋白酶解物和抗氧化肽具有良好的抗氧化活性。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实施例1按照如下方法进行：(1)预处理：取草鱼鱼肉100g，加入300mL0.4％氯化钠溶液，10000r/min均质1min后，以1000rpm磁力搅拌1h，10,000×g离心15min去除上清液，收集沉淀；加入8mmol/L氯化钙和5mmol/L柠檬酸溶液，10000r/min均质1min后，以1000rpm磁力搅拌1h，10000×g离心15min去除上清液，收集沉淀冻干(-40℃下冻干48h)，得到预处理的鱼糜。(2)酶解：向步骤(1)所得的预处理鱼糜5g中添加100mL水，均质制备鱼浆，用1mol/LNaOH调节鱼浆液pH为6.5，调节温度为55℃，添加碱性蛋白酶(酶活为200U/mg)50mg，在55℃条件酶解2h。随后调节酶解液pH为5.0左右终止碱性蛋白酶酶解反应，添加模拟胃液150mL(35mmol/LNaCl，HCl调至pH1.6)，调节酶解液pH为1.6，并调节温度为37℃，添加胃蛋白酶(酶活为1200U/mg)250mg，在37℃酶解1h，调节pH至7.0终止胃蛋白酶酶解反应；加入模拟肠液750mL(终浓度为0.02mol/L的磷酸钠缓冲溶液，pH6.5)，添加胰蛋白酶(酶活为2500U/mg)和糜蛋白酶(酶活为800U/mg)各50mg，在37℃酶解2h。酶解结束后，在100℃下保温10min，灭酶活终止酶解反应，冷却至室温，在10000×g下离心15min，收集上清液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉蛋白酶解物。(3)超滤分离脱盐：将步骤(2)所得的冻干酶解物用超纯水溶解制备超滤溶液，利用分子截留量为10、5、3和1kDa的超滤膜将步骤(2)所得的上清液依次进行超滤，收集超滤的透过液，再用200Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，收集纳滤的截留液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉抗氧化肽。此为样品1，经感官评价得，无泥土与鱼腥味。实施例2按照如下方法进行：(1)预处理：取青鱼鱼肉100g，加入200mL0.2％氯化钠溶液，10000r/min均质1min后，以1000rpm磁力搅拌1h，10000×g离心15min去除上清液，收集沉淀；加入10mmol/L氯化钙和1mmol/L柠檬酸溶液，10,000r/min均质1min后，以1000rpm磁力搅拌1h，10,000×g离心15min去除上清液，收集沉淀冻干(-40℃下冻干48h)，得到预处理的鱼糜。(2)酶解：向步骤(1)所得的预处理鱼糜5g中添加120mL水，均质制备鱼浆，用1mol/LNaOH调节鱼浆液pH为7.0，调节温度为57℃，添加碱性蛋白酶(酶活为200U/mg)65mg，在57℃条件酶解3h。随后调节酶解液pH为5.0左右终止碱性蛋白酶酶解反应，添加模拟胃液130mL(35mmol/LNaCl，HCl调至pH2.0)，调节酶解液pH为2.0，并调节温度为35℃，添加胃蛋白酶(酶活为1200U/mg)200mg，在35℃酶解1.5h，调节pH至7.0终止胃蛋白酶酶解反应；加入模拟肠液700mL(终浓度为0.03mol/L的磷酸钠缓冲溶液，pH6.8)，添加胰蛋白酶(酶活为2500U/mg)和糜蛋白酶(酶活为800U/mg)各65mg，在35℃酶解3h。酶解结束后，在100℃下保温10min，灭酶活终止酶解反应，冷却至室温，在10000×g下离心15min，收集上清液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉蛋白酶解物。(3)超滤分离脱盐：利用分子截留量为10、5、3和1kDa的超滤膜将步骤(2)所得的上清液依次进行超滤，收集超滤的透过液，再用200Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，收集纳滤的截留液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉抗氧化肽。此为样品2，经感官评价得，无泥土与鱼腥味。实施例3按照如下方法进行：(1)预处理：取鳙鱼鱼肉100g，加入500mL1.0％氯化钠溶液，13000r/min均质2min后，以200rpm磁力搅拌45min，4000×g离心15min去除上清液，收集沉淀；加入5mmol/L氯化钙和10mmol/L柠檬酸溶液，13000r/min均质2min后，以200rpm磁力搅拌45min，4000×g离心15min去除上清液，收集沉淀冻干(-40℃下冻干48h)，得到预处理的鱼糜。(2)酶解：向步骤(1)所得的预处理鱼糜5g中添加100mL水，均质制备鱼浆，用1mol/LNaOH调节鱼浆液pH为6.5，调节温度为55℃，添加碱性蛋白酶(酶活为250U/mg)50mg，在55℃条件酶解2h。随后调节酶解液pH为5.0左右终止碱性蛋白酶酶解反应，添加模拟胃液150mL(35mmol/LNaCl，HCl调至pH1.6)，调节酶解液pH为1.6，并调节温度为37℃，添加胃蛋白酶(酶活为1300U/mg)250mg，在37℃酶解1h，调节pH至7.0终止胃蛋白酶酶解反应；加入模拟肠液750mL(终浓度为0.02mol/L的磷酸钠缓冲溶液，pH6.5)，添加胰蛋白酶(酶活为2200U/mg)和糜蛋白酶(酶活为900U/mg)各50mg，在37℃酶解2h。酶解结束后，在100℃下保温10min，灭酶活终止酶解反应，冷却至室温，在4000×g下离心15min，收集上清液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉蛋白酶解物。(3)超滤分离脱盐：将步骤(2)所得的冻干酶解物用超纯水溶解制备超滤溶液，利用分子截留量为10、5、3和1kDa的超滤膜将步骤(2)所得的上清液依次进行超滤，收集超滤的透过液，再用200Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，收集纳滤的截留液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉抗氧化肽。此为样品3，经感官评价得，无泥土与鱼腥味。实施例4(1)酶解：未预处理的冻干鱼糜5g中添加100mL水，均质制备鱼浆，用1mol/LNaOH调节鱼浆液pH为6.5，调节温度为55℃，添加碱性蛋白酶50mg，在55℃条件酶解2h。随后调节酶解液pH为5.0左右终止碱性蛋白酶酶解反应，添加模拟胃液150mL(35mmol/LNaCl，HCl调至pH1.6)，调节酶解液pH为1.6，并调节温度为37℃，添加胃蛋白酶250mg，在37℃酶解1h，调节pH至7.0终止胃蛋白酶酶解反应；加入模拟肠液750mL(终浓度为0.02mol/L的磷酸钠缓冲溶液，pH6.5)，添加胰蛋白酶和糜蛋白酶各50mg，在37℃酶解2h。酶解结束后，在100℃下保温10min，灭酶活终止酶解反应，冷却至室温，在10,000×g下离心15min，收集上清液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉蛋白酶解物。(2)超滤分离脱盐：利用分子截留量为10、5、3和1kDa的超滤膜将步骤(1)所得的上清液依次进行超滤，收集超滤的透过液，再用200Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，收集纳滤的截留液，冻干(-40℃下冻干48h)得到淡水鱼肉抗氧化肽。此为样品4，经感官评价得，略有泥土与鱼腥味。实施例5实验样品：实施例1冻干鱼糜、实施例4冻干鱼糜。实验方法：(1)肌红蛋白含量测定：取鱼糜样品1.0g，添加预冷的20mL0.04mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)，在11,500rpm均质1min，随后在4℃，10,000g下离心15min，上清用滤纸过滤后测525nm处吸光度值。肌红蛋白摩尔吸光系数为7.6×10-3，分子量为16,110Da。含量表达为g/kg干样。(2)磷脂含量测定：磷脂含量测定采用钼酸蓝比色法测磷含量，称取20mg鱼糜样品于消化管中，添加50mg催化剂(硫酸铜：硫酸钾＝1:4，w/w)、2mL双蒸水、1mL浓硫酸，置于消化炉上消化完全，冷却后定容至50mL。取消化液3mL，定磷试剂(6mol/L硫酸：双蒸水：25％钼酸铵：10％抗坏血酸＝1:2:1:1，v/v)3mL，45℃水浴20min后测660nm处吸光度值。磷含量转化为磷脂的转化系数为25。结果见表1，与实施例4冻干鱼糜相比，实施例1冻干鱼糜中肌红蛋白(促氧化剂)和磷脂膜中的磷脂含量分别降低了85.1％和72.2％。表1本发明中预处理操作的实验效果样品肌红蛋白含量(g/kg干样)磷脂含量(g/kg干样)实施例1冻干鱼糜2.04±0.1864.50±0.23实施例4冻干鱼糜13.73±0.50232.36±0.45实施例6试验样品：取实施例1～4制得的鱼肉蛋白酶解物。试验方法：(1)ABTS自由基清除活性：取7mmol/L的ABTS溶液5mL和140mmol/L过硫酸钾溶液88μL混合并在室温条件下避光12～16h，作为储备液。用含0.15mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释储备液，至734nm波长吸光度为0.70±0.02，作为试验试剂。取4mL试验试剂，加入40μL样品(2mg/mL)或Trolox，室温避光反应6min后在734nm波长处测定吸光度。空白对照用磷酸盐缓冲液。0～10mmol/LTrolox绘制标准曲线。(2)氧自由基吸收能力(ORAC)测定：取78nmol/L的荧光素钠溶液60μL，60μL的样品或75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)或Trolox充分混合，然后在37℃温育15min，再加入221mmol/L的AAPH溶液30μL。用酶标仪每3min读取荧光值共进行2h。激发波长和发射波长分别是485nm和535nm。磷酸盐缓冲液代替样品作为空白(blank)，荧光值为含有AAPH的相对荧光强度与不含AAPH的相对荧光强度之比。使用0～25μΜTrolox绘制荧光淬灭标准曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积(AUC)。AUC的计算公式如下：ORAC(μmolTE/gprotein)＝[CTrolox×(AUCsample-AUCblank)]/[Csample×(AUCTrolox-AUCblank)]其中CTrolox为Trolox浓度(25μΜ)，Csample为样品浓度(0.5mg/mL)AUC＝0.5×[2×(f0+f1+...+fn-1+fn)-f0-fn]×Δtf0为起始荧光值，fn为时间n下荧光值，Δt为间隔时间。结果见表2。表2样品1～4的抗氧化活性实验效果实施例7使用高效凝胶排阻色谱法进行分子量分布情况分析，使用TSK-GelG2000SWXL色谱柱(7.8mm×300mm)。实施例1中蛋白酶解物(超滤前)用40％乙腈溶液(内含0.1％三氟乙酸)溶解至4mg/mL，0.22μm滤膜过滤后取10μL上样，使用同样的溶液进行洗脱，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，检测220nm洗脱图谱。使用细胞色素C(MW12384)、杆菌酶(MW1422)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)和乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)标准品作分子量校正曲线。由图1可知，本发明淡水鱼蛋白酶解物小于1kDa的组分高达83.16％，其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％。对实施例1各分子量的鱼蛋白抗氧化肽进行抗氧化活性实验，得图2，由图2可知，本发明所制得的淡水鱼蛋白抗氧化肽，其中分子量小于1kDa的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，分别为5263.78±77.64μmolTE/gprotein和446.55±15.32μmolTE/gprotein。实施例8使用色差仪(UltraScanPro1166)测定蛋白酶解物的色差值(L*值、a*值和b*值)。由表3可知，实施例1制得的蛋白酶解物为白色，实施例4制得的蛋白酶解物为淡黄色。预处理后酶解物白度提升了1.12倍。表3本产品蛋白酶解物色差值实施例9为测定制得的鱼肉蛋白抗氧化肽的溶解性，分别取样品1～4各100mg在室温下分散在10mL去离子水中，使用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH将溶液的pH调整为3、4、5、6、7、8，将该溶液在8900×g下离心15min。采用双缩脲法测定上清液中的蛋白质含量。样品中总蛋白含量测定是将样品溶解在0.5mol/L的NaOH溶液中进行测定的。溶解度(％)＝上清液中的蛋白质含量/样品中总蛋白含量实验结果如下表。由此而可见，本发明制备的预处理操作除去了鱼肉中的肌红蛋白85.1％，以及磷脂膜中磷脂72.2％；本发明制备的淡水鱼蛋白酶解物为白色，而未处理鱼肉制备的酶解物为淡黄色。预处理鱼肉酶解物具有很好的白度，提升了1.12倍；本发明制备的淡水鱼蛋白酶解物具有很好的抗氧化功能活性，与未处理鱼肉制备的酶解物相比，预处理鱼肉制备的酶解物的ABTS自由基清除活性和ORAC值分别增强了1.72倍和1.73倍，其中淡水鱼蛋白抗氧化肽(<1kDa)的ABTS自由基清除活性和ORAC值最高，分别为5263.78±77.64μmolTE/gprotein和446.55±15.32μmolTE/gprotein；本发明淡水鱼蛋白酶解物小于1kDa的组分高达83.16％，其中591Da肽占26.92％，233Da肽占42.34％；本发明淡水鱼蛋白酶解物和抗氧化肽是以天然产物为原料，所得产品安全、无毒、无腥味和泥土味、溶解性好，能被人体吸收利用且感官品质优良，能广泛应用于功能食品中。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页1 2 3